引用本文： 白婷婷, 王丹, 范英子, 楊向貴, 周琴, 許穎. 耐亞胺培南銅綠假單胞菌 OprD2 基因多態性的研究. 華西醫學, 2020, 35(8): 924-929. doi: 10.7507/1002-0179.202006367 復制
銅綠假單胞菌是常見的條件致病菌，也是引起院內感染的主要致病菌[1-2]，常見于燒傷或創傷后，嚴重者可引起敗血癥，致死率甚高。2018 年全國細菌耐藥監測報告顯示，銅綠假單胞菌的分離率占革蘭陰性菌的 12.4%，位居第三[3]。亞胺培南由于抗菌譜廣、抗菌活性強的優點，在臨床抗感染治療中被廣泛應用，隨之產生越來越多的耐亞胺培南銅綠假單胞菌（imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa，IRPA），給臨床抗感染治療帶來很大困難。上世紀 80 年代以來，與亞胺培南耐藥相關的膜孔蛋白 OprD2 受到人們的關注。Yoneyama 等[4]通過基因重組的方式證實了 OprD2 基因在銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥中的作用。Fang 等[5]發現 OprD2 基因的缺失或突變會導致銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥性的增加。目前大量研究表明 IRPA 中 OprD2 基因缺失情況較為普遍，但是不同地區的發生率與變異位點具有明顯差異。本研究旨在從 OprD2 mRNA 表達量及序列分析來探討本院 IRPA 菌株的耐藥特征與機制。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株來源
收集成都醫學院第一附屬醫院 2018 年 12 月－2019 年 12 月從臨床標本中分離的銅綠假單胞菌，儀器法和紙片擴散法亞胺培南均為耐藥的菌株入選耐藥組，剔除同一患者相同部位的重復菌株［藥物敏感性（藥敏）試驗結果相同的只保存第 1 株］，最終耐藥組納入 30 株；隨機選擇 30 株同時期亞胺培南敏感的銅綠假單胞菌為敏感組。兩組菌株–80℃ 保存備用。質量控制菌株為 ATCC 27853（本實驗室保存）。本研究經成都醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會審核批準，批件號：2020CYFYHEC-BA-69。
1.1.2 儀器與試劑
主要儀器為 VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定及藥敏分析系統（法國生物梅里埃公司）、熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國 Bio-Rad 公司）、TC 型基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）。血平板、麥康凱平板、巧克力平板及 Mueller-Hintot 瓊脂平板為成都瑞琦科技實業股份有限公司產品；GN 鑒定卡和 GN13 藥敏卡為法國生物梅里埃公司產品，亞胺培南紙片為溫州市康泰生物科技有限公司產品，逆轉錄試劑盒 iScriptTM cDNA Synthesis Kit、SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix 為美國 Bio-Rad 公司產品，2×Taq PCR Mix 為天根生化科技（北京）有限公司產品。引物均由四川生工生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 細菌鑒定及藥敏試驗
采用 VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定及藥敏分析系統根據臨床微生物標本規范化操作進行細菌培養鑒定及藥敏試驗。結果經紙片擴散法復核，按照美國臨床和實驗室標準協會 2020 版[6]判讀結果，儀器法最低抑菌濃度≥8 μg/mL，且紙片抑菌圈≤15 mm 的納入耐藥組，儀器法最低抑菌濃度≤2 μg/mL，且紙片抑菌圈≥19 mm 的納入敏感組。
1.2.2 實時熒光定量 PCR
將耐藥組與敏感組各 30 株細菌進行復蘇，取單個菌落放入 2 mL LB 液體培養基中，放置搖床內 37℃、150 r/min 培養過夜，離心收集菌體。采用 Trizol 裂解法按操作說明提取細菌總 RNA。逆轉錄反應采用 10 μL 體系，反應條件為：25℃ 5 min，46℃ 20 min，95℃ 1 min，最后 4℃ 保存。以合成的互補 DNA（complementary DNA，cDNA）為模板，進行實時熒光定量 PCR，上游引物：5′-GCGCATCTCCAAGACCATG-3′，下游引物：5′-GCCACGCGATTTGACGGAG-3′。以 16sRNA 作為內參，上游引物：5′-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′，下游引物：5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′。PCR 采用 10 μL 體系，2×Supermix 5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 500～1 000 ng，雙蒸水加至 10 μL，反應條件：95℃ 2 min，95℃ 10 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，共 40 個循環。實驗結束后結合擴增曲線和融解曲線判斷擴增反應的有效性與特異性。采用 2–△△Ct 法分析 mRNA 的相對表達量。結果以標準菌株 ATCC 27853 基因表達量記為 1，耐藥組銅綠假單胞菌 OprD2 表達量下降 30% 以上的認為表達降低，進行基因序列分析。
1.2.3 細菌 DNA 提取
選擇 OprD2 表達下降的菌株血平板復蘇，挑取適量菌落放入裝有 200 μL 無菌蒸餾水的 1.5 mL 離心管內。100℃ 煮沸 10 min，冷卻后用低溫離心機 4℃ 12 000 r/min 離心 10 min（離心半徑 7 cm），上清即為細菌 DNA，吸取 100 μL 轉移至一新的離心管內，–20℃ 保存備用。
1.2.4 基因擴增
根據 GenBank 序列（NC_002516）設計引物，OprD2 上游引物：5′-ATGAAAGTGATGAAGTGGAGCG-3′，OprD2 下游引物：5′-TTACAGGATCGACAGCGGATAG-3′，片段大小為 1 332 bp。PCR 反應采用 25 μL 體系：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，DNA 模板 2 μL，上游引物、下游引物各 1 μL，雙蒸水補齊至 25 μL。PCR 反應條件為：94℃ 預變性 3 min；94℃ 變性 30 s→55℃ 退火 30 s→72℃ 延伸 1 min，共 30 個循環；最后 72℃ 延伸 5 min。擴增產物經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳（130 V、15 min）檢測片段的大小與質量。
1.2.5 測序及序列分析
將擴增成功的 PCR 產物送至華大基因科技股份有限公司進行基因測序。測序結果返回后，在美國國立生物技術信息中心網站上利用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）與 GeneBank 中的銅綠假單胞菌序列（X63152）進行比對以確定突變情況。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 16.0 軟件進行統計分析。首先以 Kolmogorov-Smirnov 法對耐藥組與敏感組 OprD2 mRNA 的相對表達量進行正態性檢驗，若數據呈正態分布，采用均數±標準差表示，組間比較采用兩獨立樣本 t 檢驗；若數據呈非正態分布，則采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，并將數據轉換成正態分布后采用兩獨立樣本 t 檢驗分析組間差異（方差不齊時采用 t’ 檢驗）。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 標本基本情況
30 株非重復 IRPA 來源的臨床樣本信息見表 1，主要分布在呼吸內科（23.3%，7/30）、重癥醫學科（intensive care unit，ICU）（13.3%，4/30）、神經內科（10.0%，3/30）、神經外科（10.0%，3/30）與急診科（10.0%，3/30）。標本類型以呼吸道標本為主（80.0%，24/30），其次是傷口分泌物（10.0%，3/30）和尿標本（6.7%，2/30）。
表1
IRPA 株來源的臨床信息
2.2 OprD2 mRNA 表達量的檢測
將 30 株耐藥組與 30 株敏感組的銅綠假單胞菌菌株采用實時熒光定量 PCR 方法檢測 OprD2 基因的 mRNA 表達水平，正態性檢驗顯示敏感組表達量不服從正態分布（P=0.04）；以中位數（下四分位數，上四分位數）表示，耐藥物與敏感組的 OprD2 基因的 mRNA 表達量分別為 0.32（0.03，1.23）與 0.70（0.06，2.68）。兩組表達量數據進行平方根轉換后（0.65±0.52、1.03±0.90）均符合正態分布（P=0.54、0.45），但是方差不齊（F=8.478，P=0.005），采用 t’ 檢驗，結果顯示耐藥組與敏感組的表達量差異有統計學意義（t’=–2.030，P=0.048），耐藥株表達量明顯下降。見圖 1。
圖1
耐藥組與敏感組 OprD2 基因的 mRNA 表達量
a. 原數據；b. 平方根轉換后的比較，*
2.3 耐藥株 OprD2 序列分析
BLAST 比對結果顯示，11 株 OprD2 表達顯著降低的銅綠假單胞菌基因突變率達到 100%（11/11），每個菌株都有不同位置的多個突變類型，導致氨基酸發生改變的突變共有 29 種，其中 8 種突變類型位于 L2、L3 莖環結構。另外還在 4 個菌株中發現 1114-1115 的 TA 缺失突變，導致后邊的序列發生移碼突變。12 號菌株發生了 OprD2 基因的大片段缺失。每個菌株都有多處無義點突變。部分測序峰圖見圖 2。具體突變情況詳見表 2。
表2
IRPA 中的 OprD2 基因突變類型
圖2
部分 OprD2 基因測序結果
3 討論
銅綠假單胞菌廣泛存在于自然界，正常人體的皮膚、腸道和呼吸道等都是銅綠假單胞菌的定植場所，當人體免疫力下降、發生創傷以及患有肺炎時極易發生感染且治愈難度大[7]。在臨床上隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛應用，越來越多的 IRPA 產生。2018 年全國細菌耐藥監測報告中，亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌的檢出率為 18.4%，近 6 年來居高不下[3]，增加醫院感染風險的同時，也給臨床抗感染治療帶來嚴峻的挑戰。
銅綠假單胞菌對亞胺培南等碳青霉烯類抗生素耐藥的機制主要是產生 β-內酰胺酶和膜孔蛋白缺失。銅綠假單胞菌的膜孔蛋白 OprD2 具有孔道活性，是小分子親水物質進入細菌的通道[8]。OprD2 基因位于細菌染色體上，共編碼 443 個氨基酸，包括 23aa 的信號肽與 420aa 的成熟肽，形成 16 個跨膜 β 鏈分布于膜內外[9]。上世紀 80 年代，Quinn 等[10]第一次報道了膜孔蛋白 OprD2 與亞胺培南耐藥相關，OprD2 蛋白是亞胺培南選擇性快速進入銅綠假單胞菌的特異性通道，OprD2 基因的缺失或表達下降會導致亞胺培南耐藥性。之后國內外陸續報道了 IRPA 中 OprD2 基因的多種突變類型，主要包括點突變、插入突變和缺失等[5, 11-13]，但并不是所有 OprD2 基因突變都會使銅綠假單胞菌對亞胺培南產生耐藥。
本研究收集了我院臨床標本中分離的銅綠假單胞菌，根據亞胺培南的藥敏結果將菌株分為耐藥組與敏感組，首先通過實時熒光定量 PCR 實驗，發現耐藥組 OprD2 基因的表達量明顯降低，兩組之間差異有統計學意義（P=0.048）；進而對 11 株 OprD2 表達下降的菌株進行測序分析，結果顯示與 X63152 序列比對，突變率為 100%（11/11），主要突變類型為點突變，與之前報道[4, 14]有一定差異。Yoneyama 等[4]和宋詩鐸等[14]發現，在 IRPA 中 OprD2 基因的主要變異類型是 2 種缺失突變，一種是 395～405 位 11 bp 的小片段缺失，另一種是啟動子上游 519 位到編碼區 685 位的 1 204 bp 的大片段缺失。但在本研究中只有 1 株菌株存在?519～685 大片段的缺失。IRPA 中 OprD2 基因的缺失率全國各地的報道存在差異[15]，可能與地理位置差異和抗菌藥物使用習慣等因素有關。Kim 等[13]的研究顯示框碼移位是銅綠假單胞菌 OprD2 基因的常見突變。本研究中發現了一種缺失突變 c.1114-1115delAT，它引起下游序列的閱讀框發生改變，導致膜孔蛋白的氨基酸序列發生較大改變，此突變位于膜孔蛋白的 L7 環，有研究表明這一結構與美羅培南的耐藥有關[16]，需要進一步研究。本實驗中的耐藥株可分為 4 個不同的克隆，分別具有不同的突變位點和突變類型。其中 c.308C→G、c.344A→C、c.379G→C、c.471G→C、c.508T→C、c.553 G→C、c.556-558CCG→GGC 與 c.565-566TG→AC 的錯義突變引起膜孔蛋白 L2、L3 莖環結構上的氨基酸改變。L2 被認為是亞胺培南的結合位點，L3 可能是亞胺培南進入細菌的通道[7]，這些突變可能導致外膜對亞胺培南的通透性下降，從而產生耐藥。本研究中檢測到的 p.K115T、p.V127L、p.F170L、p.E185Q、p.R310E、p.V189T、p.P186G 與 p.E202Q 等 8 種變異國內外均有報道[5, 11-13, 17-18]，但也發現不少新的氨基酸突變位點（p.I210A、p.S240T、p.N262T、p.A281G 與 p.K296Q），發生率達到 9/11，p.E230K 的突變率為 7/11。此外還有其他發生頻率較少的點突變和無義突變被檢測到。
綜上所述，OprD2 基因變異與銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥密切相關，且突變類型存在地區差異。本地區 IRPA 中 OprD2 基因的主要突變方式是點突變。后續我們將會在敏感組中檢測上述突變類型，并期望通過基因重組的方式來驗證突變的功能，以期為銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的分子檢測提供理論依據。了解本院耐藥株的突變譜對于防止耐藥菌的傳播與院內感染的暴發也具有重要意義。
銅綠假單胞菌是常見的條件致病菌，也是引起院內感染的主要致病菌[1-2]，常見于燒傷或創傷后，嚴重者可引起敗血癥，致死率甚高。2018 年全國細菌耐藥監測報告顯示，銅綠假單胞菌的分離率占革蘭陰性菌的 12.4%，位居第三[3]。亞胺培南由于抗菌譜廣、抗菌活性強的優點，在臨床抗感染治療中被廣泛應用，隨之產生越來越多的耐亞胺培南銅綠假單胞菌（imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa，IRPA），給臨床抗感染治療帶來很大困難。上世紀 80 年代以來，與亞胺培南耐藥相關的膜孔蛋白 OprD2 受到人們的關注。Yoneyama 等[4]通過基因重組的方式證實了 OprD2 基因在銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥中的作用。Fang 等[5]發現 OprD2 基因的缺失或突變會導致銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥性的增加。目前大量研究表明 IRPA 中 OprD2 基因缺失情況較為普遍，但是不同地區的發生率與變異位點具有明顯差異。本研究旨在從 OprD2 mRNA 表達量及序列分析來探討本院 IRPA 菌株的耐藥特征與機制。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株來源
收集成都醫學院第一附屬醫院 2018 年 12 月－2019 年 12 月從臨床標本中分離的銅綠假單胞菌，儀器法和紙片擴散法亞胺培南均為耐藥的菌株入選耐藥組，剔除同一患者相同部位的重復菌株［藥物敏感性（藥敏）試驗結果相同的只保存第 1 株］，最終耐藥組納入 30 株；隨機選擇 30 株同時期亞胺培南敏感的銅綠假單胞菌為敏感組。兩組菌株–80℃ 保存備用。質量控制菌株為 ATCC 27853（本實驗室保存）。本研究經成都醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會審核批準，批件號：2020CYFYHEC-BA-69。
1.1.2 儀器與試劑
主要儀器為 VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定及藥敏分析系統（法國生物梅里埃公司）、熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國 Bio-Rad 公司）、TC 型基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）。血平板、麥康凱平板、巧克力平板及 Mueller-Hintot 瓊脂平板為成都瑞琦科技實業股份有限公司產品；GN 鑒定卡和 GN13 藥敏卡為法國生物梅里埃公司產品，亞胺培南紙片為溫州市康泰生物科技有限公司產品，逆轉錄試劑盒 iScriptTM cDNA Synthesis Kit、SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix 為美國 Bio-Rad 公司產品，2×Taq PCR Mix 為天根生化科技（北京）有限公司產品。引物均由四川生工生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 細菌鑒定及藥敏試驗
采用 VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定及藥敏分析系統根據臨床微生物標本規范化操作進行細菌培養鑒定及藥敏試驗。結果經紙片擴散法復核，按照美國臨床和實驗室標準協會 2020 版[6]判讀結果，儀器法最低抑菌濃度≥8 μg/mL，且紙片抑菌圈≤15 mm 的納入耐藥組，儀器法最低抑菌濃度≤2 μg/mL，且紙片抑菌圈≥19 mm 的納入敏感組。
1.2.2 實時熒光定量 PCR
將耐藥組與敏感組各 30 株細菌進行復蘇，取單個菌落放入 2 mL LB 液體培養基中，放置搖床內 37℃、150 r/min 培養過夜，離心收集菌體。采用 Trizol 裂解法按操作說明提取細菌總 RNA。逆轉錄反應采用 10 μL 體系，反應條件為：25℃ 5 min，46℃ 20 min，95℃ 1 min，最后 4℃ 保存。以合成的互補 DNA（complementary DNA，cDNA）為模板，進行實時熒光定量 PCR，上游引物：5′-GCGCATCTCCAAGACCATG-3′，下游引物：5′-GCCACGCGATTTGACGGAG-3′。以 16sRNA 作為內參，上游引物：5′-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′，下游引物：5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′。PCR 采用 10 μL 體系，2×Supermix 5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 500～1 000 ng，雙蒸水加至 10 μL，反應條件：95℃ 2 min，95℃ 10 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，共 40 個循環。實驗結束后結合擴增曲線和融解曲線判斷擴增反應的有效性與特異性。采用 2–△△Ct 法分析 mRNA 的相對表達量。結果以標準菌株 ATCC 27853 基因表達量記為 1，耐藥組銅綠假單胞菌 OprD2 表達量下降 30% 以上的認為表達降低，進行基因序列分析。
1.2.3 細菌 DNA 提取
選擇 OprD2 表達下降的菌株血平板復蘇，挑取適量菌落放入裝有 200 μL 無菌蒸餾水的 1.5 mL 離心管內。100℃ 煮沸 10 min，冷卻后用低溫離心機 4℃ 12 000 r/min 離心 10 min（離心半徑 7 cm），上清即為細菌 DNA，吸取 100 μL 轉移至一新的離心管內，–20℃ 保存備用。
1.2.4 基因擴增
根據 GenBank 序列（NC_002516）設計引物，OprD2 上游引物：5′-ATGAAAGTGATGAAGTGGAGCG-3′，OprD2 下游引物：5′-TTACAGGATCGACAGCGGATAG-3′，片段大小為 1 332 bp。PCR 反應采用 25 μL 體系：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，DNA 模板 2 μL，上游引物、下游引物各 1 μL，雙蒸水補齊至 25 μL。PCR 反應條件為：94℃ 預變性 3 min；94℃ 變性 30 s→55℃ 退火 30 s→72℃ 延伸 1 min，共 30 個循環；最后 72℃ 延伸 5 min。擴增產物經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳（130 V、15 min）檢測片段的大小與質量。
1.2.5 測序及序列分析
將擴增成功的 PCR 產物送至華大基因科技股份有限公司進行基因測序。測序結果返回后，在美國國立生物技術信息中心網站上利用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）與 GeneBank 中的銅綠假單胞菌序列（X63152）進行比對以確定突變情況。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 16.0 軟件進行統計分析。首先以 Kolmogorov-Smirnov 法對耐藥組與敏感組 OprD2 mRNA 的相對表達量進行正態性檢驗，若數據呈正態分布，采用均數±標準差表示，組間比較采用兩獨立樣本 t 檢驗；若數據呈非正態分布，則采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，并將數據轉換成正態分布后采用兩獨立樣本 t 檢驗分析組間差異（方差不齊時采用 t’ 檢驗）。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 標本基本情況
30 株非重復 IRPA 來源的臨床樣本信息見表 1，主要分布在呼吸內科（23.3%，7/30）、重癥醫學科（intensive care unit，ICU）（13.3%，4/30）、神經內科（10.0%，3/30）、神經外科（10.0%，3/30）與急診科（10.0%，3/30）。標本類型以呼吸道標本為主（80.0%，24/30），其次是傷口分泌物（10.0%，3/30）和尿標本（6.7%，2/30）。
表1
IRPA 株來源的臨床信息
2.2 OprD2 mRNA 表達量的檢測
將 30 株耐藥組與 30 株敏感組的銅綠假單胞菌菌株采用實時熒光定量 PCR 方法檢測 OprD2 基因的 mRNA 表達水平，正態性檢驗顯示敏感組表達量不服從正態分布（P=0.04）；以中位數（下四分位數，上四分位數）表示，耐藥物與敏感組的 OprD2 基因的 mRNA 表達量分別為 0.32（0.03，1.23）與 0.70（0.06，2.68）。兩組表達量數據進行平方根轉換后（0.65±0.52、1.03±0.90）均符合正態分布（P=0.54、0.45），但是方差不齊（F=8.478，P=0.005），采用 t’ 檢驗，結果顯示耐藥組與敏感組的表達量差異有統計學意義（t’=–2.030，P=0.048），耐藥株表達量明顯下降。見圖 1。
圖1
耐藥組與敏感組 OprD2 基因的 mRNA 表達量
a. 原數據；b. 平方根轉換后的比較，*
2.3 耐藥株 OprD2 序列分析
BLAST 比對結果顯示，11 株 OprD2 表達顯著降低的銅綠假單胞菌基因突變率達到 100%（11/11），每個菌株都有不同位置的多個突變類型，導致氨基酸發生改變的突變共有 29 種，其中 8 種突變類型位于 L2、L3 莖環結構。另外還在 4 個菌株中發現 1114-1115 的 TA 缺失突變，導致后邊的序列發生移碼突變。12 號菌株發生了 OprD2 基因的大片段缺失。每個菌株都有多處無義點突變。部分測序峰圖見圖 2。具體突變情況詳見表 2。
表2
IRPA 中的 OprD2 基因突變類型
圖2
部分 OprD2 基因測序結果
3 討論
銅綠假單胞菌廣泛存在于自然界，正常人體的皮膚、腸道和呼吸道等都是銅綠假單胞菌的定植場所，當人體免疫力下降、發生創傷以及患有肺炎時極易發生感染且治愈難度大[7]。在臨床上隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛應用，越來越多的 IRPA 產生。2018 年全國細菌耐藥監測報告中，亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌的檢出率為 18.4%，近 6 年來居高不下[3]，增加醫院感染風險的同時，也給臨床抗感染治療帶來嚴峻的挑戰。
銅綠假單胞菌對亞胺培南等碳青霉烯類抗生素耐藥的機制主要是產生 β-內酰胺酶和膜孔蛋白缺失。銅綠假單胞菌的膜孔蛋白 OprD2 具有孔道活性，是小分子親水物質進入細菌的通道[8]。OprD2 基因位于細菌染色體上，共編碼 443 個氨基酸，包括 23aa 的信號肽與 420aa 的成熟肽，形成 16 個跨膜 β 鏈分布于膜內外[9]。上世紀 80 年代，Quinn 等[10]第一次報道了膜孔蛋白 OprD2 與亞胺培南耐藥相關，OprD2 蛋白是亞胺培南選擇性快速進入銅綠假單胞菌的特異性通道，OprD2 基因的缺失或表達下降會導致亞胺培南耐藥性。之后國內外陸續報道了 IRPA 中 OprD2 基因的多種突變類型，主要包括點突變、插入突變和缺失等[5, 11-13]，但并不是所有 OprD2 基因突變都會使銅綠假單胞菌對亞胺培南產生耐藥。
本研究收集了我院臨床標本中分離的銅綠假單胞菌，根據亞胺培南的藥敏結果將菌株分為耐藥組與敏感組，首先通過實時熒光定量 PCR 實驗，發現耐藥組 OprD2 基因的表達量明顯降低，兩組之間差異有統計學意義（P=0.048）；進而對 11 株 OprD2 表達下降的菌株進行測序分析，結果顯示與 X63152 序列比對，突變率為 100%（11/11），主要突變類型為點突變，與之前報道[4, 14]有一定差異。Yoneyama 等[4]和宋詩鐸等[14]發現，在 IRPA 中 OprD2 基因的主要變異類型是 2 種缺失突變，一種是 395～405 位 11 bp 的小片段缺失，另一種是啟動子上游 519 位到編碼區 685 位的 1 204 bp 的大片段缺失。但在本研究中只有 1 株菌株存在?519～685 大片段的缺失。IRPA 中 OprD2 基因的缺失率全國各地的報道存在差異[15]，可能與地理位置差異和抗菌藥物使用習慣等因素有關。Kim 等[13]的研究顯示框碼移位是銅綠假單胞菌 OprD2 基因的常見突變。本研究中發現了一種缺失突變 c.1114-1115delAT，它引起下游序列的閱讀框發生改變，導致膜孔蛋白的氨基酸序列發生較大改變，此突變位于膜孔蛋白的 L7 環，有研究表明這一結構與美羅培南的耐藥有關[16]，需要進一步研究。本實驗中的耐藥株可分為 4 個不同的克隆，分別具有不同的突變位點和突變類型。其中 c.308C→G、c.344A→C、c.379G→C、c.471G→C、c.508T→C、c.553 G→C、c.556-558CCG→GGC 與 c.565-566TG→AC 的錯義突變引起膜孔蛋白 L2、L3 莖環結構上的氨基酸改變。L2 被認為是亞胺培南的結合位點，L3 可能是亞胺培南進入細菌的通道[7]，這些突變可能導致外膜對亞胺培南的通透性下降，從而產生耐藥。本研究中檢測到的 p.K115T、p.V127L、p.F170L、p.E185Q、p.R310E、p.V189T、p.P186G 與 p.E202Q 等 8 種變異國內外均有報道[5, 11-13, 17-18]，但也發現不少新的氨基酸突變位點（p.I210A、p.S240T、p.N262T、p.A281G 與 p.K296Q），發生率達到 9/11，p.E230K 的突變率為 7/11。此外還有其他發生頻率較少的點突變和無義突變被檢測到。
綜上所述，OprD2 基因變異與銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥密切相關，且突變類型存在地區差異。本地區 IRPA 中 OprD2 基因的主要突變方式是點突變。后續我們將會在敏感組中檢測上述突變類型，并期望通過基因重組的方式來驗證突變的功能，以期為銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的分子檢測提供理論依據。了解本院耐藥株的突變譜對于防止耐藥菌的傳播與院內感染的暴發也具有重要意義。
