引用本文： 孫楠, 韓莉, 沙依拉·海米提, 崔景秋, 王新玲. 顯性負效應在不同類型胰島素病發病機制中的作用. 華西醫學, 2018, 33(11): 1406-1410. doi: 10.7507/1002-0179.201809080 復制
胰島素病是指由胰島素編碼序列中單基因突變所引起的一類常染色體顯性遺傳性疾病。研究已證實，位于胰島素基因不同功能位點的突變可導致不同類型的糖尿病和異常胰島素病[1-3]。不同類型的基因突變導致糖尿病的發病機制不盡相同，部分引起糖尿病的胰島素基因突變不但會影響突變型胰島素原的轉運和加工，對野生型胰島素原轉運加工為成熟胰島素的過程也有抑制，即突變型胰島素原對共存的野生型胰島素原產生顯性負效應，是導致胰島素缺乏和 β 細胞功能衰竭的原因之一[4-6]。目前尚缺乏胰島素基因突變導致各種類型糖尿病發病的報道。本研究觀察 5 個與人類糖尿病相關的突變型胰島素原 V（A3）L、C（A7）Y、R（SP6）H、G（B8）S 和 G（C28）R 對共表達的野生型胰島素原加工分泌的影響，比較顯性負效應在不同類型胰島素病發病中的作用，探討胰島素基因突變導致糖尿病的分子機制。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 細胞和重組質粒
293T 細胞由天津市心血管病研究所惠贈，用含 10% 胎牛血清（美國 Gibco 公司）的 Dulbecco 改良 Eagle 培養基（高糖）（美國 Gibco 公司）培養。含突變型前胰島素原的重組質粒 pCMS-EGFP/m-V（A3）L、pCMS-EGFP/m-C（A7）Y、pCMS-EGFP/m-R（SP6）H、pCMS-EGFP/m-G（C28）R、pCMS-EGFP/m-G（B8）S 及含小鼠野生型前胰島素原互補 DNA（complementary DNA，cDNA）的重組質粒 pCMS-EGFP/m-WT、含人野生型前胰島素原 cDNA 的重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 均由美國密歇根醫學院劉銘教授惠贈。
1.2 主要試劑
脂質體轉染試劑盒（美國 Invitrogen 公司）；人胰島素原放射免疫分析試劑盒（美國 Millipore 公司）；高純度質粒中量提取試劑盒（德國 Qiagen 公司）；智能放射免疫 γ-測量儀 SN-695 型（上海核所日環光電儀器有限公司）。
1.3 重組質粒轉染 293T 細胞
293T 細胞常規培養和傳代，采用陽離子脂質體法將含有人野生型前胰島素原 cDNA 的重組質粒和含有青少年型糖尿病（mutant INS gene-induced diabetes of youth，MIDY）突變型前胰島素原 cDNA 的重組質粒雙質粒共轉染轉入 293T 細胞，DNA 轉染比例均為 1∶2。共設 8 組：① C（A7）Y 組：重組質粒 pCMS-EGFP/m-C（A7）Y 與重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；② V（A3）L 組：重組質粒 pCMS-EGFP/m-V（A3）L 與重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；③ G（C28）R 組：重組質粒 pCMS-EGFP/m-G（C28）R 與重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；④ G（B8）S 組：重組質粒 pCMS-EGFP/m-G（B8）S 與重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；⑤ R（SP6）H 組：重組質粒 pCMS-EGFP/m-R（SP6）H 與重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；⑥ 正常對照組（h-WT+m-WT 組）：含有人野生型前胰島素原 cDNA 的重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 與含有小鼠野生型前胰島素原 cDNA 的重組質粒 pCMS-EGFP/m-WT 共轉染；⑦ 陽性對照組（h-WT+Vector 組）：重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 與 pCMS-EGFP 質粒共轉染；⑧ 陰性對照組（m-WT 組）：用重組質粒 pCMS-EGFP/m-WT 轉染 293T 細胞作為放射免疫法測定人胰島素原的陰性對照。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）跟蹤轉染過程，用 Spot 圖像處理系統記錄圖像。轉染 32 h 后更換細胞培養液，繼續培養 16 h，分別收集細胞和細胞培養液，置于–80℃ 凍存。
1.4 放射免疫法測定細胞內外人胰島素原水平
酸乙醇裂解法裂解收集 293T 細胞，用放射免疫法測定轉染 48 h 后細胞裂解液及細胞培養液中的人胰島素原水平。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行統計分析。數據以均數±標準差表示。多組間實驗結果比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用 LSD 檢驗（方差齊時）或 Dunnett t 檢驗（方差不齊時）。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 轉染 48 h 后各組 293T 細胞的形態比較
將含有人野生型前胰島素原 cDNA 的重組質粒和小鼠突變型前胰島素原 cDNA 的重組質粒共轉染 293T 細胞。轉染 24 h 后細胞內出現 GFP 顆粒，48 h 后細胞中 GFP 表達呈片狀，表明轉染成功，且各組熒光強度相似，說明各組轉染效率和質粒表達接近（圖 1）。
圖1
各組重組質粒共轉染 48 h 后 293T 細胞（熒光顯微鏡 ×40）
a. C（A7）Y 組，pCMS-EGFP/m-C（A7）Y 與 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；b. V（A3）L 組，pCMS-EGFP/m-V（A3）L 與 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；c. G（C28）R 組，pCMS-EGFP/m-G（C28）R 與 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；d. G（B8）S 組，pCMS-EGFP/m-G（B8）S 與 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；e. R（SP6）H 組，pCMS-EGFP/m-R（SP6）H 與 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；f. 正常對照組，pCMS-EGFP/h-WT 與 pCMS-EGFP/m-WT 共轉染；g. 陽性對照組，pCMS-EGFP/h-WT 與 pCMS-EGFP 共轉染；h. 陰性對照組，pCMS-EGFP/m-WT 轉染
2.2 各組共轉染細胞內人胰島素原水平
與正常對照組相比，各組間共轉染細胞內人胰島素原水平差異無統計學意義（F=0.39，P>0.05），突變型胰島素原未抑制共存的野生型胰島素原的表達。見表 1。
2.3 各組共轉染細胞培養液中人胰島素原水平
與正常對照組相比，C（A7）Y 組和 G（B8）S 組細胞培養液中人胰島素原水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01），其余各組培養液中人胰島素原水平與正常對照組差異無統計學意義（P>0.05）。C（A7）Y 和 G（B8）S 突變抑制了共表達的人野生型胰島素原的分泌，V（A3）L、R（SP6）H 和 G（C28）R 突變并未影響共存的人野生型胰島素原的分泌。見表 1。
表1
各組細胞內及培養液中人胰島素原水平（n=6，pmol/L，
）
3 討論
胰島素病又稱為異常胰島素（原）血癥，由胰島素基因編碼突變而引起的胰島 β 細胞合成分泌活性減弱且結構異常的胰島素或胰島素原所致，是特殊類型糖尿病的發病原因之一[2, 4, 7-8]。已報道的可引起單基因突變糖尿病的常染色體顯性遺傳性胰島素基因突變有 39 個，分別位于胰島素基因的信號肽、A 鏈、B 鏈、C 肽以及信號肽酶和激素原轉換酶蛋白水解剪切位點的編碼區。胰島素病分為經典胰島素病和 MIDY 兩類，經典胰島素病是指由胰島素基因突變引起的成年發病的糖尿病（因為此類突變已被發現多年而得名），目前已報道的相關突變有 9 個，包括以往已證實的 7 個突變和新近發現的 2 個前胰島素原信號肽突變[4, 7]。突變會導致大量胰島素或胰島素原分泌入血，引起以高胰島素血癥和胰島素抵抗為特征的遲發型糖尿病。與經典胰島素病相比，MIDY 是一種新型單基因突變糖尿病，已報道的基因突變有 30 個，雖然以不伴有 β 細胞自身免疫異常的胰島素缺乏為主要特征，但其臨床表現呈現明顯的異質性[6, 8]。
由于胰島素病臨床表現譜廣泛，從嚴重的新生兒糖尿病到溫和的遲發型糖尿病均有涉及，提示不同的胰島素基因突變體等位基因表型不同，并通過不同機制引發糖尿病[1, 4, 9-10]。有學者認為，與 MIDY 相關的基因突變會引起嚴重的胰島素原錯誤折疊，從而導致內質網應激及 β 細胞衰竭；引起成年發病的基因突變可能不會顯著影響胰島素原的折疊、轉運和分泌，而主要通過影響胰島素與胰島素受體的結合、破壞分泌型前體的加工以及改變蛋白在分泌途徑中的儲存等機制引起糖尿病。目前胰島素基因突變導致糖尿病的發病機制尚未完全明確。本研究選取了 5 個具有代表性的突變型胰島素原：與經典胰島素病相關的 V（A3）L 突變，與 MIDY 相關的 4 個突變 R（SP6）H、C（A7）Y、G（B8）S 和 G（C28）R，突變氨基酸分別位于前胰島素原信號肽、A 鏈、B 鏈和 C 肽等重要區域，具有不同的生物學特征，通過檢測突變型胰島素原對共表達的人野生型胰島素原分泌的影響，探討突變型胰島素原導致 β 細胞功能衰竭及糖尿病的分子機制。
顯性負效應是指基因突變后不僅突變型蛋白自身無功能，還抑制或阻斷同一細胞內野生型蛋白的功能和作用，其產生的機制可能與突變型蛋白和野生型蛋白形成無功能的二聚體有關。在胰島素基因突變所致糖尿病中，C（A7）Y 突變是目前研究較多的突變之一。研究發現，不僅含 C（A7）Y 突變的胰島素原被阻滯在內質網中不能進一步加工為成熟的胰島素，而且當胰島素、C 肽水平明顯降低時，雖然新合成的胰島素原并未顯著減少，但野生型胰島素原也不能被有效轉運至下游分泌通路，提示突變型胰島素原抑制了共表達的野生型胰島素原的轉運和分泌，即突變型對野生型產生了顯性負效應，這可能是導致胰島素缺乏、胰島 β 細胞功能衰竭的原因之一，但突變型與共存的野生型胰島素原分子間相互作用的方式尚不清楚[5, 10-13]。那么，與人類糖尿病相關的各個突變型胰島素原對共存的野生型胰島素原是否都能產生顯性負效應？本研究觀察了 5 個不同突變型胰島素原對共表達的人野生型胰島素原分泌的影響，發現共轉染 48 h 后，各組突變細胞內人胰島素原水平較正常對照組（小鼠野生型胰島素原）相比無明顯差異，表明突變并未抑制共存的野生型胰島素基因的表達。進一步比較細胞培養液的人胰島素原水平，與正常對照組相比，C（A7）Y 組和 G（B8）S 組細胞培養液中人胰島素原均明顯降低，提示這 2 種突變對共存的野生型胰島素原的分泌產生了抑制，即突變型對共表達的野生型產生了顯性負效應，顯性負效應是 C（A7）Y 和 G（B8）S 突變引起胰島素缺乏和糖尿病的分子機制之一 。而可致經典胰島素病的突變 V（A3）L 和另 2 個 MIDY 突變 R（SP6）H、G（C28）R 對共表達的野生型胰島素原的分泌無顯著影響，提示這 3 種基因突變沒有對共存的野生型產生顯性負效應，不同突變型胰島素原引起糖尿病的機制各不相同。
MIDY 突變 C（A7）Y 與 G（B8）S 均可引起永久性新生兒糖尿病（permanent neonatal diabetes mellitus，PNDM），患兒表現為顯著的高血糖、糖尿病酮癥酸中毒、胰島素缺乏及免疫抗體陰性，診斷糖尿病后即開始終身使用胰島素[3, 14]。目前，胰島素基因突變已被認為是 PNDM 的第二大病因，對 PNDM 患者應盡早開展基因篩查，以便于明確診斷并制定個體化的治療方案。本研究中，C（A7）Y 突變與 G（B8）S 突變對共表達的野生型胰島素原具有很強的顯性負效應，與以往結論一致。這 2 種突變產生顯性負效應的機制推測可能與它們引起胰島素原分子構型的改變有關[9-10]。眾所周知，新合成的胰島素原必須在內質網中正確折疊，才能被轉運至下游分泌通路進一步加工。以往對胰島素分子構型的研究已證實，C（A7）Y 和 G（B8）S 突變均會影響突變型胰島素原分子中二硫鍵的正確配對而導致胰島素原錯誤折疊。錯誤折疊的胰島素原堆積在內質網中，是導致胰島素缺乏和 β 細胞功能衰竭的分子基礎。而不能正確配對的半胱氨酸殘基游離出來，增加了突變型和野生型胰島素原形成異常蛋白復合物的可能。蛋白復合物被阻滯在內質網中會進一步加重胰島素缺乏和分泌減少，這可能是突變型胰島素原產生顯性負效應的分子機制，其具體過程尚待進一步研究證實。
本研究中，另 2 個與 MIDY 相關的基因突變 G（C28）R 和 R（SP6）H 對共表達的野生型胰島素原未呈現明顯的顯性負效應，推測與突變發生在胰島素基因的不同功能位點有關。R（S6）H 突變是一個信號肽突變，初次報道患者于 20 歲發病，最初診斷為青少年的成人起病型糖尿病，表現為不依賴胰島素治療的溫和的輕型糖尿病[4]。由于信號肽在進入內質網的過程中會經蛋白水解作用切除，已有研究證實該突變對胰島素原折疊構型影響較小。突變型胰島素原的正確折疊大大減少了其與野生型胰島素原生成蛋白復合物的可能，提示 R（S6）H 突變存在其他致病機制。近年有學者報道，R（S6）H 突變會改變信號肽氨基末端的電荷，影響蛋白的定位和轉位，但其導致糖尿病的發病機制尚需進一步研究[1]。G（C28）R 突變是位于胰島素原 C 肽區的一個基因突變，最早在診斷為 1 型糖尿病的患者體內發現[6]。盡管它被歸為 MIDY 突變，但研究發現，含 G（C28）R 突變的胰島素原能被進一步加工生成正常的胰島素，因此推測它引起糖尿病的原因可能與突變型 C 肽的產生有關。本研究未發現此突變會對共存的野生型胰島素原產生顯性負效應，提示此突變存在其他的機制，尚待進一步明確。
V（A3）L 突變是最早被發現的胰島素編碼序列中 7 個引起成人糖尿病的單基因突變之一。以往研究已證實，V（A3）L 突變型胰島素的結構與野生型胰島素相同，突變僅引起輕微的熱穩定性降低，未損害胰島素的折疊過程，致病原因可能主要是由于突變型胰島素與胰島素受體的結合被破壞，經胰島素受體介導的對胰島素的攝取和降解明顯減少，使突變型胰島素分子清除率降低，導致外周血中突變型胰島素異常增多，形成遲發型高胰島素血癥[7]。本研究中，V（A3）L 突變未影響共表達的野生型胰島素原的分泌，提示突變沒有對共存的野生型產生顯性負作用，其致病原因與顯性負效應無關。
比較上述 5 個不同特性的突變型胰島素原對共表達的野生型胰島素原的影響，不難看出，對胰島素原形成正確折疊構型影響較大的突變，會對共存的野生型胰島素原產生顯性負效應，這不但加重了胰島素缺乏，也是突變引發糖尿病的分子基礎。顯性負效應的發生可能與胰島素原分子中二硫鍵的正確配對有關，其機制尚待進一步研究證實。而對胰島素原正確折疊影響較小的突變，則未見明顯的顯性負效應現象，存在其他機制。
糖尿病是一種常見的具有遺傳傾向的內分泌、代謝性疾病，其病因和發病機制至今尚未完全闡明，對其發病機制深入研究有助于進行分子學診斷和個體化治療。根據不同突變位點進行有針對性的藥物靶向治療和分子營養學干預，可望成為未來糖尿病防控的發展趨勢[15-17]。
胰島素病是指由胰島素編碼序列中單基因突變所引起的一類常染色體顯性遺傳性疾病。研究已證實，位于胰島素基因不同功能位點的突變可導致不同類型的糖尿病和異常胰島素病[1-3]。不同類型的基因突變導致糖尿病的發病機制不盡相同，部分引起糖尿病的胰島素基因突變不但會影響突變型胰島素原的轉運和加工，對野生型胰島素原轉運加工為成熟胰島素的過程也有抑制，即突變型胰島素原對共存的野生型胰島素原產生顯性負效應，是導致胰島素缺乏和 β 細胞功能衰竭的原因之一[4-6]。目前尚缺乏胰島素基因突變導致各種類型糖尿病發病的報道。本研究觀察 5 個與人類糖尿病相關的突變型胰島素原 V（A3）L、C（A7）Y、R（SP6）H、G（B8）S 和 G（C28）R 對共表達的野生型胰島素原加工分泌的影響，比較顯性負效應在不同類型胰島素病發病中的作用，探討胰島素基因突變導致糖尿病的分子機制。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 細胞和重組質粒
293T 細胞由天津市心血管病研究所惠贈，用含 10% 胎牛血清（美國 Gibco 公司）的 Dulbecco 改良 Eagle 培養基（高糖）（美國 Gibco 公司）培養。含突變型前胰島素原的重組質粒 pCMS-EGFP/m-V（A3）L、pCMS-EGFP/m-C（A7）Y、pCMS-EGFP/m-R（SP6）H、pCMS-EGFP/m-G（C28）R、pCMS-EGFP/m-G（B8）S 及含小鼠野生型前胰島素原互補 DNA（complementary DNA，cDNA）的重組質粒 pCMS-EGFP/m-WT、含人野生型前胰島素原 cDNA 的重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 均由美國密歇根醫學院劉銘教授惠贈。
1.2 主要試劑
脂質體轉染試劑盒（美國 Invitrogen 公司）；人胰島素原放射免疫分析試劑盒（美國 Millipore 公司）；高純度質粒中量提取試劑盒（德國 Qiagen 公司）；智能放射免疫 γ-測量儀 SN-695 型（上海核所日環光電儀器有限公司）。
1.3 重組質粒轉染 293T 細胞
293T 細胞常規培養和傳代，采用陽離子脂質體法將含有人野生型前胰島素原 cDNA 的重組質粒和含有青少年型糖尿病（mutant INS gene-induced diabetes of youth，MIDY）突變型前胰島素原 cDNA 的重組質粒雙質粒共轉染轉入 293T 細胞，DNA 轉染比例均為 1∶2。共設 8 組：① C（A7）Y 組：重組質粒 pCMS-EGFP/m-C（A7）Y 與重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；② V（A3）L 組：重組質粒 pCMS-EGFP/m-V（A3）L 與重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；③ G（C28）R 組：重組質粒 pCMS-EGFP/m-G（C28）R 與重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；④ G（B8）S 組：重組質粒 pCMS-EGFP/m-G（B8）S 與重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；⑤ R（SP6）H 組：重組質粒 pCMS-EGFP/m-R（SP6）H 與重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；⑥ 正常對照組（h-WT+m-WT 組）：含有人野生型前胰島素原 cDNA 的重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 與含有小鼠野生型前胰島素原 cDNA 的重組質粒 pCMS-EGFP/m-WT 共轉染；⑦ 陽性對照組（h-WT+Vector 組）：重組質粒 pCMS-EGFP/h-WT 與 pCMS-EGFP 質粒共轉染；⑧ 陰性對照組（m-WT 組）：用重組質粒 pCMS-EGFP/m-WT 轉染 293T 細胞作為放射免疫法測定人胰島素原的陰性對照。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）跟蹤轉染過程，用 Spot 圖像處理系統記錄圖像。轉染 32 h 后更換細胞培養液，繼續培養 16 h，分別收集細胞和細胞培養液，置于–80℃ 凍存。
1.4 放射免疫法測定細胞內外人胰島素原水平
酸乙醇裂解法裂解收集 293T 細胞，用放射免疫法測定轉染 48 h 后細胞裂解液及細胞培養液中的人胰島素原水平。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行統計分析。數據以均數±標準差表示。多組間實驗結果比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用 LSD 檢驗（方差齊時）或 Dunnett t 檢驗（方差不齊時）。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 轉染 48 h 后各組 293T 細胞的形態比較
將含有人野生型前胰島素原 cDNA 的重組質粒和小鼠突變型前胰島素原 cDNA 的重組質粒共轉染 293T 細胞。轉染 24 h 后細胞內出現 GFP 顆粒，48 h 后細胞中 GFP 表達呈片狀，表明轉染成功，且各組熒光強度相似，說明各組轉染效率和質粒表達接近（圖 1）。
圖1
各組重組質粒共轉染 48 h 后 293T 細胞（熒光顯微鏡 ×40）
a. C（A7）Y 組，pCMS-EGFP/m-C（A7）Y 與 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；b. V（A3）L 組，pCMS-EGFP/m-V（A3）L 與 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；c. G（C28）R 組，pCMS-EGFP/m-G（C28）R 與 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；d. G（B8）S 組，pCMS-EGFP/m-G（B8）S 與 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；e. R（SP6）H 組，pCMS-EGFP/m-R（SP6）H 與 pCMS-EGFP/h-WT 共轉染；f. 正常對照組，pCMS-EGFP/h-WT 與 pCMS-EGFP/m-WT 共轉染；g. 陽性對照組，pCMS-EGFP/h-WT 與 pCMS-EGFP 共轉染；h. 陰性對照組，pCMS-EGFP/m-WT 轉染
2.2 各組共轉染細胞內人胰島素原水平
與正常對照組相比，各組間共轉染細胞內人胰島素原水平差異無統計學意義（F=0.39，P>0.05），突變型胰島素原未抑制共存的野生型胰島素原的表達。見表 1。
2.3 各組共轉染細胞培養液中人胰島素原水平
與正常對照組相比，C（A7）Y 組和 G（B8）S 組細胞培養液中人胰島素原水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01），其余各組培養液中人胰島素原水平與正常對照組差異無統計學意義（P>0.05）。C（A7）Y 和 G（B8）S 突變抑制了共表達的人野生型胰島素原的分泌，V（A3）L、R（SP6）H 和 G（C28）R 突變并未影響共存的人野生型胰島素原的分泌。見表 1。
表1
各組細胞內及培養液中人胰島素原水平（n=6，pmol/L，
）
3 討論
胰島素病又稱為異常胰島素（原）血癥，由胰島素基因編碼突變而引起的胰島 β 細胞合成分泌活性減弱且結構異常的胰島素或胰島素原所致，是特殊類型糖尿病的發病原因之一[2, 4, 7-8]。已報道的可引起單基因突變糖尿病的常染色體顯性遺傳性胰島素基因突變有 39 個，分別位于胰島素基因的信號肽、A 鏈、B 鏈、C 肽以及信號肽酶和激素原轉換酶蛋白水解剪切位點的編碼區。胰島素病分為經典胰島素病和 MIDY 兩類，經典胰島素病是指由胰島素基因突變引起的成年發病的糖尿病（因為此類突變已被發現多年而得名），目前已報道的相關突變有 9 個，包括以往已證實的 7 個突變和新近發現的 2 個前胰島素原信號肽突變[4, 7]。突變會導致大量胰島素或胰島素原分泌入血，引起以高胰島素血癥和胰島素抵抗為特征的遲發型糖尿病。與經典胰島素病相比，MIDY 是一種新型單基因突變糖尿病，已報道的基因突變有 30 個，雖然以不伴有 β 細胞自身免疫異常的胰島素缺乏為主要特征，但其臨床表現呈現明顯的異質性[6, 8]。
由于胰島素病臨床表現譜廣泛，從嚴重的新生兒糖尿病到溫和的遲發型糖尿病均有涉及，提示不同的胰島素基因突變體等位基因表型不同，并通過不同機制引發糖尿病[1, 4, 9-10]。有學者認為，與 MIDY 相關的基因突變會引起嚴重的胰島素原錯誤折疊，從而導致內質網應激及 β 細胞衰竭；引起成年發病的基因突變可能不會顯著影響胰島素原的折疊、轉運和分泌，而主要通過影響胰島素與胰島素受體的結合、破壞分泌型前體的加工以及改變蛋白在分泌途徑中的儲存等機制引起糖尿病。目前胰島素基因突變導致糖尿病的發病機制尚未完全明確。本研究選取了 5 個具有代表性的突變型胰島素原：與經典胰島素病相關的 V（A3）L 突變，與 MIDY 相關的 4 個突變 R（SP6）H、C（A7）Y、G（B8）S 和 G（C28）R，突變氨基酸分別位于前胰島素原信號肽、A 鏈、B 鏈和 C 肽等重要區域，具有不同的生物學特征，通過檢測突變型胰島素原對共表達的人野生型胰島素原分泌的影響，探討突變型胰島素原導致 β 細胞功能衰竭及糖尿病的分子機制。
顯性負效應是指基因突變后不僅突變型蛋白自身無功能，還抑制或阻斷同一細胞內野生型蛋白的功能和作用，其產生的機制可能與突變型蛋白和野生型蛋白形成無功能的二聚體有關。在胰島素基因突變所致糖尿病中，C（A7）Y 突變是目前研究較多的突變之一。研究發現，不僅含 C（A7）Y 突變的胰島素原被阻滯在內質網中不能進一步加工為成熟的胰島素，而且當胰島素、C 肽水平明顯降低時，雖然新合成的胰島素原并未顯著減少，但野生型胰島素原也不能被有效轉運至下游分泌通路，提示突變型胰島素原抑制了共表達的野生型胰島素原的轉運和分泌，即突變型對野生型產生了顯性負效應，這可能是導致胰島素缺乏、胰島 β 細胞功能衰竭的原因之一，但突變型與共存的野生型胰島素原分子間相互作用的方式尚不清楚[5, 10-13]。那么，與人類糖尿病相關的各個突變型胰島素原對共存的野生型胰島素原是否都能產生顯性負效應？本研究觀察了 5 個不同突變型胰島素原對共表達的人野生型胰島素原分泌的影響，發現共轉染 48 h 后，各組突變細胞內人胰島素原水平較正常對照組（小鼠野生型胰島素原）相比無明顯差異，表明突變并未抑制共存的野生型胰島素基因的表達。進一步比較細胞培養液的人胰島素原水平，與正常對照組相比，C（A7）Y 組和 G（B8）S 組細胞培養液中人胰島素原均明顯降低，提示這 2 種突變對共存的野生型胰島素原的分泌產生了抑制，即突變型對共表達的野生型產生了顯性負效應，顯性負效應是 C（A7）Y 和 G（B8）S 突變引起胰島素缺乏和糖尿病的分子機制之一 。而可致經典胰島素病的突變 V（A3）L 和另 2 個 MIDY 突變 R（SP6）H、G（C28）R 對共表達的野生型胰島素原的分泌無顯著影響，提示這 3 種基因突變沒有對共存的野生型產生顯性負效應，不同突變型胰島素原引起糖尿病的機制各不相同。
MIDY 突變 C（A7）Y 與 G（B8）S 均可引起永久性新生兒糖尿病（permanent neonatal diabetes mellitus，PNDM），患兒表現為顯著的高血糖、糖尿病酮癥酸中毒、胰島素缺乏及免疫抗體陰性，診斷糖尿病后即開始終身使用胰島素[3, 14]。目前，胰島素基因突變已被認為是 PNDM 的第二大病因，對 PNDM 患者應盡早開展基因篩查，以便于明確診斷并制定個體化的治療方案。本研究中，C（A7）Y 突變與 G（B8）S 突變對共表達的野生型胰島素原具有很強的顯性負效應，與以往結論一致。這 2 種突變產生顯性負效應的機制推測可能與它們引起胰島素原分子構型的改變有關[9-10]。眾所周知，新合成的胰島素原必須在內質網中正確折疊，才能被轉運至下游分泌通路進一步加工。以往對胰島素分子構型的研究已證實，C（A7）Y 和 G（B8）S 突變均會影響突變型胰島素原分子中二硫鍵的正確配對而導致胰島素原錯誤折疊。錯誤折疊的胰島素原堆積在內質網中，是導致胰島素缺乏和 β 細胞功能衰竭的分子基礎。而不能正確配對的半胱氨酸殘基游離出來，增加了突變型和野生型胰島素原形成異常蛋白復合物的可能。蛋白復合物被阻滯在內質網中會進一步加重胰島素缺乏和分泌減少，這可能是突變型胰島素原產生顯性負效應的分子機制，其具體過程尚待進一步研究證實。
本研究中，另 2 個與 MIDY 相關的基因突變 G（C28）R 和 R（SP6）H 對共表達的野生型胰島素原未呈現明顯的顯性負效應，推測與突變發生在胰島素基因的不同功能位點有關。R（S6）H 突變是一個信號肽突變，初次報道患者于 20 歲發病，最初診斷為青少年的成人起病型糖尿病，表現為不依賴胰島素治療的溫和的輕型糖尿病[4]。由于信號肽在進入內質網的過程中會經蛋白水解作用切除，已有研究證實該突變對胰島素原折疊構型影響較小。突變型胰島素原的正確折疊大大減少了其與野生型胰島素原生成蛋白復合物的可能，提示 R（S6）H 突變存在其他致病機制。近年有學者報道，R（S6）H 突變會改變信號肽氨基末端的電荷，影響蛋白的定位和轉位，但其導致糖尿病的發病機制尚需進一步研究[1]。G（C28）R 突變是位于胰島素原 C 肽區的一個基因突變，最早在診斷為 1 型糖尿病的患者體內發現[6]。盡管它被歸為 MIDY 突變，但研究發現，含 G（C28）R 突變的胰島素原能被進一步加工生成正常的胰島素，因此推測它引起糖尿病的原因可能與突變型 C 肽的產生有關。本研究未發現此突變會對共存的野生型胰島素原產生顯性負效應，提示此突變存在其他的機制，尚待進一步明確。
V（A3）L 突變是最早被發現的胰島素編碼序列中 7 個引起成人糖尿病的單基因突變之一。以往研究已證實，V（A3）L 突變型胰島素的結構與野生型胰島素相同，突變僅引起輕微的熱穩定性降低，未損害胰島素的折疊過程，致病原因可能主要是由于突變型胰島素與胰島素受體的結合被破壞，經胰島素受體介導的對胰島素的攝取和降解明顯減少，使突變型胰島素分子清除率降低，導致外周血中突變型胰島素異常增多，形成遲發型高胰島素血癥[7]。本研究中，V（A3）L 突變未影響共表達的野生型胰島素原的分泌，提示突變沒有對共存的野生型產生顯性負作用，其致病原因與顯性負效應無關。
比較上述 5 個不同特性的突變型胰島素原對共表達的野生型胰島素原的影響，不難看出，對胰島素原形成正確折疊構型影響較大的突變，會對共存的野生型胰島素原產生顯性負效應，這不但加重了胰島素缺乏，也是突變引發糖尿病的分子基礎。顯性負效應的發生可能與胰島素原分子中二硫鍵的正確配對有關，其機制尚待進一步研究證實。而對胰島素原正確折疊影響較小的突變，則未見明顯的顯性負效應現象，存在其他機制。
糖尿病是一種常見的具有遺傳傾向的內分泌、代謝性疾病，其病因和發病機制至今尚未完全闡明，對其發病機制深入研究有助于進行分子學診斷和個體化治療。根據不同突變位點進行有針對性的藥物靶向治療和分子營養學干預，可望成為未來糖尿病防控的發展趨勢[15-17]。
