引用本文： 陳昱, 楊眉, 王蓉, 廖紅艷, 毛志剛, 鄭沁. BenchMark 全自動特殊染色機在肝臟穿刺活檢網狀纖維染色中的應用. 華西醫學, 2020, 35(9): 1090-1093. doi: 10.7507/1002-0179.201912082 復制
目前，影像醫學和血清學技術不斷進步，促使肝臟疾病診斷準確性顯著提高。但肝臟穿刺（肝穿）活檢的形態病理學檢查仍是診斷肝臟疾病的金標準[1]，它能檢測出肝臟的炎癥、腫瘤及纖維化程度，病理形態學蘇木精-伊紅染色結合特殊染色可對肝穿活檢的診斷提供重要的形態學依據[2]。網狀纖維染色是肝穿活檢的一項重要特殊染色項目。網狀纖維染色主要顯示：① 肝小葉內肝板中的網狀纖維支架分布及走向；② 肝細胞增生的結節及花結節周圍包繞的網狀纖維；③ 肝小葉界面網狀纖維的塌陷程度及纖維間隔；④ 小葉結構紊亂的狀況及嚴重程度。因此網狀纖維染色在肝穿組織的臨床診斷中具有重要意義[3]。網狀纖維有多種染色方法，常見的有 Foot 染色法、改良 Gomori 網狀纖維染色、Gordon-Sweet 染色法、網狀纖維染色-渡邊改良法等方法[3-6]。這些手工方法由于操作步驟繁瑣，耗時長，易受操作人員工作經驗、各環節染色時間難于精準控制等多因素干擾，易導致個別病例染色失敗，需反復、多次染色[7-8]。為進一步改良染色效果，提高工作效率，本研究探索了 BenchMark 全自動特殊染色機在肝穿活檢網狀纖維染色中的應用效果，現報告如下。
1 材料與方法
1.1 標本來源
回顧性連續選取四川大學華西醫院 2019 年 4 月—5 月診斷明確的網狀纖維染色陽性的肝穿標本 30 例。本研究經四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會審查通過，批件號：2019 年審（977）號。
1.2 試劑
儀器法試劑：網狀組織染色液（Reticulum II Staining Kit，美國 Ventana 醫療系統公司，批號：F02006，效期：2020-01-01）。手工法試劑：為本實驗室根據 Foot 染色標準操作規程（standard operating procedure，SOP）的配方自行配制的試劑。
1.3 方法
所有標本分別按照下列條件進行預處理：4% 中性緩沖甲醛固定，全自動脫水機處理，石蠟包埋，選用黏附載玻片，切片厚度 5 μm，65℃ 烤箱烤片 30 min。預處理完成后切片一式兩份，分別進行儀器法和手工法染色。
1.3.1 上機染色步驟
采用 BenchMark 全自動特殊染色機進行染色。步驟如下：① 烤片 65℃ 4 min，脫蠟 75℃ 20 min；② 加 300 μL 氧化劑，37℃ 8 min 后沖洗；③ 加 200 μL 漂白劑，37℃ 16 min 后沖洗；④ 加 300 μL 敏化劑，37℃ 8 min 后沖洗；⑤ 加 200 μL 銀染液 A，37℃ 20 min 后沖洗；⑥ 加 200 μL 還原劑，37℃ 4 min 后沖洗；⑦ 加 200 μL 調色劑，37℃ 4 min 后沖洗；⑧ 加 200 μL 定影劑，37℃ 4 min 后沖洗；⑨ 加 200 μL 核固紅染色液，4 min 后沖洗。后處理步驟：① 95% 乙醇脫水 2 min；② 無水乙醇脫水 5 min；③ 環保透明劑透明，中性樹膠封片保存。
1.3.2 手工染色步驟
手工染色采用 Foot 染色法[9-10]，按照本室 SOP 進行操作：① 切片常規脫蠟至蒸餾水；② 加入 0.25% 高錳酸鉀水溶液浸泡 5 min，蒸餾水沖洗 2～3 次；③ 5% 草酸水溶液浸洗，至漂白為止，流水充分沖洗，沖洗后蒸餾水洗 2～3 次；④ 浸入 2.5% 鐵明礬 5 min，蒸餾水洗 2～3 次；⑤ 浸入新鮮配制的氨銀液 5 min；⑥ 4% 中性緩沖甲醛溶液還原 2 min，蒸餾水洗 2～3 次；⑦ 0.25% 氯化金水溶液調色 4 min，流水沖洗；⑧ 浸入 5% 硫代硫酸鈉水溶液 1～5 min，流水充分沖洗；⑨ 根據需要，可用 Van Gieson 染液、核固紅等染液復染。后處理步驟：① 按照 65%、75%、85%、95% 的乙醇順序依次脫水 1～2 s；② 無水乙醇脫水 5 min；③ 環保透明劑透明，中性樹膠封片保存。
1.4 評價方法
兩種方法染色完成后，均請有豐富閱片經驗的主任病理醫師在顯微鏡下觀察、盲法評估染色效果。方法：① 染色成功：網狀纖維呈黑色，背景呈紅色，纖維清晰均勻，背景干凈，無污染。② 染色欠佳（包括但不僅限于以下幾項）：網狀纖維斷斷續續，不連貫；只有背景染色和一些斷裂的纖維；網狀纖維斷裂，染色呈點狀分布，顏色較淺。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 21.0 軟件進行統計分析。兩種方法染色成功率的比較采用配對 χ2 檢驗（McNemar 法），雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
BenchMark 特殊染色系統染色效果穩定可靠，30 例標本均染色成功（圖1a），染色成功率 100.0%。手工染色穩定性稍差，30 例標本中，成功 23 例，染色成功率 76.7%；7 例染色效果欠佳，具體表現為網狀纖維斷裂、染色過淺（圖1b～1d）。兩種方法染色成功率差異有統計學意義（χ2=5.143，P=0.023）。
圖1
兩種方法進行肝穿組織網狀纖維染色的效果（10×40）
a. 儀器染色，網狀纖維呈黑色，背景染色呈紅色，網狀纖維排列連續；b. 手工染色，網狀纖維斷斷續續，不連貫；c. 手工染色，僅見紅色背景，偶見黑色網狀纖維；d. 手工染色，網狀纖維斷裂，造成網狀纖維呈點狀分布
3 討論
3.1 網狀纖維染色的原理
網狀纖維染色的原理是：氨銀液易被組織內的網狀纖維細胞吸附，而不易與其他細胞結合。氨銀染液與組織的蛋白質結合后，經甲醛作用生成黑色或棕黑色的金屬銀，而沉積于組織內及其表面；再經氯化金調色后，用硫代硫酸鈉溶液洗去組織上未還原的銀鹽，將組織內的網狀纖維清晰顯色。網狀纖維染色可對臨床肝臟疾病的診斷和治療提供重要的形態學依據。因此做好一張完整而清晰的肝穿組織網狀纖維染色是肝穿準確診斷的重要保障[9]。
3.2 影響儀器法網狀纖維染色效果的因素
臨床對肝臟穿刺組織的前處理不合規范，可能原因包括但不限于肝穿組織固定不及時、固定時間短，或是取材后在風力過大的通風系統中放置時間過久。這些因素可導致肝穿組織在網狀纖維染色中出現銀染過淺，網狀纖維斷裂，組織中部分銀染色清晰、部分未著色等現象[11-12]。同時如果儀器染色條件設置不合理，或者儀器使用維護不當，也易造成染色失敗。現筆者將多年的儀器使用經驗分享如下。
3.2.1 清洗緩沖液
銀染對清洗緩沖液的 pH 值要求非常嚴格，新配置的清洗緩沖液 pH 值>4.5，在裝有緩沖液的大桶中放置 2～3 d 后，pH 值會隨時間和溫度等因素影響而下降，從而導致銀染失敗或是出現陰陽現象（組織半邊有網狀纖維半邊只有背景染色）。針對這一現象我們必須嚴格執行如下步驟：① 新鮮配制的大桶中的清洗緩沖液最好在 2 d 內用完，每一次進行網狀纖維染色前，必須將上機的緩沖試劑瓶中剩余的舊的清洗緩沖液倒去，然后加入新的清洗緩沖液；② 進行肝穿組織網狀纖維染色時，機器上只使用一個緩沖試劑瓶，并且在每次染色之前對機器各管道進行一次凈化清洗程序，以保證網狀纖維染色的染色結果；③ 按照儀器操作手冊，定期執行儀器的日、周、月維護保養程序；④ 定期清洗儀器管道，并消毒，至少每 3 個月進行 1 次，并填寫清洗及消毒記錄。
3.2.2 載玻片
質量良好的載玻片是保證儀器法染色質量的重要因素之一。若玻片表面涂層良好，清洗緩沖液在玻片表面會均勻散開；若玻片表面涂層不好，清洗緩沖液在玻片表面散開不均勻，也會導致染色液在載玻片上分布不均，使部分組織著色而部分組織未著色。因此，我科室在做肝穿網狀纖維染色時使用黏附載玻片以保證染色質量[12]。
3.2.3 切片厚度
切片厚度也是影響肝穿組織網狀纖維染色的重要因素[13]。儀器法肝穿組織網狀纖維染色時，切片厚度必須≥5 μm；若切片厚度<5 μm，則染色結果不佳，會出現網狀纖維斷裂，組織中部分網狀纖維染出，部分網狀纖維未染出來的現象，或者是整張切片都未染出銀染部分[13]。
3.2.4 銀染色時間
銀染色時間的長短影響肝穿組織網狀纖維染色效果[14]。根據我室探索，儀器法銀染時間以 20 min 為最佳，此條件下網狀纖維染色清晰且分布均勻。銀染時間過長易導致脫片，背景顏色較深，難以區分網狀纖維和其他組織；銀染時間較短易造成網狀纖維染色淺且斷斷續續，或是呈點狀分布。因此我們在肝穿組織網狀纖維染色時宜選用最佳銀染時間以保證染色的質量[15-16]。
3.3 影響手工法網狀纖維染色效果的因素
手工法染色易受干擾，常見因素如下：① 試劑：手工法需多種試劑，大部分均需手工配制，難以標準化，質量難以保證；并且手工法部分試劑需回收使用，回收次數受標本量及操作者主觀因素影響，均會影響染色效果。② 人員素質：手工染色易受操作者的染色經驗、人員能力、操作手法等多因素的干擾。③ 染色程序標準化：操作過程難以完全標準化，并且易受外界因素干擾。
因此，肝穿組織的網狀纖維染色需要我們從組織的前期處理開始，切片以及染色的每一步驟都要嚴格按照染色要求來完成，任何一個環節出現問題都會導致染色失敗。BenchMark 全自動特殊染色機的染色穩定性及染色效果明顯優于手工染色法，并且節約了實驗室人力資源，提高了工作效率；但其對儀器的依賴程度高，試劑成本稍高于手工方法，限制了其在中小型病理科室的推廣。無論何種方法，一張制備精良的肝穿纖維染色玻片才是臨床肝穿準確診斷的重要依據，實驗室可根據各自的實際情況，選擇適合的方法。
目前，影像醫學和血清學技術不斷進步，促使肝臟疾病診斷準確性顯著提高。但肝臟穿刺（肝穿）活檢的形態病理學檢查仍是診斷肝臟疾病的金標準[1]，它能檢測出肝臟的炎癥、腫瘤及纖維化程度，病理形態學蘇木精-伊紅染色結合特殊染色可對肝穿活檢的診斷提供重要的形態學依據[2]。網狀纖維染色是肝穿活檢的一項重要特殊染色項目。網狀纖維染色主要顯示：① 肝小葉內肝板中的網狀纖維支架分布及走向；② 肝細胞增生的結節及花結節周圍包繞的網狀纖維；③ 肝小葉界面網狀纖維的塌陷程度及纖維間隔；④ 小葉結構紊亂的狀況及嚴重程度。因此網狀纖維染色在肝穿組織的臨床診斷中具有重要意義[3]。網狀纖維有多種染色方法，常見的有 Foot 染色法、改良 Gomori 網狀纖維染色、Gordon-Sweet 染色法、網狀纖維染色-渡邊改良法等方法[3-6]。這些手工方法由于操作步驟繁瑣，耗時長，易受操作人員工作經驗、各環節染色時間難于精準控制等多因素干擾，易導致個別病例染色失敗，需反復、多次染色[7-8]。為進一步改良染色效果，提高工作效率，本研究探索了 BenchMark 全自動特殊染色機在肝穿活檢網狀纖維染色中的應用效果，現報告如下。
1 材料與方法
1.1 標本來源
回顧性連續選取四川大學華西醫院 2019 年 4 月—5 月診斷明確的網狀纖維染色陽性的肝穿標本 30 例。本研究經四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會審查通過，批件號：2019 年審（977）號。
1.2 試劑
儀器法試劑：網狀組織染色液（Reticulum II Staining Kit，美國 Ventana 醫療系統公司，批號：F02006，效期：2020-01-01）。手工法試劑：為本實驗室根據 Foot 染色標準操作規程（standard operating procedure，SOP）的配方自行配制的試劑。
1.3 方法
所有標本分別按照下列條件進行預處理：4% 中性緩沖甲醛固定，全自動脫水機處理，石蠟包埋，選用黏附載玻片，切片厚度 5 μm，65℃ 烤箱烤片 30 min。預處理完成后切片一式兩份，分別進行儀器法和手工法染色。
1.3.1 上機染色步驟
采用 BenchMark 全自動特殊染色機進行染色。步驟如下：① 烤片 65℃ 4 min，脫蠟 75℃ 20 min；② 加 300 μL 氧化劑，37℃ 8 min 后沖洗；③ 加 200 μL 漂白劑，37℃ 16 min 后沖洗；④ 加 300 μL 敏化劑，37℃ 8 min 后沖洗；⑤ 加 200 μL 銀染液 A，37℃ 20 min 后沖洗；⑥ 加 200 μL 還原劑，37℃ 4 min 后沖洗；⑦ 加 200 μL 調色劑，37℃ 4 min 后沖洗；⑧ 加 200 μL 定影劑，37℃ 4 min 后沖洗；⑨ 加 200 μL 核固紅染色液，4 min 后沖洗。后處理步驟：① 95% 乙醇脫水 2 min；② 無水乙醇脫水 5 min；③ 環保透明劑透明，中性樹膠封片保存。
1.3.2 手工染色步驟
手工染色采用 Foot 染色法[9-10]，按照本室 SOP 進行操作：① 切片常規脫蠟至蒸餾水；② 加入 0.25% 高錳酸鉀水溶液浸泡 5 min，蒸餾水沖洗 2～3 次；③ 5% 草酸水溶液浸洗，至漂白為止，流水充分沖洗，沖洗后蒸餾水洗 2～3 次；④ 浸入 2.5% 鐵明礬 5 min，蒸餾水洗 2～3 次；⑤ 浸入新鮮配制的氨銀液 5 min；⑥ 4% 中性緩沖甲醛溶液還原 2 min，蒸餾水洗 2～3 次；⑦ 0.25% 氯化金水溶液調色 4 min，流水沖洗；⑧ 浸入 5% 硫代硫酸鈉水溶液 1～5 min，流水充分沖洗；⑨ 根據需要，可用 Van Gieson 染液、核固紅等染液復染。后處理步驟：① 按照 65%、75%、85%、95% 的乙醇順序依次脫水 1～2 s；② 無水乙醇脫水 5 min；③ 環保透明劑透明，中性樹膠封片保存。
1.4 評價方法
兩種方法染色完成后，均請有豐富閱片經驗的主任病理醫師在顯微鏡下觀察、盲法評估染色效果。方法：① 染色成功：網狀纖維呈黑色，背景呈紅色，纖維清晰均勻，背景干凈，無污染。② 染色欠佳（包括但不僅限于以下幾項）：網狀纖維斷斷續續，不連貫；只有背景染色和一些斷裂的纖維；網狀纖維斷裂，染色呈點狀分布，顏色較淺。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 21.0 軟件進行統計分析。兩種方法染色成功率的比較采用配對 χ2 檢驗（McNemar 法），雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
BenchMark 特殊染色系統染色效果穩定可靠，30 例標本均染色成功（圖1a），染色成功率 100.0%。手工染色穩定性稍差，30 例標本中，成功 23 例，染色成功率 76.7%；7 例染色效果欠佳，具體表現為網狀纖維斷裂、染色過淺（圖1b～1d）。兩種方法染色成功率差異有統計學意義（χ2=5.143，P=0.023）。
圖1
兩種方法進行肝穿組織網狀纖維染色的效果（10×40）
a. 儀器染色，網狀纖維呈黑色，背景染色呈紅色，網狀纖維排列連續；b. 手工染色，網狀纖維斷斷續續，不連貫；c. 手工染色，僅見紅色背景，偶見黑色網狀纖維；d. 手工染色，網狀纖維斷裂，造成網狀纖維呈點狀分布
3 討論
3.1 網狀纖維染色的原理
網狀纖維染色的原理是：氨銀液易被組織內的網狀纖維細胞吸附，而不易與其他細胞結合。氨銀染液與組織的蛋白質結合后，經甲醛作用生成黑色或棕黑色的金屬銀，而沉積于組織內及其表面；再經氯化金調色后，用硫代硫酸鈉溶液洗去組織上未還原的銀鹽，將組織內的網狀纖維清晰顯色。網狀纖維染色可對臨床肝臟疾病的診斷和治療提供重要的形態學依據。因此做好一張完整而清晰的肝穿組織網狀纖維染色是肝穿準確診斷的重要保障[9]。
3.2 影響儀器法網狀纖維染色效果的因素
臨床對肝臟穿刺組織的前處理不合規范，可能原因包括但不限于肝穿組織固定不及時、固定時間短，或是取材后在風力過大的通風系統中放置時間過久。這些因素可導致肝穿組織在網狀纖維染色中出現銀染過淺，網狀纖維斷裂，組織中部分銀染色清晰、部分未著色等現象[11-12]。同時如果儀器染色條件設置不合理，或者儀器使用維護不當，也易造成染色失敗。現筆者將多年的儀器使用經驗分享如下。
3.2.1 清洗緩沖液
銀染對清洗緩沖液的 pH 值要求非常嚴格，新配置的清洗緩沖液 pH 值>4.5，在裝有緩沖液的大桶中放置 2～3 d 后，pH 值會隨時間和溫度等因素影響而下降，從而導致銀染失敗或是出現陰陽現象（組織半邊有網狀纖維半邊只有背景染色）。針對這一現象我們必須嚴格執行如下步驟：① 新鮮配制的大桶中的清洗緩沖液最好在 2 d 內用完，每一次進行網狀纖維染色前，必須將上機的緩沖試劑瓶中剩余的舊的清洗緩沖液倒去，然后加入新的清洗緩沖液；② 進行肝穿組織網狀纖維染色時，機器上只使用一個緩沖試劑瓶，并且在每次染色之前對機器各管道進行一次凈化清洗程序，以保證網狀纖維染色的染色結果；③ 按照儀器操作手冊，定期執行儀器的日、周、月維護保養程序；④ 定期清洗儀器管道，并消毒，至少每 3 個月進行 1 次，并填寫清洗及消毒記錄。
3.2.2 載玻片
質量良好的載玻片是保證儀器法染色質量的重要因素之一。若玻片表面涂層良好，清洗緩沖液在玻片表面會均勻散開；若玻片表面涂層不好，清洗緩沖液在玻片表面散開不均勻，也會導致染色液在載玻片上分布不均，使部分組織著色而部分組織未著色。因此，我科室在做肝穿網狀纖維染色時使用黏附載玻片以保證染色質量[12]。
3.2.3 切片厚度
切片厚度也是影響肝穿組織網狀纖維染色的重要因素[13]。儀器法肝穿組織網狀纖維染色時，切片厚度必須≥5 μm；若切片厚度<5 μm，則染色結果不佳，會出現網狀纖維斷裂，組織中部分網狀纖維染出，部分網狀纖維未染出來的現象，或者是整張切片都未染出銀染部分[13]。
3.2.4 銀染色時間
銀染色時間的長短影響肝穿組織網狀纖維染色效果[14]。根據我室探索，儀器法銀染時間以 20 min 為最佳，此條件下網狀纖維染色清晰且分布均勻。銀染時間過長易導致脫片，背景顏色較深，難以區分網狀纖維和其他組織；銀染時間較短易造成網狀纖維染色淺且斷斷續續，或是呈點狀分布。因此我們在肝穿組織網狀纖維染色時宜選用最佳銀染時間以保證染色的質量[15-16]。
3.3 影響手工法網狀纖維染色效果的因素
手工法染色易受干擾，常見因素如下：① 試劑：手工法需多種試劑，大部分均需手工配制，難以標準化，質量難以保證；并且手工法部分試劑需回收使用，回收次數受標本量及操作者主觀因素影響，均會影響染色效果。② 人員素質：手工染色易受操作者的染色經驗、人員能力、操作手法等多因素的干擾。③ 染色程序標準化：操作過程難以完全標準化，并且易受外界因素干擾。
因此，肝穿組織的網狀纖維染色需要我們從組織的前期處理開始，切片以及染色的每一步驟都要嚴格按照染色要求來完成，任何一個環節出現問題都會導致染色失敗。BenchMark 全自動特殊染色機的染色穩定性及染色效果明顯優于手工染色法，并且節約了實驗室人力資源，提高了工作效率；但其對儀器的依賴程度高，試劑成本稍高于手工方法，限制了其在中小型病理科室的推廣。無論何種方法，一張制備精良的肝穿纖維染色玻片才是臨床肝穿準確診斷的重要依據，實驗室可根據各自的實際情況，選擇適合的方法。
