電壓門控氯離子通道 7（chloride voltage-gated channel 7，CLCN7）基因突變可使陷窩內酸化不能，造成骨溶解障礙，從而導致以全身骨密度增高為特征的骨硬化癥及溶酶體儲積疾病等。而硬化骨壓迫損傷神經、中耳負壓及耳硬化等均可導致耳聾。該文將介紹 CLCN7 基因及 CLCN7 蛋白結構功能、骨溶解過程（包括破骨細胞簡介和骨溶解機制）、骨硬化癥、CLCN7 基因突變致骨硬化癥的機制及其治療以及骨硬化癥與綜合征性耳聾，以期為臨床診斷及治療提供依據。
引用本文： 劉夢瀟, 龐秀紅. 電壓門控氯離子通道 7 基因致綜合征性耳聾相關骨硬化癥機制的研究進展. 華西醫學, 2021, 36(4): 529-534. doi: 10.7507/1002-0179.202007228 復制
耳聾是最常見的感覺障礙，據統計，全球共有 7 千萬人正遭受著耳聾帶來的困難和影響，其中遺傳性耳聾占 50%～60%[1]。根據是否合并其他系統異常，耳聾可分為綜合征性耳聾和非綜合征性耳聾。目前，已知合并耳聾的綜合征共有 600 多種[2]。骨硬化癥是一組以綜合征性耳聾、骨密度增高、肝脾腫大、全血細胞減少和智力低下等為特征的異質性疾病，根據臨床表型和遺傳方式，分為 3 種亞型：常染色體隱性遺傳骨硬化癥（autosomal recessive osteopetrosis，ARO）、常染色體顯性遺傳骨硬化癥（autosomal dominant osteopetrosis，ADO）和中間型 ARO[3]。據報道，骨硬化癥相關致病基因達 12 種，電壓門控氯離子通道 7（chloride voltage-gated channel 7，CLCN7）基因是其常見的遺傳性致病基因[4]。該基因在骨溶解過程中發揮酸化破骨細胞及溶酶體腔隙并維持電中性的重要作用。本文將介紹 CLCN7 基因及 CLCN7 蛋白結構功能、骨溶解過程、骨硬化癥、CLCN7 基因突變致骨硬化癥的機制及其治療以及骨硬化癥與綜合征性耳聾，以期為臨床診斷及治療提供依據。
1 CLCN7 基因與 CLCN7 蛋白
CLCN7 基因位于 16 號染色體短臂 13 區 3 帶，長度為 26 Kb，內含 26 個外顯子，編碼由 805 個氨基酸組成的氯離子/氫離子膜轉運蛋白 CLCN7[5-6]，人類與小鼠具有相同的 CLCN7 基因結構[7]。CLCN7 廣泛表達于體內多個組織器官，如脾臟、腎及骨髓等，大多存在于溶酶體及破骨細胞皺褶膜中[8-10]。
CLCN7 蛋白屬于氯離子通道家族，是由 2 個亞單位組成的同二聚體；每個亞單位包含 18 個膜內 α 螺旋、4 個高度保守的氯離子結合位點和 2 個位于拓撲結構域羧基端附近的胱硫醚 β 合成酶結構域[11-12]；每個亞單位都包含有獨立的離子滲透途徑，該途徑在很大程度上獨立于其他亞基[13]。CLCN7 蛋白作為慢電壓門控的氯離子/氫離子通道轉運蛋白，為液泡質子 ATP 酶有效質子泵提供所需的氯離子[8]，起到保持電中性的作用，使質子被泵入溶酶體及破骨細胞等腔隙中[10]。任何 1 個亞單位的失活都會導致小鼠或人類的溶酶體儲存疾病及骨硬化癥[8, 10, 14]。
2 骨溶解過程
2.1 破骨細胞簡介
破骨細胞起源于造血干細胞[15]，經過一系列步驟最終成為功能性破骨細胞，包括分化為單核/巨噬細胞系、前破骨細胞增殖、破骨細胞生成，以及細胞極化[16-17]。破骨細胞是體內負責骨基質吸收的主要細胞，保證骨骼持續更新及正常功能[16, 18]。破骨細胞通過足狀突與骨表面之間建立 1 個緊密接觸的圈，即“封閉區”（也叫吸收陷窩），它是骨細胞的吸收場所[19-20]。封閉區內的破骨細胞表面被卷曲，形成破骨細胞形態上最顯著的特征之一?皺褶邊緣。當這層皺褶通過整合素 avβ3 受體與骨接觸時，骨骼基質就會降解[21-22]。CLCN7 通道蛋白、液泡質子 ATP 酶及組織蛋白酶 K 可以通過晚期內質體-溶酶體膜的胞吐作用而插入到這個特殊的質膜結構域中[7]。破骨細胞的成熟分化與功能受到多種細胞因子的調節，如巨噬細胞集落刺激因子和核轉錄因子-κB 配體受體激活劑可促進破骨細胞分化[16-17, 23]；轉化生長因子 β1 可誘導破骨細胞凋亡[24]；CLCN7 蛋白的 α3 亞單位骨硬化相關跨膜蛋白 1 對酸化吸收陷窩的能力至關重要[25]等。
2.2 骨溶解機制
骨骼長期處于動態平衡中，它通過骨溶解的緊密耦合來吸收舊骨，然后形成新的骨骼[26]。骨溶解對維持骨內環境穩態、適應功能負荷、修復損傷和骨折愈合非常重要。骨溶解的過程受破骨細胞數量的調節，并極大依賴于單個破骨細胞皺褶邊緣分泌氫離子的能力[27]。骨骼分為有機質及無機質，有機質主要由Ⅰ型膠原組成，約占骨中蛋白質的 90%，除Ⅰ型膠原外，骨中還存在許多非膠原蛋白，包括骨橋蛋白、骨鈣素和骨粘連蛋白等[28]。骨骼的無機質提供了支撐作用所需的硬度和承重力，其中鈣和磷酸鹽離子以羥基磷灰石的形式存在，形成極細小的晶體，這些晶體很容易溶解，可提供離子進行骨骼的代謝[29]。
骨溶解過程由破骨細胞胞漿中碳酸酐酶Ⅱ啟動，碳酸酐酶Ⅱ催化二氧化碳和水轉化為碳酸，進而電離成氫離子以及碳酸氫根離子[30]，位于基底外側的陰離子交換體 2 將碳酸氫根離子交換成氯離子[31]。氫離子通過液泡質子 ATP 酶被釋放到吸收陷窩中[32]，為了維持腔隙的電中性，CLCN7 蛋白的每一次轉換只去除 1 個氫離子，同時引入 2 個氯離子，反轉運體降低了膜電位，并有助于通過液泡質子 ATP 酶繼續泵送質子。有研究表明，氯離子通道 7 的一次轉換將允許液泡質子 ATP 酶隨后泵入 3 個以上的氫離子，而不會對膜電位產生凈變化；因此，整個循環將產生 2 個氫離子的凈積累[33]。當吸收陷窩中的 pH 值低于 4.5 時，羥基磷灰石溶解為鈣、磷和水[19]，同時，破骨細胞分泌酸性膠原酶、組織蛋白酶 K 和酸性環境中有活性的磷酸酶（抗酒石酸酸性磷酸酶），降解Ⅰ型膠原蛋白為主的有機質[31, 34]。除此之外，一些信號分子，包含骨形態發生蛋白、轉化生長因子 β1、成纖維細胞因子、Hedgehog 和 Wnt，參與了顱面骨及牙齒的調控[35]。溶酶體作為終末消化場所，含有大量水解酶，大分子可通過胞吐的方式進入并被降解[36]。而溶酶體的有效功能依賴于其酸性的維持[20, 37]。
3 骨硬化癥
骨硬化癥是一種罕見的異質性遺傳性骨病，其發病機制為破骨細胞功能降低，導致骨量增加和骨脆性增高[3, 7, 38]。根據遺傳方式、嚴重程度和臨床表現，骨硬化癥分為 3 種亞型：ARO、ADO 和中間型 ARO[39]。已知有 12 種基因可導致人類骨硬化癥，其中 8 個參與破骨細胞的效應功能（包括 CLCN7），4 個參與破骨細胞的分化和形成[8-9, 39-44]。
ADO 臨床癥狀較輕，為良性骨硬化癥，患者一般沒有全身性癥狀。按照致病基因和臨床表現不同，可進一步分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。ADO-Ⅰ型即輕度彌漫性骨硬化，以顱骨為著，可僅有骨密度增高的全身表現。ADO-Ⅱ型也被稱為 Albers-Schonberg 病，是骨硬化癥中最常見的類型，一般發生在兒童晚期或成人期，多為骨骼癥狀，如骨痛、病理性骨折、關節退行性病變、骨髓抑制以及骨髓炎等骨科疾病，近 5% 的患者可出現顱神經壓迫癥狀，如耳聾、失明等[38, 45-47]。影像學檢查呈現特征性改變?“夾心椎骨”、四肢長骨干骺端呈“三明治樣”、髂骨表現出“骨中骨”等[48-49]。ADO-Ⅲ型為“離心性”骨硬化癥，大多發生于遠心端，如四肢、顱底等[50]。而 ARO 是骨硬化癥中最嚴重的類型，故又被稱為惡性骨硬化癥[42, 51]。ARO 患者表現為骨髓質硬化、無效造血增多、貧血及肝脾代償性肥大，而 ARO 患兒表現為身材矮小、粒細胞及血小板減少，通常在 3 歲以內因嚴重感染、出血等并發癥死亡[26, 52-54]。據估計，78% 的 ARO 患者存在聽力損失[6]。另外，ARO 還有一種亞型即碳酸酐酶Ⅱ缺乏綜合征，表現為骨硬化合并腎小管酸中毒[55-56]，患者常存在發育遲緩，多伴有顱內硬化，但骨髓損害較為罕見[57]。而中間型 ARO 與 ARO 相比，前者的惡性程度較低，通常兒童期起病，病情溫和，壽命多與正常人無異[55]。既往文獻報道過的中間型 ARO 表型涉及多個系統，如造血系統中出現骨髓增生性貧血、全血細胞減少及肝脾腫大；骨骼系統中易發生輕微外力下的骨折、骨痛、髖內翻、關節炎及下頜骨和長骨骨髓炎、牙齒發育不全、上顎高拱及巨顱等；繼發性的神經系統異常，如失明、面癱、輕癱、智力發育不全、腦積水及抽搐等；泌尿系統可出現腎小管性酸中毒等[39, 54, 58-61]。
4 CLCN7 基因突變致骨硬化癥的機制及其治療
據文獻報道，人類中 CLCN7 基因突變可表現為骨硬化癥中的各個亞型，從 ARO，到中間型 ARO，甚至到 ADO，也包括一些無癥狀患者[62]。目前，已有 200 多個突變被報道，包括錯義、無義、小缺失/插入、剪接位點突變、大基因組缺失和內含子突變[12, 62]。CLCN7 基因突變致骨硬化癥的具體機制目前尚不明確。Kornak 等[8]認為 CLCN7 基因是單倍型的，其雙等位基因功能缺失突變導致嚴重 ARO。而在 ADO-Ⅱ型中，CLCN7 基因大多含有顯性陰性特征的錯義突變，其突變亞基雖然功能受損，但仍然可以形成二聚體[6, 26]。Zhang 等[63]敲除斑馬魚的 CLCN7 基因，發現溶酶體儲存以及組織蛋白酶 K 水平下調，進一步改變了轉化生長因子-β/骨形態發生蛋白信號通路的平衡，導致破骨細胞功能和生長發育異常，表明骨硬化癥中顱面骨和牙齒畸形與氯離子通道 7/組織蛋白酶 K/轉化生長因子-β/骨形態發生蛋白/Smad 的機制鏈有關。CLCN7 基因突變導致的骨硬化癥中，破骨細胞大多為非功能性細胞[64]，形態上呈現出不規則梭形或衛星形，無明顯突起和皺褶[15, 65]；另外，這些破骨細胞內存在溶酶體小泡聚集，其酸化能力顯著降低，降解礦物質和有機骨基質的能力降低[21]。Chen 等[15]在骨硬化癥患者及動物模型中發現，介導細胞/基質識別的整合素 avβ3 異常分布和表達，導致吸收陷窩窄而淺，影響骨溶解過程。有趣的是，Kajiya 等[21]發現 ADO 患者的吸收陷窩面積減少，但單個面積相同，這意味著一部分破骨細胞仍然能夠溶解吸收骨。Perdu 等[40]在大鼠模型中發現破骨細胞數量顯著減少，表面呈泡沫狀，可形成皺褶的邊界和清晰的區域，但它們的骨再吸收能力卻大大受損。Sartelet 等[66]首次發現某些 CLCN7 突變加速了氯離子通道轉運蛋白的電壓門控，從而改變了細胞胱硫醚 β 合成酶結構域和跨膜部分之間的氨基酸殘基，使空間結構改變。Leisle 等[6]認為該機制可導致顯性遺傳方式的骨硬化癥，并且一些加速突變也可能降低蛋白質的穩定性。Supanchart 等[67]的模型表明 CLCN7 功能降低約 70% 可增加骨量，但不一定增強骨形成；降低到正常水平的 20%～30% 之間會顯著損害破骨細胞功能。而吸收陷窩酸化至 pH 值低于 4.5 時，激活外向氯離子電流，CLCN7 基因突變使氯離子通道活性（即電流幅度）降低，破骨細胞溶解吸收活性減低，導致骨量增加，骨脆性增高，即骨硬化癥的發生[68-69]。有研究者認為不同程度的氯離子通道功能是導致表型變異的原因，從 ARO 功能完全喪失到中間型 ARO 部分喪失不等[5, 12]。還有研究者通過定位研究發現CLCN7突變時可導致氯離子通道蛋白運輸缺陷，將其保留在內質網中，抑制向下游目標細胞器溶酶體的運輸，由于 CLCN7 蛋白在內質網中積累，不能轉運到溶酶體，使其酸化受阻[46]。而另一些研究者認為缺乏 CLCN7 的細胞溶酶體 pH 值仍能保持正常，但溶酶體中的氯離子水平較低，組織蛋白酶 K 的活性依賴于溶酶體內氯離子濃度[10, 70]。即使在酸化正常的情況下，CLCN7 突變也可導致溶酶體功能受損，蛋白水解障礙，造成溶酶體貯存病[71]。
氯離子轉運通道抑制物 NS3736 先前已被發現可抑制溶酶體酸化[34]。而強效雙膦酸鹽可充分抑制破骨細胞，導致獲得性骨硬化癥[72]。Ohgi 等[68]發現多克隆抗體可特異性地抑制破骨細胞中酸激活的 CLCN7 氯離子電導并阻止骨溶解過程。故針對 CLCN7 的抗體治療是一種新的直接抑制破骨細胞骨溶解的治療方法。雖然骨硬化癥的治療方法較多，但最根本的是造血干細胞移植，其可糾正血液學異常和阻止由進行性顱孔狹窄引起的顱神經缺損[73-74]。小干擾 RNA 及間充質干細胞理論上也可作為治療骨硬化癥的方法，但尚未應用于臨床[26, 46, 75]。
5 骨硬化癥與綜合征性耳聾
合并有其他臨床癥狀的耳聾被稱為綜合征性耳聾，目前已發現 600 多種，占遺傳性耳聾的 30%[2]。骨硬化癥即為其中之一，但耳聾通常不作為骨硬化癥的主要早期表現特征[76]。骨硬化癥導致耳聾有多種病因，最常見的是骨過度生長致骨孔狹窄使顱神經壓迫，從而引起神經損傷[26]。影像學研究顯示，ADO-Ⅰ型患者的外聽道寬度較 ADO-Ⅱ型患者明顯減小，更容易發生傳導性耳聾，而在 ARO 中，顳骨 CT 常顯示乳突氣化不良[77]。顱神經和脊神經的受累壓迫以及外聽道變窄，是導致傳導性耳聾的主要原因，此外，中耳腔容積的縮小，進一步壓迫咽鼓管，使中耳引流不良，造成 ARO 和中間型 ARO 患者中耳積液，也可導致耳鳴及聽力下降。感音神經性耳聾的發生由侵犯內耳道引起，內聽道和面神經管均因硬化骨而逐漸變窄，故更容易發生于 ADO-Ⅱ型[77]。需要特別指出的是，當硬化累及顳骨，骨迷路發生局灶性病變，出現血管豐富的海綿狀骨質增生時，也可能導致耳硬化癥[78]。
而在病理學上，顳骨獨特地具有內生軟骨層軟骨殘體的終身持久性，該骨形成了骨迷路骨壁的中間層，位于骨內膜層和骨外膜層之間[79]。這個中間層在胎兒中期部分鈣化，但很快被骨替代，軟骨內骨化在耳膜周圍進行，最后發生在前窗區；因此，這個部位最容易含有持續的纖維軟骨[80]。在耳硬化癥中，有一個海綿化階段，內生軟骨層的正常骨吸收，形成疏松的海綿骨，周圍充滿破骨細胞、成骨細胞及纖維組織；隨后，不成熟的網狀骨沉積，體積增大，后者轉化為排列不規則的板層骨，骨質變硬，成為硬化灶[80]。耳硬化癥最常見的受累區域是前窗裂，它是胚胎軟骨和結締組織的胚胎學殘余[81]。耳硬化癥也可能累及骨迷路包囊的其他部分，如耳蝸內、蝸窗、半規管等，根據具體受累區域的不同，患者可能會出現傳導性、感音神經性或混合性聽力損失，或顱神經壓迫引起的神經病變，這可能是骨硬化癥引起綜合征性耳聾的原因之一[82]。
6 小結
CLCN7 是人體內發揮重要功能的一類氯離子通道蛋白的編碼基因，若該基因發生突變可使破骨細胞及溶酶體功能障礙，從而導致骨硬化癥及溶酶體儲積病。酸分泌減少、有機基質溶解欠佳、運輸缺陷和破骨細胞黏附結構受損都可導致骨溶解過程障礙，但 CLCN7 基因致骨硬化癥的機制尚不明確。另外，目前對于骨硬化癥伴發耳聾的機制及治療研究較少，研究者或可先構建動物模型，以確定骨硬化癥對骨傳導的影響。相信隨著分子生物學的不斷發展，未來對骨硬化癥的致病機制的探索值得期待。
耳聾是最常見的感覺障礙，據統計，全球共有 7 千萬人正遭受著耳聾帶來的困難和影響，其中遺傳性耳聾占 50%～60%[1]。根據是否合并其他系統異常，耳聾可分為綜合征性耳聾和非綜合征性耳聾。目前，已知合并耳聾的綜合征共有 600 多種[2]。骨硬化癥是一組以綜合征性耳聾、骨密度增高、肝脾腫大、全血細胞減少和智力低下等為特征的異質性疾病，根據臨床表型和遺傳方式，分為 3 種亞型：常染色體隱性遺傳骨硬化癥（autosomal recessive osteopetrosis，ARO）、常染色體顯性遺傳骨硬化癥（autosomal dominant osteopetrosis，ADO）和中間型 ARO[3]。據報道，骨硬化癥相關致病基因達 12 種，電壓門控氯離子通道 7（chloride voltage-gated channel 7，CLCN7）基因是其常見的遺傳性致病基因[4]。該基因在骨溶解過程中發揮酸化破骨細胞及溶酶體腔隙并維持電中性的重要作用。本文將介紹 CLCN7 基因及 CLCN7 蛋白結構功能、骨溶解過程、骨硬化癥、CLCN7 基因突變致骨硬化癥的機制及其治療以及骨硬化癥與綜合征性耳聾，以期為臨床診斷及治療提供依據。
1 CLCN7 基因與 CLCN7 蛋白
CLCN7 基因位于 16 號染色體短臂 13 區 3 帶，長度為 26 Kb，內含 26 個外顯子，編碼由 805 個氨基酸組成的氯離子/氫離子膜轉運蛋白 CLCN7[5-6]，人類與小鼠具有相同的 CLCN7 基因結構[7]。CLCN7 廣泛表達于體內多個組織器官，如脾臟、腎及骨髓等，大多存在于溶酶體及破骨細胞皺褶膜中[8-10]。
CLCN7 蛋白屬于氯離子通道家族，是由 2 個亞單位組成的同二聚體；每個亞單位包含 18 個膜內 α 螺旋、4 個高度保守的氯離子結合位點和 2 個位于拓撲結構域羧基端附近的胱硫醚 β 合成酶結構域[11-12]；每個亞單位都包含有獨立的離子滲透途徑，該途徑在很大程度上獨立于其他亞基[13]。CLCN7 蛋白作為慢電壓門控的氯離子/氫離子通道轉運蛋白，為液泡質子 ATP 酶有效質子泵提供所需的氯離子[8]，起到保持電中性的作用，使質子被泵入溶酶體及破骨細胞等腔隙中[10]。任何 1 個亞單位的失活都會導致小鼠或人類的溶酶體儲存疾病及骨硬化癥[8, 10, 14]。
2 骨溶解過程
2.1 破骨細胞簡介
破骨細胞起源于造血干細胞[15]，經過一系列步驟最終成為功能性破骨細胞，包括分化為單核/巨噬細胞系、前破骨細胞增殖、破骨細胞生成，以及細胞極化[16-17]。破骨細胞是體內負責骨基質吸收的主要細胞，保證骨骼持續更新及正常功能[16, 18]。破骨細胞通過足狀突與骨表面之間建立 1 個緊密接觸的圈，即“封閉區”（也叫吸收陷窩），它是骨細胞的吸收場所[19-20]。封閉區內的破骨細胞表面被卷曲，形成破骨細胞形態上最顯著的特征之一?皺褶邊緣。當這層皺褶通過整合素 avβ3 受體與骨接觸時，骨骼基質就會降解[21-22]。CLCN7 通道蛋白、液泡質子 ATP 酶及組織蛋白酶 K 可以通過晚期內質體-溶酶體膜的胞吐作用而插入到這個特殊的質膜結構域中[7]。破骨細胞的成熟分化與功能受到多種細胞因子的調節，如巨噬細胞集落刺激因子和核轉錄因子-κB 配體受體激活劑可促進破骨細胞分化[16-17, 23]；轉化生長因子 β1 可誘導破骨細胞凋亡[24]；CLCN7 蛋白的 α3 亞單位骨硬化相關跨膜蛋白 1 對酸化吸收陷窩的能力至關重要[25]等。
2.2 骨溶解機制
骨骼長期處于動態平衡中，它通過骨溶解的緊密耦合來吸收舊骨，然后形成新的骨骼[26]。骨溶解對維持骨內環境穩態、適應功能負荷、修復損傷和骨折愈合非常重要。骨溶解的過程受破骨細胞數量的調節，并極大依賴于單個破骨細胞皺褶邊緣分泌氫離子的能力[27]。骨骼分為有機質及無機質，有機質主要由Ⅰ型膠原組成，約占骨中蛋白質的 90%，除Ⅰ型膠原外，骨中還存在許多非膠原蛋白，包括骨橋蛋白、骨鈣素和骨粘連蛋白等[28]。骨骼的無機質提供了支撐作用所需的硬度和承重力，其中鈣和磷酸鹽離子以羥基磷灰石的形式存在，形成極細小的晶體，這些晶體很容易溶解，可提供離子進行骨骼的代謝[29]。
骨溶解過程由破骨細胞胞漿中碳酸酐酶Ⅱ啟動，碳酸酐酶Ⅱ催化二氧化碳和水轉化為碳酸，進而電離成氫離子以及碳酸氫根離子[30]，位于基底外側的陰離子交換體 2 將碳酸氫根離子交換成氯離子[31]。氫離子通過液泡質子 ATP 酶被釋放到吸收陷窩中[32]，為了維持腔隙的電中性，CLCN7 蛋白的每一次轉換只去除 1 個氫離子，同時引入 2 個氯離子，反轉運體降低了膜電位，并有助于通過液泡質子 ATP 酶繼續泵送質子。有研究表明，氯離子通道 7 的一次轉換將允許液泡質子 ATP 酶隨后泵入 3 個以上的氫離子，而不會對膜電位產生凈變化；因此，整個循環將產生 2 個氫離子的凈積累[33]。當吸收陷窩中的 pH 值低于 4.5 時，羥基磷灰石溶解為鈣、磷和水[19]，同時，破骨細胞分泌酸性膠原酶、組織蛋白酶 K 和酸性環境中有活性的磷酸酶（抗酒石酸酸性磷酸酶），降解Ⅰ型膠原蛋白為主的有機質[31, 34]。除此之外，一些信號分子，包含骨形態發生蛋白、轉化生長因子 β1、成纖維細胞因子、Hedgehog 和 Wnt，參與了顱面骨及牙齒的調控[35]。溶酶體作為終末消化場所，含有大量水解酶，大分子可通過胞吐的方式進入并被降解[36]。而溶酶體的有效功能依賴于其酸性的維持[20, 37]。
3 骨硬化癥
骨硬化癥是一種罕見的異質性遺傳性骨病，其發病機制為破骨細胞功能降低，導致骨量增加和骨脆性增高[3, 7, 38]。根據遺傳方式、嚴重程度和臨床表現，骨硬化癥分為 3 種亞型：ARO、ADO 和中間型 ARO[39]。已知有 12 種基因可導致人類骨硬化癥，其中 8 個參與破骨細胞的效應功能（包括 CLCN7），4 個參與破骨細胞的分化和形成[8-9, 39-44]。
ADO 臨床癥狀較輕，為良性骨硬化癥，患者一般沒有全身性癥狀。按照致病基因和臨床表現不同，可進一步分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。ADO-Ⅰ型即輕度彌漫性骨硬化，以顱骨為著，可僅有骨密度增高的全身表現。ADO-Ⅱ型也被稱為 Albers-Schonberg 病，是骨硬化癥中最常見的類型，一般發生在兒童晚期或成人期，多為骨骼癥狀，如骨痛、病理性骨折、關節退行性病變、骨髓抑制以及骨髓炎等骨科疾病，近 5% 的患者可出現顱神經壓迫癥狀，如耳聾、失明等[38, 45-47]。影像學檢查呈現特征性改變?“夾心椎骨”、四肢長骨干骺端呈“三明治樣”、髂骨表現出“骨中骨”等[48-49]。ADO-Ⅲ型為“離心性”骨硬化癥，大多發生于遠心端，如四肢、顱底等[50]。而 ARO 是骨硬化癥中最嚴重的類型，故又被稱為惡性骨硬化癥[42, 51]。ARO 患者表現為骨髓質硬化、無效造血增多、貧血及肝脾代償性肥大，而 ARO 患兒表現為身材矮小、粒細胞及血小板減少，通常在 3 歲以內因嚴重感染、出血等并發癥死亡[26, 52-54]。據估計，78% 的 ARO 患者存在聽力損失[6]。另外，ARO 還有一種亞型即碳酸酐酶Ⅱ缺乏綜合征，表現為骨硬化合并腎小管酸中毒[55-56]，患者常存在發育遲緩，多伴有顱內硬化，但骨髓損害較為罕見[57]。而中間型 ARO 與 ARO 相比，前者的惡性程度較低，通常兒童期起病，病情溫和，壽命多與正常人無異[55]。既往文獻報道過的中間型 ARO 表型涉及多個系統，如造血系統中出現骨髓增生性貧血、全血細胞減少及肝脾腫大；骨骼系統中易發生輕微外力下的骨折、骨痛、髖內翻、關節炎及下頜骨和長骨骨髓炎、牙齒發育不全、上顎高拱及巨顱等；繼發性的神經系統異常，如失明、面癱、輕癱、智力發育不全、腦積水及抽搐等；泌尿系統可出現腎小管性酸中毒等[39, 54, 58-61]。
4 CLCN7 基因突變致骨硬化癥的機制及其治療
據文獻報道，人類中 CLCN7 基因突變可表現為骨硬化癥中的各個亞型，從 ARO，到中間型 ARO，甚至到 ADO，也包括一些無癥狀患者[62]。目前，已有 200 多個突變被報道，包括錯義、無義、小缺失/插入、剪接位點突變、大基因組缺失和內含子突變[12, 62]。CLCN7 基因突變致骨硬化癥的具體機制目前尚不明確。Kornak 等[8]認為 CLCN7 基因是單倍型的，其雙等位基因功能缺失突變導致嚴重 ARO。而在 ADO-Ⅱ型中，CLCN7 基因大多含有顯性陰性特征的錯義突變，其突變亞基雖然功能受損，但仍然可以形成二聚體[6, 26]。Zhang 等[63]敲除斑馬魚的 CLCN7 基因，發現溶酶體儲存以及組織蛋白酶 K 水平下調，進一步改變了轉化生長因子-β/骨形態發生蛋白信號通路的平衡，導致破骨細胞功能和生長發育異常，表明骨硬化癥中顱面骨和牙齒畸形與氯離子通道 7/組織蛋白酶 K/轉化生長因子-β/骨形態發生蛋白/Smad 的機制鏈有關。CLCN7 基因突變導致的骨硬化癥中，破骨細胞大多為非功能性細胞[64]，形態上呈現出不規則梭形或衛星形，無明顯突起和皺褶[15, 65]；另外，這些破骨細胞內存在溶酶體小泡聚集，其酸化能力顯著降低，降解礦物質和有機骨基質的能力降低[21]。Chen 等[15]在骨硬化癥患者及動物模型中發現，介導細胞/基質識別的整合素 avβ3 異常分布和表達，導致吸收陷窩窄而淺，影響骨溶解過程。有趣的是，Kajiya 等[21]發現 ADO 患者的吸收陷窩面積減少，但單個面積相同，這意味著一部分破骨細胞仍然能夠溶解吸收骨。Perdu 等[40]在大鼠模型中發現破骨細胞數量顯著減少，表面呈泡沫狀，可形成皺褶的邊界和清晰的區域，但它們的骨再吸收能力卻大大受損。Sartelet 等[66]首次發現某些 CLCN7 突變加速了氯離子通道轉運蛋白的電壓門控，從而改變了細胞胱硫醚 β 合成酶結構域和跨膜部分之間的氨基酸殘基，使空間結構改變。Leisle 等[6]認為該機制可導致顯性遺傳方式的骨硬化癥，并且一些加速突變也可能降低蛋白質的穩定性。Supanchart 等[67]的模型表明 CLCN7 功能降低約 70% 可增加骨量，但不一定增強骨形成；降低到正常水平的 20%～30% 之間會顯著損害破骨細胞功能。而吸收陷窩酸化至 pH 值低于 4.5 時，激活外向氯離子電流，CLCN7 基因突變使氯離子通道活性（即電流幅度）降低，破骨細胞溶解吸收活性減低，導致骨量增加，骨脆性增高，即骨硬化癥的發生[68-69]。有研究者認為不同程度的氯離子通道功能是導致表型變異的原因，從 ARO 功能完全喪失到中間型 ARO 部分喪失不等[5, 12]。還有研究者通過定位研究發現CLCN7突變時可導致氯離子通道蛋白運輸缺陷，將其保留在內質網中，抑制向下游目標細胞器溶酶體的運輸，由于 CLCN7 蛋白在內質網中積累，不能轉運到溶酶體，使其酸化受阻[46]。而另一些研究者認為缺乏 CLCN7 的細胞溶酶體 pH 值仍能保持正常，但溶酶體中的氯離子水平較低，組織蛋白酶 K 的活性依賴于溶酶體內氯離子濃度[10, 70]。即使在酸化正常的情況下，CLCN7 突變也可導致溶酶體功能受損，蛋白水解障礙，造成溶酶體貯存病[71]。
氯離子轉運通道抑制物 NS3736 先前已被發現可抑制溶酶體酸化[34]。而強效雙膦酸鹽可充分抑制破骨細胞，導致獲得性骨硬化癥[72]。Ohgi 等[68]發現多克隆抗體可特異性地抑制破骨細胞中酸激活的 CLCN7 氯離子電導并阻止骨溶解過程。故針對 CLCN7 的抗體治療是一種新的直接抑制破骨細胞骨溶解的治療方法。雖然骨硬化癥的治療方法較多，但最根本的是造血干細胞移植，其可糾正血液學異常和阻止由進行性顱孔狹窄引起的顱神經缺損[73-74]。小干擾 RNA 及間充質干細胞理論上也可作為治療骨硬化癥的方法，但尚未應用于臨床[26, 46, 75]。
5 骨硬化癥與綜合征性耳聾
合并有其他臨床癥狀的耳聾被稱為綜合征性耳聾，目前已發現 600 多種，占遺傳性耳聾的 30%[2]。骨硬化癥即為其中之一，但耳聾通常不作為骨硬化癥的主要早期表現特征[76]。骨硬化癥導致耳聾有多種病因，最常見的是骨過度生長致骨孔狹窄使顱神經壓迫，從而引起神經損傷[26]。影像學研究顯示，ADO-Ⅰ型患者的外聽道寬度較 ADO-Ⅱ型患者明顯減小，更容易發生傳導性耳聾，而在 ARO 中，顳骨 CT 常顯示乳突氣化不良[77]。顱神經和脊神經的受累壓迫以及外聽道變窄，是導致傳導性耳聾的主要原因，此外，中耳腔容積的縮小，進一步壓迫咽鼓管，使中耳引流不良，造成 ARO 和中間型 ARO 患者中耳積液，也可導致耳鳴及聽力下降。感音神經性耳聾的發生由侵犯內耳道引起，內聽道和面神經管均因硬化骨而逐漸變窄，故更容易發生于 ADO-Ⅱ型[77]。需要特別指出的是，當硬化累及顳骨，骨迷路發生局灶性病變，出現血管豐富的海綿狀骨質增生時，也可能導致耳硬化癥[78]。
而在病理學上，顳骨獨特地具有內生軟骨層軟骨殘體的終身持久性，該骨形成了骨迷路骨壁的中間層，位于骨內膜層和骨外膜層之間[79]。這個中間層在胎兒中期部分鈣化，但很快被骨替代，軟骨內骨化在耳膜周圍進行，最后發生在前窗區；因此，這個部位最容易含有持續的纖維軟骨[80]。在耳硬化癥中，有一個海綿化階段，內生軟骨層的正常骨吸收，形成疏松的海綿骨，周圍充滿破骨細胞、成骨細胞及纖維組織；隨后，不成熟的網狀骨沉積，體積增大，后者轉化為排列不規則的板層骨，骨質變硬，成為硬化灶[80]。耳硬化癥最常見的受累區域是前窗裂，它是胚胎軟骨和結締組織的胚胎學殘余[81]。耳硬化癥也可能累及骨迷路包囊的其他部分，如耳蝸內、蝸窗、半規管等，根據具體受累區域的不同，患者可能會出現傳導性、感音神經性或混合性聽力損失，或顱神經壓迫引起的神經病變，這可能是骨硬化癥引起綜合征性耳聾的原因之一[82]。
6 小結
CLCN7 是人體內發揮重要功能的一類氯離子通道蛋白的編碼基因，若該基因發生突變可使破骨細胞及溶酶體功能障礙，從而導致骨硬化癥及溶酶體儲積病。酸分泌減少、有機基質溶解欠佳、運輸缺陷和破骨細胞黏附結構受損都可導致骨溶解過程障礙，但 CLCN7 基因致骨硬化癥的機制尚不明確。另外，目前對于骨硬化癥伴發耳聾的機制及治療研究較少，研究者或可先構建動物模型，以確定骨硬化癥對骨傳導的影響。相信隨著分子生物學的不斷發展，未來對骨硬化癥的致病機制的探索值得期待。