引用本文： 吳登輝, 于津瀾, 張蛟, 楊麗珍, 孫玉華, 張躍輝. 多囊卵巢綜合征中環狀 RNA 差異表達的生物信息學分析. 華西醫學, 2022, 37(2): 231-236. doi: 10.7507/1002-0179.202012054 復制
多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患病率為 5%～10%，是育齡期婦女最常見的內分泌紊亂疾病之一[1]。其通常表現為肥胖、多毛、稀發排卵或無排卵和卵巢多囊樣改變，常與胰島素抵抗、血脂異常和肥胖癥并存，并具有發展心血管疾病、代謝后遺癥（例如糖尿病和代謝綜合征）的重大風險[2]。盡管該病在臨床上非常多見，但其病因和病理生理學過程仍不明確，不斷有證據表明，PCOS 可能是一種復雜的多基因疾病，與強表觀遺傳和環境影響相關[3]。因此，探究該疾病早期的生物學標志物，對改善和治療 PCOS 具有重要的臨床意義。環狀 RNA（circular RNA，circRNA）是一類閉合環狀的 RNA 分子，主要由真核生物信使 RNA 的前體通過可變剪切加工產生，在古細菌和動植物等多種物種中被發現[4]。circRNA 不具有 5’ 端帽子和 3’ 末端 poly（A）尾巴結構，這一結構上的獨特性使其不易被核酸外切酶和分支酶降解[5]，因而有高穩定性、物種間高度保守和組織特異性的特點[6]。目前國內外學者已經發現 circRNA 在腫瘤、心血管疾病、神經系統疾病等多種疾病中均存在差異表達[7]，并有多項研究表明 circRNA 可能在 PCOS 的進程中起著重要作用[8-9]。本研究旨在通過對基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus database，GEO）中的 PCOS 卵丘細胞基因芯片進行生物信息學分析，篩選出差異 circRNA，并預測這些差異 circRNA 的潛在調控 miRNA，為幫助闡明 PCOS 的發病機制和治療藥物的研發提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 數據收集
從美國國立生物技術信息中心的 GEO 數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載基因表達芯片 GSE145296，其所處平臺為 GPL28148 Agilent-084217 CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2。該芯片包含 6 例 PCOS 患者和 6 例健康個體，本研究將對該芯片中健康個體和 PCOS 患者的卵丘細胞中的 circRNA 進行分析。
1.2 差異 circRNA 的數據分析
本研究選用基因表達芯片 GSE145296，用 GEO2R 在線分析軟件進行差異 circRNA 的篩選。GEO2R 是 GEO 數據庫自帶的在線分析工具，基于此工具可以對部分 GEO 樣品數據進行基因差異表達分析。該工具主要針對芯片數據，使用的是基于 R 編程語言的開源軟件項目 Bioconductor 項目中的 GEOquery 和 limma R 包，能夠對原始提交者提供的處理后的數據表進行比較。將原始數據進行分析，以 P<0.05 和 |logFC|≥1.2 作為篩選條件。
1.3 基因富集分析
把篩選的差異 circRNA 的基因導入 DAVID 數據庫（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery）進行在線分析，選用“Homo sapiens”，對上調或下調的差異 circRNA 進行基因本體（Gene Ontology，GO）分析及京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路分析，得到生物功能富集數據，DAVID 數據庫版本為 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）。GO 是基因分析的常用方法，可以對基因進行注釋和分類。GO 注釋主要分為分子生物學過程、細胞學組分和生物學功能 3 個部分。KEGG 通路也是常見的基因功能富集分析方法。GO 和 KEGG 各項均以 P<0.05 為篩選條件。
1.4 circRNA-miRNA 基因網絡圖構建
分別選取表達上調和下調的 circRNA 中 |logFC| 排序前 5 位的 circRNA，定義為差異表達最顯著的 circRNA，通過位點預測網站 Circular RNA interactome（https://circinteractome.nia.nih.gov/）對這些 circRNA 潛在調控的 miRNA 進行預測，將數據整理后導入 Cytoscape 工具，繪制出 circRNA-miRNA 基因網絡圖，再利用 cytohubba 插件，找出前 10 個能夠與不同差異 circRNA 共同結合的 miRNA。
2 結果
2.1 差異 circRNA 的提取
經 GEO2R 初步分析獲得 175875 個差異 circRNA，隨后經 P<0.05、|logFC|≥1.2 條件篩選，共鑒定出 247 個差異 circRNA，其中包括了 157 個上調基因和 90 個下調基因，上調和下調差異表達倍數前 5 個基因見表1。
表1
差異表達變化最大的基因
2.2 差異 circRNA 的 GO 富集分析和 KEGG 信號通路分析
在生物學過程中，差異 circRNA 主要富集在有絲分裂核分裂、有絲分裂紡錘體裝配檢查點、細胞分裂、有絲分裂細胞質分裂和細胞增殖上（圖1a）；在細胞定位中，差異 circRNA 主要富集在紡錘體、細胞膜、細胞質、細胞微管和紡錘極體上（圖1b）；從分子功能上看，差異 circRNA 主要集中在蛋白結合、微管馬達活動、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結合、Rho 鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶蛋白結合和蛋白激酶 A 結合上（圖1c）。KEGG 信號通路分析結果顯示，差異 circRNA 主要富集于叉頭框蛋白 O（forkhead box O，FoxO）信號通路、p53 信號通路、黃體酮介導卵母細胞成熟、卵母細胞減數分裂和細胞周期等信號通路過程（圖1d）。
圖1
差異 circRNA 的 GO 富集分析和 KEGG 信號通路分析
a. 生物學過程；b. 細胞定位；c. 分子功能；d. KEGG 富集通路。圖中左側文字后括號內數字表示基因數量
2.3 circRNA-miRNA 基因網絡圖建
通過 Circular RNA interactome 預測到差異表達最顯著的 circRNA 潛在調控的 miRNA 共 402 個，其中與目標上調基因結合的 miRNA 共 277 個，與目標下調基因結合的 miRNA 共 125 個，利用 Cytoscape 工具構建出 circRNA-miRNA 基因網絡圖（圖2），通過 cytohubba 功能找到前 10 個與多個差異 circRNA 結合的 miRNA，分別為 hsa-miR-557、hsa-miR-507、hsa-miR-224、hsa-miR-136、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-579、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-1253、hsa-miR-432。
圖2
circRNA-miRNA 網絡圖
紅色三角形表示上調基因，綠色三角箭頭代表下調基因，藍色橢圓表示與之相結合的 miRNA
3 討論
自 1976 年 Sanger 等[10]在 RNA 病毒中發現 circRNA 至今已經 30 多年，隨著科學技術水平的發展和檢測手段的不斷提高，circRNA 在動植物及人體中的作用被不斷探索。諸多研究者發現多種 circRNA 在不同的細胞類型和發育階段中存在特異性表達，這提示 circRNA 很有可能具有重要的基因調控功能[11]。盡管既往研究已發現了很多與 PCOS 發生發展相關的因素，但是當前 PCOS 的發病機制仍不明確[12]。目前許多研究證實了非編碼 RNA 在 PCOS 的發生發展過程中具有重要的調控作用，如 Jiao 等[13]發現健康婦女和 PCOS 患者之間、成熟和不成熟的卵泡液中的長非編碼 RNA 和信使 RNA 譜存在顯著差異；Li 等[14]研究表明，PCOS 顆粒細胞中牛磺酸正調節 1 蛋白表達的增加可能有助于過度的卵泡活化和生長，并可能破壞優勢卵泡的選擇；Wang 等[15]發現Ⅱ類主要組織相容性復合體 DRα 和白細胞介素-10 可能通過金黃色葡萄球菌感染富集的吞噬體促進 PCOS 進程，而 miR-486-5p 可能通過靶向 PRELID2 基因參與 PCOS 的卵泡發育，miR-4651 可能通過調節其靶基因而通過白細胞跨內皮遷移參與炎癥。circRNA 作為非編碼 RNA 的組成部分，其在 PCOS 中也發揮了重要作用。Liu 等[16]通過實驗證明 circ-PSMC3 可通過海綿化 miR-296-3p 調節 PTEN 表達來緩解 PCOS 癥狀；Wang 等[17]通過高通量測序進行表達譜分析，獲得了值得進一步研究的新 circRNA、miRNA 和基因靶標，為 PCOS 發病機制的研究提供了有價值的補充。
本研究通過 GEO 數據庫分析了一個 PCOS 的 circRNA 芯片表達譜 GSE145276，通過 GEO2R 分析并發現了 247 個差異表達 circRNA，包括 157 個上調 circRNA 和 90 個下調 circRNA。因為 circRNA 較其他線性 RNA 分子更穩定，因此這些 circRNA 可以為 PCOS 的診斷與治療提供重要的分子標志物。GO 富集分析結果發現，差異 circRNA 主要富集在細胞分裂、細胞增殖以及紡錘體檢查點，功能主要集中在蛋白質結合和核酸結合上。KEGG 信號通路分析結果顯示差異 circRNA 主要富集于 FoxO 信號通路、p53 信號通路、黃體酮介導卵母細胞成熟、卵母細胞減數分裂和細胞周期等信號通路過程。PCOS 主要表現有卵巢多囊樣改變、稀疏排卵或無排卵，已有相關研究表明這主要與卵母細胞的功能有關[18]，卵母細胞分泌的因子控制早期竇狀卵泡發育，在整個卵泡形成過程中，由各種蛋白質、類固醇、能量代謝物、細胞因子和生長因子建立的不斷變化的卵泡內微環境適當協調卵泡生長和卵母細胞發育，差異 circRNA 作用于細胞生長發育和增殖過程，這有助于解釋 PCOS 的發病機制。p53 信號通路一般被認為與腫瘤密切相關，但也有研究者發現，p53 基因的一個變異與代謝密切相關，這可能會導致肥胖和 2 型糖尿病的發展，甚至與心臟病相關[19]。FoxO 信號通路參與許多細胞生理事件，例如細胞凋亡、細胞周期控制、葡萄糖代謝、抗氧化應激和長壽，當受到生長因子或胰島素的刺激時，FoxO 被磷酸化并失去活性，磷酸化的 FoxO 改變其構象，然后與 14-3-3 蛋白結合，介導 FoxO 從細胞核到細胞質的輸出，并減少 FoxO 靶基因的表達[20]。
circRNA 是一種競爭性的內源性 RNA，其含有共同的 miRNA 應答元件，它的一個重要作用機制是發揮 miRNA 海綿功能，能夠與 miRNA 靶向結合，間接調節 mRNA 的翻譯，調控基因表達，影響疾病的發生發展。miRNA 的有效性受其 miRNA 應答元件細胞濃度的影響，因此，miRNA 的活性與 circRNA 的存在與否密切相關[21]。circRNA 競爭性結合到 miRNA 而導致 miRNA 分子減少，從而使其對 miRNA 靶基因的抑制作用減弱，致使 miRNA 靶基因的表達上調[22]。本研究通過在線軟件分析預測到，與差異最顯著的 10 個 circRNA 結合的 miRNA 有 402 個，并發現存在一個 miRNA 與多個 circRNA 有結合位點的情況，通過 Cytoscape 找出了前 10 個這樣的 miRNA，即 hsa-miR-557、hsa-miR-507、hsa-miR-224、hsa-miR-136、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-579、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-1253、hsa-miR-432。有研究表明，在 PCOS 患者的顆粒細胞（包括卵巢顆粒細胞和卵巢顆粒腫瘤細胞）中，hsa_circ_0118530 大大升高，將 hsa_circ_0118530 siRNA 轉染到卵巢顆粒細胞中，能夠誘導細胞凋亡，抑制細胞遷移，而 miR-136 的抑制作用明顯逆轉了 hsa_circ_0118530 對顆粒細胞進程、氧化應激和炎癥釋放的功能，miR-136 被預測并確認為 hsa_circ_0118530 的靶標，敲除 hsa_circ_0118530 被認為可以抑制海綿狀 miR-136 的 PCOS 進程[23]。Ma 等[24]通過實驗驗證了 hsa_circ_0043533 和 hsa_circ_0097636 在 PCOS 組和對照組中表達差異顯著，在患者卵丘顆粒細胞中分別顯著上調和下調；相關性分析提示，二者的表達與患者睪酮水平呈現正相關，它們在 PCOS 的發生發展中發揮了重要作用。Song 等[25]發現顆粒細胞中 hsa-miR-186 的水平與 PCOS 患者的血清雌二醇水平呈正相關。此外，雌二醇治療直接增加了卵巢顆粒細胞和主要顆粒細胞中 hsa-miR-186 的水平，這為了解 PCOS 的病理生理學提供了新的見識。另外還有多種 miRNA 雖然未在 PCOS 中有相關研究報道，但在婦科腫瘤疾病中研究卻有所涉及，例如 hsa-miR-127-5p 被認為可能參與了子宮內膜腺癌的病程[26]，hsa-miR-579 對卵巢癌的發展有所影響[27]。
綜上，通過本研究及相關文獻資料的檢索不難發現，circRNA 通過多種方式參與到 PCOS 的發生發展過程，hsa_circ_0118530、hsa_circ_0043533 和 hsa_circ_0097636 作為差異表達基因在 PCOS 中發揮的作用值得進一步挖掘。通過預測 circRNA 潛在調控的 miRNA，能夠更清晰地對 circRNA 在 PCOS 中的作用進行相關分析，增加對 PCOS 病理生理過程的進一步了解。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患病率為 5%～10%，是育齡期婦女最常見的內分泌紊亂疾病之一[1]。其通常表現為肥胖、多毛、稀發排卵或無排卵和卵巢多囊樣改變，常與胰島素抵抗、血脂異常和肥胖癥并存，并具有發展心血管疾病、代謝后遺癥（例如糖尿病和代謝綜合征）的重大風險[2]。盡管該病在臨床上非常多見，但其病因和病理生理學過程仍不明確，不斷有證據表明，PCOS 可能是一種復雜的多基因疾病，與強表觀遺傳和環境影響相關[3]。因此，探究該疾病早期的生物學標志物，對改善和治療 PCOS 具有重要的臨床意義。環狀 RNA（circular RNA，circRNA）是一類閉合環狀的 RNA 分子，主要由真核生物信使 RNA 的前體通過可變剪切加工產生，在古細菌和動植物等多種物種中被發現[4]。circRNA 不具有 5’ 端帽子和 3’ 末端 poly（A）尾巴結構，這一結構上的獨特性使其不易被核酸外切酶和分支酶降解[5]，因而有高穩定性、物種間高度保守和組織特異性的特點[6]。目前國內外學者已經發現 circRNA 在腫瘤、心血管疾病、神經系統疾病等多種疾病中均存在差異表達[7]，并有多項研究表明 circRNA 可能在 PCOS 的進程中起著重要作用[8-9]。本研究旨在通過對基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus database，GEO）中的 PCOS 卵丘細胞基因芯片進行生物信息學分析，篩選出差異 circRNA，并預測這些差異 circRNA 的潛在調控 miRNA，為幫助闡明 PCOS 的發病機制和治療藥物的研發提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 數據收集
從美國國立生物技術信息中心的 GEO 數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載基因表達芯片 GSE145296，其所處平臺為 GPL28148 Agilent-084217 CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2。該芯片包含 6 例 PCOS 患者和 6 例健康個體，本研究將對該芯片中健康個體和 PCOS 患者的卵丘細胞中的 circRNA 進行分析。
1.2 差異 circRNA 的數據分析
本研究選用基因表達芯片 GSE145296，用 GEO2R 在線分析軟件進行差異 circRNA 的篩選。GEO2R 是 GEO 數據庫自帶的在線分析工具，基于此工具可以對部分 GEO 樣品數據進行基因差異表達分析。該工具主要針對芯片數據，使用的是基于 R 編程語言的開源軟件項目 Bioconductor 項目中的 GEOquery 和 limma R 包，能夠對原始提交者提供的處理后的數據表進行比較。將原始數據進行分析，以 P<0.05 和 |logFC|≥1.2 作為篩選條件。
1.3 基因富集分析
把篩選的差異 circRNA 的基因導入 DAVID 數據庫（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery）進行在線分析，選用“Homo sapiens”，對上調或下調的差異 circRNA 進行基因本體（Gene Ontology，GO）分析及京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路分析，得到生物功能富集數據，DAVID 數據庫版本為 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）。GO 是基因分析的常用方法，可以對基因進行注釋和分類。GO 注釋主要分為分子生物學過程、細胞學組分和生物學功能 3 個部分。KEGG 通路也是常見的基因功能富集分析方法。GO 和 KEGG 各項均以 P<0.05 為篩選條件。
1.4 circRNA-miRNA 基因網絡圖構建
分別選取表達上調和下調的 circRNA 中 |logFC| 排序前 5 位的 circRNA，定義為差異表達最顯著的 circRNA，通過位點預測網站 Circular RNA interactome（https://circinteractome.nia.nih.gov/）對這些 circRNA 潛在調控的 miRNA 進行預測，將數據整理后導入 Cytoscape 工具，繪制出 circRNA-miRNA 基因網絡圖，再利用 cytohubba 插件，找出前 10 個能夠與不同差異 circRNA 共同結合的 miRNA。
2 結果
2.1 差異 circRNA 的提取
經 GEO2R 初步分析獲得 175875 個差異 circRNA，隨后經 P<0.05、|logFC|≥1.2 條件篩選，共鑒定出 247 個差異 circRNA，其中包括了 157 個上調基因和 90 個下調基因，上調和下調差異表達倍數前 5 個基因見表1。
表1
差異表達變化最大的基因
2.2 差異 circRNA 的 GO 富集分析和 KEGG 信號通路分析
在生物學過程中，差異 circRNA 主要富集在有絲分裂核分裂、有絲分裂紡錘體裝配檢查點、細胞分裂、有絲分裂細胞質分裂和細胞增殖上（圖1a）；在細胞定位中，差異 circRNA 主要富集在紡錘體、細胞膜、細胞質、細胞微管和紡錘極體上（圖1b）；從分子功能上看，差異 circRNA 主要集中在蛋白結合、微管馬達活動、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結合、Rho 鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶蛋白結合和蛋白激酶 A 結合上（圖1c）。KEGG 信號通路分析結果顯示，差異 circRNA 主要富集于叉頭框蛋白 O（forkhead box O，FoxO）信號通路、p53 信號通路、黃體酮介導卵母細胞成熟、卵母細胞減數分裂和細胞周期等信號通路過程（圖1d）。
圖1
差異 circRNA 的 GO 富集分析和 KEGG 信號通路分析
a. 生物學過程；b. 細胞定位；c. 分子功能；d. KEGG 富集通路。圖中左側文字后括號內數字表示基因數量
2.3 circRNA-miRNA 基因網絡圖建
通過 Circular RNA interactome 預測到差異表達最顯著的 circRNA 潛在調控的 miRNA 共 402 個，其中與目標上調基因結合的 miRNA 共 277 個，與目標下調基因結合的 miRNA 共 125 個，利用 Cytoscape 工具構建出 circRNA-miRNA 基因網絡圖（圖2），通過 cytohubba 功能找到前 10 個與多個差異 circRNA 結合的 miRNA，分別為 hsa-miR-557、hsa-miR-507、hsa-miR-224、hsa-miR-136、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-579、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-1253、hsa-miR-432。
圖2
circRNA-miRNA 網絡圖
紅色三角形表示上調基因，綠色三角箭頭代表下調基因，藍色橢圓表示與之相結合的 miRNA
3 討論
自 1976 年 Sanger 等[10]在 RNA 病毒中發現 circRNA 至今已經 30 多年，隨著科學技術水平的發展和檢測手段的不斷提高，circRNA 在動植物及人體中的作用被不斷探索。諸多研究者發現多種 circRNA 在不同的細胞類型和發育階段中存在特異性表達，這提示 circRNA 很有可能具有重要的基因調控功能[11]。盡管既往研究已發現了很多與 PCOS 發生發展相關的因素，但是當前 PCOS 的發病機制仍不明確[12]。目前許多研究證實了非編碼 RNA 在 PCOS 的發生發展過程中具有重要的調控作用，如 Jiao 等[13]發現健康婦女和 PCOS 患者之間、成熟和不成熟的卵泡液中的長非編碼 RNA 和信使 RNA 譜存在顯著差異；Li 等[14]研究表明，PCOS 顆粒細胞中牛磺酸正調節 1 蛋白表達的增加可能有助于過度的卵泡活化和生長，并可能破壞優勢卵泡的選擇；Wang 等[15]發現Ⅱ類主要組織相容性復合體 DRα 和白細胞介素-10 可能通過金黃色葡萄球菌感染富集的吞噬體促進 PCOS 進程，而 miR-486-5p 可能通過靶向 PRELID2 基因參與 PCOS 的卵泡發育，miR-4651 可能通過調節其靶基因而通過白細胞跨內皮遷移參與炎癥。circRNA 作為非編碼 RNA 的組成部分，其在 PCOS 中也發揮了重要作用。Liu 等[16]通過實驗證明 circ-PSMC3 可通過海綿化 miR-296-3p 調節 PTEN 表達來緩解 PCOS 癥狀；Wang 等[17]通過高通量測序進行表達譜分析，獲得了值得進一步研究的新 circRNA、miRNA 和基因靶標，為 PCOS 發病機制的研究提供了有價值的補充。
本研究通過 GEO 數據庫分析了一個 PCOS 的 circRNA 芯片表達譜 GSE145276，通過 GEO2R 分析并發現了 247 個差異表達 circRNA，包括 157 個上調 circRNA 和 90 個下調 circRNA。因為 circRNA 較其他線性 RNA 分子更穩定，因此這些 circRNA 可以為 PCOS 的診斷與治療提供重要的分子標志物。GO 富集分析結果發現，差異 circRNA 主要富集在細胞分裂、細胞增殖以及紡錘體檢查點，功能主要集中在蛋白質結合和核酸結合上。KEGG 信號通路分析結果顯示差異 circRNA 主要富集于 FoxO 信號通路、p53 信號通路、黃體酮介導卵母細胞成熟、卵母細胞減數分裂和細胞周期等信號通路過程。PCOS 主要表現有卵巢多囊樣改變、稀疏排卵或無排卵，已有相關研究表明這主要與卵母細胞的功能有關[18]，卵母細胞分泌的因子控制早期竇狀卵泡發育，在整個卵泡形成過程中，由各種蛋白質、類固醇、能量代謝物、細胞因子和生長因子建立的不斷變化的卵泡內微環境適當協調卵泡生長和卵母細胞發育，差異 circRNA 作用于細胞生長發育和增殖過程，這有助于解釋 PCOS 的發病機制。p53 信號通路一般被認為與腫瘤密切相關，但也有研究者發現，p53 基因的一個變異與代謝密切相關，這可能會導致肥胖和 2 型糖尿病的發展，甚至與心臟病相關[19]。FoxO 信號通路參與許多細胞生理事件，例如細胞凋亡、細胞周期控制、葡萄糖代謝、抗氧化應激和長壽，當受到生長因子或胰島素的刺激時，FoxO 被磷酸化并失去活性，磷酸化的 FoxO 改變其構象，然后與 14-3-3 蛋白結合，介導 FoxO 從細胞核到細胞質的輸出，并減少 FoxO 靶基因的表達[20]。
circRNA 是一種競爭性的內源性 RNA，其含有共同的 miRNA 應答元件，它的一個重要作用機制是發揮 miRNA 海綿功能，能夠與 miRNA 靶向結合，間接調節 mRNA 的翻譯，調控基因表達，影響疾病的發生發展。miRNA 的有效性受其 miRNA 應答元件細胞濃度的影響，因此，miRNA 的活性與 circRNA 的存在與否密切相關[21]。circRNA 競爭性結合到 miRNA 而導致 miRNA 分子減少，從而使其對 miRNA 靶基因的抑制作用減弱，致使 miRNA 靶基因的表達上調[22]。本研究通過在線軟件分析預測到，與差異最顯著的 10 個 circRNA 結合的 miRNA 有 402 個，并發現存在一個 miRNA 與多個 circRNA 有結合位點的情況，通過 Cytoscape 找出了前 10 個這樣的 miRNA，即 hsa-miR-557、hsa-miR-507、hsa-miR-224、hsa-miR-136、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-579、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-1253、hsa-miR-432。有研究表明，在 PCOS 患者的顆粒細胞（包括卵巢顆粒細胞和卵巢顆粒腫瘤細胞）中，hsa_circ_0118530 大大升高，將 hsa_circ_0118530 siRNA 轉染到卵巢顆粒細胞中，能夠誘導細胞凋亡，抑制細胞遷移，而 miR-136 的抑制作用明顯逆轉了 hsa_circ_0118530 對顆粒細胞進程、氧化應激和炎癥釋放的功能，miR-136 被預測并確認為 hsa_circ_0118530 的靶標，敲除 hsa_circ_0118530 被認為可以抑制海綿狀 miR-136 的 PCOS 進程[23]。Ma 等[24]通過實驗驗證了 hsa_circ_0043533 和 hsa_circ_0097636 在 PCOS 組和對照組中表達差異顯著，在患者卵丘顆粒細胞中分別顯著上調和下調；相關性分析提示，二者的表達與患者睪酮水平呈現正相關，它們在 PCOS 的發生發展中發揮了重要作用。Song 等[25]發現顆粒細胞中 hsa-miR-186 的水平與 PCOS 患者的血清雌二醇水平呈正相關。此外，雌二醇治療直接增加了卵巢顆粒細胞和主要顆粒細胞中 hsa-miR-186 的水平，這為了解 PCOS 的病理生理學提供了新的見識。另外還有多種 miRNA 雖然未在 PCOS 中有相關研究報道，但在婦科腫瘤疾病中研究卻有所涉及，例如 hsa-miR-127-5p 被認為可能參與了子宮內膜腺癌的病程[26]，hsa-miR-579 對卵巢癌的發展有所影響[27]。
綜上，通過本研究及相關文獻資料的檢索不難發現，circRNA 通過多種方式參與到 PCOS 的發生發展過程，hsa_circ_0118530、hsa_circ_0043533 和 hsa_circ_0097636 作為差異表達基因在 PCOS 中發揮的作用值得進一步挖掘。通過預測 circRNA 潛在調控的 miRNA，能夠更清晰地對 circRNA 在 PCOS 中的作用進行相關分析，增加對 PCOS 病理生理過程的進一步了解。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
