臨床上，骨折不愈合常導致患者遭受疼痛的困擾甚至殘疾，而且往往需要額外的手術治療來恢復骨骼肌肉功能，因此骨折不愈合的治療一直是骨科領域的難點。近些年，隨著基因工程的發展，利用基因治療骨折不愈合的技術得以廣泛研究。大量實驗證實，將編碼骨折愈合相關生長因子的目的基因通過體內或體外不同的傳遞方式導入至靶細胞，從而表達出特定的生長因子，可以促進骨折修復，這為治療骨折不愈合提供了新途徑。該文將討論成骨基因不同傳遞方式的研究現狀，以及各自的優缺點，旨在為目的基因治療骨折不愈合提供理論基礎。
引用本文： 王寧, 陳俊毅, 朱倫井, 段江濤, 彭稱飛, 貝朝涌. 目的基因治療骨折不愈合的研究進展. 華西醫學, 2020, 35(1): 89-92. doi: 10.7507/1002-0179.201910049 復制
骨折不愈合即骨折超過預期時間沒有愈合，其發生率目前估計為 4.9%[1]。骨折不愈合常與患者多發性骨折、使用非甾體抗炎藥、使用阿片類藥物、開放性骨折、骨關節炎合并類風濕關節炎等有關[2]。臨床上，骨折不愈合常使患者經歷更多疼痛，導致殘疾、醫療費用增加以及勞動力恢復緩慢[3]，所以其治療一直是國內外骨科領域的熱點。自體松質骨移植目前被認為是治療骨折不愈合的最佳選擇[4]，但存在疼痛、出血、感染和取材方面的限制；而異體骨移植替代物可能導致移植失敗、感染、免疫反應以及成本增加等問題[5]，這些風險提示需要新的骨折愈合策略。近些年來，生長因子促進骨折修復一直是研究熱點，但外源性生長因子制備困難、存在副反應等限制了其應用[6]。而通過將編碼生長因子的相關基因經體內或體外的方式導入靶細胞，從而表達出生長因子蛋白治療骨折不愈合的方法得到了廣泛的研究，包括病毒傳遞、非病毒傳遞、基因活化基質（gene-activated matrix，GAM）與基因工程療法。在這篇綜述中，我們將討論成骨基因不同傳遞方式的研究現狀，以及各自的優缺點，旨在為目的基因治療骨折不愈合提供理論基礎。
1 體內導入
1.1 病毒基因傳遞
病毒自身 DNA 片段可以被目的基因所取代，病毒具有將基因轉移至靶細胞的能力。目前使用病毒載體進行的實驗已經超過 1 200 項[7]，使用的病毒載體包括腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒載體等[8]，這些載體通過傳遞不同的目的基因來誘導體內成骨[9-12]。目前的實驗研究中，腺病毒載體由于其毒性低、制備簡單、瞬時高表達的特點而被廣泛應用在基因治療中[8]。Liu 等[13]用攜帶綿羊骨骼肌骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2 基因的腺病毒載體轉染在大鼠的顱骨缺損中，得到了良好的新生骨組織，說明了腺病毒轉染治療骨缺損能夠獲得長期穩定表達。腺病毒載體介導的轉染已用于研究多種生長因子的聯合療法，其中就包括 Seamon 等[14]的研究將血管內皮生長因子基因和 BMP-6 基因傳遞至大鼠骨髓間充質干細胞促進成骨。目前腺病毒轉染成骨也運用在大型動物上，同樣獲得了良好的成骨效應[15]。除此之外，腺相關病毒載體具有無致病性、能長期表達、能感染多種細胞等優點，被廣泛用于基因載體[8]。甚至有學者將其拓展到成骨兩階段的研究[16]。但是，在病毒介導的成骨研究方面，轉染基因的大小與數目是否受到病毒本身攜帶能力的限制卻鮮有報道。逆轉錄病毒在用于成骨研究時，其安全性飽受詬病，免疫反應、潛在的致癌性被激活等都大大限制了其廣泛應用[17]。為了提高安全性，Alaee 等[18]應用自殺基因的方法提高了 BMP-2 的安全性，基于該研究，使用自殺基因的方法使治療后有害物質殘留減少是很有前景的。
1.2 非病毒基因傳遞
非病毒載體包括化學和物理傳遞方法。化學方法主要依賴于與 DNA 絡合的陽離子聚合物或脂質體、質粒等，以減少其細胞膜的電化學排斥。脂質體介導的基因轉染技術日趨成熟，例如陳寧等[19]應用雙基因（神經生長因子基因和 BMP-2 基因）真核質粒脂質體介導轉染大鼠骨髓間充質干細胞促進了成骨細胞分化。最近一項雙基因對比轉染的研究顯示，脂質體介導的基因轉染操作相對簡便，成本相對低廉，比病毒更容易構建，但轉染效率明顯低于慢病毒且轉染后穩定表達能力較弱[20]。物理方法則包括電穿孔和超聲波穿孔，它們分別使用電能和機械能在細胞膜上形成允許外源 DNA 導入的透明孔。如 Kimelman-Bleich 等[21]等首次表明成骨基因電穿孔可以治療骨缺損。而對于基于超聲技術的基因傳遞，Shapiro 等[22]等成功用超聲介導的轉基因募集到骨損傷部位。這些研究都表明超聲波傳遞基因安全性高，但效率卻不太顯著。近年來，有關超聲造影劑靶向運載藥物日益增多，該方法通過調整微泡本身的特性，可將治療性基因整合于微泡中。如 Bez 等[23]使用微泡增強超聲波轉染內源性間充質干細胞以表達 BMP-6，使豬的骨折愈合，暴露出來的問題是操作較為麻煩。這些方法雖然被認為相比病毒方法具有低免疫原性，卻目前只是停留在大型動物的基礎研究上，面對其效率低、表達時間不足、保存困難等問題仍需進一步尋找理想的解決辦法。
1.3 GAM
與 DNA 被細胞外 DNA 酶快速降解的大多數物理基因遞送方法不同，GAM 是一種負載細胞因子的細胞支架或者細胞外支架，允許基因可控制地、緩慢地釋放到周圍細胞。GAM 的優勢在于當種子細胞（包括成骨細胞、骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞等）自分泌或者旁分泌、增殖與分化作用時，其可提供骨傳導作用，甚至骨誘導三維環境，也能夠在再生過程中提供機械支持，使種子細胞與 GAM 形成細胞支架復合體，從而高效地修復骨組織損傷；缺點則是這種機械支持既沒有神經也沒有血管。Fang 等[24]首次將 GAM 用于體內骨再生，使用膠原支架和兩種不同的成骨質粒刺激新骨形成。為了提高轉染率，D’Mello 等[25]用雙基因進行研究，即編碼血管內皮生長因子基因和血小板衍生生長因子基因的聚乙烯亞胺-質粒 DNA 復合物的組合同時遞送用于顱骨缺損骨再生的初步研究，結果表明其目的成骨基因能夠在體內穩定、高效、持續表達。關于 GAM 的第 1 個臨床應用于 2016 年發表，Bozo 等[26]將膠原羥基磷灰石支架和編碼血管內皮生長因子的質粒 DNA 植入患有自體骨移植重建下頜骨骨不連的患者體內，在 1 年的隨訪中，發現了骨組織再生，且沒有觀察到不良事件。這項研究隨訪時間并不長，對于 GAM 在臨床患者中應用是否能達到預期的高效持久、穩定安全，則需要更長時間的隨訪來確定這種持續的表達隨時間跨度是否可變，同時應該考慮是否具有臨床適用性（如治療脛骨下端缺損以提供負重作用）。隨著越來越多的治療基因、載體、支架及其組合的發掘[27-29]，現階段需要更多試驗來研究揭示它們在復雜、高度調節中協同促進骨愈合的安全性及有效性。
2 基因工程細胞
物理基因傳遞、GAM 和病毒載體傳遞基因是體內傳遞的形式，而基因工程是利用重組技術，在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，對各種生物的核酸（基因）進行改造和重新組合，然后導入微生物或真核細胞（包括自體或同種異體細胞）內，使重組基因在細胞內表達，產生出人類需要的基因產物（生長因子和轉錄因子等）。基因工程細胞雖然更為復雜，但被認為更安全，因為它能更好地控制轉染過程，并且可直接引入參與修復缺損的細胞。Turgeman 等[30]早期的研究以人骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cell，hMSC）在培養基中擴增，并用編碼成骨因子人 BMP-2 的重組腺病毒載體轉染，在體外和體內評估基因工程 hMSC 的成骨潛力，結果基因工程 hMSC 在培養中顯示出持久增殖和成骨分化的能力。在體內，移植的基因工程 hMSC 能夠在異位部位移植并形成骨和軟骨，重要的是，從患有骨質疏松癥的患者中分離出的 hMSC 獲得了相同的結果[31]，這代表了骨骼基因治療的新平臺。為了提高骨髓間充質干細胞移植的治療效果，Yanagihara 等[32]將三維球形培養系統與基因轉染技術結合，研究以編碼 Runt 相關轉錄因子 2 的質粒 DNA 轉染骨髓間充質干細胞球體移植治療骨缺損，觀察到了持久穩定的骨再生。從這些研究來看，基因工程細胞治療骨缺損目的性更強，也同樣需要復雜的操作。目前，基因工程也已經用于研究大型動物模型的骨折愈合[33]。
3 問題與展望
骨再生的基因治療在過去突飛猛進，研究人員也在不斷推動及發現新的治療基因、載體、支架等，目前已經在體內和體外進行了嚴格的研究。一方面，雖然已發布了很多方法，但哪些可以轉化為臨床試驗卻難以確定。另一方面，這些豐富的研究信息使得需要對比性研究，但目前這樣的研究甚少。若要克服這些棘手的問題，研究人員不僅要面對科學挑戰，而且要面對像外源基因能否在體內穩定而持續地表達、是否會產生免疫反應等一系列問題。
迄今為止，通過不同的基因傳遞，大量基因和細胞已被研究和證明能用于骨再生，但仍沒有一種單一的方式能夠作為治療骨缺損的最佳方法。目前越來越多關于基因治療骨缺損的研究已發布，但大都仍處于對不同動物模型的基礎研究階段，且部分研究者并未嚴格控制動物模型中動物的年齡、性別、食物等混雜因素。在臨床前研究中需應用更嚴格的標準，并推動有前景的方法轉化為臨床應用，這將有利于患者和整個社會。
骨折不愈合即骨折超過預期時間沒有愈合，其發生率目前估計為 4.9%[1]。骨折不愈合常與患者多發性骨折、使用非甾體抗炎藥、使用阿片類藥物、開放性骨折、骨關節炎合并類風濕關節炎等有關[2]。臨床上，骨折不愈合常使患者經歷更多疼痛，導致殘疾、醫療費用增加以及勞動力恢復緩慢[3]，所以其治療一直是國內外骨科領域的熱點。自體松質骨移植目前被認為是治療骨折不愈合的最佳選擇[4]，但存在疼痛、出血、感染和取材方面的限制；而異體骨移植替代物可能導致移植失敗、感染、免疫反應以及成本增加等問題[5]，這些風險提示需要新的骨折愈合策略。近些年來，生長因子促進骨折修復一直是研究熱點，但外源性生長因子制備困難、存在副反應等限制了其應用[6]。而通過將編碼生長因子的相關基因經體內或體外的方式導入靶細胞，從而表達出生長因子蛋白治療骨折不愈合的方法得到了廣泛的研究，包括病毒傳遞、非病毒傳遞、基因活化基質（gene-activated matrix，GAM）與基因工程療法。在這篇綜述中，我們將討論成骨基因不同傳遞方式的研究現狀，以及各自的優缺點，旨在為目的基因治療骨折不愈合提供理論基礎。
1 體內導入
1.1 病毒基因傳遞
病毒自身 DNA 片段可以被目的基因所取代，病毒具有將基因轉移至靶細胞的能力。目前使用病毒載體進行的實驗已經超過 1 200 項[7]，使用的病毒載體包括腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒載體等[8]，這些載體通過傳遞不同的目的基因來誘導體內成骨[9-12]。目前的實驗研究中，腺病毒載體由于其毒性低、制備簡單、瞬時高表達的特點而被廣泛應用在基因治療中[8]。Liu 等[13]用攜帶綿羊骨骼肌骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2 基因的腺病毒載體轉染在大鼠的顱骨缺損中，得到了良好的新生骨組織，說明了腺病毒轉染治療骨缺損能夠獲得長期穩定表達。腺病毒載體介導的轉染已用于研究多種生長因子的聯合療法，其中就包括 Seamon 等[14]的研究將血管內皮生長因子基因和 BMP-6 基因傳遞至大鼠骨髓間充質干細胞促進成骨。目前腺病毒轉染成骨也運用在大型動物上，同樣獲得了良好的成骨效應[15]。除此之外，腺相關病毒載體具有無致病性、能長期表達、能感染多種細胞等優點，被廣泛用于基因載體[8]。甚至有學者將其拓展到成骨兩階段的研究[16]。但是，在病毒介導的成骨研究方面，轉染基因的大小與數目是否受到病毒本身攜帶能力的限制卻鮮有報道。逆轉錄病毒在用于成骨研究時，其安全性飽受詬病，免疫反應、潛在的致癌性被激活等都大大限制了其廣泛應用[17]。為了提高安全性，Alaee 等[18]應用自殺基因的方法提高了 BMP-2 的安全性，基于該研究，使用自殺基因的方法使治療后有害物質殘留減少是很有前景的。
1.2 非病毒基因傳遞
非病毒載體包括化學和物理傳遞方法。化學方法主要依賴于與 DNA 絡合的陽離子聚合物或脂質體、質粒等，以減少其細胞膜的電化學排斥。脂質體介導的基因轉染技術日趨成熟，例如陳寧等[19]應用雙基因（神經生長因子基因和 BMP-2 基因）真核質粒脂質體介導轉染大鼠骨髓間充質干細胞促進了成骨細胞分化。最近一項雙基因對比轉染的研究顯示，脂質體介導的基因轉染操作相對簡便，成本相對低廉，比病毒更容易構建，但轉染效率明顯低于慢病毒且轉染后穩定表達能力較弱[20]。物理方法則包括電穿孔和超聲波穿孔，它們分別使用電能和機械能在細胞膜上形成允許外源 DNA 導入的透明孔。如 Kimelman-Bleich 等[21]等首次表明成骨基因電穿孔可以治療骨缺損。而對于基于超聲技術的基因傳遞，Shapiro 等[22]等成功用超聲介導的轉基因募集到骨損傷部位。這些研究都表明超聲波傳遞基因安全性高，但效率卻不太顯著。近年來，有關超聲造影劑靶向運載藥物日益增多，該方法通過調整微泡本身的特性，可將治療性基因整合于微泡中。如 Bez 等[23]使用微泡增強超聲波轉染內源性間充質干細胞以表達 BMP-6，使豬的骨折愈合，暴露出來的問題是操作較為麻煩。這些方法雖然被認為相比病毒方法具有低免疫原性，卻目前只是停留在大型動物的基礎研究上，面對其效率低、表達時間不足、保存困難等問題仍需進一步尋找理想的解決辦法。
1.3 GAM
與 DNA 被細胞外 DNA 酶快速降解的大多數物理基因遞送方法不同，GAM 是一種負載細胞因子的細胞支架或者細胞外支架，允許基因可控制地、緩慢地釋放到周圍細胞。GAM 的優勢在于當種子細胞（包括成骨細胞、骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞等）自分泌或者旁分泌、增殖與分化作用時，其可提供骨傳導作用，甚至骨誘導三維環境，也能夠在再生過程中提供機械支持，使種子細胞與 GAM 形成細胞支架復合體，從而高效地修復骨組織損傷；缺點則是這種機械支持既沒有神經也沒有血管。Fang 等[24]首次將 GAM 用于體內骨再生，使用膠原支架和兩種不同的成骨質粒刺激新骨形成。為了提高轉染率，D’Mello 等[25]用雙基因進行研究，即編碼血管內皮生長因子基因和血小板衍生生長因子基因的聚乙烯亞胺-質粒 DNA 復合物的組合同時遞送用于顱骨缺損骨再生的初步研究，結果表明其目的成骨基因能夠在體內穩定、高效、持續表達。關于 GAM 的第 1 個臨床應用于 2016 年發表，Bozo 等[26]將膠原羥基磷灰石支架和編碼血管內皮生長因子的質粒 DNA 植入患有自體骨移植重建下頜骨骨不連的患者體內，在 1 年的隨訪中，發現了骨組織再生，且沒有觀察到不良事件。這項研究隨訪時間并不長，對于 GAM 在臨床患者中應用是否能達到預期的高效持久、穩定安全，則需要更長時間的隨訪來確定這種持續的表達隨時間跨度是否可變，同時應該考慮是否具有臨床適用性（如治療脛骨下端缺損以提供負重作用）。隨著越來越多的治療基因、載體、支架及其組合的發掘[27-29]，現階段需要更多試驗來研究揭示它們在復雜、高度調節中協同促進骨愈合的安全性及有效性。
2 基因工程細胞
物理基因傳遞、GAM 和病毒載體傳遞基因是體內傳遞的形式，而基因工程是利用重組技術，在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，對各種生物的核酸（基因）進行改造和重新組合，然后導入微生物或真核細胞（包括自體或同種異體細胞）內，使重組基因在細胞內表達，產生出人類需要的基因產物（生長因子和轉錄因子等）。基因工程細胞雖然更為復雜，但被認為更安全，因為它能更好地控制轉染過程，并且可直接引入參與修復缺損的細胞。Turgeman 等[30]早期的研究以人骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cell，hMSC）在培養基中擴增，并用編碼成骨因子人 BMP-2 的重組腺病毒載體轉染，在體外和體內評估基因工程 hMSC 的成骨潛力，結果基因工程 hMSC 在培養中顯示出持久增殖和成骨分化的能力。在體內，移植的基因工程 hMSC 能夠在異位部位移植并形成骨和軟骨，重要的是，從患有骨質疏松癥的患者中分離出的 hMSC 獲得了相同的結果[31]，這代表了骨骼基因治療的新平臺。為了提高骨髓間充質干細胞移植的治療效果，Yanagihara 等[32]將三維球形培養系統與基因轉染技術結合，研究以編碼 Runt 相關轉錄因子 2 的質粒 DNA 轉染骨髓間充質干細胞球體移植治療骨缺損，觀察到了持久穩定的骨再生。從這些研究來看，基因工程細胞治療骨缺損目的性更強，也同樣需要復雜的操作。目前，基因工程也已經用于研究大型動物模型的骨折愈合[33]。
3 問題與展望
骨再生的基因治療在過去突飛猛進，研究人員也在不斷推動及發現新的治療基因、載體、支架等，目前已經在體內和體外進行了嚴格的研究。一方面，雖然已發布了很多方法，但哪些可以轉化為臨床試驗卻難以確定。另一方面，這些豐富的研究信息使得需要對比性研究，但目前這樣的研究甚少。若要克服這些棘手的問題，研究人員不僅要面對科學挑戰，而且要面對像外源基因能否在體內穩定而持續地表達、是否會產生免疫反應等一系列問題。
迄今為止，通過不同的基因傳遞，大量基因和細胞已被研究和證明能用于骨再生，但仍沒有一種單一的方式能夠作為治療骨缺損的最佳方法。目前越來越多關于基因治療骨缺損的研究已發布，但大都仍處于對不同動物模型的基礎研究階段，且部分研究者并未嚴格控制動物模型中動物的年齡、性別、食物等混雜因素。在臨床前研究中需應用更嚴格的標準，并推動有前景的方法轉化為臨床應用，這將有利于患者和整個社會。