引用本文： 楊汐靜, 陳曉婷, 劉道龍, 楊陽, 楊光. 金黃色葡萄球菌纖連蛋白結合蛋白 A r10-11 截短體蛋白基因片段的原核表達與免疫原性. 華西醫學, 2018, 33(12): 1519-1525. doi: 10.7507/1002-0179.201811035 復制
金黃色葡萄球菌是一種人畜共患菌，廣泛存在于自然界，如空氣和土壤中，也存在于人和動物的皮膚以及與外界相通的腔道中，其不僅影響乳產品安全，也危害人體健康[1]。在人群中有 20%～50% 鼻咽部帶有病原型球菌，醫院工作人員以及醫療器械帶菌率很高，是醫院內感染的重要來源；其可引起的疾病從皮膚、軟組織感染到肺炎、腦膜炎、細菌性心內膜炎甚至危及生命的中毒性休克綜合征，危害極大，臨床上 80% 以上的皮膚化膿性疾病都是由金黃色葡萄球菌引起的[2]。近百年來，國內外開展了各種關于金黃色葡萄球菌疫苗的研究，經歷了從滅活全菌苗到亞單位疫苗再到 DNA 疫苗的 3 次轉變，但是體外培養的金黃色葡萄球菌全菌滅活苗經過實驗驗證效果不理想，不能有效抵抗新的感染發生[3]。而 DNA 疫苗刺激機體產生免疫應答反應較弱，而且有外源 DNA 整合入基因組的潛在危險，目前亞單位疫苗使用最為普遍而且效果較理想。已有研究發現，將金黃色葡萄球菌與免疫血清共同作用一段時間后，細菌與宿主的結合能力下降 92%，在體外也受到巨噬細胞吞噬[4]。因此，制備金黃色葡萄球菌亞單位疫苗成為當下一個熱點。
金黃色葡萄球菌釋放黏附素，通過介質結合到細胞表面達到定植和侵染。纖連蛋白結合蛋白（fibronectin binding protein，FnBP）是金黃色葡萄球菌表面黏附素因子中的一種[5]，能識別細胞外基質內配體纖連蛋白、纖維蛋白與彈性蛋白等，依次介導連接到細胞表面整合素，使細胞表面肌動蛋白重排，達到黏附作用[6-7]。故金黃色葡萄球菌分泌的黏附素是細菌感染的先決條件，抑制其活性可從根源上切斷金黃色葡萄球菌感染。FnBP 分為 FnBPA 和 FnBPB，幾乎所有金黃色葡萄球菌都能分泌 FnBPA，少數能共分泌 FnBPA 和 FnBPB[8-10]。故 FnBPA 已成為最近研究治療與檢測金黃色葡萄球菌感染的熱點。
金黃色葡萄球菌 FnBPA 蛋白由 1 081 個氨基酸構成，N-端前 37 位氨基酸為信號肽，37-511 位氨基酸為連接彈性蛋白 EL 與纖維連接蛋白 Fg 區域，分為 N1、N2、N3 區；511-874 位氨基酸由 11 個重復序列構成（FnBPAr1-11），是 FnBPA 鏈接配體 Fn 的主要黏附區域（FnBPR）；874-948 位氨基酸為富含脯氨酸構成的 PRR 區域，類似于抗體鉸鏈區，其功能有待于進一步研究；982–986 位氨基酸區域為 LPXTG 基序，C-端 948-1081 位氨基酸為連接細胞壁與細胞膜區域[11-13]。
根據 FnBPA 的蛋白二級結構分析，FnBPAr1-11 是連接其配體 Fn 的主要區域，而且每一個區域都能單獨連接細胞基質內配體，11 個配體連接區域也分為強弱黏附區域，而 r10-11 都是強黏附區域[14]。據此實驗針對金黃色葡萄球菌的 FnBPAr10-11 蛋白基因進行誘導表達，表達金黃色葡萄球菌 FnBPAr10-11 截短體蛋白，并分離純化，為后續動物免疫實驗做好準備，同時也為后續的多聯嵌合疫苗制備提供一定的依據。
1 材料與方法
1.1 菌種、藥品、化學試劑及動物
金黃色葡萄球菌 Newman 株，大腸桿菌 DH5α、BL21（DE3）受贈于黑龍江八一農墾大學生命學院崔玉東教授；pET-32a 原核表達系統來源于四川大學華西醫院衛生部重點實驗室移植免疫研究室；限制性內切酶 BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA 連接酶、LA Taq DNA 聚合酶、DL8000、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside，IPTG）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、氨芐青霉素、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、十二烷基硫酸購自日本 TaKaRa 公司；蛋白質 Marker 購自立陶宛 Fermentas（MBI）公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、二硫蘇糖醇、溴酚藍、脫脂乳購自美國 Ameresco 公司。細菌培養用胰胨及 Yerst Extract 購自英國 Oxoid 公司；Plasmid Miniprep Purification kit 和 Gal/PCRpurification kit 購自上海 Gene Tech 公司；酶聯免疫斑點法（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）試劑盒購自達科為公司。
實驗用 81 只 BalB/C 雄性健康小鼠，體重 18～24 g，購自成都達碩公司，生產許可證為［SCXK（川）2015-30］，檢驗檢疫合格證號為 No.51203500001021，動物飼養在四川大學華西醫院動物實驗中心無特定病原體屏障系統，使用許可證為［SYXK（川）2013-119］，溫度 22～26℃，濕度 40%～70%，晝夜節律為 12 h，飼料為小鼠專用輻照全價日糧，自由采食飲水。動物實驗已通過四川大學華西醫院動物倫理委員會審查，符合動物倫理要求，倫理備案號為 2017101A。
1.2 引物的設計與合成
根據 GenBank 中 FnBPA（GI:120457）中基因序列設計 2 條引物。上游引物：5′-CGC GGATCCAAGTATGAACATGGCG-3′；下游引物：5′-CAC AAGCTTAGGTGTTGTATCTTCTTC-3′。上游引物劃線部分是 BamHⅠ酶切位點，下游劃線部分為 HindⅢ酶切位點。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
1.3 金黃色葡萄球菌培養與基因組 DNA 的提取
從–70℃ 冰箱中取出原始菌株金黃色葡萄球菌 Newman 并在胰蛋白胨大豆瓊脂培養基平板上劃線過夜培養，挑取單菌落在 BST 液體培養基中 37℃，180 r/min 培養 12 h，后采用試劑盒提取金黃色葡萄球菌 Newman 全基因組。
1.4 金黃色葡萄球菌 fnbpAr10-11 目的基因的克隆與鑒定
1.4.1 fnbpAr10-11 目的基因的聚合酶鏈反應（ploymerase chain reaction，PCR）擴增
以提取的金黃色葡萄球菌 Newman 的基因組為模板，按順序依次加入模板 DNA（200 ng/μL）2.5 μL、上游引物（20 μmol/L）5 μL、下游引物（20 μmol/L）5 μL、DNA 聚合酶（5 U/μL）2.5 μL、dNTP 10 μL、10×Buffer 緩沖液 10 μL、無菌去離子水 65 μL 至 100 μL 體系。將 100 μL 體系平均分配到 PCR 管內，每個 PCR 管 20 μL 體系，同時設立陰性對照，并按以下過程進行 PCR 反應：94℃ 預變性 10 min，94℃ 變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 1 min；35 個循環，最后 72℃ 延伸 10 min。
1.4.2 PCR 產物的膠回收、T 載體連接及鑒定
將 PCR 產物在 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，并將驗證正確目的片段采用 Gal/PCR purification kit 試劑盒進行膠回收（具體步驟見說明書），回收后的目的基因在 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。回收后的目的片段鏈接到 pMD-18T 載體上進行克隆，PCR 管內按順序依次加入目的基因 fnbpAr10-11 4.5 μL、pMD-18T 載體 0.5 μL、solutionⅠ（含 T4 連接酶）5 μL 至 10 μL 體系。以上程序均在冰上進行。將混合后的 10 μL 體系在 16℃ 恒溫連接儀上孵育2 h， 后轉化到制備好的大腸桿菌 DH5α 感受態中。
轉化過程如下：–70℃ 取出制備好的 DH5α 感受態冰上孵化，將鏈接混合物加入到感受態細胞內，放置在冰盒內 30 min，42℃ 熱激 90 s，熱激后再次放到冰盒內 1～2 min，此過程不能劇烈晃動感受態細胞，加入 37℃ 預熱 LB 1 mL，之后 37℃ 空氣搖床 110 r/min，培養 1 h，4 000 r/min 離心 5 min，棄去上清 800 μL，剩余的上清液混懸沉淀，取 200 μL 在含有 Amp+抗性的 LB 瓊脂培養平皿上進行涂布，37℃ 過夜培養。
取陽性單菌落在還有 Amp+抗性的 LB 液體培養基內 180 r/min 培養 12 h，培養后的菌液采用 Plasmid Miniprep Purification kit 試劑盒提取質粒，提取后的質粒進行雙酶切鑒定，按順序依次加入 fnbpAr10-11-pMD-18T 質粒 10 μL、BamHⅠ 1 μL、HindⅢ 1 μL、10×Buffer 緩沖液 2 μL、無菌去離子水 6 μL 至 20 μL 體系。37℃ 水浴 15 min，后在 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。
1.5 金黃色葡萄球菌 fnbpAr10-11-pET-32a 表達載體的構建
將陽性質粒 fnbpAr10-11-pMD-18T 用 BamHⅠ和 HindⅢ雙酶切，之后用 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，并回收雙酶切后的目的片段，同時對表達載體 pET-32a 進行雙酶切，并回收雙酶切后載體片段。將雙酶切后的目的片段和載體按 4∶1 比例進行連接：目的片段 4 μL，雙酶切后 pET-32a 1 μL，含有 T4DNA 連接酶的 solutionⅠ 5 μL 至 10 μL 體系，并在 16℃ 恒溫鏈接儀上連接 2 h，連接后產物轉化到大腸桿菌 DH5α 中，具體步驟同 pMD-18T。并用含有 Amp+抗性的 LB 瓊脂平板進行篩選。
挑取陽性單菌落接種到含有 Amp+抗性 LB 液體培養基中 37℃，180 r/min 培養 12 h，提取質粒，并用 BamHⅠ和 HindⅢ雙酶切進行驗證并留圖。將鑒定正確的質粒轉入到大腸桿菌 BL21（DE3）中，重組載體命名為 fnbpAr10-11-pET32a。同時將鑒定正確的菌株進行基因測序，測序由上海生工生物工程有限公司提供服務。
1.6 融合蛋白的誘導表達及分析
將篩選到的陽性重組菌 fnbpAr10-11-pET32a/BL21 以 1∶50 比例接種到含有 Amp+抗性 LB 液體培養基中 37℃ 過夜培養。取新鮮菌液以 1∶100 比例接種到含有 Amp+抗性 LB 液體培養基 100 mL 中，37℃ 180 r/min 培養至波長 600 nm 處吸光度（absorbance，A600）為 0.4～0.6，加入終濃度為 1.0 mmol/L 誘導劑 IPTG，37℃ 誘導 4 h。同時設立陰性對照組空載體 pET-32a/BL21。分別取實驗組與對照組誘導后菌液 2 mL，12 000 r/min 離心 2 min，棄去上清，并用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）80 μL 對沉淀菌體懸浮，加入 5×上樣緩沖液（含二硫蘇糖醇）20 μL 充分混勻，并在沸水浴中煮沸 10 min，使菌體破裂，取處理后樣品 5 μL 進行 12% 的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE ）分析。
1.7 實驗動物分組及免疫
免疫組：根據統計學要求將 6 周齡 BalB/C 雄性小鼠隨機分成 A、B、C 3 組，每組 27 只，飼養 1 周后，分別于第 0 天和第 21 天皮下注射 PBS-佐劑、FnBPA-佐劑、FnBPAr10-11-佐劑，劑量為 100 μg/只。每組分別于第 21 天和第 35 天時隨機取 3 只小鼠，尾根采血，分離血清，待檢測特異性抗體水平。
攻毒組：上面的免疫組，每組取出 20 只，分成 2 籠，每籠 10 只，分別于每只小鼠腹腔注射金黃色葡萄球菌 Newman 株 1×1010 CFU、金黃色葡萄球菌 Wood46 株 0.8×1010 CFU。觀察 1 周，從攻毒后的 12 h 開始每天做記錄。
1.7.1 最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數的確定
抗原以 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600 稀釋，陰陽性血清分別以 1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200 稀釋，進行間接酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），每個稀釋度做 3 個重復。
1.7.2 間接 ELISA 方法陰陽性臨界值的確定
用 FnBPA 蛋白抗原包被好的酶標板，間接 ELISA 測定 3 份 BalB/C 小鼠陰性血清 A450 值。每份血清做 3 個重復。
1.7.3 各組血清中抗體效價檢測
根據之前確定的最佳抗原濃度包被 ELISA 板，血清以 1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000 倍稀釋，進行間接 ELISA 試驗，在 A450 分別檢測實驗組和對照組中實驗小鼠初免后 21、35 d 的血清，每組 3 只。
1.7.4 細胞因子檢測
于免疫后第 4 周每組取 4 只小鼠處死，分離脾臟淋巴細胞，用于細胞因子檢測。使用達科為公司的 ELISPOT 試劑盒測定 FnBPA、FnBPAr10-11、PBS 組小鼠脾臟分泌白細胞介素（interleukin，IL）-4、γ-干擾素淋巴細胞的水平。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 18.0 軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK-q 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 金黃色葡萄球菌 fnbpAr10-11 基因的 PCR 擴增
以金黃色葡萄球菌 Newman 全基因組為模板進行 PCR 擴增，擴增后的產物進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得大小為 222 bp 目的片段，與設計長度一致（圖 1a）。
2.2 重組原核表達質粒 fnbpAr10-11-pET32a 的酶切鑒定及測序結果
將重組陽性質粒 fnbpAr10-11-pET32a 進行雙酶切驗證（BamHⅠ和 HindⅢ），將酶切后的產物進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，得到的兩條目的條帶分別為 5 900、222 bp，與預期效果相同（圖 1b）。測序結果同金黃色葡萄球菌 Newman 全基因組進行 BLAST 分析，結果相同率為 100%，說明構建的重組質粒正確沒有突變。
2.3 重組質粒 fnbpAr10-11-pET32a 在大腸桿菌 BL21（DE3）中的表達
根據 1.6 中的方法，重組菌 fnbpAr10-11-pET32a/BL21 經 IPTG 誘導表達后進行全菌體 SDS-PAGE 分析，在相對分子質量為 33×103左右處有一明顯增量條帶，目的基因大小為 222 bp，表達蛋白相對分子質量約為 8.14×103，因表達載體 pET-32a 自身表達蛋白相對分子質量約為 25×103，所以得到目的片段相對分子質量為 33.1×103 。誘導前與誘導后有明顯增加，表明 FnBPAr10-11 在 pET-32a 表達載體中成功大量表達，Immage scanner Ⅲ掃描并運用專業分析軟件 Glyko Bandscan 對電泳圖譜進行分析表明，得到目的條帶相對分子質量 33.1×103與預期效果一樣（圖 1c）。
圖1
fnbpAr10-11 基因的 PCR、雙酶切及 FnBPAr10-11 蛋白的 SDS-PAGE 檢測結果
a. 金黃色葡萄球菌
2.4 實驗小鼠血清免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）抗體檢測
2.4.1 最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數的確定
經分析抗原 1∶100 稀釋，血清 1∶1 600 稀釋時，陰性 A450 值在 0.2 以下，且 P/N 值最大，所以抗原最佳稀釋度定為 1∶100，濃度為 10 μg/mL，血清最佳稀釋度定為 1∶1 600。
2.4.2 間接 ELISA 方法陰陽性臨界值的確定
經統計分析，3 份陰性血清的 A450 的平均值為 0.157 5，標準差為 0.040 6，因此 ELISA 陰陽性臨界值等于 0.198 1，確定樣品 A450≥0.198 1 判定為陽性。
2.4.3 各組血清中抗體效價檢測
經 ELISA 檢測后，FnBPA 組和 FnBPAr10-11 組二免后抗體效價高者達 1∶128 000，PBS 組抗體效價未見明顯上升，抗體效價結果見表 1；以最佳包被濃度包被 ELISA 板，血清以最佳稀釋度 1∶1 600 來稀釋，測得 A450 數據見表 2，抗體效價越高，A450 值越大，結果表明 FnBPA 組和 FnBPAr10-11 組與 PBS 組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
表1
免疫小鼠血清抗 FnBPA IgG 抗體效價
表2
間接 ELISA 檢測免疫小鼠血清 IgG 抗體 A450 值（
）
2.5 細胞因子檢測
重組蛋白 FnBPAr10-11 免疫組小鼠脾淋巴細胞分泌 IL-4 和 γ-干擾素的能力與全蛋白 FnBPA 組比較差異無統計學意義（P>0.05），與 PBS 比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3、圖 2。
表3
各實驗組細胞因子 IL-4、γ-干擾素含量（
）
圖2
ELISPOT 檢測各組 IL-4、γ-干擾素結果
顯微鏡下觀察 IL-4、γ-干擾素斑點形成情況
2.6 截短蛋白 FnBPAr10-11 的免疫保護結果
各實驗免疫組，在加強免疫 14 d 后用金黃色葡萄球菌 Newman、Wood46，以絕對致死量進行攻毒，攻毒后觀察實驗小鼠死亡情況并記錄數據；FnBPAr10-11 實驗組免疫保護率為 50%（Newman 株）和 50%（Wood46 株）。見圖 3。
圖3
攻毒試驗結果
a. 實驗動物金黃色葡萄球菌 Newman 株攻毒后存活率；b. 實驗動物金黃色葡萄球菌 Wood46 株攻毒后存活率
3 討論
金黃色葡萄球菌是一種常見的革蘭陽性球菌，既是人體皮膚和鼻腔的常見定植菌，也是引起人類臨床感染的常見致病菌[15]。其為社區、醫院獲得性細菌感染的主要原因，具有很強的致病作用和很高的致死率，即使在適當治療情況下仍比其他細菌感染的病死率高。
人類化膿感染中金黃色葡萄球菌是最常見的病原菌之一，除了引起皮膚和軟組織感染外，同時還能引起骨髓炎、肺炎、心內膜炎及敗血癥等全身性感染，導致患者住院時間延長和比較昂貴的醫療費用支出。隨著抗菌藥物在金黃色葡萄球菌感染治療中的廣泛應用，大量金黃色葡萄球菌耐藥菌株出現，致使金黃色葡萄球菌抗藥性增強，甚至抗菌藥物治療毫無效果，危害人類生命健康，所造成的影響不能小覷[16]。此外金黃色葡萄球菌也是奶牛乳房感染的主要病原菌之一，感染后導致奶牛產奶量和奶品質下降，嚴重影響乳業及食品安全，給畜牧業帶來巨大經濟損失[17]。
金黃色葡萄球菌感染機體后，能夠產生一系列菌體表面相聯的黏附分子和分泌到細胞外的黏附因子，進而定植在感染的組織并進行增殖，同時逃避宿主免疫防御，引起機體感染。FnBPA 是金黃色葡萄球菌產生的重要表面黏附分子之一，主要在金黃色葡萄球菌對數生長前期表達，能夠與細胞外基質中的纖連蛋白、纖維蛋白原等組織成分結合，成為細菌與宿主細胞表面結合的橋梁，從而使細菌在宿主細胞上定植進而侵染宿主細胞[18]。同時，金黃色葡萄球菌與 FnBPA 結合后可對細菌起到保護作用，進而逃避宿主防御。因此，FnBPA 在金黃色葡萄球菌感染中顯得尤為重要。FnBPA 蛋白具有良好的免疫原性，是重要的疫苗候選抗原，但因分子量過大而不易在體外獲得高水平表達，限制了其作為疫苗的應用。
本實驗采用重組 PCR 方法成功構建表達截短蛋白 FnBPAr10-11 的重組菌株，通過抗體水平檢測和細胞因子檢測，該截短蛋白 FnBPAr10-11 的免疫原性同全蛋白 FnBPA 無明顯差異，表明該截短體保留了蛋白 FnBPA 原來的活性及功能，免疫原性良好。同時通過 2 種金黃色葡萄球菌的攻毒試驗可以看出，該截短體免疫保護作用大于 50%，保護效果良好。
金黃色葡萄球菌是一類攜帶多個有效抗原的病原微生物，包括 FnBP、Trap、ClfA、ClfB、Cna 等。雖然亞單位疫苗有較好的免疫保護性，但因抗原單一性，治療效果片面，發展多聯嵌合疫苗不僅可解決抗原單一性的問題，其同時還具有良好的免疫原性。然而有效完整的抗原蛋白量都較大，直接串聯制成多聯嵌合體，超出了表達載體的承載量，導致表達量過低構建失敗。制作多聯嵌合疫苗很重要的一點就是要串聯的蛋白量盡可能小、同時又保留了蛋白的免疫原性，這樣既能比較容易地得到重組菌株又有較好的免疫效果。本研究中的截短體蛋白 FnBPAr10-11 保留了該蛋白的主要免疫原性，為后續多聯嵌合重組疫苗的構建奠定了一定基礎。
金黃色葡萄球菌是一種人畜共患菌，廣泛存在于自然界，如空氣和土壤中，也存在于人和動物的皮膚以及與外界相通的腔道中，其不僅影響乳產品安全，也危害人體健康[1]。在人群中有 20%～50% 鼻咽部帶有病原型球菌，醫院工作人員以及醫療器械帶菌率很高，是醫院內感染的重要來源；其可引起的疾病從皮膚、軟組織感染到肺炎、腦膜炎、細菌性心內膜炎甚至危及生命的中毒性休克綜合征，危害極大，臨床上 80% 以上的皮膚化膿性疾病都是由金黃色葡萄球菌引起的[2]。近百年來，國內外開展了各種關于金黃色葡萄球菌疫苗的研究，經歷了從滅活全菌苗到亞單位疫苗再到 DNA 疫苗的 3 次轉變，但是體外培養的金黃色葡萄球菌全菌滅活苗經過實驗驗證效果不理想，不能有效抵抗新的感染發生[3]。而 DNA 疫苗刺激機體產生免疫應答反應較弱，而且有外源 DNA 整合入基因組的潛在危險，目前亞單位疫苗使用最為普遍而且效果較理想。已有研究發現，將金黃色葡萄球菌與免疫血清共同作用一段時間后，細菌與宿主的結合能力下降 92%，在體外也受到巨噬細胞吞噬[4]。因此，制備金黃色葡萄球菌亞單位疫苗成為當下一個熱點。
金黃色葡萄球菌釋放黏附素，通過介質結合到細胞表面達到定植和侵染。纖連蛋白結合蛋白（fibronectin binding protein，FnBP）是金黃色葡萄球菌表面黏附素因子中的一種[5]，能識別細胞外基質內配體纖連蛋白、纖維蛋白與彈性蛋白等，依次介導連接到細胞表面整合素，使細胞表面肌動蛋白重排，達到黏附作用[6-7]。故金黃色葡萄球菌分泌的黏附素是細菌感染的先決條件，抑制其活性可從根源上切斷金黃色葡萄球菌感染。FnBP 分為 FnBPA 和 FnBPB，幾乎所有金黃色葡萄球菌都能分泌 FnBPA，少數能共分泌 FnBPA 和 FnBPB[8-10]。故 FnBPA 已成為最近研究治療與檢測金黃色葡萄球菌感染的熱點。
金黃色葡萄球菌 FnBPA 蛋白由 1 081 個氨基酸構成，N-端前 37 位氨基酸為信號肽，37-511 位氨基酸為連接彈性蛋白 EL 與纖維連接蛋白 Fg 區域，分為 N1、N2、N3 區；511-874 位氨基酸由 11 個重復序列構成（FnBPAr1-11），是 FnBPA 鏈接配體 Fn 的主要黏附區域（FnBPR）；874-948 位氨基酸為富含脯氨酸構成的 PRR 區域，類似于抗體鉸鏈區，其功能有待于進一步研究；982–986 位氨基酸區域為 LPXTG 基序，C-端 948-1081 位氨基酸為連接細胞壁與細胞膜區域[11-13]。
根據 FnBPA 的蛋白二級結構分析，FnBPAr1-11 是連接其配體 Fn 的主要區域，而且每一個區域都能單獨連接細胞基質內配體，11 個配體連接區域也分為強弱黏附區域，而 r10-11 都是強黏附區域[14]。據此實驗針對金黃色葡萄球菌的 FnBPAr10-11 蛋白基因進行誘導表達，表達金黃色葡萄球菌 FnBPAr10-11 截短體蛋白，并分離純化，為后續動物免疫實驗做好準備，同時也為后續的多聯嵌合疫苗制備提供一定的依據。
1 材料與方法
1.1 菌種、藥品、化學試劑及動物
金黃色葡萄球菌 Newman 株，大腸桿菌 DH5α、BL21（DE3）受贈于黑龍江八一農墾大學生命學院崔玉東教授；pET-32a 原核表達系統來源于四川大學華西醫院衛生部重點實驗室移植免疫研究室；限制性內切酶 BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA 連接酶、LA Taq DNA 聚合酶、DL8000、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside，IPTG）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、氨芐青霉素、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、十二烷基硫酸購自日本 TaKaRa 公司；蛋白質 Marker 購自立陶宛 Fermentas（MBI）公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、二硫蘇糖醇、溴酚藍、脫脂乳購自美國 Ameresco 公司。細菌培養用胰胨及 Yerst Extract 購自英國 Oxoid 公司；Plasmid Miniprep Purification kit 和 Gal/PCRpurification kit 購自上海 Gene Tech 公司；酶聯免疫斑點法（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）試劑盒購自達科為公司。
實驗用 81 只 BalB/C 雄性健康小鼠，體重 18～24 g，購自成都達碩公司，生產許可證為［SCXK（川）2015-30］，檢驗檢疫合格證號為 No.51203500001021，動物飼養在四川大學華西醫院動物實驗中心無特定病原體屏障系統，使用許可證為［SYXK（川）2013-119］，溫度 22～26℃，濕度 40%～70%，晝夜節律為 12 h，飼料為小鼠專用輻照全價日糧，自由采食飲水。動物實驗已通過四川大學華西醫院動物倫理委員會審查，符合動物倫理要求，倫理備案號為 2017101A。
1.2 引物的設計與合成
根據 GenBank 中 FnBPA（GI:120457）中基因序列設計 2 條引物。上游引物：5′-CGC GGATCCAAGTATGAACATGGCG-3′；下游引物：5′-CAC AAGCTTAGGTGTTGTATCTTCTTC-3′。上游引物劃線部分是 BamHⅠ酶切位點，下游劃線部分為 HindⅢ酶切位點。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
1.3 金黃色葡萄球菌培養與基因組 DNA 的提取
從–70℃ 冰箱中取出原始菌株金黃色葡萄球菌 Newman 并在胰蛋白胨大豆瓊脂培養基平板上劃線過夜培養，挑取單菌落在 BST 液體培養基中 37℃，180 r/min 培養 12 h，后采用試劑盒提取金黃色葡萄球菌 Newman 全基因組。
1.4 金黃色葡萄球菌 fnbpAr10-11 目的基因的克隆與鑒定
1.4.1 fnbpAr10-11 目的基因的聚合酶鏈反應（ploymerase chain reaction，PCR）擴增
以提取的金黃色葡萄球菌 Newman 的基因組為模板，按順序依次加入模板 DNA（200 ng/μL）2.5 μL、上游引物（20 μmol/L）5 μL、下游引物（20 μmol/L）5 μL、DNA 聚合酶（5 U/μL）2.5 μL、dNTP 10 μL、10×Buffer 緩沖液 10 μL、無菌去離子水 65 μL 至 100 μL 體系。將 100 μL 體系平均分配到 PCR 管內，每個 PCR 管 20 μL 體系，同時設立陰性對照，并按以下過程進行 PCR 反應：94℃ 預變性 10 min，94℃ 變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 1 min；35 個循環，最后 72℃ 延伸 10 min。
1.4.2 PCR 產物的膠回收、T 載體連接及鑒定
將 PCR 產物在 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，并將驗證正確目的片段采用 Gal/PCR purification kit 試劑盒進行膠回收（具體步驟見說明書），回收后的目的基因在 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。回收后的目的片段鏈接到 pMD-18T 載體上進行克隆，PCR 管內按順序依次加入目的基因 fnbpAr10-11 4.5 μL、pMD-18T 載體 0.5 μL、solutionⅠ（含 T4 連接酶）5 μL 至 10 μL 體系。以上程序均在冰上進行。將混合后的 10 μL 體系在 16℃ 恒溫連接儀上孵育2 h， 后轉化到制備好的大腸桿菌 DH5α 感受態中。
轉化過程如下：–70℃ 取出制備好的 DH5α 感受態冰上孵化，將鏈接混合物加入到感受態細胞內，放置在冰盒內 30 min，42℃ 熱激 90 s，熱激后再次放到冰盒內 1～2 min，此過程不能劇烈晃動感受態細胞，加入 37℃ 預熱 LB 1 mL，之后 37℃ 空氣搖床 110 r/min，培養 1 h，4 000 r/min 離心 5 min，棄去上清 800 μL，剩余的上清液混懸沉淀，取 200 μL 在含有 Amp+抗性的 LB 瓊脂培養平皿上進行涂布，37℃ 過夜培養。
取陽性單菌落在還有 Amp+抗性的 LB 液體培養基內 180 r/min 培養 12 h，培養后的菌液采用 Plasmid Miniprep Purification kit 試劑盒提取質粒，提取后的質粒進行雙酶切鑒定，按順序依次加入 fnbpAr10-11-pMD-18T 質粒 10 μL、BamHⅠ 1 μL、HindⅢ 1 μL、10×Buffer 緩沖液 2 μL、無菌去離子水 6 μL 至 20 μL 體系。37℃ 水浴 15 min，后在 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。
1.5 金黃色葡萄球菌 fnbpAr10-11-pET-32a 表達載體的構建
將陽性質粒 fnbpAr10-11-pMD-18T 用 BamHⅠ和 HindⅢ雙酶切，之后用 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，并回收雙酶切后的目的片段，同時對表達載體 pET-32a 進行雙酶切，并回收雙酶切后載體片段。將雙酶切后的目的片段和載體按 4∶1 比例進行連接：目的片段 4 μL，雙酶切后 pET-32a 1 μL，含有 T4DNA 連接酶的 solutionⅠ 5 μL 至 10 μL 體系，并在 16℃ 恒溫鏈接儀上連接 2 h，連接后產物轉化到大腸桿菌 DH5α 中，具體步驟同 pMD-18T。并用含有 Amp+抗性的 LB 瓊脂平板進行篩選。
挑取陽性單菌落接種到含有 Amp+抗性 LB 液體培養基中 37℃，180 r/min 培養 12 h，提取質粒，并用 BamHⅠ和 HindⅢ雙酶切進行驗證并留圖。將鑒定正確的質粒轉入到大腸桿菌 BL21（DE3）中，重組載體命名為 fnbpAr10-11-pET32a。同時將鑒定正確的菌株進行基因測序，測序由上海生工生物工程有限公司提供服務。
1.6 融合蛋白的誘導表達及分析
將篩選到的陽性重組菌 fnbpAr10-11-pET32a/BL21 以 1∶50 比例接種到含有 Amp+抗性 LB 液體培養基中 37℃ 過夜培養。取新鮮菌液以 1∶100 比例接種到含有 Amp+抗性 LB 液體培養基 100 mL 中，37℃ 180 r/min 培養至波長 600 nm 處吸光度（absorbance，A600）為 0.4～0.6，加入終濃度為 1.0 mmol/L 誘導劑 IPTG，37℃ 誘導 4 h。同時設立陰性對照組空載體 pET-32a/BL21。分別取實驗組與對照組誘導后菌液 2 mL，12 000 r/min 離心 2 min，棄去上清，并用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）80 μL 對沉淀菌體懸浮，加入 5×上樣緩沖液（含二硫蘇糖醇）20 μL 充分混勻，并在沸水浴中煮沸 10 min，使菌體破裂，取處理后樣品 5 μL 進行 12% 的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE ）分析。
1.7 實驗動物分組及免疫
免疫組：根據統計學要求將 6 周齡 BalB/C 雄性小鼠隨機分成 A、B、C 3 組，每組 27 只，飼養 1 周后，分別于第 0 天和第 21 天皮下注射 PBS-佐劑、FnBPA-佐劑、FnBPAr10-11-佐劑，劑量為 100 μg/只。每組分別于第 21 天和第 35 天時隨機取 3 只小鼠，尾根采血，分離血清，待檢測特異性抗體水平。
攻毒組：上面的免疫組，每組取出 20 只，分成 2 籠，每籠 10 只，分別于每只小鼠腹腔注射金黃色葡萄球菌 Newman 株 1×1010 CFU、金黃色葡萄球菌 Wood46 株 0.8×1010 CFU。觀察 1 周，從攻毒后的 12 h 開始每天做記錄。
1.7.1 最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數的確定
抗原以 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600 稀釋，陰陽性血清分別以 1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200 稀釋，進行間接酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），每個稀釋度做 3 個重復。
1.7.2 間接 ELISA 方法陰陽性臨界值的確定
用 FnBPA 蛋白抗原包被好的酶標板，間接 ELISA 測定 3 份 BalB/C 小鼠陰性血清 A450 值。每份血清做 3 個重復。
1.7.3 各組血清中抗體效價檢測
根據之前確定的最佳抗原濃度包被 ELISA 板，血清以 1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000 倍稀釋，進行間接 ELISA 試驗，在 A450 分別檢測實驗組和對照組中實驗小鼠初免后 21、35 d 的血清，每組 3 只。
1.7.4 細胞因子檢測
于免疫后第 4 周每組取 4 只小鼠處死，分離脾臟淋巴細胞，用于細胞因子檢測。使用達科為公司的 ELISPOT 試劑盒測定 FnBPA、FnBPAr10-11、PBS 組小鼠脾臟分泌白細胞介素（interleukin，IL）-4、γ-干擾素淋巴細胞的水平。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 18.0 軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK-q 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 金黃色葡萄球菌 fnbpAr10-11 基因的 PCR 擴增
以金黃色葡萄球菌 Newman 全基因組為模板進行 PCR 擴增，擴增后的產物進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得大小為 222 bp 目的片段，與設計長度一致（圖 1a）。
2.2 重組原核表達質粒 fnbpAr10-11-pET32a 的酶切鑒定及測序結果
將重組陽性質粒 fnbpAr10-11-pET32a 進行雙酶切驗證（BamHⅠ和 HindⅢ），將酶切后的產物進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，得到的兩條目的條帶分別為 5 900、222 bp，與預期效果相同（圖 1b）。測序結果同金黃色葡萄球菌 Newman 全基因組進行 BLAST 分析，結果相同率為 100%，說明構建的重組質粒正確沒有突變。
2.3 重組質粒 fnbpAr10-11-pET32a 在大腸桿菌 BL21（DE3）中的表達
根據 1.6 中的方法，重組菌 fnbpAr10-11-pET32a/BL21 經 IPTG 誘導表達后進行全菌體 SDS-PAGE 分析，在相對分子質量為 33×103左右處有一明顯增量條帶，目的基因大小為 222 bp，表達蛋白相對分子質量約為 8.14×103，因表達載體 pET-32a 自身表達蛋白相對分子質量約為 25×103，所以得到目的片段相對分子質量為 33.1×103 。誘導前與誘導后有明顯增加，表明 FnBPAr10-11 在 pET-32a 表達載體中成功大量表達，Immage scanner Ⅲ掃描并運用專業分析軟件 Glyko Bandscan 對電泳圖譜進行分析表明，得到目的條帶相對分子質量 33.1×103與預期效果一樣（圖 1c）。
圖1
fnbpAr10-11 基因的 PCR、雙酶切及 FnBPAr10-11 蛋白的 SDS-PAGE 檢測結果
a. 金黃色葡萄球菌
2.4 實驗小鼠血清免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）抗體檢測
2.4.1 最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數的確定
經分析抗原 1∶100 稀釋，血清 1∶1 600 稀釋時，陰性 A450 值在 0.2 以下，且 P/N 值最大，所以抗原最佳稀釋度定為 1∶100，濃度為 10 μg/mL，血清最佳稀釋度定為 1∶1 600。
2.4.2 間接 ELISA 方法陰陽性臨界值的確定
經統計分析，3 份陰性血清的 A450 的平均值為 0.157 5，標準差為 0.040 6，因此 ELISA 陰陽性臨界值等于 0.198 1，確定樣品 A450≥0.198 1 判定為陽性。
2.4.3 各組血清中抗體效價檢測
經 ELISA 檢測后，FnBPA 組和 FnBPAr10-11 組二免后抗體效價高者達 1∶128 000，PBS 組抗體效價未見明顯上升，抗體效價結果見表 1；以最佳包被濃度包被 ELISA 板，血清以最佳稀釋度 1∶1 600 來稀釋，測得 A450 數據見表 2，抗體效價越高，A450 值越大，結果表明 FnBPA 組和 FnBPAr10-11 組與 PBS 組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
表1
免疫小鼠血清抗 FnBPA IgG 抗體效價
表2
間接 ELISA 檢測免疫小鼠血清 IgG 抗體 A450 值（
）
2.5 細胞因子檢測
重組蛋白 FnBPAr10-11 免疫組小鼠脾淋巴細胞分泌 IL-4 和 γ-干擾素的能力與全蛋白 FnBPA 組比較差異無統計學意義（P>0.05），與 PBS 比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3、圖 2。
表3
各實驗組細胞因子 IL-4、γ-干擾素含量（
）
圖2
ELISPOT 檢測各組 IL-4、γ-干擾素結果
顯微鏡下觀察 IL-4、γ-干擾素斑點形成情況
2.6 截短蛋白 FnBPAr10-11 的免疫保護結果
各實驗免疫組，在加強免疫 14 d 后用金黃色葡萄球菌 Newman、Wood46，以絕對致死量進行攻毒，攻毒后觀察實驗小鼠死亡情況并記錄數據；FnBPAr10-11 實驗組免疫保護率為 50%（Newman 株）和 50%（Wood46 株）。見圖 3。
圖3
攻毒試驗結果
a. 實驗動物金黃色葡萄球菌 Newman 株攻毒后存活率；b. 實驗動物金黃色葡萄球菌 Wood46 株攻毒后存活率
3 討論
金黃色葡萄球菌是一種常見的革蘭陽性球菌，既是人體皮膚和鼻腔的常見定植菌，也是引起人類臨床感染的常見致病菌[15]。其為社區、醫院獲得性細菌感染的主要原因，具有很強的致病作用和很高的致死率，即使在適當治療情況下仍比其他細菌感染的病死率高。
人類化膿感染中金黃色葡萄球菌是最常見的病原菌之一，除了引起皮膚和軟組織感染外，同時還能引起骨髓炎、肺炎、心內膜炎及敗血癥等全身性感染，導致患者住院時間延長和比較昂貴的醫療費用支出。隨著抗菌藥物在金黃色葡萄球菌感染治療中的廣泛應用，大量金黃色葡萄球菌耐藥菌株出現，致使金黃色葡萄球菌抗藥性增強，甚至抗菌藥物治療毫無效果，危害人類生命健康，所造成的影響不能小覷[16]。此外金黃色葡萄球菌也是奶牛乳房感染的主要病原菌之一，感染后導致奶牛產奶量和奶品質下降，嚴重影響乳業及食品安全，給畜牧業帶來巨大經濟損失[17]。
金黃色葡萄球菌感染機體后，能夠產生一系列菌體表面相聯的黏附分子和分泌到細胞外的黏附因子，進而定植在感染的組織并進行增殖，同時逃避宿主免疫防御，引起機體感染。FnBPA 是金黃色葡萄球菌產生的重要表面黏附分子之一，主要在金黃色葡萄球菌對數生長前期表達，能夠與細胞外基質中的纖連蛋白、纖維蛋白原等組織成分結合，成為細菌與宿主細胞表面結合的橋梁，從而使細菌在宿主細胞上定植進而侵染宿主細胞[18]。同時，金黃色葡萄球菌與 FnBPA 結合后可對細菌起到保護作用，進而逃避宿主防御。因此，FnBPA 在金黃色葡萄球菌感染中顯得尤為重要。FnBPA 蛋白具有良好的免疫原性，是重要的疫苗候選抗原，但因分子量過大而不易在體外獲得高水平表達，限制了其作為疫苗的應用。
本實驗采用重組 PCR 方法成功構建表達截短蛋白 FnBPAr10-11 的重組菌株，通過抗體水平檢測和細胞因子檢測，該截短蛋白 FnBPAr10-11 的免疫原性同全蛋白 FnBPA 無明顯差異，表明該截短體保留了蛋白 FnBPA 原來的活性及功能，免疫原性良好。同時通過 2 種金黃色葡萄球菌的攻毒試驗可以看出，該截短體免疫保護作用大于 50%，保護效果良好。
金黃色葡萄球菌是一類攜帶多個有效抗原的病原微生物，包括 FnBP、Trap、ClfA、ClfB、Cna 等。雖然亞單位疫苗有較好的免疫保護性，但因抗原單一性，治療效果片面，發展多聯嵌合疫苗不僅可解決抗原單一性的問題，其同時還具有良好的免疫原性。然而有效完整的抗原蛋白量都較大，直接串聯制成多聯嵌合體，超出了表達載體的承載量，導致表達量過低構建失敗。制作多聯嵌合疫苗很重要的一點就是要串聯的蛋白量盡可能小、同時又保留了蛋白的免疫原性，這樣既能比較容易地得到重組菌株又有較好的免疫效果。本研究中的截短體蛋白 FnBPAr10-11 保留了該蛋白的主要免疫原性，為后續多聯嵌合重組疫苗的構建奠定了一定基礎。
