細菌生物膜是慢性傷口感染和難以愈合的關鍵問題，如何防治細菌生物膜，改善慢性傷口預后已成為傷口護理領域的研究熱點。該文將從慢性傷口細菌生物膜形成過程中表面附著、小集落形成、生物膜成熟、分散分離等 4 個主要階段，生物膜存在時宿主的免疫反應特點，生物膜形態學、微生物學、分子檢測方法，生物膜治療體外試驗、動物實驗、臨床試驗進展以及新興治療方法等方面進行綜述，旨在為慢性傷口生物膜治療提供依據。
引用本文： 余靜雅, 戴燕, 石玉蘭. 慢性傷口細菌生物膜的研究進展. 華西醫學, 2021, 36(5): 686-690. doi: 10.7507/1002-0179.202102198 復制
慢性傷口是指經 1 個月臨床治療后未痊愈的傷口[1]，常見的慢性傷口包括血管性潰瘍、糖尿病足潰瘍、壓力性損傷、創傷性潰瘍等。全球每年約有 1% 的人口受慢性傷口的困擾[2]，約 1/6 的糖尿病足潰瘍患者存在截肢風險，病死率高達 47%～70%，嚴重影響患者生活質量[3]。同時，慢性傷口已成為世界各國重要的衛生保健負擔，在西方國家，每年用于慢性傷口的醫療支出高達 250 億美元，占醫療總支出的 2%～4%[4]。感染是傷口延遲愈合的主要原因[5]，60% 的慢性傷口感染由生物膜細菌造成[6]。近年來，細菌生物膜在慢性傷口感染中的作用一直是研究熱點，對于細菌生物膜的管理被認為是慢性傷口護理的重要組成部分。現將慢性傷口細菌生物膜形成機制、檢測方法和治療方法綜述如下。
1 細菌生物膜形成機制
慢性傷口中細菌生物膜的檢出率為 78.2%[7]，而急性傷口中生物膜檢出率僅為 6%[8]，大部分細菌以浮游狀態存在。生物膜是一種復雜的微生物聚集物，具有分泌黏合劑和保護基質的特征[6]。生物膜相關慢性傷口感染通常是多種微生物感染的結果[9]，最常見的兩種菌為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。生物膜形成的危險因素包括糖尿病、靜脈功能不全、營養不良、腫瘤和重復創傷等[6]。慢性傷口生物膜的形成與皮膚微環境破壞有關，皮膚菌群表型和基因型重組進而致病[8]。細菌生物膜形成主要分為 4 個階段[10]：① 表面附著；② 小集落形成；③ 生物膜成熟；④ 分散分離。生物膜在生物表面的初始附著需要浮游細菌和表面之間通過特定的錨定蛋白和菌毛的相互作用。首先，細菌沉淀并附著在合適的宿主組織表面，成功附著后，浮游細菌開始形成固定的微菌落，細菌通過群體感應系統轉化為生物膜狀態[11]。細菌開始產生生物膜基質，從而進一步加強附著并提供結構和生化支持。建立第 1 層生物膜后，密集的微菌落開始結構的形成[12]。小菌落逐漸成熟為生物膜，通過細胞外聚合物質（extracellular polymeric substances，EPS）進一步結合在一起[13]，被宿主炎癥物質和細胞包圍。在發育良好的生物膜中，EPS 占生物膜體積的 90%，細菌只占 10%[14]，EPS 中的細菌可以作為獨立的細胞（浮游狀態）或作為生物膜群落的成員（生物膜狀態）存在[10]。EPS 的形成主要是保護細菌免受宿主的免疫防御[15]。生物膜最終形成莖狀結構，分散和分離形成新的菌落或合并到現有的生物膜中[11]。
高水平氧化應激和慢性炎癥是慢性傷口的兩大特征，炎癥細胞不斷涌入，釋放細胞毒素酶，增加自由基，常見的慢性傷口相關細菌，如葡萄球菌、鏈球菌、假單胞菌可以產生外毒素，對宿主組織造成廣泛的損傷，破壞宿主細胞，破壞正常的細胞代謝，導致宿主組織的廣泛損傷。生物膜的存在可引起宿主的免疫反應，最直接的細胞反應是中性粒細胞浸潤[11]。研究顯示，大量中性粒細胞僅包圍了生物膜，但未滲透，可能與中性粒細胞被細菌分泌的群體感應系統因子麻痹和溶解有關[16]。宿主對生物膜的反應也會誘導炎癥細胞因子和生長因子的釋放，包括表皮生長因子、血小板生長因子、血管內皮生長因子、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6 和趨化因子 CXCL8/IL-8[17]，其中 TNF-α 在慢性傷口中水平較高[18]，與 TNF-α 轉換酶（TNF-α converting enzyme，TACE）的過度激活和 TACE 抑制劑缺乏有關[19]。動物研究已證實，抗 TNF-α 藥物在加速傷口愈合中有效[20]。
2 細菌生物膜檢測方法
目前，尚無慢性傷口細菌生物膜檢測的金標準，生物膜有效檢測主要集中在兩個方面：生物膜定位和病原鑒定[11]。當懷疑存在生物膜相關慢性傷口感染時，應從清創后的傷口基底處獲得活組織[11]。生物膜檢測方法按其檢測水平可分為形態學檢測、微生物學檢測和分子檢測。
2.1 形態學檢測
客觀評價慢性傷口形態對生物膜的定位至關重要，細菌和生物膜常位于潰瘍傷口和焦痂內[21]。美國傳染病學會糖尿病足部感染診斷和治療臨床實踐指南指出深層創面組織活檢是細菌生物膜檢測的首選方法[22]。鑒于生物膜在創面基底和焦痂中分布不均，應從創面淺層和深層獲取多個組織樣本，以提高該檢測方法的敏感性，而微創方法如傷口拭子，可能無法收集到足夠的生物膜材料[23]。創面組織活檢用于生物膜檢測具有簡便易行的特點，但由于組織學檢測取決于活檢位置以及組織標本的切面，可能會導致高假陰性[24]。掃描電子顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）是最為可靠的生物膜活檢方法，具有無創、準確診斷的特點[5]。通過掃描電子顯微鏡，可觀察到沒有鞭毛的銅綠假單胞菌包裹在沒有炎癥跡象的傷口細胞外基質中[25]。然而，由于設備和專業人員的稀缺，臨床采用該方法檢測生物膜可行性低。
2.2 微生物學檢測
微生物學檢測常用于感染疾病病原體的確定。然而，由于生物膜相關慢性傷口感染往往與多種病原體有關，如糖尿病足潰瘍傷口中可檢測出 2～5 種細菌[26]，因此采用微生物學檢測生物膜具有一定的難度。由于細菌分離率受細菌狀態的影響，傳統的細菌培養方法只能鑒定出 1% 的慢性傷口細菌[27]，某些生長緩慢的細菌會進入一種可存活但不可培養（viable but nonculturable，VBNC）狀態，這可能是細菌在低 pH 值、缺氧和/或營養缺乏等應激環境條件下的適應機制[28]。鑒于生物膜中大量細菌可能出現這種休眠狀態，同時，生物膜中多細菌共存使得細菌的可培養性會受到生物膜基質中其他細菌的影響[29]，細菌培養會更為復雜，因此使用傳統細菌培養方法用于生物膜病原體檢測極具挑戰。此外，VBNC 菌也不能在常規瓊脂平板上培養，這意味著常規平板計數法檢出率很低[28]。
2.3 分子檢測
微生物檢測的局限性刺激了宏基因組學檢測的發展，以直接識別慢性傷口生物膜中的病原體[30]。該方法利用作為引物結合位點 16S 核糖體 RNA（ribosomal RNA，rRNA）序列，為鑒定病原體提供特異性信息。變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是分析復雜生物膜多樣性的常用方法，DGGE 根據暴露的 DNA 變性物質分離長度相同但序列不同的 DNA 序列，與 16S rRNA、聚合酶鏈式反應一起用于分析慢性傷口的微生物負荷[31]。通過對各種 16S rRNA 序列的半定量分析，可鑒定 40% 的傳統細菌培養方法檢測不到的菌株[11]。單獨或聯合使用 16S rRNA 的檢測方法有部分核糖體擴增和焦磷酸測序（partial ribosomal amplification and pyrosequencing，PRAPS）；全核糖體擴增、克隆桑格測序（full ribosomal amplification，cloning and Sanger sequencing，FRACS）；部分核糖體擴增、變性梯度凝膠電泳桑格測序（partial ribo somal amplification denaturing gradient gel electrophoresis and Sanger sequencing，PRADS）[32]，PRAPS、FRACS 和 PRADS 具有 24 h 內病原體快速檢測、可識別多種 VBNC 狀態細菌的特點[11]。其他分子檢測方法還有細菌標記編碼 FLX 擴增焦磷酸測序，該方法可識別難以在實驗室中生長的病原體，但無法區分浮游細菌和生物膜細菌[33]。
3 細菌生物膜治療方法
生物膜被認為是慢性傷口延遲愈合的原因，生物膜中的微生物細胞出現生長改變，使得其對抗菌藥物和宿主防御高度耐受。創面床制備是去除生物膜的重要環節，創面清創是去除或減少生物膜最有效的方法[9]，國際傷口感染協會將緩釋碘推薦為去除傷口細菌（浮游細菌、生物膜細菌）的一線療法。
3.1 體外試驗
在細菌生物膜去除研究中，體外試驗最為常見。體外試驗中，為了更好地反映傷口環境，通常對試驗模型進行了適當的調整。大多數研究使用一種體外生物膜模型，少數研究使用兩個及以上生物膜模型，最常見的生物膜模型是最低生物膜根除濃度/孔板試驗模型。模型菌種方面，最常見的單菌種模型為銅綠假單胞菌模型和金黃色葡萄球菌模型，菌種量范圍為 105～108 cfu/mL。生物膜體外試驗模型建立時間有 24、48、≥72 h 模型，其中以 24 h 模型最為常見。CLSM 常用于確認生物膜生長，稀釋和電鍍法是確認菌量的常用方法。生物膜形成后，外部干預作用于生物膜上，研究多集中在某一特定干預措施對生物膜的去除效果，亦有少部分研究分析了多種措施的聯合干預效果。療效評定方面，最常用的評價指標是細菌活力，其余常見指標包括光密度、生物膜生物量等。體外試驗表明聚維酮碘溶液、銀敷料、蜂蜜、表面活性劑等外用制劑均顯示出一定的生物膜去除效果，其中以聚維酮碘溶液降低菌量最為有效，聚維酮碘溶液長期以來被用作抗菌劑，可穿透和破壞生物膜[34]，同時含碘消毒劑未顯示出耐藥性[35]。研究顯示，針對常見的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜模型，聚維酮碘溶液具有良好的生物膜去除效果，以控釋方式緩慢釋放碘，顯著減少細菌菌量效果可持續 3 d[36]。此外碘敷料對哺乳動物細胞毒性相對較低。
3.2 動物實驗
相較于體外試驗，細菌生物膜動物實驗很少，常用的生物膜模型有兔耳創傷模型、豬創傷模型、慢性傷口大鼠模型等。與體外試驗相比，動物實驗中各類去除方法對生物膜的去除效果較低。Phillips 等[37]測試了卡地姆碘敷料、銀敷料、聚己雙胍、蜂蜜、乙醇敷料等抗菌敷料和羧甲基纖維素鈉纖維、海藻酸鈣纖維、紗布等保濕敷料在豬皮膚生物膜的去除效果，研究顯示緩釋卡地姆碘敷料和緩釋銀凝膠對于減少生物膜最有效。Yang 等[38]研究了表面活性劑凝膠去除豬皮膚生物膜的效果，研究表明，生物膜感染可在 3 d 內消除，表面活性劑有助于將生物膜細菌轉變為對抗菌藥物更為敏感的浮游細菌，但這種轉變機制尚不清楚。總的來說，慢性傷口細菌生物膜動物實驗在研究設計和報道方面存在一定的不足，主要存在的問題有未充分說明動物樣本量計算依據、試驗動物的隨機分配和基線情況不明、給予干預時偏倚的控制以及未充分解釋選擇該種動物模型的原因。
3.3 臨床試驗
在體外試驗和動物實驗基礎上，臨床試驗進一步證實了多種生物膜去除方法，清創是去除傷口細菌生物膜的關鍵第一步，銀離子敷料作為治療傷口細菌生物膜的首選敷料，具有廣譜抗菌性能[39]，臨床試驗多在這兩種干預措施的基礎上聯合其他治療。徐元玲[40]進行了銳器清創聯合銀離子敷料干預壓力性損傷和膿皮病細菌生物膜的研究，初步證明了該法可有效去除慢性傷口細菌生物膜。牛妞[41]觀察了負壓治療技術聯合納米銀敷料對慢性全層細菌生物膜感染傷口的療效，經過 14 d 的干預，研究顯示細菌生物膜形態結構發生了變化，表明該方法在促進慢性細菌生物膜感染傷口愈合方面具有一定的療效。魏敏[42]研究了抗菌蛋白酶聯合銀敷料對慢性傷口細菌生物膜感染的療效，通過多種方法分析發現治療 28 d 后傷口生物膜中 EPS 及膜內細菌均顯著減少，可促進傷口愈合。負壓治療結合滴注沖洗和負壓治療結合微氧治療改良清創方法在單一菌群的體外試驗已被證實能有效去除細菌生物膜，但能否清除臨床傷口患者的生物膜感染，尚有待進一步的研究證實[43]。
3.4 細菌生物膜治療新興方法
近年來，學者在細菌生物膜治療新技術、新敷料上進行了大量的研究。Bou Haidar 等[44]開發了一種抗生物膜蛋白不對稱釋放系統，通過加入親水致孔劑獲得高孔隙度的不對稱膜，該膜呈致密的上層，孔隙小到足以阻止細菌的滲透，干、濕狀況下均能保持膜的完整性和機械性能。使用表皮葡萄球菌模型進行體外有效性實驗表明，該膜在抑制或分散預形成的生物膜方面效果顯著，清除率高達 80%；使用重建人表皮模型進行體外細胞毒性試驗顯示，該膜具有良好的生物相容性，該膜為一種安全有效的傷口敷料。Silva 等[45]進行了臭氧油在去除糖尿病足潰瘍感染的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的研究，研究中使用的臭氧油濃度為 0.53～17 mg/g，采用氣相色譜儀測定臭氧油中脂肪酸含量，采用紙片瓊脂擴散法測定臭氧油對生物膜的影響；隨著臭氧氧化時間的延長，不飽和脂肪酸含量降低，過氧化值增加，當臭氧油濃度為 4.24 mg/g 時，對大多數菌株均有抑制作用，去除生物膜效能良好。
4 小結與展望
慢性傷口感染往往與生物膜有關，與浮游細菌相比，生物膜中生長的細菌具有特定的表型，并對抗菌藥物表現出更高的耐藥性。目前尚無慢性傷口細菌生物膜檢測的金標準，傳統的組織活檢、細菌培養等方法在生物膜的檢測中存在一定的局限性，近年來基因組學等新的檢測方法極大地提升了生物膜的檢測水平，對生物膜的即時檢測可促進充分治療。目前生物膜去除研究大多為體外試驗，然而，由于細菌轉錄組在體外、動物和人類慢性傷口中存在差異，現有的體外試驗證據亟待臨床研究進一步驗證。我國學者 Liu 等[46]探討了云南白藥在抑制生物膜方面的效用，提示國內相關研究可挖掘傳統中藥在去除生物膜上的作用，拓展敷料研發思路，為慢性難愈傷口的治療提供本土化證據。
慢性傷口是指經 1 個月臨床治療后未痊愈的傷口[1]，常見的慢性傷口包括血管性潰瘍、糖尿病足潰瘍、壓力性損傷、創傷性潰瘍等。全球每年約有 1% 的人口受慢性傷口的困擾[2]，約 1/6 的糖尿病足潰瘍患者存在截肢風險，病死率高達 47%～70%，嚴重影響患者生活質量[3]。同時，慢性傷口已成為世界各國重要的衛生保健負擔，在西方國家，每年用于慢性傷口的醫療支出高達 250 億美元，占醫療總支出的 2%～4%[4]。感染是傷口延遲愈合的主要原因[5]，60% 的慢性傷口感染由生物膜細菌造成[6]。近年來，細菌生物膜在慢性傷口感染中的作用一直是研究熱點，對于細菌生物膜的管理被認為是慢性傷口護理的重要組成部分。現將慢性傷口細菌生物膜形成機制、檢測方法和治療方法綜述如下。
1 細菌生物膜形成機制
慢性傷口中細菌生物膜的檢出率為 78.2%[7]，而急性傷口中生物膜檢出率僅為 6%[8]，大部分細菌以浮游狀態存在。生物膜是一種復雜的微生物聚集物，具有分泌黏合劑和保護基質的特征[6]。生物膜相關慢性傷口感染通常是多種微生物感染的結果[9]，最常見的兩種菌為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。生物膜形成的危險因素包括糖尿病、靜脈功能不全、營養不良、腫瘤和重復創傷等[6]。慢性傷口生物膜的形成與皮膚微環境破壞有關，皮膚菌群表型和基因型重組進而致病[8]。細菌生物膜形成主要分為 4 個階段[10]：① 表面附著；② 小集落形成；③ 生物膜成熟；④ 分散分離。生物膜在生物表面的初始附著需要浮游細菌和表面之間通過特定的錨定蛋白和菌毛的相互作用。首先，細菌沉淀并附著在合適的宿主組織表面，成功附著后，浮游細菌開始形成固定的微菌落，細菌通過群體感應系統轉化為生物膜狀態[11]。細菌開始產生生物膜基質，從而進一步加強附著并提供結構和生化支持。建立第 1 層生物膜后，密集的微菌落開始結構的形成[12]。小菌落逐漸成熟為生物膜，通過細胞外聚合物質（extracellular polymeric substances，EPS）進一步結合在一起[13]，被宿主炎癥物質和細胞包圍。在發育良好的生物膜中，EPS 占生物膜體積的 90%，細菌只占 10%[14]，EPS 中的細菌可以作為獨立的細胞（浮游狀態）或作為生物膜群落的成員（生物膜狀態）存在[10]。EPS 的形成主要是保護細菌免受宿主的免疫防御[15]。生物膜最終形成莖狀結構，分散和分離形成新的菌落或合并到現有的生物膜中[11]。
高水平氧化應激和慢性炎癥是慢性傷口的兩大特征，炎癥細胞不斷涌入，釋放細胞毒素酶，增加自由基，常見的慢性傷口相關細菌，如葡萄球菌、鏈球菌、假單胞菌可以產生外毒素，對宿主組織造成廣泛的損傷，破壞宿主細胞，破壞正常的細胞代謝，導致宿主組織的廣泛損傷。生物膜的存在可引起宿主的免疫反應，最直接的細胞反應是中性粒細胞浸潤[11]。研究顯示，大量中性粒細胞僅包圍了生物膜，但未滲透，可能與中性粒細胞被細菌分泌的群體感應系統因子麻痹和溶解有關[16]。宿主對生物膜的反應也會誘導炎癥細胞因子和生長因子的釋放，包括表皮生長因子、血小板生長因子、血管內皮生長因子、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6 和趨化因子 CXCL8/IL-8[17]，其中 TNF-α 在慢性傷口中水平較高[18]，與 TNF-α 轉換酶（TNF-α converting enzyme，TACE）的過度激活和 TACE 抑制劑缺乏有關[19]。動物研究已證實，抗 TNF-α 藥物在加速傷口愈合中有效[20]。
2 細菌生物膜檢測方法
目前，尚無慢性傷口細菌生物膜檢測的金標準，生物膜有效檢測主要集中在兩個方面：生物膜定位和病原鑒定[11]。當懷疑存在生物膜相關慢性傷口感染時，應從清創后的傷口基底處獲得活組織[11]。生物膜檢測方法按其檢測水平可分為形態學檢測、微生物學檢測和分子檢測。
2.1 形態學檢測
客觀評價慢性傷口形態對生物膜的定位至關重要，細菌和生物膜常位于潰瘍傷口和焦痂內[21]。美國傳染病學會糖尿病足部感染診斷和治療臨床實踐指南指出深層創面組織活檢是細菌生物膜檢測的首選方法[22]。鑒于生物膜在創面基底和焦痂中分布不均，應從創面淺層和深層獲取多個組織樣本，以提高該檢測方法的敏感性，而微創方法如傷口拭子，可能無法收集到足夠的生物膜材料[23]。創面組織活檢用于生物膜檢測具有簡便易行的特點，但由于組織學檢測取決于活檢位置以及組織標本的切面，可能會導致高假陰性[24]。掃描電子顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）是最為可靠的生物膜活檢方法，具有無創、準確診斷的特點[5]。通過掃描電子顯微鏡，可觀察到沒有鞭毛的銅綠假單胞菌包裹在沒有炎癥跡象的傷口細胞外基質中[25]。然而，由于設備和專業人員的稀缺，臨床采用該方法檢測生物膜可行性低。
2.2 微生物學檢測
微生物學檢測常用于感染疾病病原體的確定。然而，由于生物膜相關慢性傷口感染往往與多種病原體有關，如糖尿病足潰瘍傷口中可檢測出 2～5 種細菌[26]，因此采用微生物學檢測生物膜具有一定的難度。由于細菌分離率受細菌狀態的影響，傳統的細菌培養方法只能鑒定出 1% 的慢性傷口細菌[27]，某些生長緩慢的細菌會進入一種可存活但不可培養（viable but nonculturable，VBNC）狀態，這可能是細菌在低 pH 值、缺氧和/或營養缺乏等應激環境條件下的適應機制[28]。鑒于生物膜中大量細菌可能出現這種休眠狀態，同時，生物膜中多細菌共存使得細菌的可培養性會受到生物膜基質中其他細菌的影響[29]，細菌培養會更為復雜，因此使用傳統細菌培養方法用于生物膜病原體檢測極具挑戰。此外，VBNC 菌也不能在常規瓊脂平板上培養，這意味著常規平板計數法檢出率很低[28]。
2.3 分子檢測
微生物檢測的局限性刺激了宏基因組學檢測的發展，以直接識別慢性傷口生物膜中的病原體[30]。該方法利用作為引物結合位點 16S 核糖體 RNA（ribosomal RNA，rRNA）序列，為鑒定病原體提供特異性信息。變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是分析復雜生物膜多樣性的常用方法，DGGE 根據暴露的 DNA 變性物質分離長度相同但序列不同的 DNA 序列，與 16S rRNA、聚合酶鏈式反應一起用于分析慢性傷口的微生物負荷[31]。通過對各種 16S rRNA 序列的半定量分析，可鑒定 40% 的傳統細菌培養方法檢測不到的菌株[11]。單獨或聯合使用 16S rRNA 的檢測方法有部分核糖體擴增和焦磷酸測序（partial ribosomal amplification and pyrosequencing，PRAPS）；全核糖體擴增、克隆桑格測序（full ribosomal amplification，cloning and Sanger sequencing，FRACS）；部分核糖體擴增、變性梯度凝膠電泳桑格測序（partial ribo somal amplification denaturing gradient gel electrophoresis and Sanger sequencing，PRADS）[32]，PRAPS、FRACS 和 PRADS 具有 24 h 內病原體快速檢測、可識別多種 VBNC 狀態細菌的特點[11]。其他分子檢測方法還有細菌標記編碼 FLX 擴增焦磷酸測序，該方法可識別難以在實驗室中生長的病原體，但無法區分浮游細菌和生物膜細菌[33]。
3 細菌生物膜治療方法
生物膜被認為是慢性傷口延遲愈合的原因，生物膜中的微生物細胞出現生長改變，使得其對抗菌藥物和宿主防御高度耐受。創面床制備是去除生物膜的重要環節，創面清創是去除或減少生物膜最有效的方法[9]，國際傷口感染協會將緩釋碘推薦為去除傷口細菌（浮游細菌、生物膜細菌）的一線療法。
3.1 體外試驗
在細菌生物膜去除研究中，體外試驗最為常見。體外試驗中，為了更好地反映傷口環境，通常對試驗模型進行了適當的調整。大多數研究使用一種體外生物膜模型，少數研究使用兩個及以上生物膜模型，最常見的生物膜模型是最低生物膜根除濃度/孔板試驗模型。模型菌種方面，最常見的單菌種模型為銅綠假單胞菌模型和金黃色葡萄球菌模型，菌種量范圍為 105～108 cfu/mL。生物膜體外試驗模型建立時間有 24、48、≥72 h 模型，其中以 24 h 模型最為常見。CLSM 常用于確認生物膜生長，稀釋和電鍍法是確認菌量的常用方法。生物膜形成后，外部干預作用于生物膜上，研究多集中在某一特定干預措施對生物膜的去除效果，亦有少部分研究分析了多種措施的聯合干預效果。療效評定方面，最常用的評價指標是細菌活力，其余常見指標包括光密度、生物膜生物量等。體外試驗表明聚維酮碘溶液、銀敷料、蜂蜜、表面活性劑等外用制劑均顯示出一定的生物膜去除效果，其中以聚維酮碘溶液降低菌量最為有效，聚維酮碘溶液長期以來被用作抗菌劑，可穿透和破壞生物膜[34]，同時含碘消毒劑未顯示出耐藥性[35]。研究顯示，針對常見的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜模型，聚維酮碘溶液具有良好的生物膜去除效果，以控釋方式緩慢釋放碘，顯著減少細菌菌量效果可持續 3 d[36]。此外碘敷料對哺乳動物細胞毒性相對較低。
3.2 動物實驗
相較于體外試驗，細菌生物膜動物實驗很少，常用的生物膜模型有兔耳創傷模型、豬創傷模型、慢性傷口大鼠模型等。與體外試驗相比，動物實驗中各類去除方法對生物膜的去除效果較低。Phillips 等[37]測試了卡地姆碘敷料、銀敷料、聚己雙胍、蜂蜜、乙醇敷料等抗菌敷料和羧甲基纖維素鈉纖維、海藻酸鈣纖維、紗布等保濕敷料在豬皮膚生物膜的去除效果，研究顯示緩釋卡地姆碘敷料和緩釋銀凝膠對于減少生物膜最有效。Yang 等[38]研究了表面活性劑凝膠去除豬皮膚生物膜的效果，研究表明，生物膜感染可在 3 d 內消除，表面活性劑有助于將生物膜細菌轉變為對抗菌藥物更為敏感的浮游細菌，但這種轉變機制尚不清楚。總的來說，慢性傷口細菌生物膜動物實驗在研究設計和報道方面存在一定的不足，主要存在的問題有未充分說明動物樣本量計算依據、試驗動物的隨機分配和基線情況不明、給予干預時偏倚的控制以及未充分解釋選擇該種動物模型的原因。
3.3 臨床試驗
在體外試驗和動物實驗基礎上，臨床試驗進一步證實了多種生物膜去除方法，清創是去除傷口細菌生物膜的關鍵第一步，銀離子敷料作為治療傷口細菌生物膜的首選敷料，具有廣譜抗菌性能[39]，臨床試驗多在這兩種干預措施的基礎上聯合其他治療。徐元玲[40]進行了銳器清創聯合銀離子敷料干預壓力性損傷和膿皮病細菌生物膜的研究，初步證明了該法可有效去除慢性傷口細菌生物膜。牛妞[41]觀察了負壓治療技術聯合納米銀敷料對慢性全層細菌生物膜感染傷口的療效，經過 14 d 的干預，研究顯示細菌生物膜形態結構發生了變化，表明該方法在促進慢性細菌生物膜感染傷口愈合方面具有一定的療效。魏敏[42]研究了抗菌蛋白酶聯合銀敷料對慢性傷口細菌生物膜感染的療效，通過多種方法分析發現治療 28 d 后傷口生物膜中 EPS 及膜內細菌均顯著減少，可促進傷口愈合。負壓治療結合滴注沖洗和負壓治療結合微氧治療改良清創方法在單一菌群的體外試驗已被證實能有效去除細菌生物膜，但能否清除臨床傷口患者的生物膜感染，尚有待進一步的研究證實[43]。
3.4 細菌生物膜治療新興方法
近年來，學者在細菌生物膜治療新技術、新敷料上進行了大量的研究。Bou Haidar 等[44]開發了一種抗生物膜蛋白不對稱釋放系統，通過加入親水致孔劑獲得高孔隙度的不對稱膜，該膜呈致密的上層，孔隙小到足以阻止細菌的滲透，干、濕狀況下均能保持膜的完整性和機械性能。使用表皮葡萄球菌模型進行體外有效性實驗表明，該膜在抑制或分散預形成的生物膜方面效果顯著，清除率高達 80%；使用重建人表皮模型進行體外細胞毒性試驗顯示，該膜具有良好的生物相容性，該膜為一種安全有效的傷口敷料。Silva 等[45]進行了臭氧油在去除糖尿病足潰瘍感染的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的研究，研究中使用的臭氧油濃度為 0.53～17 mg/g，采用氣相色譜儀測定臭氧油中脂肪酸含量，采用紙片瓊脂擴散法測定臭氧油對生物膜的影響；隨著臭氧氧化時間的延長，不飽和脂肪酸含量降低，過氧化值增加，當臭氧油濃度為 4.24 mg/g 時，對大多數菌株均有抑制作用，去除生物膜效能良好。
4 小結與展望
慢性傷口感染往往與生物膜有關，與浮游細菌相比，生物膜中生長的細菌具有特定的表型，并對抗菌藥物表現出更高的耐藥性。目前尚無慢性傷口細菌生物膜檢測的金標準，傳統的組織活檢、細菌培養等方法在生物膜的檢測中存在一定的局限性，近年來基因組學等新的檢測方法極大地提升了生物膜的檢測水平，對生物膜的即時檢測可促進充分治療。目前生物膜去除研究大多為體外試驗，然而，由于細菌轉錄組在體外、動物和人類慢性傷口中存在差異，現有的體外試驗證據亟待臨床研究進一步驗證。我國學者 Liu 等[46]探討了云南白藥在抑制生物膜方面的效用，提示國內相關研究可挖掘傳統中藥在去除生物膜上的作用，拓展敷料研發思路，為慢性難愈傷口的治療提供本土化證據。