引用本文： 巫麗娟, 張莉, 趙藝, 黃馨怡, 周娟, 丁柳, 彭武, 莊杰, 周汶靜, 陸小軍, 陳捷. 血漿EB病毒核酸檢測在非高發區鼻咽癌患者中的臨床價值探討. 華西醫學, 2021, 36(8): 1032-1036. doi: 10.7507/1002-0179.201909175 復制
鼻咽癌是常見的惡性腫瘤之一，在我國東南沿海及東南亞呈高發趨勢，而在我國西南地區鼻咽癌發病趨勢明顯低于東南沿海，其發生與種族、遺傳、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染、環境和某些化學致癌物等因素有關。由于定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術的發展，定量檢測血漿中的游離病毒 DNA 載量逐漸受到學者們的關注[1-3]。已有相關文獻報道測定血漿中的 EBV-DNA 載量可作為診斷及監測鼻咽癌患者病情變化的手段之一[4-5]，但在我國西南地區，鼻咽癌患者的發病情況及復發情況等與 EBV 檢測陽性之間的臨床價值關系尚未見報道。因此，本研究采用實時熒光定量 PCR 技術測定鼻咽癌患者血漿中游離 EBV 的 DNA 拷貝數，來探討血漿 EBV-DNA 檢測情況與非高發區鼻咽癌患者生存及預后之間的關系。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集 2014 年 1 月—2015 年 12 月在我院確診的非角化型鼻咽癌患者資料。納入標準：綜合患者的病理、影像學報告等資料，由資深耳鼻喉科臨床醫生確診的非角化型鼻咽癌患者。排除標準：① 合并鼻咽部其他疾病的患者；② 無法完成 3 年隨訪患者。本研究經四川大學華西醫院臨床試驗與生物醫學倫理專委會審查通過，審批號：2014 年審（198）。
1.2 EBV 核酸提取及擴增
相關資料均來源于四川大學華西醫院的醫院信息系統及實驗室信息系統，EBV-DNA 載量的檢測由實驗醫學科完成，根據醫院的標準操作規程和要求，采集患者全血，離心取血漿進行 EBV-DNA 提取，EBV 核酸提取采用圣湘生物科技股份有限公司 Natch S 全自動核酸提取儀，核酸定量檢測采用 PCR-熒光探針法。具體擴增條件根據試劑盒說明書進行。
1.3 觀察指標
計算我院總體鼻咽癌患者 EBV-DNA 檢測率及治療前后 EBV-DNA 檢測陽性率。其中我院總體鼻咽癌患者 EBV-DNA 檢測率=我院治療前檢測 EBV-DNA 的鼻咽癌患者例數/我院鼻咽癌患者例數×100%；EBV-DNA 檢測陽性率=EBV-DNA 陽性患者例數/檢測 EBV-DNA 的鼻咽癌患者例數×100%，對于治療后的 EBV-DNA 檢測陽性率，本研究只回顧性分析了治療后半年內進行過 EBV-DNA 檢測的患者，治療后半年內多次檢測病毒載量的患者以其病毒載量最高的一次結果為準。
對治療后半年內至少有過 1 次 EBV-DNA 檢測患者的復發、轉移及疾病進展等情況與治療后 EBV-DNA 陽性間的關聯進行分析，了解 EBV-DNA 陽性對患者預后及生存期的影響，同時回顧分析一般資料（年齡、性別、疾病分期）與疾病 3 年期預后的關系。由資深耳鼻喉科臨床醫生綜合患者的病理、影像學報告等資料，判斷復發與轉移情況，疾病有復發或有遠處轉移之一均定義為疾病有進展。根據以往文獻經驗，本研究年齡以 45 歲進行分組；TNM 分期中因Ⅰ期和Ⅱ期分化程度高，Ⅲ、Ⅳ期分化程度低，本研究以Ⅰ期+Ⅱ期為早期，以Ⅲ期+Ⅳ期為晚期。
1.4 統計學方法
應用 SPSS 20.0 軟件對數據進行統計學處理。正態分布計量資料采用均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布計量資料采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示。計數資料采用例數和/或百分比表示，組間率的比較采用 Pearson χ2檢驗，治療前后陽性率的比較采用 McNemar 檢驗；因分析數據時有單元格的理論頻數小于 5，而總樣本例數大于 40，故用到了χ2檢驗中的連續修正值。對于隨訪數據，繪制 Kaplan-Meier 生存曲線并進行對數秩檢驗。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 治療前后 EBV-DNA 檢測情況
本研究共納入 235 例患者，其中 164 例治療前檢測了 EBV-DNA，檢測率為 69.79%。164 例患者中，EBV-DNA 陽性 149 例，陽性率為 90.85%；EBV-DNA 載量中位數（下四分位數，上四分位數）為 2850（527，12750）copies/mL。將 164 例患者按性別、年齡、分期分別進行分組，男性與女性患者間［90.91%（100/110）vs. 90.74%（49/54）；χ2=0.000，P=1.000］、年齡≤45 歲與>45 歲患者間［89.19%（66/74）vs. 92.22%（83/90）；χ2=0.450，P=0.503］、早期（Ⅰ期+Ⅱ期）與晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）患者間［84.00%（21/25）vs. 92.09%（128/139）；χ2=0.836，P=0.360］陽性率比較，差異均無統計學意義。
治療后半年內檢測 EBV-DNA 的患者共 131 例。其中男 89 例，女 42 例；年齡≤45 歲 53 例，>45 歲 78 例；早期（Ⅰ期+Ⅱ期）25 例，晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）106 例；28 例治療后半年內檢測出 EBV-DNA 陽性，陽性率為 21.37%。治療后半年內 EBV-DNA 檢測陽性組和陰性組的性別、年齡、分期差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
治療后半年內 EBV-DNA 陽性和陰性患者基本資料比較
2.2 治療前后 EBV-DNA 檢測結果比較
治療后半年內檢測 EBV-DNA 的 131 例患者中，治療前 EBV-DNA 陰性 14 例，陽性 117 例（89.31%）；治療后 EBV-DNA 陰性 103 例，陽性 28 例（21.37%）；治療前后的陽性率差異有統計學意義（χ2=85.172，P<0.001），治療后陽性率明顯降低。見表 2。
表2
131 例患者治療前后 EBV-DNA 檢測結果對比（例）
2.3 治療后半年內 EBV-DNA 陰性和陽性患者的 3 年期預后比較
治療后半年內 EBV-DNA 陽性組中 9 例患者有疾病進展，其中復發 3 例，轉移 6 例；治療后半年內 EBV-DNA 陰性組中共 7 例有疾病進展，其中復發 2 例，轉移 3 例，復發合并轉移 2 例。治療后半年內 EBV-DNA 陽性與陰性患者的復發率比較，差異無統計學意義（P>0.05）；但其轉移率及疾病進展率比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
治療后半年內 EBV-DNA 陽性和陰性患者 3 年期預后比較［例（%）］
2.4 治療后半年內檢測 EBV-DNA 患者的 3 年期生存分析
治療后半年內 EBV-DNA 檢測陽性患者 3 年無進展生存率（67.86%）及無轉移生存率（78.57%）均明顯低于治療后半年內 EBV-DNA 檢測陰性患者（93.20%、95.15%），差異均有統計學意義（χ2=14.099，P<0.001；χ2=8.170，P=0.004），見圖 1。不同性別、年齡及腫瘤分期的鼻咽癌患者的 3 年無進展生存差異無統計學意義（P>0.05），見圖 2。
圖1
治療后半年內檢測 EBV-DNA 患者的 3 年生存分析
a. 無進展生存分析；b. 無轉移生存分析
圖2
不同性別、年齡及腫瘤分期的鼻咽癌患者 3 年無進展生存分析
a. 不同性別比較；b. 不同年齡段比較；c. 不同分期間比較
3 討論
EBV 同鼻咽癌的發生發展關系密切，血漿中的 EBV-DNA 主要源自腫瘤細胞，EBV-DNA 載量能反映體內腫瘤的負荷，是一項能反映鼻咽癌分期、預后及監測鼻咽癌患者治療療效的靈敏而又特異的分子生物學指標[6-8]。目前血漿 EBV-DNA 檢測已廣泛應用于鼻咽癌的篩查、診斷及判斷治療反應[9-10]，而在我院就診且治療前檢測 EBV-DNA 的 164 例鼻咽癌患者陽性率為 90.85%，治療后半年內在我院檢測 EBV-DNA 的 131 例患者中，EBV-DNA 陽性檢出率為 21.37%，治療后陽性率顯著降低，這些數據與其他學者的研究[11]結果一致，再次驗證了 EBV-DNA 檢測對于鼻咽癌的篩查及診斷具有重要意義。
血漿 EBV-DNA 的陽性判斷標準目前尚存在爭議[12-13]，且目前國際上還沒有統一的檢測標準，無法確立統一的臨界值作為陽性參考值，這可能會影響研究中的靈敏度和特異度[14]，根據不同地區的實際情況制定適合自己實驗室的陽性報告值是十分必要的。本研究中所有鼻咽癌患者的 EBV-DNA 檢測結果都是按照我院的陽性報告標準進行，即報告陽性結果以具體數字為準，未擴增出 EBV-DNA 的檢測則報告陰性。本研究治療前血漿陽性率（90.85%）顯著高于高發區鼻咽癌患者[15-17]，EBV-DNA 載量中位數（下四分位數，上四分位數）為 2850（527，12750）copies/mL，病毒載量結果普遍偏低。這種 EBV-DNA 高檢出率、低載量值很可能與我院 EBV-DNA 陽性結果的報告方式有關，但也有可能與鼻咽癌低發地區人群所攜帶的 EBV 載量低于高發地區有關，尚待進一步深入研究。
本研究結果顯示，治療后半年內 EBV-DNA 陽性與 EBV-DNA 陰性者的預后比較，陽性組的 3 年無進展生存率及 3 年無遠處轉移生存率均低于陰性組，同時治療后半年內 EBV-DNA 陽性與 EBV-DNA 陰性者的 3 年生存曲線分析結果也表明兩組間差異有統計學意義。由于樣本量較小，本研究未進行多因素分析，但陽性組與陰性組患者的性別、年齡、腫瘤分期的分布差異無統計學意義，且按上述因素分組時，組間 3 年生存曲線差異均無統計學意義，能夠在一定程度上排除這些因素的干擾，可以認為治療后半年內 EBV-DNA 陰陽性對患者預后及進展有一定影響。堅持監測 EBV-DNA 能為臨床后期治療與監測疾病提供重要的參考價值，若治療后 EBV-DNA 陽性，則可能預示著疾病預后及進展不理想，提示臨床醫生需要對該類患者進行更多的關注。
綜上，對于非高發區的非角化型鼻咽癌患者，EBV-DNA 檢測對于鼻咽癌的篩查及診斷具有重要意義，且治療后半年內 EBV-DNA 陰陽性可能為患者預后及進展的重要影響因素，治療前后都應定期監測血漿 EBV-DNA 水平，EBV-DNA 檢測有重要的臨床價值。
鼻咽癌是常見的惡性腫瘤之一，在我國東南沿海及東南亞呈高發趨勢，而在我國西南地區鼻咽癌發病趨勢明顯低于東南沿海，其發生與種族、遺傳、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染、環境和某些化學致癌物等因素有關。由于定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術的發展，定量檢測血漿中的游離病毒 DNA 載量逐漸受到學者們的關注[1-3]。已有相關文獻報道測定血漿中的 EBV-DNA 載量可作為診斷及監測鼻咽癌患者病情變化的手段之一[4-5]，但在我國西南地區，鼻咽癌患者的發病情況及復發情況等與 EBV 檢測陽性之間的臨床價值關系尚未見報道。因此，本研究采用實時熒光定量 PCR 技術測定鼻咽癌患者血漿中游離 EBV 的 DNA 拷貝數，來探討血漿 EBV-DNA 檢測情況與非高發區鼻咽癌患者生存及預后之間的關系。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集 2014 年 1 月—2015 年 12 月在我院確診的非角化型鼻咽癌患者資料。納入標準：綜合患者的病理、影像學報告等資料，由資深耳鼻喉科臨床醫生確診的非角化型鼻咽癌患者。排除標準：① 合并鼻咽部其他疾病的患者；② 無法完成 3 年隨訪患者。本研究經四川大學華西醫院臨床試驗與生物醫學倫理專委會審查通過，審批號：2014 年審（198）。
1.2 EBV 核酸提取及擴增
相關資料均來源于四川大學華西醫院的醫院信息系統及實驗室信息系統，EBV-DNA 載量的檢測由實驗醫學科完成，根據醫院的標準操作規程和要求，采集患者全血，離心取血漿進行 EBV-DNA 提取，EBV 核酸提取采用圣湘生物科技股份有限公司 Natch S 全自動核酸提取儀，核酸定量檢測采用 PCR-熒光探針法。具體擴增條件根據試劑盒說明書進行。
1.3 觀察指標
計算我院總體鼻咽癌患者 EBV-DNA 檢測率及治療前后 EBV-DNA 檢測陽性率。其中我院總體鼻咽癌患者 EBV-DNA 檢測率=我院治療前檢測 EBV-DNA 的鼻咽癌患者例數/我院鼻咽癌患者例數×100%；EBV-DNA 檢測陽性率=EBV-DNA 陽性患者例數/檢測 EBV-DNA 的鼻咽癌患者例數×100%，對于治療后的 EBV-DNA 檢測陽性率，本研究只回顧性分析了治療后半年內進行過 EBV-DNA 檢測的患者，治療后半年內多次檢測病毒載量的患者以其病毒載量最高的一次結果為準。
對治療后半年內至少有過 1 次 EBV-DNA 檢測患者的復發、轉移及疾病進展等情況與治療后 EBV-DNA 陽性間的關聯進行分析，了解 EBV-DNA 陽性對患者預后及生存期的影響，同時回顧分析一般資料（年齡、性別、疾病分期）與疾病 3 年期預后的關系。由資深耳鼻喉科臨床醫生綜合患者的病理、影像學報告等資料，判斷復發與轉移情況，疾病有復發或有遠處轉移之一均定義為疾病有進展。根據以往文獻經驗，本研究年齡以 45 歲進行分組；TNM 分期中因Ⅰ期和Ⅱ期分化程度高，Ⅲ、Ⅳ期分化程度低，本研究以Ⅰ期+Ⅱ期為早期，以Ⅲ期+Ⅳ期為晚期。
1.4 統計學方法
應用 SPSS 20.0 軟件對數據進行統計學處理。正態分布計量資料采用均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布計量資料采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示。計數資料采用例數和/或百分比表示，組間率的比較采用 Pearson χ2檢驗，治療前后陽性率的比較采用 McNemar 檢驗；因分析數據時有單元格的理論頻數小于 5，而總樣本例數大于 40，故用到了χ2檢驗中的連續修正值。對于隨訪數據，繪制 Kaplan-Meier 生存曲線并進行對數秩檢驗。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 治療前后 EBV-DNA 檢測情況
本研究共納入 235 例患者，其中 164 例治療前檢測了 EBV-DNA，檢測率為 69.79%。164 例患者中，EBV-DNA 陽性 149 例，陽性率為 90.85%；EBV-DNA 載量中位數（下四分位數，上四分位數）為 2850（527，12750）copies/mL。將 164 例患者按性別、年齡、分期分別進行分組，男性與女性患者間［90.91%（100/110）vs. 90.74%（49/54）；χ2=0.000，P=1.000］、年齡≤45 歲與>45 歲患者間［89.19%（66/74）vs. 92.22%（83/90）；χ2=0.450，P=0.503］、早期（Ⅰ期+Ⅱ期）與晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）患者間［84.00%（21/25）vs. 92.09%（128/139）；χ2=0.836，P=0.360］陽性率比較，差異均無統計學意義。
治療后半年內檢測 EBV-DNA 的患者共 131 例。其中男 89 例，女 42 例；年齡≤45 歲 53 例，>45 歲 78 例；早期（Ⅰ期+Ⅱ期）25 例，晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）106 例；28 例治療后半年內檢測出 EBV-DNA 陽性，陽性率為 21.37%。治療后半年內 EBV-DNA 檢測陽性組和陰性組的性別、年齡、分期差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
治療后半年內 EBV-DNA 陽性和陰性患者基本資料比較
2.2 治療前后 EBV-DNA 檢測結果比較
治療后半年內檢測 EBV-DNA 的 131 例患者中，治療前 EBV-DNA 陰性 14 例，陽性 117 例（89.31%）；治療后 EBV-DNA 陰性 103 例，陽性 28 例（21.37%）；治療前后的陽性率差異有統計學意義（χ2=85.172，P<0.001），治療后陽性率明顯降低。見表 2。
表2
131 例患者治療前后 EBV-DNA 檢測結果對比（例）
2.3 治療后半年內 EBV-DNA 陰性和陽性患者的 3 年期預后比較
治療后半年內 EBV-DNA 陽性組中 9 例患者有疾病進展，其中復發 3 例，轉移 6 例；治療后半年內 EBV-DNA 陰性組中共 7 例有疾病進展，其中復發 2 例，轉移 3 例，復發合并轉移 2 例。治療后半年內 EBV-DNA 陽性與陰性患者的復發率比較，差異無統計學意義（P>0.05）；但其轉移率及疾病進展率比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
治療后半年內 EBV-DNA 陽性和陰性患者 3 年期預后比較［例（%）］
2.4 治療后半年內檢測 EBV-DNA 患者的 3 年期生存分析
治療后半年內 EBV-DNA 檢測陽性患者 3 年無進展生存率（67.86%）及無轉移生存率（78.57%）均明顯低于治療后半年內 EBV-DNA 檢測陰性患者（93.20%、95.15%），差異均有統計學意義（χ2=14.099，P<0.001；χ2=8.170，P=0.004），見圖 1。不同性別、年齡及腫瘤分期的鼻咽癌患者的 3 年無進展生存差異無統計學意義（P>0.05），見圖 2。
圖1
治療后半年內檢測 EBV-DNA 患者的 3 年生存分析
a. 無進展生存分析；b. 無轉移生存分析
圖2
不同性別、年齡及腫瘤分期的鼻咽癌患者 3 年無進展生存分析
a. 不同性別比較；b. 不同年齡段比較；c. 不同分期間比較
3 討論
EBV 同鼻咽癌的發生發展關系密切，血漿中的 EBV-DNA 主要源自腫瘤細胞，EBV-DNA 載量能反映體內腫瘤的負荷，是一項能反映鼻咽癌分期、預后及監測鼻咽癌患者治療療效的靈敏而又特異的分子生物學指標[6-8]。目前血漿 EBV-DNA 檢測已廣泛應用于鼻咽癌的篩查、診斷及判斷治療反應[9-10]，而在我院就診且治療前檢測 EBV-DNA 的 164 例鼻咽癌患者陽性率為 90.85%，治療后半年內在我院檢測 EBV-DNA 的 131 例患者中，EBV-DNA 陽性檢出率為 21.37%，治療后陽性率顯著降低，這些數據與其他學者的研究[11]結果一致，再次驗證了 EBV-DNA 檢測對于鼻咽癌的篩查及診斷具有重要意義。
血漿 EBV-DNA 的陽性判斷標準目前尚存在爭議[12-13]，且目前國際上還沒有統一的檢測標準，無法確立統一的臨界值作為陽性參考值，這可能會影響研究中的靈敏度和特異度[14]，根據不同地區的實際情況制定適合自己實驗室的陽性報告值是十分必要的。本研究中所有鼻咽癌患者的 EBV-DNA 檢測結果都是按照我院的陽性報告標準進行，即報告陽性結果以具體數字為準，未擴增出 EBV-DNA 的檢測則報告陰性。本研究治療前血漿陽性率（90.85%）顯著高于高發區鼻咽癌患者[15-17]，EBV-DNA 載量中位數（下四分位數，上四分位數）為 2850（527，12750）copies/mL，病毒載量結果普遍偏低。這種 EBV-DNA 高檢出率、低載量值很可能與我院 EBV-DNA 陽性結果的報告方式有關，但也有可能與鼻咽癌低發地區人群所攜帶的 EBV 載量低于高發地區有關，尚待進一步深入研究。
本研究結果顯示，治療后半年內 EBV-DNA 陽性與 EBV-DNA 陰性者的預后比較，陽性組的 3 年無進展生存率及 3 年無遠處轉移生存率均低于陰性組，同時治療后半年內 EBV-DNA 陽性與 EBV-DNA 陰性者的 3 年生存曲線分析結果也表明兩組間差異有統計學意義。由于樣本量較小，本研究未進行多因素分析，但陽性組與陰性組患者的性別、年齡、腫瘤分期的分布差異無統計學意義，且按上述因素分組時，組間 3 年生存曲線差異均無統計學意義，能夠在一定程度上排除這些因素的干擾，可以認為治療后半年內 EBV-DNA 陰陽性對患者預后及進展有一定影響。堅持監測 EBV-DNA 能為臨床后期治療與監測疾病提供重要的參考價值，若治療后 EBV-DNA 陽性，則可能預示著疾病預后及進展不理想，提示臨床醫生需要對該類患者進行更多的關注。
綜上，對于非高發區的非角化型鼻咽癌患者，EBV-DNA 檢測對于鼻咽癌的篩查及診斷具有重要意義，且治療后半年內 EBV-DNA 陰陽性可能為患者預后及進展的重要影響因素，治療前后都應定期監測血漿 EBV-DNA 水平，EBV-DNA 檢測有重要的臨床價值。
