長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過 200 個核苷酸、無法編碼完整蛋白質的核酸序列。近年來，它在多種病理生理過程中發揮的重要調控作用被逐漸明確，然而其在致癌病毒感染中的研究較少。該文總結了目前已知在乙型肝炎病毒誘導的肝細胞癌中異常表達的 lncRNA，著重闡述 lncRNA 通過調控病毒復制和宿主免疫、肝癌細胞細胞周期和增殖、侵襲和轉移、自噬和凋亡等生物學過程參與乙型肝炎病毒相關肝細胞癌發生發展的機制，以期為乙型肝炎病毒相關肝細胞癌的分子靶向治療提供理論基礎。
引用本文： 豐姝, 陶傳敏. 乙型肝炎病毒相關肝細胞癌中長鏈非編碼 RNA 的研究進展. 華西醫學, 2020, 35(8): 983-990. doi: 10.7507/1002-0179.202007031 復制
嗜肝病毒科的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染人類肝細胞后，可引起急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）、肝硬化及肝細胞癌等一系列肝臟疾病[1]。在中國，超過 78% 的肝細胞癌病例由肝炎病毒的慢性感染引起[2]，而 HBV 相關肝細胞癌（HBV-related hepatocellular carcinoma，HBV-HCC）的問題尤為嚴重。2018 年，全球共有 36 萬例新發 HBV-HCC 病例，其中 69.4% 的病患來自中國[3]。諸多信號通路在 HBV 致癌過程中被異常調控，譬如腫瘤蛋白 p53 抑癌通路及磷脂酰肌醇 3-激酶/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）等促癌通路[4]，然而，HBV 導致肝細胞癌的機制仍未被完全闡明。長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）參與廣泛的生物學過程，影響轉錄、mRNA 剪切、翻譯等幾乎每一步基因生命周期[5]。一些 lncRNA 在 HBV-HCC 中表達異常，與 HBV 之間存在直接或間接的相互作用，但具體機制尚不明確。其可能的作用途徑包括調控 HBV 復制和免疫應答、調節細胞周期和細胞增殖、影響細胞遷移和侵襲、控制細胞自噬和凋亡等。本文就 HBV-HCC 疾病中異常上調或下調的 lncRNA 進行綜述，旨在理解 HBV-HCC 發生發展的分子機制，為 HBV-HCC 患者的分子靶向治療提供新思路。
1 調控病毒復制和宿主免疫應答
HBV 感染不會殺死肝細胞，現在廣泛認為其感染誘發的肝細胞惡變是一個長期且慢性的過程[6]，與病毒和宿主之間的相互作用密切相關。總的來說，CHB 患者血清中 HBV DNA 水平與肝細胞癌的嚴重程度呈正相關；亦有研究表明，血清中乙型肝炎表面抗原被清除后，患者罹患肝細胞癌的風險顯著降低[4, 7]。分子病毒學認為 HBV-HCC 的發生發展一般與以下因素相關：① HBV DNA 整合至宿主基因組；② 炎癥反應及肝細胞損傷；③ 病理性再生[8]。此過程中，除 HBV DNA 外，其編碼產生的如乙型肝炎病毒 X 蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）、乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein，HBc）及包膜蛋白，均可激活促癌通路、影響肝細胞功能[9]。同時，長期的慢性炎癥可刺激白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-22、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等細胞因子的釋放，亦可通過激活核因子 κB 等信號通路觸發免疫逃逸，利于肝細胞癌發生[10]。研究發現，目前可通過間接靶向 HBV 前基因組 RNA 或者通過結合 HBx 或 HBc 蛋白影響 HBV 共價閉合環狀 DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）從而參與 HBV-HCC 發生的 lncRNA 有 lincRNA-SFMBT2、PCNAP1、肝癌高表達轉錄本（highly upregulated in liver cancer，HULC）、淋巴細胞白血病缺失 2 基因（deleted in lymphocytic leukaemia 2，DLEU2）和轉錄相關鋅帶蛋白基因反義 RNA1（zinc ribbon domain-containing 1 antisense RNA 1，ZNRD1-AS1）等；在 HBV 感染后異常表達，通過參與宿主免疫應答及 HBV 清除從而影響 HBV-HCC 進程的 lncRNA 有 HBx-長散布核元件-1（long interspersed nuclear element-1，LINE1）、lnc-DC、AX800134、LINC01149 和 lncRNA#32 等。
1.1 上調的lncRNA
HBx-LINE1 是一個獨特的 lncRNA，它是由病毒 DNA 與宿主序列 LINE1 的嵌合體轉錄而成，為目前發現的唯一一個證明 HBV 通過整合其 DNA 至宿主細胞基因組從而影響 HBV-HCC 進程的 lncRNA[11-12]。HBx-LINE1 能抑制微 RNA（microRNA，miRNA 或 miR）-122 的表達，而 miR-122 可直接靶向 HBV 前基因組 RNA 以削弱 HBV 的復制[13]。另外，由于 miR-122 受 α 干擾素抑制，故 HBx-LINE1 可能有負向調控 α 干擾素抗病毒的功能[14]。因此，HBx-LINE1 有可能通過消除 miR-122，促進 HBV 復制同時抑制 α 干擾素的抗 HBV 效應[15]。
Yilmaz Susluer 等[16]的研究發現，與健康對照者相比，CHB 患者血漿中的 anti-NOS2A、lincRNA-SFMBT2 和 Zfhx2as 顯著升高，其中 lincRNA-SFMBT2 具有增強肝癌細胞中 HBV DNA 復制的功能。LncRNA PCNAP1[17]以及其祖先基因增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在受 HBV 感染的人源化小鼠的肝臟組織中上調，升高的 PCNA 又以 HBc 依賴的方式與 HBV cccDNA 相互作用，從而促進 HBV 復制。而 PCNAP1 亦可通過與 miR-154 競爭調控 PCNA 的表達，增強肝癌細胞的增殖參與 HBV-HCC 發展，并最終在 HBV-HCC 患者肝癌組織中呈現高表達狀態[17]。另外，HULC 能夠發揮腳手架平臺的作用，將組蛋白乙酰基轉移酶 1（histone acetyltransferase 1，HAT1）和 HBc 組合成 HAT1/HULC/HBc 復合物，從而對 HBV cccDNA 的組蛋白 H3 第 27 位賴氨酸（lysine 27 of histone H3，H3K27）/組蛋白 H4 第 5 位賴氨酸/組蛋白 H4 第 12 位賴氨酸乙酰化位點進行修飾，最終促進 HBV cccDNA 積累以及 HBV 復制[18]。HBx 能夠與 DLEU2 啟動子結合，增強其轉錄從而增加 DLEU2 的表達水平。而 DLEU2 的第 1 內含子能夠直接與 HBx 和果蠅 ZESTE 基因增強子人類同源物 2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）蛋白相互結合，因此 DLEU2 和 HBx 的共同募集可競爭性替換病毒染色體上結合的 EZH2，從而調控 HBV cccDNA 轉錄，促進 HBV 復制；同時，亦可在 HBV 感染的肝細胞中激活被 EZH2 沉默的靶基因的表達，從而促進肝細胞向肝癌細胞轉化[19]。
將 HepG2.2.15 細胞和樹突狀細胞共培養后發現，HBV 能夠提高樹突狀細胞中 lnc-DC 的表達水平，并通過激活 Toll 樣受體 9/信號轉導及轉錄激活蛋白 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路抑制 TNF-α、IL-6、IL-12 和 γ 干擾素等細胞因子水平，促進 IL-1β 釋放，從而控制 HBV 感染后樹突狀細胞的免疫應答、細胞增殖力、細胞周期和凋亡[20]。與健康對照者和 HBV 陰性的 HCC 患者相比，AX800134 在 HBV-HCC 患者的血清中異常高表達。細胞實驗表明 AX800134 可被 HBx 蛋白誘導[21]。有意思的是，TNF-α 可通過促進細胞核中核因子 κB 通路的 p65 蛋白磷酸化上調 AX800134，而 AX800134 又能發揮促進腫瘤細胞增殖和侵襲、抑制凋亡的功能[21]。另外，研究發現，LINC01149 的單核苷酸多態性位點 rs2844512 G>C 的突變有利于 HBV 的清除。但是，該突變是發生 HCC 的危險因素，可能是它創造了一個 LINC01149 與 miR-128-3p 發生結合的位點，上調 MHC-I 類分子鏈相關基因 A（MHC class I-related chain A，MICA）基因表達而招募自然殺傷細胞，進而殺傷 HBV 陽性肝細胞；同時，上調的 MICA 能夠通過蛋白水解脫落釋放大量的可溶性 MICA，對自然殺傷細胞表面活化性受體 D 表達產生抑制，從而誘導自然殺傷細胞耗竭，最終引起腫瘤細胞的免疫逃逸，增加發生 HCC 的風險[22]。
1.2 下調的lncRNA
CHB 患者血漿中 lncRNA Y5 的含量明顯降低[16]。LncRNA#32（即 LOC100506895）和 ZNRD1-AS1 在 HBV-HCC 中的表達尚未知。但是研究發現，lncRNA#32 可通過與激活轉錄因子-2 互相作用正向調控干擾素刺激基因 ISG 的表達，從而通過Ⅰ型干擾素信號通路顯著抑制 HBV 復制[23]。由于 ZNRD1-AS1 基因上的 3 個單核苷酸多態性位點（rs3757328、rs6940552 和 rs9261204）[24]作為 ZNRD1 基因的數量性狀基因座可明顯增加宿主的肝細胞癌風險，而 rs3757328 與 HBV 的清除密切相關，因此 Wen 等[24]發現 ZNRD1-AS1 可以通過下調 ZNRD1 表達以抑制 HBV復制，同時抑制 DNA 損傷修復并促進細胞增殖。
2 影響肝癌細胞的細胞周期和增殖
細胞周期由 G1 期、S期 （DNA 合成期）、G2 期和 M 期（有絲分裂期）組成。細胞周期的進展受細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）及其細胞周期蛋白伴侶的調控，后者可形成細胞周期蛋白（cyclin）/CDK 復合物以發揮功能。活化的 CDK 使其特定底物發生磷酸化，引發細胞周期從 G1 期到 S 期或從 G2 期到 M 期的轉變，繼而促進細胞癌變進程[15]。另外，機體內本身還存在負向調控細胞周期的機制，即細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI），包括 INK4 家族（如 p15 蛋白、p16 蛋白、p18 蛋白和 p19 蛋白）和 CIP/KIP 家族（如 p21 蛋白、p27 蛋白和 p57 蛋白），可通過結合并失活 cyclin/CDK 復合物來阻滯細胞周期的發展[15]。目前研究發現參與細胞周期調控的 lncRNA 可通過影響 cyclin、CDK 或 CKI 表達，從而影響肝癌細胞增殖。
2.1 上調的lncRNA
一些 lncRNA 可被 HBV 或其產生的 HBx 蛋白刺激后上調，通過影響肝癌細胞的細胞周期或增殖從而促進肝細胞癌發展。HULC[25]、HOX 轉錄反義 RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）[26]、尿路上皮癌相關 1（urothelial cancer-associated 1，UCA1）[27]、肺腺癌轉移相關轉錄本 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）[28]、多巴胺 β 羥化酶反義 RNA 1（dopamine β hydroxylase antisense RNA 1，DBH-AS1）[29]、WEE2 反義 RNA1（WEE2 antisense RNA 1，WEE2-AS1）[30]、Unigene56159[31]、肝癌微血管侵犯相關 lncRNA（lncRNA associated with microvascular invasion in HCC，MVIH）[32]和肝癌中高表達 lncRNA（lncRNA high expression in HCC，HEIH）[33]等被發現在 HBV-HCC 患者肝癌組織中明顯上調。
Lu 等[34]發現，與健康對照人群相比，HBV-HCC 患者血清中 lncRNA-uc003wbd 和 lncRNA-AF085935 的表達顯著升高，且這 2 個 lncRNA 的水平可以將 HCC 患者、CHB 患者及健康人群區分開來。亦有研究利用 RNA 免疫沉淀表明，在 HBV-HCC 中 HULC 和 HEIH 直接與 HBx 互相作用蛋白結合，提示了它們與 HBV-HCC 發展之間的密切關系[35]。另外，HEIH、UCA1 和 HOTAIR 還可通過與多梳蛋白抑制復合物 2 成員之一即 EZH2 密切作用，抑制 CKI 從而促進肝癌細胞增殖[15]。
轉錄因子 cAMP 響應元件結合蛋白（cAMP responsive element binding protein，CREB）可介導 HBx 蛋白對 HULC 的轉錄調控。HULC 通過下調 miR-372 從而解除 miR-372 對下游靶基因 cAMP 依賴性蛋白激酶催化亞基 β（protein kinase cAMP-activated catalytic subunit beta，PRKACB）轉錄的抑制作用，反饋增強 CREB 磷酸化[36]。而磷酸化的 CREB 將 P300 和梵天相關基因 1（brahma-related gene 1，Brg1）蛋白募集至 HULC 啟動子處，引發表觀遺傳標志物激活和染色質重塑，繼而促進 HULC 轉錄[36]。有意思的是，HULC 被激活后可直接結合 p18 基因啟動子區域以抑制 p18 蛋白表達，增加 CDK4 表達；亦可通過特異地結合 Y-盒結合蛋白并促進其磷酸化來增加細胞周期蛋白 D1（cylin D1，CCND1）和細胞周期蛋白 E1（cylin E1，CCNE1）的轉錄活性，誘發 G1 期至 S 期轉化，最終促進肝癌細胞增殖[25, 37]。受 HBx 蛋白調控轉錄的 lncRNA 還有 HOTAIR。在 HBx 穩定表達細胞系 4pX-1 中，有絲分裂 polo 樣激酶 1 被激活，誘導 2 個轉錄抑制因子多梳蛋白 SUZ12 和鋅指蛋白 198 在蛋白酶體中的降解，從而改變被感染細胞的表觀遺傳修飾，激活 HOTAIR 轉錄[26]。而 HOTAIR 與 EZH2 的相互作用可抑制 miR-218 表達以增加 B 細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點-1 蛋白表達，導致 p16 和 p14 表達降低從而有助于肝細胞癌發生[38]。HBx 除通過 HULC 和 HOTAIR 調控肝癌細胞增殖外，HBx/lncRNA 小核仁 RNA 宿主基因 20/磷酸酯酶與張力蛋白同源物[39]通路和 HBx/HULC/STAT3/miR-539/載脂蛋白 B mRNA 編輯酶催化多肽 3B[40]作用軸在 HBV-HCC 發展中亦起著重要的作用。
HBV-HCC 中高表達的 UCA1 一方面可通過與 EZH2 作用，降低 CKI 蛋白 p27 的表達，導致細胞周期蛋白 CDK2 表達上調，有助于細胞由 G1 期至 S 期轉變，加速細胞增殖[27]。另一方面，UCA1 可競爭結合 miR-216，促進細胞外信號調節蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路，增強 miR-216 下游基因成纖維細胞生長因子受體 1 的表達[41]。Yang 等[33]利用基因芯片及實時熒光定量聚合酶鏈反應方法，發現了一種在 HBV-HCC 患者肝癌組織高表達的 lncRNA HEIH，與肝癌患者的高復發及低術后生存率密切相關。細胞實驗發現，HEIH 通過與 EZH2 相互作用，可抑制 CKI 蛋白如 p16 和 p21 的表達，從而減少阻滯于 G0/G1 期的細胞，最終促進腫瘤發展[33]。DBH-AS1 可以被 HBx 誘導顯著表達，且可以被 p53 失活。它通過激活 ERK/p38/JNK MAPK 信號通路，促進細胞周期蛋白 CDK6、CCND1 和 CCNE1 的表達，并減少 p16、p21、p27 蛋白的水平[29]。
在 HBV-HCC 患者、HBx 過表達細胞系以及 HBx 轉基因小鼠中，轉錄因子嗜親性病毒插入位點 1 顯著上調，并且可通過上調多個 lncRNA（如 AK016494、AK015487、AK021106和AK044545）促進表達 HBx 的肝癌細胞的增殖[42]。Lnc-HUR1 在 HBV 陽性肝癌細胞 HepG2-4D14 中顯著上調，細胞實驗和小鼠體內實驗均證明 lnc-HUR1 能夠促進成瘤，它可通過與 p53 相互作用抑制其下游基因的轉錄調控，如抑制 p21 和 Bax mRNA 及蛋白質的含量[43]。此外，HBx 蛋白誘導 LINC01152 上調后，LINC01152 可通過與 IL-23 基因的啟動子結合，調控其轉錄促進 IL-23 的表達上調 STAT3 和磷酸化 STAT3 蛋白的水平，最終促進肝癌細胞的增殖[44]。另外，由 HBV 誘導的含不育 α 基元域 12 反義 RNA1 可以通過與核磷蛋白結合以阻礙其與人雙微粒體 2 蛋白的 E3 連接酶之間的相互作用，游離的人雙微粒體 2 能夠與 p53 蛋白結合并促進 p53 的泛素化和降解，從而促進肝癌細胞增殖、抑制凋亡[45]。
2.2 下調的lncRNA
HBx 下調表達 lncRNA（down-regulated expression by HBx，DREH）在 HBV-HCC 中、HBx 轉基因小鼠及表達 HBx 蛋白的小鼠肝臟細胞中均觀察到表達水平的異常下調[46]。腫瘤低表達 lncRNA（lncRNA-low expression in tumor，LET）的水平亦在 HBV-HCC 中降低[47]。有意思的是，印記基因 H19 水平在 HBV-HCC 中降低，而在肝細胞癌中上調。LncRNA-6195 能與 α-烯醇酶相結合以抑制其酶活性，然后通過抑制肝癌細胞的能量代謝遏制細胞增殖，它在 HBV-HCC 患者肝癌組織中相對于癌旁組織顯著下調，且低表達的患者預后不良[48]。
3 影響肝癌細胞侵襲和轉移
腫瘤轉移是由一系列浸潤-轉移的復雜級聯反應形成的病理改變，是造成肝細胞癌患者預后不良的主要原因，上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的形成是其重要標志。此時的上皮細胞失去了細胞-細胞間接觸，其標志性蛋白的表達亦從上皮細胞（E-鈣黏蛋白、細胞角蛋白和 γ-連環蛋白）轉變為間充質細胞（N-鈣黏蛋白、波形蛋白和纖連蛋白），并且極大增加其遷移和侵襲能力[15, 49]。發生了 EMT 變化的細胞可進一步擴散到周圍或遠處的正常組織中，錨定自身并重新獲得上皮樣狀態，然后達到擴大轉移。HBV-HCC 中，lncRNA 可通過調控 EMT 相關基因表達，調控 TGF-β、Wnt/β-catenin 等信號通路，以及調節腫瘤微環境、細胞因子和細胞外基質蛋白等途徑參與肝癌細胞侵襲與轉移。
3.1 上調的lncRNA
HBV-HCC 中表達異常上調的 MALAT-1[28]、HOTAIR[50]、UCA1[51]、HULC[52]、HBx-LINE1[12]、TGF-β 活化 lncRNA（lncRNA activated by TGF-β，ATB）[53]和 unigene56159[31]等具有增強肝癌細胞侵襲和轉移的能力。另外，MVIH 可通過促進腫瘤血管形成從而加速肝癌細胞的侵襲力[32]。
HBx-LINE1 能夠明顯削弱 miR-122 表達以促進 EMT 樣效應，如激活 Wnt/β-catenin 信號通路、抑制 E-鈣黏蛋白、增強細胞遷移，最后引發肝癌細胞發生轉移[12, 54]。UCA1[51]和 unigene56159[31]通過分別靶向 miR-140-5p 和 miR-203，增強 EMT 相關轉錄因子蝸牛家族轉錄抑制因子 2 表達，導致 E-鈣黏蛋白和細胞角蛋白減少、波形蛋白增加，最終促進 EMT 發生。LINC00152 可由 HBx 蛋白誘導上調，通過與 EZH2 相互作用抑制 E-鈣黏蛋白的表達，最終促進 EMT 增加肝癌細胞的增殖和侵襲[55]。HBx 蛋白亦可通過鋅指 E-盒結合同源異形盒 2 反義 RNA 1 調控 EMT 以及 Wnt 信號通路[56]。n335586 在 HBV-HCC 中高表達，并可以通過 n335586/miR-924/線粒體肌酸激酶 1A 作用軸促進 EMT，從而促進肝癌細胞的遷移和侵襲[57]。LncIHS 可被 HBx 和 SET 與 MYND 結構域蛋白 3 蛋白共同誘導，并且能夠通過調控 EMT 相關的 c-Myc 和 Cyclin D1 蛋白表達，亦可通過調控 ERK 和蛋白激酶 B 信號通路，最終促進肝癌細胞遷移和侵襲能力[58]。
MVIH 可以抑制血管生成抑制蛋白即磷酸甘油酸激酶 1 分泌，強烈激活血管的生成，從而促進腫瘤生長和肝內轉移[32]。HOTAIR 則可調控其他腫瘤微環境成分，如抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9 及血管內皮生長因子、增加 RNA 結合基序蛋白 38 等表達[59-60]。HULC 通過靶向 Y-框結合蛋白 1 蛋白增加 MMP-3 水平，亦可以通過抑制 miR-200a-3p 促進轉錄因子鋅指 E-盒結合同源異形盒 1 的表達，還可以與 miR-107 結合以上調下游基因 E2F 轉錄因子 1，誘發鞘氨醇激酶 1、1-磷酸鞘氨醇蛋白表達，終而促進腫瘤血管形成[37, 52]。
有研究報道了漿細胞瘤多樣異位基因 1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）參與肝細胞癌發展的特性[61]，而 Jiang 等[62]發現 PVT1 僅在 HBV-HCC 患者肝癌樣本而非 HBV 陰性 HCC 患者肝癌樣本中高表達，且 PVT1 僅在 HBV 穩定細胞株 Hep3B 細胞中促進細胞的增殖、侵襲和遷移能力，在 HepG2 細胞中無此現象。Jiang 等[62]通過 RNA 下拉實驗證實 PVT1 與多梳蛋白抑制復合物 2 之間存在相互作用，并發現 PVT1 可通過結合 EZH2 阻礙 EZH2 招募至 MYC 基因的啟動子處，改變 MYC 啟動子的 H3K27me3 甲基化狀態而促進 c-Myc 蛋白質的表達，最終促進 Hep3B 細胞增殖。
3.2 下調的lncRNA
LET 和 DREH 在 HBV-HCC 中表達下調，細胞研究表明它們會顯著抑制肝癌細胞的侵襲能力，小鼠體內實驗亦提示相同功能[46, 63]。其中，LET 降低核因子 90 及其下游基因缺氧誘導因子 1α 的表達，導致肝癌細胞中由缺氧誘導的侵襲受抑制[63]。DREH 可通過直接靶向波形蛋白抑制其表達，從而抑制細胞遷移和侵襲[46]。H19 可利用表觀遺傳學修飾上調 miR-200 及 miR-22，以抑制 EMT 相關基因的表達水平，如轉錄因子鋅指 E-盒結合同源異形盒 1/2、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、β-catenin 和 MMP-9 等[64-65]。
Deng 等[66]首先因為 lncRNA F11-AS1 參與調控 HCC 進展而關注該 lncRNA，推測 F11-AS1/miR-211-5p/核受體亞家族 1I 組成員 3（nuclear receptor subfamily 1 group I member 3，NR1I3）軸很可能參與 HBV-HCC 進展，故檢測 45 例 HBV-HCC 患者和 28 例 HBV 陰性 HCC 患者肝癌組織及癌旁組織后發現 F11-AS1 僅在 HBV-HCC 患者肝癌組織中顯著下調，亦僅在 HBV 穩定表達細胞系 HepG2.2.15 中顯著下調。Deng 等[66]分別向 HepG2.2.15 細胞中轉染 HBV 的 X、C、S 和 P 基因，發現僅 HBx 蛋白負調控 F11-AS1 表達，且 F11-AS1 通過 miR-211-5p/NR1I3 軸抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。
4 影響肝癌細胞自噬和凋亡
自噬和凋亡被認為是細胞的程序性死亡。一般來說，當細胞內沒有足夠營養、不適合進行 DNA 復制時，細胞周期檢查點會將細胞阻滯于 G1 期，使細胞無法進入 S 期；而當細胞內 DNA 受損修復失敗時，細胞周期檢查點則將細胞阻滯于 G2 期，阻止其有絲分裂，并誘發細胞死亡（如凋亡、自噬）[67-68]。自噬為高度保守的細胞內蛋白的降解過程，起始事件為自噬小體的形成，隨后自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，然后降解其內的蛋白質[69]。一些自噬相關基因（autophagy related gene，ATG）如 ATG3、ATG5、ATG7 等，在其中起著重要的作用。細胞凋亡過程中，級聯信號被激活后，細胞中的蛋白會被無選擇性地降解。HBV 在感染肝細胞早期可誘發自噬以促進病毒在感染細胞后的復制；然而在 HBV 相關肝癌中，自噬現象被抑制，但是目前關于自噬在不同階段的肝癌中發揮的作用尚無明確的定論[70]。總的來說，在 HBV-HCC 的微環境中，失衡的自噬和凋亡有利于腫瘤細胞的存活，最終促進肝癌細胞的生長以及發展。HBV-HCC 中高表達的 HOTAIR 通過提升 ATG3 和 ATG7 的表達來激活自噬以及高敏感化 TNF-α 誘導的凋亡，從而降低肝癌細胞對化療藥物（如順鉑、多柔比星等）的敏感性[71]。DBH-AS1 可以保護肝癌細胞免受饑餓誘導的凋亡，幫助細胞更好地生存下來。最新研究發現，肝癌患者中更晚期的腫瘤轉移分期、肝癌組織中 lncRNA ATB 的高表達均與 HBV 感染密切相關[53]。細胞實驗亦證實，向 HepG2 細胞中轉染 HBx 質粒后，HBx 蛋白能夠通過刺激細胞自噬而上調 ATB 和 TGF-β，從而參與 HBV 誘導的肝細胞癌的發生[53]。
5 結語
越來越多證據表明，lncRNA 是調控各種生命過程的重要調節劑。如本文所述，lncRNA 的失調與 HBV-HCC 的發生發展十分密切。盡管在過去 10 年中研究人員對 miRNA 的功能進行了比較廣泛的研究，但對 lncRNA 在 HBV 感染及其誘發的肝細胞癌中的生理及病理意義的關注才剛剛開始。了解 lncRNA 參與的致病機制及調控作用將利于闡明 HBV 引起肝臟癌變的分子機制。但是，目前探究 lncRNA 潛在功能的研究進展緩慢，可能與以下方面有關：① 發現 HBV-HCC 中異常表達 lncRNA 的手段有限；② 對于全新的 lncRNA 缺乏注釋；③ 一條 lncRNA 可能發揮多種生物學功能。其中，目前發現 HBV-HCC 中發揮重要作用的 lncRNA 主要通過：① 提取 HBV-HCC 患者肝臟組織 RNA 進行基因芯片檢測或測序，利用生物信息學篩選得到候選 lncRNA；② 鎖定已知在肝細胞癌或其他腫瘤中的 lncRNA，進一步檢測、研究其在 HBV-HCC 中的表達水平；③ 深入探討僅在 HBV 穩定表達細胞系（如 HepAD38、Hep3B、HepG2.2.15 細胞等）而非普通肝癌細胞系（如 Huh7、HepG2 細胞等）中異常表達的 lncRNA。因此，加深對 lncRNA 的認識，發現并利用 lncRNA 診斷 HBV-HCC 疾病的發生或發展，或者判斷 HBV-HCC 患者預后，或在分子水平上嘗試靶向治療，很可能是今后面臨的挑戰，也更需要進一步的研究以將基礎實驗成果轉化為臨床應用，以期盡早改善 HBV-HCC 患者的生存狀態。
嗜肝病毒科的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染人類肝細胞后，可引起急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）、肝硬化及肝細胞癌等一系列肝臟疾病[1]。在中國，超過 78% 的肝細胞癌病例由肝炎病毒的慢性感染引起[2]，而 HBV 相關肝細胞癌（HBV-related hepatocellular carcinoma，HBV-HCC）的問題尤為嚴重。2018 年，全球共有 36 萬例新發 HBV-HCC 病例，其中 69.4% 的病患來自中國[3]。諸多信號通路在 HBV 致癌過程中被異常調控，譬如腫瘤蛋白 p53 抑癌通路及磷脂酰肌醇 3-激酶/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）等促癌通路[4]，然而，HBV 導致肝細胞癌的機制仍未被完全闡明。長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）參與廣泛的生物學過程，影響轉錄、mRNA 剪切、翻譯等幾乎每一步基因生命周期[5]。一些 lncRNA 在 HBV-HCC 中表達異常，與 HBV 之間存在直接或間接的相互作用，但具體機制尚不明確。其可能的作用途徑包括調控 HBV 復制和免疫應答、調節細胞周期和細胞增殖、影響細胞遷移和侵襲、控制細胞自噬和凋亡等。本文就 HBV-HCC 疾病中異常上調或下調的 lncRNA 進行綜述，旨在理解 HBV-HCC 發生發展的分子機制，為 HBV-HCC 患者的分子靶向治療提供新思路。
1 調控病毒復制和宿主免疫應答
HBV 感染不會殺死肝細胞，現在廣泛認為其感染誘發的肝細胞惡變是一個長期且慢性的過程[6]，與病毒和宿主之間的相互作用密切相關。總的來說，CHB 患者血清中 HBV DNA 水平與肝細胞癌的嚴重程度呈正相關；亦有研究表明，血清中乙型肝炎表面抗原被清除后，患者罹患肝細胞癌的風險顯著降低[4, 7]。分子病毒學認為 HBV-HCC 的發生發展一般與以下因素相關：① HBV DNA 整合至宿主基因組；② 炎癥反應及肝細胞損傷；③ 病理性再生[8]。此過程中，除 HBV DNA 外，其編碼產生的如乙型肝炎病毒 X 蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）、乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein，HBc）及包膜蛋白，均可激活促癌通路、影響肝細胞功能[9]。同時，長期的慢性炎癥可刺激白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-22、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等細胞因子的釋放，亦可通過激活核因子 κB 等信號通路觸發免疫逃逸，利于肝細胞癌發生[10]。研究發現，目前可通過間接靶向 HBV 前基因組 RNA 或者通過結合 HBx 或 HBc 蛋白影響 HBV 共價閉合環狀 DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）從而參與 HBV-HCC 發生的 lncRNA 有 lincRNA-SFMBT2、PCNAP1、肝癌高表達轉錄本（highly upregulated in liver cancer，HULC）、淋巴細胞白血病缺失 2 基因（deleted in lymphocytic leukaemia 2，DLEU2）和轉錄相關鋅帶蛋白基因反義 RNA1（zinc ribbon domain-containing 1 antisense RNA 1，ZNRD1-AS1）等；在 HBV 感染后異常表達，通過參與宿主免疫應答及 HBV 清除從而影響 HBV-HCC 進程的 lncRNA 有 HBx-長散布核元件-1（long interspersed nuclear element-1，LINE1）、lnc-DC、AX800134、LINC01149 和 lncRNA#32 等。
1.1 上調的lncRNA
HBx-LINE1 是一個獨特的 lncRNA，它是由病毒 DNA 與宿主序列 LINE1 的嵌合體轉錄而成，為目前發現的唯一一個證明 HBV 通過整合其 DNA 至宿主細胞基因組從而影響 HBV-HCC 進程的 lncRNA[11-12]。HBx-LINE1 能抑制微 RNA（microRNA，miRNA 或 miR）-122 的表達，而 miR-122 可直接靶向 HBV 前基因組 RNA 以削弱 HBV 的復制[13]。另外，由于 miR-122 受 α 干擾素抑制，故 HBx-LINE1 可能有負向調控 α 干擾素抗病毒的功能[14]。因此，HBx-LINE1 有可能通過消除 miR-122，促進 HBV 復制同時抑制 α 干擾素的抗 HBV 效應[15]。
Yilmaz Susluer 等[16]的研究發現，與健康對照者相比，CHB 患者血漿中的 anti-NOS2A、lincRNA-SFMBT2 和 Zfhx2as 顯著升高，其中 lincRNA-SFMBT2 具有增強肝癌細胞中 HBV DNA 復制的功能。LncRNA PCNAP1[17]以及其祖先基因增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在受 HBV 感染的人源化小鼠的肝臟組織中上調，升高的 PCNA 又以 HBc 依賴的方式與 HBV cccDNA 相互作用，從而促進 HBV 復制。而 PCNAP1 亦可通過與 miR-154 競爭調控 PCNA 的表達，增強肝癌細胞的增殖參與 HBV-HCC 發展，并最終在 HBV-HCC 患者肝癌組織中呈現高表達狀態[17]。另外，HULC 能夠發揮腳手架平臺的作用，將組蛋白乙酰基轉移酶 1（histone acetyltransferase 1，HAT1）和 HBc 組合成 HAT1/HULC/HBc 復合物，從而對 HBV cccDNA 的組蛋白 H3 第 27 位賴氨酸（lysine 27 of histone H3，H3K27）/組蛋白 H4 第 5 位賴氨酸/組蛋白 H4 第 12 位賴氨酸乙酰化位點進行修飾，最終促進 HBV cccDNA 積累以及 HBV 復制[18]。HBx 能夠與 DLEU2 啟動子結合，增強其轉錄從而增加 DLEU2 的表達水平。而 DLEU2 的第 1 內含子能夠直接與 HBx 和果蠅 ZESTE 基因增強子人類同源物 2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）蛋白相互結合，因此 DLEU2 和 HBx 的共同募集可競爭性替換病毒染色體上結合的 EZH2，從而調控 HBV cccDNA 轉錄，促進 HBV 復制；同時，亦可在 HBV 感染的肝細胞中激活被 EZH2 沉默的靶基因的表達，從而促進肝細胞向肝癌細胞轉化[19]。
將 HepG2.2.15 細胞和樹突狀細胞共培養后發現，HBV 能夠提高樹突狀細胞中 lnc-DC 的表達水平，并通過激活 Toll 樣受體 9/信號轉導及轉錄激活蛋白 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路抑制 TNF-α、IL-6、IL-12 和 γ 干擾素等細胞因子水平，促進 IL-1β 釋放，從而控制 HBV 感染后樹突狀細胞的免疫應答、細胞增殖力、細胞周期和凋亡[20]。與健康對照者和 HBV 陰性的 HCC 患者相比，AX800134 在 HBV-HCC 患者的血清中異常高表達。細胞實驗表明 AX800134 可被 HBx 蛋白誘導[21]。有意思的是，TNF-α 可通過促進細胞核中核因子 κB 通路的 p65 蛋白磷酸化上調 AX800134，而 AX800134 又能發揮促進腫瘤細胞增殖和侵襲、抑制凋亡的功能[21]。另外，研究發現，LINC01149 的單核苷酸多態性位點 rs2844512 G>C 的突變有利于 HBV 的清除。但是，該突變是發生 HCC 的危險因素，可能是它創造了一個 LINC01149 與 miR-128-3p 發生結合的位點，上調 MHC-I 類分子鏈相關基因 A（MHC class I-related chain A，MICA）基因表達而招募自然殺傷細胞，進而殺傷 HBV 陽性肝細胞；同時，上調的 MICA 能夠通過蛋白水解脫落釋放大量的可溶性 MICA，對自然殺傷細胞表面活化性受體 D 表達產生抑制，從而誘導自然殺傷細胞耗竭，最終引起腫瘤細胞的免疫逃逸，增加發生 HCC 的風險[22]。
1.2 下調的lncRNA
CHB 患者血漿中 lncRNA Y5 的含量明顯降低[16]。LncRNA#32（即 LOC100506895）和 ZNRD1-AS1 在 HBV-HCC 中的表達尚未知。但是研究發現，lncRNA#32 可通過與激活轉錄因子-2 互相作用正向調控干擾素刺激基因 ISG 的表達，從而通過Ⅰ型干擾素信號通路顯著抑制 HBV 復制[23]。由于 ZNRD1-AS1 基因上的 3 個單核苷酸多態性位點（rs3757328、rs6940552 和 rs9261204）[24]作為 ZNRD1 基因的數量性狀基因座可明顯增加宿主的肝細胞癌風險，而 rs3757328 與 HBV 的清除密切相關，因此 Wen 等[24]發現 ZNRD1-AS1 可以通過下調 ZNRD1 表達以抑制 HBV復制，同時抑制 DNA 損傷修復并促進細胞增殖。
2 影響肝癌細胞的細胞周期和增殖
細胞周期由 G1 期、S期 （DNA 合成期）、G2 期和 M 期（有絲分裂期）組成。細胞周期的進展受細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）及其細胞周期蛋白伴侶的調控，后者可形成細胞周期蛋白（cyclin）/CDK 復合物以發揮功能。活化的 CDK 使其特定底物發生磷酸化，引發細胞周期從 G1 期到 S 期或從 G2 期到 M 期的轉變，繼而促進細胞癌變進程[15]。另外，機體內本身還存在負向調控細胞周期的機制，即細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI），包括 INK4 家族（如 p15 蛋白、p16 蛋白、p18 蛋白和 p19 蛋白）和 CIP/KIP 家族（如 p21 蛋白、p27 蛋白和 p57 蛋白），可通過結合并失活 cyclin/CDK 復合物來阻滯細胞周期的發展[15]。目前研究發現參與細胞周期調控的 lncRNA 可通過影響 cyclin、CDK 或 CKI 表達，從而影響肝癌細胞增殖。
2.1 上調的lncRNA
一些 lncRNA 可被 HBV 或其產生的 HBx 蛋白刺激后上調，通過影響肝癌細胞的細胞周期或增殖從而促進肝細胞癌發展。HULC[25]、HOX 轉錄反義 RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）[26]、尿路上皮癌相關 1（urothelial cancer-associated 1，UCA1）[27]、肺腺癌轉移相關轉錄本 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）[28]、多巴胺 β 羥化酶反義 RNA 1（dopamine β hydroxylase antisense RNA 1，DBH-AS1）[29]、WEE2 反義 RNA1（WEE2 antisense RNA 1，WEE2-AS1）[30]、Unigene56159[31]、肝癌微血管侵犯相關 lncRNA（lncRNA associated with microvascular invasion in HCC，MVIH）[32]和肝癌中高表達 lncRNA（lncRNA high expression in HCC，HEIH）[33]等被發現在 HBV-HCC 患者肝癌組織中明顯上調。
Lu 等[34]發現，與健康對照人群相比，HBV-HCC 患者血清中 lncRNA-uc003wbd 和 lncRNA-AF085935 的表達顯著升高，且這 2 個 lncRNA 的水平可以將 HCC 患者、CHB 患者及健康人群區分開來。亦有研究利用 RNA 免疫沉淀表明，在 HBV-HCC 中 HULC 和 HEIH 直接與 HBx 互相作用蛋白結合，提示了它們與 HBV-HCC 發展之間的密切關系[35]。另外，HEIH、UCA1 和 HOTAIR 還可通過與多梳蛋白抑制復合物 2 成員之一即 EZH2 密切作用，抑制 CKI 從而促進肝癌細胞增殖[15]。
轉錄因子 cAMP 響應元件結合蛋白（cAMP responsive element binding protein，CREB）可介導 HBx 蛋白對 HULC 的轉錄調控。HULC 通過下調 miR-372 從而解除 miR-372 對下游靶基因 cAMP 依賴性蛋白激酶催化亞基 β（protein kinase cAMP-activated catalytic subunit beta，PRKACB）轉錄的抑制作用，反饋增強 CREB 磷酸化[36]。而磷酸化的 CREB 將 P300 和梵天相關基因 1（brahma-related gene 1，Brg1）蛋白募集至 HULC 啟動子處，引發表觀遺傳標志物激活和染色質重塑，繼而促進 HULC 轉錄[36]。有意思的是，HULC 被激活后可直接結合 p18 基因啟動子區域以抑制 p18 蛋白表達，增加 CDK4 表達；亦可通過特異地結合 Y-盒結合蛋白并促進其磷酸化來增加細胞周期蛋白 D1（cylin D1，CCND1）和細胞周期蛋白 E1（cylin E1，CCNE1）的轉錄活性，誘發 G1 期至 S 期轉化，最終促進肝癌細胞增殖[25, 37]。受 HBx 蛋白調控轉錄的 lncRNA 還有 HOTAIR。在 HBx 穩定表達細胞系 4pX-1 中，有絲分裂 polo 樣激酶 1 被激活，誘導 2 個轉錄抑制因子多梳蛋白 SUZ12 和鋅指蛋白 198 在蛋白酶體中的降解，從而改變被感染細胞的表觀遺傳修飾，激活 HOTAIR 轉錄[26]。而 HOTAIR 與 EZH2 的相互作用可抑制 miR-218 表達以增加 B 細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點-1 蛋白表達，導致 p16 和 p14 表達降低從而有助于肝細胞癌發生[38]。HBx 除通過 HULC 和 HOTAIR 調控肝癌細胞增殖外，HBx/lncRNA 小核仁 RNA 宿主基因 20/磷酸酯酶與張力蛋白同源物[39]通路和 HBx/HULC/STAT3/miR-539/載脂蛋白 B mRNA 編輯酶催化多肽 3B[40]作用軸在 HBV-HCC 發展中亦起著重要的作用。
HBV-HCC 中高表達的 UCA1 一方面可通過與 EZH2 作用，降低 CKI 蛋白 p27 的表達，導致細胞周期蛋白 CDK2 表達上調，有助于細胞由 G1 期至 S 期轉變，加速細胞增殖[27]。另一方面，UCA1 可競爭結合 miR-216，促進細胞外信號調節蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路，增強 miR-216 下游基因成纖維細胞生長因子受體 1 的表達[41]。Yang 等[33]利用基因芯片及實時熒光定量聚合酶鏈反應方法，發現了一種在 HBV-HCC 患者肝癌組織高表達的 lncRNA HEIH，與肝癌患者的高復發及低術后生存率密切相關。細胞實驗發現，HEIH 通過與 EZH2 相互作用，可抑制 CKI 蛋白如 p16 和 p21 的表達，從而減少阻滯于 G0/G1 期的細胞，最終促進腫瘤發展[33]。DBH-AS1 可以被 HBx 誘導顯著表達，且可以被 p53 失活。它通過激活 ERK/p38/JNK MAPK 信號通路，促進細胞周期蛋白 CDK6、CCND1 和 CCNE1 的表達，并減少 p16、p21、p27 蛋白的水平[29]。
在 HBV-HCC 患者、HBx 過表達細胞系以及 HBx 轉基因小鼠中，轉錄因子嗜親性病毒插入位點 1 顯著上調，并且可通過上調多個 lncRNA（如 AK016494、AK015487、AK021106和AK044545）促進表達 HBx 的肝癌細胞的增殖[42]。Lnc-HUR1 在 HBV 陽性肝癌細胞 HepG2-4D14 中顯著上調，細胞實驗和小鼠體內實驗均證明 lnc-HUR1 能夠促進成瘤，它可通過與 p53 相互作用抑制其下游基因的轉錄調控，如抑制 p21 和 Bax mRNA 及蛋白質的含量[43]。此外，HBx 蛋白誘導 LINC01152 上調后，LINC01152 可通過與 IL-23 基因的啟動子結合，調控其轉錄促進 IL-23 的表達上調 STAT3 和磷酸化 STAT3 蛋白的水平，最終促進肝癌細胞的增殖[44]。另外，由 HBV 誘導的含不育 α 基元域 12 反義 RNA1 可以通過與核磷蛋白結合以阻礙其與人雙微粒體 2 蛋白的 E3 連接酶之間的相互作用，游離的人雙微粒體 2 能夠與 p53 蛋白結合并促進 p53 的泛素化和降解，從而促進肝癌細胞增殖、抑制凋亡[45]。
2.2 下調的lncRNA
HBx 下調表達 lncRNA（down-regulated expression by HBx，DREH）在 HBV-HCC 中、HBx 轉基因小鼠及表達 HBx 蛋白的小鼠肝臟細胞中均觀察到表達水平的異常下調[46]。腫瘤低表達 lncRNA（lncRNA-low expression in tumor，LET）的水平亦在 HBV-HCC 中降低[47]。有意思的是，印記基因 H19 水平在 HBV-HCC 中降低，而在肝細胞癌中上調。LncRNA-6195 能與 α-烯醇酶相結合以抑制其酶活性，然后通過抑制肝癌細胞的能量代謝遏制細胞增殖，它在 HBV-HCC 患者肝癌組織中相對于癌旁組織顯著下調，且低表達的患者預后不良[48]。
3 影響肝癌細胞侵襲和轉移
腫瘤轉移是由一系列浸潤-轉移的復雜級聯反應形成的病理改變，是造成肝細胞癌患者預后不良的主要原因，上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的形成是其重要標志。此時的上皮細胞失去了細胞-細胞間接觸，其標志性蛋白的表達亦從上皮細胞（E-鈣黏蛋白、細胞角蛋白和 γ-連環蛋白）轉變為間充質細胞（N-鈣黏蛋白、波形蛋白和纖連蛋白），并且極大增加其遷移和侵襲能力[15, 49]。發生了 EMT 變化的細胞可進一步擴散到周圍或遠處的正常組織中，錨定自身并重新獲得上皮樣狀態，然后達到擴大轉移。HBV-HCC 中，lncRNA 可通過調控 EMT 相關基因表達，調控 TGF-β、Wnt/β-catenin 等信號通路，以及調節腫瘤微環境、細胞因子和細胞外基質蛋白等途徑參與肝癌細胞侵襲與轉移。
3.1 上調的lncRNA
HBV-HCC 中表達異常上調的 MALAT-1[28]、HOTAIR[50]、UCA1[51]、HULC[52]、HBx-LINE1[12]、TGF-β 活化 lncRNA（lncRNA activated by TGF-β，ATB）[53]和 unigene56159[31]等具有增強肝癌細胞侵襲和轉移的能力。另外，MVIH 可通過促進腫瘤血管形成從而加速肝癌細胞的侵襲力[32]。
HBx-LINE1 能夠明顯削弱 miR-122 表達以促進 EMT 樣效應，如激活 Wnt/β-catenin 信號通路、抑制 E-鈣黏蛋白、增強細胞遷移，最后引發肝癌細胞發生轉移[12, 54]。UCA1[51]和 unigene56159[31]通過分別靶向 miR-140-5p 和 miR-203，增強 EMT 相關轉錄因子蝸牛家族轉錄抑制因子 2 表達，導致 E-鈣黏蛋白和細胞角蛋白減少、波形蛋白增加，最終促進 EMT 發生。LINC00152 可由 HBx 蛋白誘導上調，通過與 EZH2 相互作用抑制 E-鈣黏蛋白的表達，最終促進 EMT 增加肝癌細胞的增殖和侵襲[55]。HBx 蛋白亦可通過鋅指 E-盒結合同源異形盒 2 反義 RNA 1 調控 EMT 以及 Wnt 信號通路[56]。n335586 在 HBV-HCC 中高表達，并可以通過 n335586/miR-924/線粒體肌酸激酶 1A 作用軸促進 EMT，從而促進肝癌細胞的遷移和侵襲[57]。LncIHS 可被 HBx 和 SET 與 MYND 結構域蛋白 3 蛋白共同誘導，并且能夠通過調控 EMT 相關的 c-Myc 和 Cyclin D1 蛋白表達，亦可通過調控 ERK 和蛋白激酶 B 信號通路，最終促進肝癌細胞遷移和侵襲能力[58]。
MVIH 可以抑制血管生成抑制蛋白即磷酸甘油酸激酶 1 分泌，強烈激活血管的生成，從而促進腫瘤生長和肝內轉移[32]。HOTAIR 則可調控其他腫瘤微環境成分，如抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9 及血管內皮生長因子、增加 RNA 結合基序蛋白 38 等表達[59-60]。HULC 通過靶向 Y-框結合蛋白 1 蛋白增加 MMP-3 水平，亦可以通過抑制 miR-200a-3p 促進轉錄因子鋅指 E-盒結合同源異形盒 1 的表達，還可以與 miR-107 結合以上調下游基因 E2F 轉錄因子 1，誘發鞘氨醇激酶 1、1-磷酸鞘氨醇蛋白表達，終而促進腫瘤血管形成[37, 52]。
有研究報道了漿細胞瘤多樣異位基因 1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）參與肝細胞癌發展的特性[61]，而 Jiang 等[62]發現 PVT1 僅在 HBV-HCC 患者肝癌樣本而非 HBV 陰性 HCC 患者肝癌樣本中高表達，且 PVT1 僅在 HBV 穩定細胞株 Hep3B 細胞中促進細胞的增殖、侵襲和遷移能力，在 HepG2 細胞中無此現象。Jiang 等[62]通過 RNA 下拉實驗證實 PVT1 與多梳蛋白抑制復合物 2 之間存在相互作用，并發現 PVT1 可通過結合 EZH2 阻礙 EZH2 招募至 MYC 基因的啟動子處，改變 MYC 啟動子的 H3K27me3 甲基化狀態而促進 c-Myc 蛋白質的表達，最終促進 Hep3B 細胞增殖。
3.2 下調的lncRNA
LET 和 DREH 在 HBV-HCC 中表達下調，細胞研究表明它們會顯著抑制肝癌細胞的侵襲能力，小鼠體內實驗亦提示相同功能[46, 63]。其中，LET 降低核因子 90 及其下游基因缺氧誘導因子 1α 的表達，導致肝癌細胞中由缺氧誘導的侵襲受抑制[63]。DREH 可通過直接靶向波形蛋白抑制其表達，從而抑制細胞遷移和侵襲[46]。H19 可利用表觀遺傳學修飾上調 miR-200 及 miR-22，以抑制 EMT 相關基因的表達水平，如轉錄因子鋅指 E-盒結合同源異形盒 1/2、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、β-catenin 和 MMP-9 等[64-65]。
Deng 等[66]首先因為 lncRNA F11-AS1 參與調控 HCC 進展而關注該 lncRNA，推測 F11-AS1/miR-211-5p/核受體亞家族 1I 組成員 3（nuclear receptor subfamily 1 group I member 3，NR1I3）軸很可能參與 HBV-HCC 進展，故檢測 45 例 HBV-HCC 患者和 28 例 HBV 陰性 HCC 患者肝癌組織及癌旁組織后發現 F11-AS1 僅在 HBV-HCC 患者肝癌組織中顯著下調，亦僅在 HBV 穩定表達細胞系 HepG2.2.15 中顯著下調。Deng 等[66]分別向 HepG2.2.15 細胞中轉染 HBV 的 X、C、S 和 P 基因，發現僅 HBx 蛋白負調控 F11-AS1 表達，且 F11-AS1 通過 miR-211-5p/NR1I3 軸抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。
4 影響肝癌細胞自噬和凋亡
自噬和凋亡被認為是細胞的程序性死亡。一般來說，當細胞內沒有足夠營養、不適合進行 DNA 復制時，細胞周期檢查點會將細胞阻滯于 G1 期，使細胞無法進入 S 期；而當細胞內 DNA 受損修復失敗時，細胞周期檢查點則將細胞阻滯于 G2 期，阻止其有絲分裂，并誘發細胞死亡（如凋亡、自噬）[67-68]。自噬為高度保守的細胞內蛋白的降解過程，起始事件為自噬小體的形成，隨后自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，然后降解其內的蛋白質[69]。一些自噬相關基因（autophagy related gene，ATG）如 ATG3、ATG5、ATG7 等，在其中起著重要的作用。細胞凋亡過程中，級聯信號被激活后，細胞中的蛋白會被無選擇性地降解。HBV 在感染肝細胞早期可誘發自噬以促進病毒在感染細胞后的復制；然而在 HBV 相關肝癌中，自噬現象被抑制，但是目前關于自噬在不同階段的肝癌中發揮的作用尚無明確的定論[70]。總的來說，在 HBV-HCC 的微環境中，失衡的自噬和凋亡有利于腫瘤細胞的存活，最終促進肝癌細胞的生長以及發展。HBV-HCC 中高表達的 HOTAIR 通過提升 ATG3 和 ATG7 的表達來激活自噬以及高敏感化 TNF-α 誘導的凋亡，從而降低肝癌細胞對化療藥物（如順鉑、多柔比星等）的敏感性[71]。DBH-AS1 可以保護肝癌細胞免受饑餓誘導的凋亡，幫助細胞更好地生存下來。最新研究發現，肝癌患者中更晚期的腫瘤轉移分期、肝癌組織中 lncRNA ATB 的高表達均與 HBV 感染密切相關[53]。細胞實驗亦證實，向 HepG2 細胞中轉染 HBx 質粒后，HBx 蛋白能夠通過刺激細胞自噬而上調 ATB 和 TGF-β，從而參與 HBV 誘導的肝細胞癌的發生[53]。
5 結語
越來越多證據表明，lncRNA 是調控各種生命過程的重要調節劑。如本文所述，lncRNA 的失調與 HBV-HCC 的發生發展十分密切。盡管在過去 10 年中研究人員對 miRNA 的功能進行了比較廣泛的研究，但對 lncRNA 在 HBV 感染及其誘發的肝細胞癌中的生理及病理意義的關注才剛剛開始。了解 lncRNA 參與的致病機制及調控作用將利于闡明 HBV 引起肝臟癌變的分子機制。但是，目前探究 lncRNA 潛在功能的研究進展緩慢，可能與以下方面有關：① 發現 HBV-HCC 中異常表達 lncRNA 的手段有限；② 對于全新的 lncRNA 缺乏注釋；③ 一條 lncRNA 可能發揮多種生物學功能。其中，目前發現 HBV-HCC 中發揮重要作用的 lncRNA 主要通過：① 提取 HBV-HCC 患者肝臟組織 RNA 進行基因芯片檢測或測序，利用生物信息學篩選得到候選 lncRNA；② 鎖定已知在肝細胞癌或其他腫瘤中的 lncRNA，進一步檢測、研究其在 HBV-HCC 中的表達水平；③ 深入探討僅在 HBV 穩定表達細胞系（如 HepAD38、Hep3B、HepG2.2.15 細胞等）而非普通肝癌細胞系（如 Huh7、HepG2 細胞等）中異常表達的 lncRNA。因此，加深對 lncRNA 的認識，發現并利用 lncRNA 診斷 HBV-HCC 疾病的發生或發展，或者判斷 HBV-HCC 患者預后，或在分子水平上嘗試靶向治療，很可能是今后面臨的挑戰，也更需要進一步的研究以將基礎實驗成果轉化為臨床應用，以期盡早改善 HBV-HCC 患者的生存狀態。