引用本文： 袁余, 王遠芳, 舒玲, 劉雅, 康梅, 馬瑩. 側向層析法檢測隱球菌莢膜多糖抗原在隱球菌感染診斷中的臨床價值. 華西醫學, 2021, 36(8): 1044-1047. doi: 10.7507/1002-0179.202007025 復制
隱球菌是條件致病性深部真菌，易發于細胞免疫功能受損人群，主要累及中樞神經系統、肺、皮膚、骨骼及淋巴結等臟器，可引起人腦膜炎和肺炎等，其中中樞神經系統隱球菌感染占 80%[1]。新型隱球菌是隱球菌屬重要致病菌，屬環境腐生菌，可從土壤和鴿糞中分離，是人和動物的主要傳染源。近年來，因抗菌藥物的濫用以及獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）、惡性腫瘤、器官移植、細胞免疫功能低下、糖尿病等患者增多等因素，隱球菌感染已成為繼白色念珠菌后常見的機會感染真菌[2]。隱球菌感染由于其臨床表現多樣性，缺乏特異性，診斷往往在疾病晚期，導致治療延誤，故對隱球菌感染的早期快速診斷可促進及時有效治療，降低死亡率[3-5]。本研究以我院隱球菌莢膜多糖抗原側向層析法在臨床應用中的情況及與常規病原學檢測方法比較，分析其在臨床應用中的價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集我院 2018 年 1 月—12 月送檢隱球菌莢膜多糖抗原檢測患者臨床資料，排除同一患者同一樣本類型重復送檢。本研究已通過四川大學華西醫院生物醫學倫理分委會審批，審批號：2018 年審（53）號。
1.2 試劑
采用隱球菌莢膜多糖抗原檢測試劑（美國 IMMY 生物科技有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 側向層析法操作流程
隱球菌莢膜多糖抗原側向層析法可檢測腦脊液、血清或血漿樣本，取樣本處理液 40 μL，再加入等體積的腦脊液或血清、血漿樣本，混勻，插入測試條，10 min 后判讀結果。按試劑說明書進行操作，僅質量控制（質控）線出現為陰性；質控線和檢測線同時出現為陽性；質控條帶未出現則檢測失敗，應重做。
1.3.2 微生物培養
腦脊液標本接種到血液培養基（blood agar plate，BAP）、巧克力培養基（chocolate plate，CA）、沙堡弱葡萄糖瓊脂（sabouraud dextrose agar，SDA）培養基；血培養標本接種到 BACT/ALE RT 3D 血培養瓶，陽性再轉種到 BAP、CA、SDA 培養基，35℃ 培養 2～5 d，平板有菌生長后做質譜鑒定。該實驗所有培養平皿均來自鄭州安途生物工程有限公司；質譜儀為德國 Bruker（布魯克）分析儀器公司。
1.3.3 顯微鏡檢查（鏡檢）
腦脊液和痰標本墨汁染色法（墨染法）查找隱球菌菌體；革蘭染色查找具有無色莢膜的紫色圓形菌體。采用日本奧林巴斯顯微鏡，鏡檢倍數：×10、×40、×100。
1.3.4 病理檢測
在 CT 或 B 型超聲引導下進行肺穿刺活檢，經固定、包埋、切片后進行蘇木精-伊紅染色法和特殊染色。
1.4 觀察指標
收集患者姓名、性別、科室、標本類型、病原學和病理學檢測結果等，且病原學和病理學檢測是臨床確診隱球菌感染疾病的金標準。分析臨床送檢樣本類型、送檢科室及病原學檢測中墨汁染色、真菌培養、隱球菌莢膜多糖抗原檢測等結果。
靈敏度=真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%，特異度=真陰性例數/（真陰性例數+假陽性例數）×100%，陽性預測值=真陽性例數/（真陽性例數+假陽性例數）×100%，陰性預測值=真陰性例數/（真陰性例數+假陰性例數）×100%，陽性率=陽性例數/（陽性例數+陰性例數）×100%。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析。計量資料采用中位數進行統計描述，計數資料采用例數和百分比進行統計描述。
2 結果
2.1 患者一般資料
2018 年全院送檢隱球菌莢膜多糖抗原檢測 721 例。送檢患者年齡中位數為 48 歲，最小 7 歲，最大 85 歲；男 391 例，女 330 例；常見送檢科室有感染科、呼吸內科、傳染科、神經內科、急診科等 5 個科室；標本類型：腦脊液樣本 290 例（40.22%），血液樣本 431 例（59.78%）。
由于臨床送檢患者常因頭痛、頭暈、意識障礙、發熱、肺部感染等診斷入院診治，因病理檢測耗時長且需手術或侵襲性操作取材，所以在確診病例中，僅 4 例患者送檢。
2.2 隱球菌莢膜多糖抗原檢出結果
721 例患者中，檢出隱球菌莢膜多糖抗原陽性 66 例，其中已確診隱球菌感染 62 例［隱球菌性腦膜炎 45 例（72.58%）、隱球菌肺炎 16 例（25.81%）、骨隱球菌 1 例（1.61%，肝移植術后）］，假陽性 4 例（臨床診斷分別為系統性紅斑狼瘡、雙肺結核、膿毒血癥、蛋白尿，病理及病原學檢測均提示非隱球菌感染）。
側向層析法檢測隱球菌感染的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別是 100.00%（62/62）、99.39%（655/659）、93.93%（62/66）、100.00%（655/655），見表1；墨染法、真菌培養法、側向層析法檢測隱球菌感染的陽性率分別是 63.46%（33/52）、48.00%（24/50）、100.00%（62/62），見表2。
表1
隱球菌莢膜多糖抗原側向層析法檢測結果（n=721，例）
表2
臨床確診隱球菌感染患者的墨染法、真菌培養法及側向層析法檢測結果比較（n=62，例）
3 討論
隱球菌病患者臨床表現及影像學檢查因缺乏特異性，易漏診、誤診、延誤治療，部分患者甚至被當炎癥或其他感染性疾病治療，最后因腦部手術或肺部手術才被確診[6-7]。目前實驗室對隱球菌檢測主要包括病原學檢測（墨染法、真菌培養法）、免疫學及病理學檢測，且病原學和病理學檢測是臨床確診隱球菌感染疾病的金標準[8-9]。墨染法方便快捷，但人為因素影響大、陽性率低；真菌培養法及組織病理檢測法特異性高，但存在耗時長、侵襲性操作、陽性率低等因素而導致延誤診斷和治療。免疫學方法檢測隱球菌莢膜多糖抗原有酶聯免疫吸附測定法、乳膠凝集法和側向層析法，其中側向層析法為近年來新注冊產品，其采用免疫層析技術，以膠體金標記單克隆抗體，可檢測隱球菌（A-D）4 種血清型，因其有較高敏感性和特異性，且具有操作簡單、快速，結果易判讀等特點，被作為隱球菌感染篩查和輔助診斷的有效方法應用于臨床[10-11]。
2018 年我院送檢隱球菌莢膜多糖抗原檢測 721 例，全年送檢腦脊液標本 290 例、血液標本 431 例。全年檢出隱球菌莢膜多糖抗原陽性樣本 66 例，已確診隱球菌感染 62 例，假陽性 4 例。類風濕因子、二氧化碳噬纖維菌、黏膜口腔球菌、系統性紅斑狼瘡、白吉利毛孢子菌、巨球蛋白、抗酸桿菌均與新生隱球菌莢膜多糖抗原存在交叉抗原，可引起假陽性。因此若隱球菌抗原檢測條帶顯示較弱，臨床隱球菌感染診斷不明，建議重新抽血復查，慎重解釋隱球菌感染。有文獻指出，體內高載量濃度隱球菌所致溝狀現象、感染早期抗原量過低和莢膜過小及體內未知非特異性蛋白對隱球菌抗原的掩蓋效應，可引起假陰性[12-13]。在臨床研究中若考慮溝狀效應，因試劑說明未提及且無臨床標準和專家共識說明樣本最大稀釋倍數，所以一般實驗室會進行 10 倍、20 倍稀釋后進行報告。本文中的陰性樣本為 655 例，未從臨床資料和其他檢查中發現假陰性病例。
目前病原學及病理學檢測是隱球菌感染的“金標準”，62 例有臨床明確診斷的隱球菌抗原陽性患者中，側向層析法檢測陽性率 100.00%，墨染法檢測陽性率 63.46%，真菌培養法檢測陽性率 48.00%。可見側向層析法檢測隱球菌感染的陽性率高于墨染法和真菌培養法。且墨染法和真菌培養法一次檢出率較低，需離心和多次反復送檢可提高陽性檢出率。有文獻報道真菌培養檢出陽性率僅 25%～46%[14]，我院真菌培養法陽性率 48.00% 與其較一致。62 例已確診隱球菌感染患者中，45 例為隱球菌性腦膜炎（72.58%）、隱球菌肺炎 16 例（25.81%）、骨隱球菌感染 1 例（1.61%）。目前，隱球菌性腦膜炎仍是隱球菌感染所致疾病第 1 位，國外隱球菌性腦膜炎研究主要針對 AIDS 患者，而我國隱球菌性腦膜炎患者較多仍是非 AIDS 患者，但在人口增長速度較快的城市 AIDS 患者合并隱球菌性腦膜炎有增多趨勢。肺隱球菌感染常見于免疫力低下人群，可引起急性、亞急性、慢性深部真菌感染。近年來肺隱球菌感染不斷增多，部分患者無臨床表現，部分表現為慢性隱匿起病，病情發展嚴重時可因呼吸衰竭而死。骨隱球菌感染引起的骨髓炎在臨床較為少見，因其影像學特點非特異性，常與結核、惡性腫瘤混淆，所以一般骨隱球菌感染需病理檢測或真菌培養才可確診。骨隱球菌感染一般很少發生在免疫功能正常患者中，我院檢出的該例骨隱球菌病例是 1 例肝移植術后患者，因術后半年出現髖部疼痛不適，伴活動受限，先經隱球菌側向層析法檢測陽性，后進行穿刺活檢查見肉芽腫性炎癥，組織形態學顯示為新型隱球菌感染，所以早期識別和合理選擇抗真菌藥物治療對隱球菌感染愈后影響極大。
近年來，隱球菌莢膜多糖抗原檢測作為隱球菌感染的輔助診斷不斷應用于臨床，本文研究結果表明側向層析法檢測莢膜多糖抗原對隱球菌感染的診斷有較好敏感性和特異性，與已有文獻報道[15-16]一致。基于該檢測方法的高敏感性及特異性，其在敏感性上優于傳統方法，且該檢測方法對實驗室要求不高，標本用量較少、操作簡單、易判讀、用時短等特點，可在不同等級醫院開展用以臨床對隱球菌的早期快速篩查和輔助診斷。
隱球菌是條件致病性深部真菌，易發于細胞免疫功能受損人群，主要累及中樞神經系統、肺、皮膚、骨骼及淋巴結等臟器，可引起人腦膜炎和肺炎等，其中中樞神經系統隱球菌感染占 80%[1]。新型隱球菌是隱球菌屬重要致病菌，屬環境腐生菌，可從土壤和鴿糞中分離，是人和動物的主要傳染源。近年來，因抗菌藥物的濫用以及獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）、惡性腫瘤、器官移植、細胞免疫功能低下、糖尿病等患者增多等因素，隱球菌感染已成為繼白色念珠菌后常見的機會感染真菌[2]。隱球菌感染由于其臨床表現多樣性，缺乏特異性，診斷往往在疾病晚期，導致治療延誤，故對隱球菌感染的早期快速診斷可促進及時有效治療，降低死亡率[3-5]。本研究以我院隱球菌莢膜多糖抗原側向層析法在臨床應用中的情況及與常規病原學檢測方法比較，分析其在臨床應用中的價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集我院 2018 年 1 月—12 月送檢隱球菌莢膜多糖抗原檢測患者臨床資料，排除同一患者同一樣本類型重復送檢。本研究已通過四川大學華西醫院生物醫學倫理分委會審批，審批號：2018 年審（53）號。
1.2 試劑
采用隱球菌莢膜多糖抗原檢測試劑（美國 IMMY 生物科技有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 側向層析法操作流程
隱球菌莢膜多糖抗原側向層析法可檢測腦脊液、血清或血漿樣本，取樣本處理液 40 μL，再加入等體積的腦脊液或血清、血漿樣本，混勻，插入測試條，10 min 后判讀結果。按試劑說明書進行操作，僅質量控制（質控）線出現為陰性；質控線和檢測線同時出現為陽性；質控條帶未出現則檢測失敗，應重做。
1.3.2 微生物培養
腦脊液標本接種到血液培養基（blood agar plate，BAP）、巧克力培養基（chocolate plate，CA）、沙堡弱葡萄糖瓊脂（sabouraud dextrose agar，SDA）培養基；血培養標本接種到 BACT/ALE RT 3D 血培養瓶，陽性再轉種到 BAP、CA、SDA 培養基，35℃ 培養 2～5 d，平板有菌生長后做質譜鑒定。該實驗所有培養平皿均來自鄭州安途生物工程有限公司；質譜儀為德國 Bruker（布魯克）分析儀器公司。
1.3.3 顯微鏡檢查（鏡檢）
腦脊液和痰標本墨汁染色法（墨染法）查找隱球菌菌體；革蘭染色查找具有無色莢膜的紫色圓形菌體。采用日本奧林巴斯顯微鏡，鏡檢倍數：×10、×40、×100。
1.3.4 病理檢測
在 CT 或 B 型超聲引導下進行肺穿刺活檢，經固定、包埋、切片后進行蘇木精-伊紅染色法和特殊染色。
1.4 觀察指標
收集患者姓名、性別、科室、標本類型、病原學和病理學檢測結果等，且病原學和病理學檢測是臨床確診隱球菌感染疾病的金標準。分析臨床送檢樣本類型、送檢科室及病原學檢測中墨汁染色、真菌培養、隱球菌莢膜多糖抗原檢測等結果。
靈敏度=真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%，特異度=真陰性例數/（真陰性例數+假陽性例數）×100%，陽性預測值=真陽性例數/（真陽性例數+假陽性例數）×100%，陰性預測值=真陰性例數/（真陰性例數+假陰性例數）×100%，陽性率=陽性例數/（陽性例數+陰性例數）×100%。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析。計量資料采用中位數進行統計描述，計數資料采用例數和百分比進行統計描述。
2 結果
2.1 患者一般資料
2018 年全院送檢隱球菌莢膜多糖抗原檢測 721 例。送檢患者年齡中位數為 48 歲，最小 7 歲，最大 85 歲；男 391 例，女 330 例；常見送檢科室有感染科、呼吸內科、傳染科、神經內科、急診科等 5 個科室；標本類型：腦脊液樣本 290 例（40.22%），血液樣本 431 例（59.78%）。
由于臨床送檢患者常因頭痛、頭暈、意識障礙、發熱、肺部感染等診斷入院診治，因病理檢測耗時長且需手術或侵襲性操作取材，所以在確診病例中，僅 4 例患者送檢。
2.2 隱球菌莢膜多糖抗原檢出結果
721 例患者中，檢出隱球菌莢膜多糖抗原陽性 66 例，其中已確診隱球菌感染 62 例［隱球菌性腦膜炎 45 例（72.58%）、隱球菌肺炎 16 例（25.81%）、骨隱球菌 1 例（1.61%，肝移植術后）］，假陽性 4 例（臨床診斷分別為系統性紅斑狼瘡、雙肺結核、膿毒血癥、蛋白尿，病理及病原學檢測均提示非隱球菌感染）。
側向層析法檢測隱球菌感染的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別是 100.00%（62/62）、99.39%（655/659）、93.93%（62/66）、100.00%（655/655），見表1；墨染法、真菌培養法、側向層析法檢測隱球菌感染的陽性率分別是 63.46%（33/52）、48.00%（24/50）、100.00%（62/62），見表2。
表1
隱球菌莢膜多糖抗原側向層析法檢測結果（n=721，例）
表2
臨床確診隱球菌感染患者的墨染法、真菌培養法及側向層析法檢測結果比較（n=62，例）
3 討論
隱球菌病患者臨床表現及影像學檢查因缺乏特異性，易漏診、誤診、延誤治療，部分患者甚至被當炎癥或其他感染性疾病治療，最后因腦部手術或肺部手術才被確診[6-7]。目前實驗室對隱球菌檢測主要包括病原學檢測（墨染法、真菌培養法）、免疫學及病理學檢測，且病原學和病理學檢測是臨床確診隱球菌感染疾病的金標準[8-9]。墨染法方便快捷，但人為因素影響大、陽性率低；真菌培養法及組織病理檢測法特異性高，但存在耗時長、侵襲性操作、陽性率低等因素而導致延誤診斷和治療。免疫學方法檢測隱球菌莢膜多糖抗原有酶聯免疫吸附測定法、乳膠凝集法和側向層析法，其中側向層析法為近年來新注冊產品，其采用免疫層析技術，以膠體金標記單克隆抗體，可檢測隱球菌（A-D）4 種血清型，因其有較高敏感性和特異性，且具有操作簡單、快速，結果易判讀等特點，被作為隱球菌感染篩查和輔助診斷的有效方法應用于臨床[10-11]。
2018 年我院送檢隱球菌莢膜多糖抗原檢測 721 例，全年送檢腦脊液標本 290 例、血液標本 431 例。全年檢出隱球菌莢膜多糖抗原陽性樣本 66 例，已確診隱球菌感染 62 例，假陽性 4 例。類風濕因子、二氧化碳噬纖維菌、黏膜口腔球菌、系統性紅斑狼瘡、白吉利毛孢子菌、巨球蛋白、抗酸桿菌均與新生隱球菌莢膜多糖抗原存在交叉抗原，可引起假陽性。因此若隱球菌抗原檢測條帶顯示較弱，臨床隱球菌感染診斷不明，建議重新抽血復查，慎重解釋隱球菌感染。有文獻指出，體內高載量濃度隱球菌所致溝狀現象、感染早期抗原量過低和莢膜過小及體內未知非特異性蛋白對隱球菌抗原的掩蓋效應，可引起假陰性[12-13]。在臨床研究中若考慮溝狀效應，因試劑說明未提及且無臨床標準和專家共識說明樣本最大稀釋倍數，所以一般實驗室會進行 10 倍、20 倍稀釋后進行報告。本文中的陰性樣本為 655 例，未從臨床資料和其他檢查中發現假陰性病例。
目前病原學及病理學檢測是隱球菌感染的“金標準”，62 例有臨床明確診斷的隱球菌抗原陽性患者中，側向層析法檢測陽性率 100.00%，墨染法檢測陽性率 63.46%，真菌培養法檢測陽性率 48.00%。可見側向層析法檢測隱球菌感染的陽性率高于墨染法和真菌培養法。且墨染法和真菌培養法一次檢出率較低，需離心和多次反復送檢可提高陽性檢出率。有文獻報道真菌培養檢出陽性率僅 25%～46%[14]，我院真菌培養法陽性率 48.00% 與其較一致。62 例已確診隱球菌感染患者中，45 例為隱球菌性腦膜炎（72.58%）、隱球菌肺炎 16 例（25.81%）、骨隱球菌感染 1 例（1.61%）。目前，隱球菌性腦膜炎仍是隱球菌感染所致疾病第 1 位，國外隱球菌性腦膜炎研究主要針對 AIDS 患者，而我國隱球菌性腦膜炎患者較多仍是非 AIDS 患者，但在人口增長速度較快的城市 AIDS 患者合并隱球菌性腦膜炎有增多趨勢。肺隱球菌感染常見于免疫力低下人群，可引起急性、亞急性、慢性深部真菌感染。近年來肺隱球菌感染不斷增多，部分患者無臨床表現，部分表現為慢性隱匿起病，病情發展嚴重時可因呼吸衰竭而死。骨隱球菌感染引起的骨髓炎在臨床較為少見，因其影像學特點非特異性，常與結核、惡性腫瘤混淆，所以一般骨隱球菌感染需病理檢測或真菌培養才可確診。骨隱球菌感染一般很少發生在免疫功能正常患者中，我院檢出的該例骨隱球菌病例是 1 例肝移植術后患者，因術后半年出現髖部疼痛不適，伴活動受限，先經隱球菌側向層析法檢測陽性，后進行穿刺活檢查見肉芽腫性炎癥，組織形態學顯示為新型隱球菌感染，所以早期識別和合理選擇抗真菌藥物治療對隱球菌感染愈后影響極大。
近年來，隱球菌莢膜多糖抗原檢測作為隱球菌感染的輔助診斷不斷應用于臨床，本文研究結果表明側向層析法檢測莢膜多糖抗原對隱球菌感染的診斷有較好敏感性和特異性，與已有文獻報道[15-16]一致。基于該檢測方法的高敏感性及特異性，其在敏感性上優于傳統方法，且該檢測方法對實驗室要求不高，標本用量較少、操作簡單、易判讀、用時短等特點，可在不同等級醫院開展用以臨床對隱球菌的早期快速篩查和輔助診斷。
