引用本文： 王芳, 王群, 辛力華, 張瓊芳, 李睿, 吳波, 任然, 張青. 某中醫院耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥表型及耐藥基因分析. 華西醫學, 2020, 35(8): 912-917. doi: 10.7507/1002-0179.202005354 復制
碳青霉烯類藥物因其抗菌譜廣、抗菌活性強、不良反應少等優點成為了治療重癥革蘭陰性桿菌感染的首選藥物。然而，近年來產超廣譜 β-內酰胺酶（extended spectrum β-lactamase，ESBL）的腸桿菌科細菌廣泛傳播，碳青霉烯類抗菌藥物大量應用，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（carbapenem resistant Enterobacteriaceae，CRE）逐漸出現并流行起來。由于治療方式有限、傳播迅速、發病率和死亡率高，CRE 已經成為近 10 年來全球最大的傳染病威脅之一[1]，給臨床診療帶來了巨大挑戰。CRE 的耐藥機制主要集中在耐藥酶的產生、靶點的改變、活性外排泵和膜通透性的改變、靶酶或競爭性靶酶底物的過度合成等幾個方面[2]，其中最主要的耐藥機制是產碳青霉烯酶[3]。為明確 CRE 的分子流行病學特點，本次研究收集成都中醫藥大學附屬醫院近 3 年臨床標本中分離到的 CRE 菌株，進行碳青霉烯酶表型確證試驗、耐藥基因擴增和測序，分析該院 CRE 主要耐藥機制，幫助臨床醫師選擇最佳治療方案，減少細菌耐藥性的發生。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料
1.1.1 菌株來源
2 901 例腸桿菌科細菌來自成都中醫藥大學附屬醫院臨床各科室 2016 年 1 月—2018 年 12 月送檢標本，按照《全國臨床檢驗操作規程》第 4 版[4]分離所得。剔除分離自同一患者同一部位的重復菌株冷凍保存，根據菌株所屬患者的病歷號，回顧性分析其臨床資料。
1.1.2 實驗儀器及試劑
VITEK-2 Compact 細菌分析鑒定和藥物敏感性（藥敏）試驗系統及其配套的鑒定及藥敏卡、瓊脂平板為法國生物梅里埃公司生產，紙片擴散法藥敏紙片、胰蛋白胨和酵母提取物購于英國 OXOID 公司，細菌裂解液購于上海貝博生物有限公司，七水硫酸鋅、酚紅、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）反應混合液、DNA 分子量標準（marker）和核酸染料均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，亞胺培南/西司他丁鈉購自杭州默沙東制藥有限公司。PCR 擴增儀來自美國 BIO-RAD 有限公司，電泳凝膠成像儀產自北京君意東方公司。基因測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行。
1.1.3 質量控制菌株
陰溝腸桿菌 ATCC 700323、嗜麥芽窄食單胞菌 ATCC 17666、大腸埃希菌 ATCC 25922、肺炎克雷伯菌 ATCC 700603 等質量控制菌株由國家衛生健康委臨床檢驗中心提供。CRE 陽性對照菌株 S1707 經基因測序確定為攜帶blaKPC-2 基因的肺炎克雷伯菌，來自四川省臨床檢驗中心。
1.2 實驗方法
1.2.1 細菌分離培養鑒定及藥敏試驗
按照《全國臨床檢驗標準操作規程》第 4 版的要求進行病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[4]，藥敏結果按美國臨床和實驗室標準協會標準[5]進行判讀。
1.2.2 碳青霉烯酶的表型檢測
① 改良 Hodge 試驗。將大腸埃希菌 ATCC 25922 菌落調成 0.5 麥氏濁度的菌懸液，用生理鹽水稀釋 10 倍后均勻涂布于 Mueller-Hinton（MH）瓊脂平板上，放置 10 min。將美羅培南紙片貼于涂有菌懸液 MH 瓊脂平板中，用接種環挑取 3～5 個待測菌落從紙片邊緣開始劃線，劃至平板邊緣，（35±2）℃ 孵育 16～20 h。若平板上大腸埃希菌與待測菌株抑菌圈的交匯處大腸埃希菌出現增強性生長，則改良 Hodge 試驗陽性，提示待測菌產碳青霉烯酶。
② 改良碳青霉烯酶滅活（modified carbapenem inactivation method，mCIM）試驗。取 1 μL 接種環的過夜培養純菌落于 2 mL 胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）中，每管放入 1 張美羅培南紙片，（35±2）℃ 孵育 4 h±15 min。制備 0.5 麥氏濁度的大腸埃希菌菌懸液并涂布 MH 平板，干燥 5 min。將美羅培南紙片從 TSB 中取出，貼于 MH 平板上，（35±2）℃ 培養 18～24 h 后量取抑菌圈直徑。美羅培南抑菌圈直徑為 6～15 mm 或直徑為 16～18 mm 但抑菌圈內有肉眼可見的散在菌落為碳青霉烯酶陽性。
③ Carba NP 試驗。取 2 支無菌管，分別標記“A”“B”，先在 A、B 管中分別加入 100 μL 細菌蛋白提取液，后向 A 管加 100 μL Carba NP 試劑 A，B 管加 100 μL Carba NP 試劑 B，震蕩混勻，（35±2）℃ 孵育 2 h，顏色由紅色或橘紅色變成深黃色或黃色為陽性結果，提示待測菌產碳青霉烯酶。
1.2.3 耐藥基因檢測
根據試劑盒說明書制備細菌 DNA 模板，采用 PCR 方法，針對 KPC、NDM、GES、SME、IMI、NMC、IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、OXA 這 12 種酶，參照文獻[6-8]合成引物，所有引物經美國國立生物技術信息中心基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）驗證，將擴增陽性產物進行瓊脂糖凝膠電泳確定目的條帶，最后由生工生物工程（上海）股份有限公司進行耐藥基因測序。測序結果經過 GenBank 在線數據庫比對，分析耐藥基因型別。
1.3 統計學方法
所有數據采用 WHONET 5.6 軟件進行數據統計處理，用 SPSS 21.0 軟件進行統計學分析。計數資料采用株數和率表示；CRE 分離率隨時間的變化趨勢分析采用趨勢χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細菌分布情況
我院 2016 年—2018 年共計檢出 2 901 例腸桿菌科細菌，篩選出 CRE 231 株（7.96%），其中 2016 年 63 株（6.91%，63/912），2017 年 63 株（6.98%，63/902），2018 年 105 株（9.66%，105/1 087），3 年間 CRE 分離率呈上升趨勢（χ2趨勢=5.405，P=0.020）；檢出的 CRE 涵蓋肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、產酸克雷伯菌、奇異變形桿菌、黏質沙雷菌、產氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌等，以肺炎克雷伯菌（75.32%，174/231）和大腸埃希菌（17.32%，40/231）為主。
2.2 藥敏試驗結果
耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌除對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、復方磺胺甲噁唑、替加環素耐藥率<80% 外，對其他常用抗菌藥物耐藥率均高于 90%；耐碳青霉烯類大腸埃希菌僅對阿米卡星、妥布霉素、復方磺胺甲噁唑、頭孢哌酮/舒巴坦、替加環素耐藥率在 80% 以下。174 株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌和 40 株耐碳青霉烯類大腸埃希菌耐藥情況見表 1。
表1
耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌耐藥率［株（%）］
2.3 臨床資料分析
剔除臨床資料不詳及保種復蘇失敗菌株，共收集到 101 株 CRE 作為試驗菌株，以肺炎克雷伯菌（73.27%，74/101）和大腸埃希菌（14.85%，15/101）為主；主要來源于痰液、導管尿、靜脈留置導管、分泌物、支氣管灌洗液、血液等標本，其中痰液標本所占比例最高（63.37%，64/101），其次是尿液標本（11.88%，12/101）、支氣管灌洗液（8.91%，9/101）、血液（6.93%，7/101）。101 例 CRE 感染者中，59 例（58.42%）來自重癥監護病房，17 例（16.83%）來自急診科病區，5 例（4.95%）來自針灸康復科。CRE 感染者以老年患者為主，平均年齡 75 歲，≥80 歲者占 69.31%（70/101）。抗菌藥物治療方案以內酰胺酶抑制劑（61.39%，62/101）和碳青霉烯類抗生素（75.25%，76/101）聯合其他抗生素治療居多。住院治療后，有明顯好轉 40 例（39.60%）；無效（出院或轉院）30 例（29.70%）；死亡 31 例（30.69%），其中重癥監護病房患者死亡 23 例，占死亡總人數的 74.19%（23/31），死亡患者年齡均>80 歲。
2.4 碳青霉烯酶的表型檢測結果
101 株耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌中，改良 Hodge 試驗陽性 94 株，陽性率為 93.07%；Carba NP 試驗陽性 96 株，陽性率為 95.05%；mCIM 試驗陽性 98 株，陽性率為 97.03%。有 2 株菌 3 種表型試驗均為陰性。見表 2。
表2
碳青霉烯酶的表型檢測結果（株）
2.5 耐藥基因及其型別檢測結果
部分 PCR 擴增產物電泳結果見圖 1、2。在blaKPC 和blaNDM 基因相應大小位置出現條帶，其他類型基因條帶均未檢出。101 株 CRE 菌株中有 92 株（91.09%）檢出耐藥基因，其中blaKPC 基因 70 株（69.31%），blaNDM 基因 22 株（21.78%）。
圖1
部分 CRE 菌株blaKPC（785 bp）PCR 擴增產物電泳圖
M：DNA marker；B：空白對照；P：陽性對照；N：陰性對照；1～13：
圖2
部分 CRE 菌株blaNDM（750 bp）PCR 擴增產物電泳圖
M：DNA marker；B：空白對照；P：陽性對照；N：陰性對照；1～6：
2.6 PCR 產物序列比對結果
測序結果經 BLAST 比對得知，66 株（65.35%）攜帶blaKPC-2 型基因，4 株（3.96%）攜帶blaKPC-19 型基因，9 株（8.91%）攜帶blaNDM-1 型基因，13 株（12.87%）攜帶blaNDM-5 型基因。未檢出同時攜帶 2 種耐藥基因的 CRE 菌株。見表 3。
表3
碳青霉烯酶的基因型檢測結果（株）
2.7 碳青霉烯酶耐藥表型試驗結果同基因型結果比較
以基因檢測結果為金標準，改良 Hodge 試驗、Carba NP 試驗、mCIM 試驗對產碳青霉烯酶的 CRE 菌株檢出情況見表 4，其中，mCIM 試驗靈敏度達 100.00%（92/92）。
表4
3 種表型試驗結果同基因檢測結果比較（株）
3 討論
此研究顯示 2016 年—2018 年本院 CRE 菌株以肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌為主，對臨床常用的大多數抗菌藥物呈高水平耐藥。CRE 感染者主要為老年患者，科室分布以重癥監護病房最常見，多有碳青霉烯類藥物和廣譜抗菌藥物治療史，病死率高。老年患者基礎疾病較多，病程長，身體抵抗力較差，分析耐藥機制，從而采用合理的抗感染治療尤為重要。
本次研究采用美國臨床和實驗室標準協會推薦的改良 Hodge 試驗、Carba NP 試驗、mCIM 試驗檢測碳青霉烯酶耐藥表型，結果顯示，mCIM 試驗陽性率為 97.03%（98/101），靈敏度（以基因檢測結果為金標準）為 100.00%（92/92），與 PCR 檢測耐藥基因結果高度吻合，可見 mCIM 試驗是一種結果可靠、經濟實惠、適合我院及其他不具備基因測序能力的實驗室開展的碳青霉烯酶表型篩選方法。101 株 CRE 菌株中，有 2 株菌 3 種表型試驗均為陰性且未檢出碳青霉烯酶基因，可能是除產碳青霉烯酶外，其他耐藥機制引起的細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，如外膜孔蛋白缺失、產頭孢菌素酶或是細菌產 ESBL[9]。有 92 株采用 PCR 方法檢測到了碳青霉烯酶基因，7 株碳青霉烯酶耐藥表型陽性但基因檢測結果陰性，可能是產生了非本次實驗涉及到的其他碳青霉烯酶。
研究表明，產 KPC 和 NDM 型碳青霉烯酶是我院 CRE 最主要的耐藥機制，肺炎克雷伯菌主要攜帶blaKPC-2 基因，大腸埃希菌主要攜帶blaNDM-5 基因，同國內主要流行基因型相符[10-11]，與部分文獻報道的其他地區和其他國家不同[12-16]，證實 CRE 流行特征具有區域差異。此次研究未檢出產 OXA 型碳青霉烯酶的 CRE 菌株，但我國已逐漸有產 OXA 型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌的流行報道[17-18]，我院實驗室需密切關注 CRE 菌株中 D 類碳青霉烯酶的檢出情況，有待提高待檢樣本量、擴大樣本區域以作后續研究。
近幾年 CRE 暴發流行，使臨床治療難度加大。替加環素對 CRE 菌株耐藥率較低但不宜單藥治療，新型藥物頭孢他啶-阿維巴坦和美羅培南-伐波巴坦可能成為治療重癥高風險感染的首選藥物[19]。頭孢他啶-阿維巴坦表現出對產 KPC、ESBL、頭孢菌素酶以及 OXA-48 酶的細菌有較強的抗菌活性，但不能抑制 B 類酶[20]；美羅培南-伐波巴坦對 A 類酶尤其是 KPC 酶有效，對 D 類 OXA-48 酶及金屬酶無效[19]。我國細菌耐藥監測網學術委員會專家建議，選擇敏感或中介的抗菌藥物聯合用藥，如替加環素聯合多黏菌素、氨基糖苷類或磷霉素，酶抑制劑復合制劑聯合氨基糖苷類、多黏菌素、氟喹諾酮類等，并依據藥敏結果合理調整給藥方案[21]。
綜上所述，本院 CRE 最主要的耐藥機制是產碳青霉烯酶 KPC-2 和 NDM-5。3 種表型試驗中，mCIM 試驗陽性率最高，與耐藥基因檢測結果高度一致，是一種可靠的碳青霉烯酶表型試驗篩選方法。由于不同的碳青霉烯酶類型會導致細菌對抗菌藥物的反應不同，因此針對 CRE 的感染，為保證對個體化精準治療，開展耐藥基因的檢測有著非常重要的意義。了解病原菌的耐藥機制，不僅能幫助臨床醫師選擇最佳的治療方案，還能減少細菌耐藥性的發生，延緩多重耐藥菌株的增長和傳播。
碳青霉烯類藥物因其抗菌譜廣、抗菌活性強、不良反應少等優點成為了治療重癥革蘭陰性桿菌感染的首選藥物。然而，近年來產超廣譜 β-內酰胺酶（extended spectrum β-lactamase，ESBL）的腸桿菌科細菌廣泛傳播，碳青霉烯類抗菌藥物大量應用，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（carbapenem resistant Enterobacteriaceae，CRE）逐漸出現并流行起來。由于治療方式有限、傳播迅速、發病率和死亡率高，CRE 已經成為近 10 年來全球最大的傳染病威脅之一[1]，給臨床診療帶來了巨大挑戰。CRE 的耐藥機制主要集中在耐藥酶的產生、靶點的改變、活性外排泵和膜通透性的改變、靶酶或競爭性靶酶底物的過度合成等幾個方面[2]，其中最主要的耐藥機制是產碳青霉烯酶[3]。為明確 CRE 的分子流行病學特點，本次研究收集成都中醫藥大學附屬醫院近 3 年臨床標本中分離到的 CRE 菌株，進行碳青霉烯酶表型確證試驗、耐藥基因擴增和測序，分析該院 CRE 主要耐藥機制，幫助臨床醫師選擇最佳治療方案，減少細菌耐藥性的發生。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料
1.1.1 菌株來源
2 901 例腸桿菌科細菌來自成都中醫藥大學附屬醫院臨床各科室 2016 年 1 月—2018 年 12 月送檢標本，按照《全國臨床檢驗操作規程》第 4 版[4]分離所得。剔除分離自同一患者同一部位的重復菌株冷凍保存，根據菌株所屬患者的病歷號，回顧性分析其臨床資料。
1.1.2 實驗儀器及試劑
VITEK-2 Compact 細菌分析鑒定和藥物敏感性（藥敏）試驗系統及其配套的鑒定及藥敏卡、瓊脂平板為法國生物梅里埃公司生產，紙片擴散法藥敏紙片、胰蛋白胨和酵母提取物購于英國 OXOID 公司，細菌裂解液購于上海貝博生物有限公司，七水硫酸鋅、酚紅、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）反應混合液、DNA 分子量標準（marker）和核酸染料均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，亞胺培南/西司他丁鈉購自杭州默沙東制藥有限公司。PCR 擴增儀來自美國 BIO-RAD 有限公司，電泳凝膠成像儀產自北京君意東方公司。基因測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行。
1.1.3 質量控制菌株
陰溝腸桿菌 ATCC 700323、嗜麥芽窄食單胞菌 ATCC 17666、大腸埃希菌 ATCC 25922、肺炎克雷伯菌 ATCC 700603 等質量控制菌株由國家衛生健康委臨床檢驗中心提供。CRE 陽性對照菌株 S1707 經基因測序確定為攜帶blaKPC-2 基因的肺炎克雷伯菌，來自四川省臨床檢驗中心。
1.2 實驗方法
1.2.1 細菌分離培養鑒定及藥敏試驗
按照《全國臨床檢驗標準操作規程》第 4 版的要求進行病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[4]，藥敏結果按美國臨床和實驗室標準協會標準[5]進行判讀。
1.2.2 碳青霉烯酶的表型檢測
① 改良 Hodge 試驗。將大腸埃希菌 ATCC 25922 菌落調成 0.5 麥氏濁度的菌懸液，用生理鹽水稀釋 10 倍后均勻涂布于 Mueller-Hinton（MH）瓊脂平板上，放置 10 min。將美羅培南紙片貼于涂有菌懸液 MH 瓊脂平板中，用接種環挑取 3～5 個待測菌落從紙片邊緣開始劃線，劃至平板邊緣，（35±2）℃ 孵育 16～20 h。若平板上大腸埃希菌與待測菌株抑菌圈的交匯處大腸埃希菌出現增強性生長，則改良 Hodge 試驗陽性，提示待測菌產碳青霉烯酶。
② 改良碳青霉烯酶滅活（modified carbapenem inactivation method，mCIM）試驗。取 1 μL 接種環的過夜培養純菌落于 2 mL 胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）中，每管放入 1 張美羅培南紙片，（35±2）℃ 孵育 4 h±15 min。制備 0.5 麥氏濁度的大腸埃希菌菌懸液并涂布 MH 平板，干燥 5 min。將美羅培南紙片從 TSB 中取出，貼于 MH 平板上，（35±2）℃ 培養 18～24 h 后量取抑菌圈直徑。美羅培南抑菌圈直徑為 6～15 mm 或直徑為 16～18 mm 但抑菌圈內有肉眼可見的散在菌落為碳青霉烯酶陽性。
③ Carba NP 試驗。取 2 支無菌管，分別標記“A”“B”，先在 A、B 管中分別加入 100 μL 細菌蛋白提取液，后向 A 管加 100 μL Carba NP 試劑 A，B 管加 100 μL Carba NP 試劑 B，震蕩混勻，（35±2）℃ 孵育 2 h，顏色由紅色或橘紅色變成深黃色或黃色為陽性結果，提示待測菌產碳青霉烯酶。
1.2.3 耐藥基因檢測
根據試劑盒說明書制備細菌 DNA 模板，采用 PCR 方法，針對 KPC、NDM、GES、SME、IMI、NMC、IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、OXA 這 12 種酶，參照文獻[6-8]合成引物，所有引物經美國國立生物技術信息中心基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）驗證，將擴增陽性產物進行瓊脂糖凝膠電泳確定目的條帶，最后由生工生物工程（上海）股份有限公司進行耐藥基因測序。測序結果經過 GenBank 在線數據庫比對，分析耐藥基因型別。
1.3 統計學方法
所有數據采用 WHONET 5.6 軟件進行數據統計處理，用 SPSS 21.0 軟件進行統計學分析。計數資料采用株數和率表示；CRE 分離率隨時間的變化趨勢分析采用趨勢χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細菌分布情況
我院 2016 年—2018 年共計檢出 2 901 例腸桿菌科細菌，篩選出 CRE 231 株（7.96%），其中 2016 年 63 株（6.91%，63/912），2017 年 63 株（6.98%，63/902），2018 年 105 株（9.66%，105/1 087），3 年間 CRE 分離率呈上升趨勢（χ2趨勢=5.405，P=0.020）；檢出的 CRE 涵蓋肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、產酸克雷伯菌、奇異變形桿菌、黏質沙雷菌、產氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌等，以肺炎克雷伯菌（75.32%，174/231）和大腸埃希菌（17.32%，40/231）為主。
2.2 藥敏試驗結果
耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌除對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、復方磺胺甲噁唑、替加環素耐藥率<80% 外，對其他常用抗菌藥物耐藥率均高于 90%；耐碳青霉烯類大腸埃希菌僅對阿米卡星、妥布霉素、復方磺胺甲噁唑、頭孢哌酮/舒巴坦、替加環素耐藥率在 80% 以下。174 株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌和 40 株耐碳青霉烯類大腸埃希菌耐藥情況見表 1。
表1
耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌耐藥率［株（%）］
2.3 臨床資料分析
剔除臨床資料不詳及保種復蘇失敗菌株，共收集到 101 株 CRE 作為試驗菌株，以肺炎克雷伯菌（73.27%，74/101）和大腸埃希菌（14.85%，15/101）為主；主要來源于痰液、導管尿、靜脈留置導管、分泌物、支氣管灌洗液、血液等標本，其中痰液標本所占比例最高（63.37%，64/101），其次是尿液標本（11.88%，12/101）、支氣管灌洗液（8.91%，9/101）、血液（6.93%，7/101）。101 例 CRE 感染者中，59 例（58.42%）來自重癥監護病房，17 例（16.83%）來自急診科病區，5 例（4.95%）來自針灸康復科。CRE 感染者以老年患者為主，平均年齡 75 歲，≥80 歲者占 69.31%（70/101）。抗菌藥物治療方案以內酰胺酶抑制劑（61.39%，62/101）和碳青霉烯類抗生素（75.25%，76/101）聯合其他抗生素治療居多。住院治療后，有明顯好轉 40 例（39.60%）；無效（出院或轉院）30 例（29.70%）；死亡 31 例（30.69%），其中重癥監護病房患者死亡 23 例，占死亡總人數的 74.19%（23/31），死亡患者年齡均>80 歲。
2.4 碳青霉烯酶的表型檢測結果
101 株耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌中，改良 Hodge 試驗陽性 94 株，陽性率為 93.07%；Carba NP 試驗陽性 96 株，陽性率為 95.05%；mCIM 試驗陽性 98 株，陽性率為 97.03%。有 2 株菌 3 種表型試驗均為陰性。見表 2。
表2
碳青霉烯酶的表型檢測結果（株）
2.5 耐藥基因及其型別檢測結果
部分 PCR 擴增產物電泳結果見圖 1、2。在blaKPC 和blaNDM 基因相應大小位置出現條帶，其他類型基因條帶均未檢出。101 株 CRE 菌株中有 92 株（91.09%）檢出耐藥基因，其中blaKPC 基因 70 株（69.31%），blaNDM 基因 22 株（21.78%）。
圖1
部分 CRE 菌株blaKPC（785 bp）PCR 擴增產物電泳圖
M：DNA marker；B：空白對照；P：陽性對照；N：陰性對照；1～13：
圖2
部分 CRE 菌株blaNDM（750 bp）PCR 擴增產物電泳圖
M：DNA marker；B：空白對照；P：陽性對照；N：陰性對照；1～6：
2.6 PCR 產物序列比對結果
測序結果經 BLAST 比對得知，66 株（65.35%）攜帶blaKPC-2 型基因，4 株（3.96%）攜帶blaKPC-19 型基因，9 株（8.91%）攜帶blaNDM-1 型基因，13 株（12.87%）攜帶blaNDM-5 型基因。未檢出同時攜帶 2 種耐藥基因的 CRE 菌株。見表 3。
表3
碳青霉烯酶的基因型檢測結果（株）
2.7 碳青霉烯酶耐藥表型試驗結果同基因型結果比較
以基因檢測結果為金標準，改良 Hodge 試驗、Carba NP 試驗、mCIM 試驗對產碳青霉烯酶的 CRE 菌株檢出情況見表 4，其中，mCIM 試驗靈敏度達 100.00%（92/92）。
表4
3 種表型試驗結果同基因檢測結果比較（株）
3 討論
此研究顯示 2016 年—2018 年本院 CRE 菌株以肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌為主，對臨床常用的大多數抗菌藥物呈高水平耐藥。CRE 感染者主要為老年患者，科室分布以重癥監護病房最常見，多有碳青霉烯類藥物和廣譜抗菌藥物治療史，病死率高。老年患者基礎疾病較多，病程長，身體抵抗力較差，分析耐藥機制，從而采用合理的抗感染治療尤為重要。
本次研究采用美國臨床和實驗室標準協會推薦的改良 Hodge 試驗、Carba NP 試驗、mCIM 試驗檢測碳青霉烯酶耐藥表型，結果顯示，mCIM 試驗陽性率為 97.03%（98/101），靈敏度（以基因檢測結果為金標準）為 100.00%（92/92），與 PCR 檢測耐藥基因結果高度吻合，可見 mCIM 試驗是一種結果可靠、經濟實惠、適合我院及其他不具備基因測序能力的實驗室開展的碳青霉烯酶表型篩選方法。101 株 CRE 菌株中，有 2 株菌 3 種表型試驗均為陰性且未檢出碳青霉烯酶基因，可能是除產碳青霉烯酶外，其他耐藥機制引起的細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，如外膜孔蛋白缺失、產頭孢菌素酶或是細菌產 ESBL[9]。有 92 株采用 PCR 方法檢測到了碳青霉烯酶基因，7 株碳青霉烯酶耐藥表型陽性但基因檢測結果陰性，可能是產生了非本次實驗涉及到的其他碳青霉烯酶。
研究表明，產 KPC 和 NDM 型碳青霉烯酶是我院 CRE 最主要的耐藥機制，肺炎克雷伯菌主要攜帶blaKPC-2 基因，大腸埃希菌主要攜帶blaNDM-5 基因，同國內主要流行基因型相符[10-11]，與部分文獻報道的其他地區和其他國家不同[12-16]，證實 CRE 流行特征具有區域差異。此次研究未檢出產 OXA 型碳青霉烯酶的 CRE 菌株，但我國已逐漸有產 OXA 型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌的流行報道[17-18]，我院實驗室需密切關注 CRE 菌株中 D 類碳青霉烯酶的檢出情況，有待提高待檢樣本量、擴大樣本區域以作后續研究。
近幾年 CRE 暴發流行，使臨床治療難度加大。替加環素對 CRE 菌株耐藥率較低但不宜單藥治療，新型藥物頭孢他啶-阿維巴坦和美羅培南-伐波巴坦可能成為治療重癥高風險感染的首選藥物[19]。頭孢他啶-阿維巴坦表現出對產 KPC、ESBL、頭孢菌素酶以及 OXA-48 酶的細菌有較強的抗菌活性，但不能抑制 B 類酶[20]；美羅培南-伐波巴坦對 A 類酶尤其是 KPC 酶有效，對 D 類 OXA-48 酶及金屬酶無效[19]。我國細菌耐藥監測網學術委員會專家建議，選擇敏感或中介的抗菌藥物聯合用藥，如替加環素聯合多黏菌素、氨基糖苷類或磷霉素，酶抑制劑復合制劑聯合氨基糖苷類、多黏菌素、氟喹諾酮類等，并依據藥敏結果合理調整給藥方案[21]。
綜上所述，本院 CRE 最主要的耐藥機制是產碳青霉烯酶 KPC-2 和 NDM-5。3 種表型試驗中，mCIM 試驗陽性率最高，與耐藥基因檢測結果高度一致，是一種可靠的碳青霉烯酶表型試驗篩選方法。由于不同的碳青霉烯酶類型會導致細菌對抗菌藥物的反應不同，因此針對 CRE 的感染，為保證對個體化精準治療，開展耐藥基因的檢測有著非常重要的意義。了解病原菌的耐藥機制，不僅能幫助臨床醫師選擇最佳的治療方案，還能減少細菌耐藥性的發生，延緩多重耐藥菌株的增長和傳播。
