環狀 RNA 是以共價閉合環為特征的非編碼 RNA，可通過轉錄調控機制影響細胞轉導、蛋白質合成等生物學功能，與多種疾病的發病機制有關，是一類嶄新的生物標志物。該文就環狀 RNA 的來源、結構、功能、研究方法進行介紹，并初步探究了環狀 RNA 在結核病研究中的應用。
引用本文： 王旻晉, 陳雪融. 環狀 RNA 的結構和功能及在結核病研究中的應用初探. 華西醫學, 2018, 33(8): 1023-1027. doi: 10.7507/1002-0179.201807077 復制
環狀 RNA（circular RNA，circRNA）是一類以共價封閉環為特征的非編碼 RNA，于 1970 年作為 RNA 轉錄副產品被鑒別出來[1]，可以通過轉錄調控機制影響細胞信號傳導、蛋白質轉錄合成等生物學功能[2-3]。其在多種疾病的發病機制中扮演重要角色，是一類嶄新的疾病生物標志物和藥物治療靶標。現對其結構與功能及其在結核病研究中的應用作一綜述。
1 circRNA 概述
1.1 circRNA 的產生、結構和降解
隨著 RNA 測序技術及其生物信息學的發展，在 15 種不同腫瘤或非腫瘤的細胞鏈中，被發現的 circRNA 超過 47 000 種。circRNA 主要存在于真核細胞內，分布十分廣泛，可出現在包括神經組織、肝臟組織等各種組織中，并且不同組織的 circRNA 差異十分顯著。例如，Guo 等[4]在多種人類細胞系相關的 39 種生物樣本中總共發現了 7 112 種 circRNA。Gene Ontology（GO）分析表明神經細胞內大部分 circRNA 有對應的蛋白編碼基因，能夠參與到疾病發生發展過程中[5]；亦有研究發現，不同神經組織區域中 circRNA 的表達量和表達譜都有明顯差異[6]。
circRNA 生成于細胞核，通過招募信使 RNA（messenger RNA，mRNA）輸出因子，轉移至細胞質并發揮作用，具體機制尚不清楚。Hansen 等[7]研究發現，微 RNA-7（microRNA-7，miR-7）的環狀 RNA 海綿（circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7）定位于細胞質的 P 小體，介導其發揮作用的效應因子蛋白 AGO 也定位于此。
介導 circRNA 產生的基因序列和蛋白包括：側翼內含子與補充序列如 Alu；涉及反向剪接的外顯子；RNA 結合蛋白，例如腺苷脫氨酶、可變因子、盲肌蛋白（muscleblind-like protein，MBL）等[1, 8-10]。其產生可以和轉錄同時發生，也可以發生在轉錄后。生成的方式有兩種：套索驅動的環化和內含子配對驅動的環化，在后一種方式中，circRNA 的側翼內含子含有 Alu 重復序列。circRNA 的生成可能通過剪接和反向剪接的競爭調節線性 RNA 的形成[1]。
circRNA 分子根據其在基因組中的來源及其構成序列的不同分為以下 3 類：外顯子來源的 circRNA 分子（exonic circRNA，ecRNA）、內含子來源的環狀 RNA 分子（intronic circRNA，ciRNA）以及由外顯子和內含子共同組成的環狀 RNA 分子（exon-intron circular RNA，EIciRNA）。ecRNA 主要存在于細胞質內，ciRNA 和 EIciRNA 一般分布在細胞核[1, 11-13]。
circRNA 的降解目前不甚清楚。零星研究提示 ciRS-7 是與 miR-671 結合后降解的[14]。
1.2 circRNA 的研究方法
1.2.1 circRNA 的數據庫
與 circRNA 有關的數據庫已創建不少，包括 findcirc、CIRCexplorer、circRNA_Finder、Circ2Traits、CIRI、circBase、starBase、CircInteractome 和 CircNet 等，是研究 circRNA 的重要生物信息學工具。不同數據庫各有特點，可綜合應用。circBase（http://www. circbase.org/）包含已經發布的 circRNA 數據，提供 circBase 支持的 circRNA ID 號或基因組區域位置信息，或者通過 tablebrowser 進行條件設置，可以查詢相關 circRNA 信息[15]。Circ2Traits（http://gyanxet-beta.com/circdb/）收集了與人類疾病關聯的 circRNA 數據，并通過預測構建了 miRNA-circRNA-gene 相互作用網絡，鑒定了 circRNA 上的 AGO 相互作用位點[16]。CircInteractome（http:// circinteractome.nia.nih.gov/）數據庫可以鑒定出具有 RNA 結合蛋白海綿樣作用的潛在 circRNA，設計小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）以沉默 circRNA [17]。
1.2.2 circRNA 的分子生物學研究方法
分為 3 個方面：① 表達分析技術。包括 RNA 測序、實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qT-PCR）、Northern 雜交、芯片技術、RNA-熒光原位雜交技術和生物素偶聯 circRNA 捕獲技術。其中芯片技術主要用于篩查，qT-PCR 主要用作驗證。生物素偶聯 circRNA 捕獲技術是一種基于多生物素信號放大的 circRNA Northen 印跡技術，具有高靈敏度等特點。② 功能研究。包括通過構建相關載體實現 circRNA 過表達，以及設計 siRNA 和小發夾 RNA 敲低（敲除）circRNA。前者如通過轉染 pcDNA3-ciRS-7 重組質粒入斑馬魚胚胎，來實現 ciRS-7 過表達，發現可對大腦發育產生一定影響。后者如使用 siRNA 技術研究 circRNA 在直結腸癌發病中的作用，發現 hsa_circ_0007534 可以抑制直結腸細胞的增殖，誘發其凋亡[18]。③ circRNA 和 miRNA 相互作用研究。一般通過 AGO 免疫沉淀技術結合 qT-PCR 分析，主要是研究 circRNA 吸附 miRNA 的“海綿”作用，由于 circRNA、miRNA 及 AGO 蛋白可在細胞內共定位結合，故可利用抗體特異性結合純化富集 AGO 蛋白，籍此探索 circRNA 和 miRNA 的數量、變化與互動。
1.3 circRNA 的特點
circRNA 廣泛存在于生物中，具有量大、序列特異性高、組織豐富性和疾病特異性等特點。一是豐富：circRNA 在真核細胞中廣泛表達，circRNA 的表達水平有時甚至超過線性異構體的 10 倍[1]。二是特異性：有時空特異性，如 ciRS-7 主要存在于細胞質，而 circEIF3J 和 ci-ankrd52 則僅聚集于細胞核[2, 19]。又如 hsa_circRNA_2149 只在 CD19+白細胞而非 CD34+白細胞或中性粒細胞中表達；一些 circRNA 在卵母細胞中表達，在胚胎細胞則缺如[20-21]。三是穩定性：無論是在細胞核中還是在細胞質中，circRNA 都是穩定存在的。由于 circRNA 具有共價閉合環結構，缺乏 5’端的帽子結構和 3’末端 poly（A）尾巴，且不易被 RNA 核酸外切酶降解，這使其比 mRNA 分子更穩定。這種特性使得 circRNA 作為生物標志物較線性 RNA 有一定優勢。四是保守性：ciRNA 主要特點是以 1 個 2’,5’-磷酸二酯鍵使首尾相連，而 ecRNA 則以 1 個 3’,5’-磷酸二酯鍵連接首尾兩端，提示特殊的反式剪接具有高度的保守性，同時這兩種產物在進化上也是高度保守的。
1.4 circRNA 的功能與作用機制
1.4.1 作為 miRNA 海綿發揮作用
這是目前研究得最多的作用機制。例如 circCDR1 作為顱內小腦降解相關蛋白 1（cerebellar degeneration related protein 1，CDR1）基因 miRNA 海綿，調節顱內 miR-7 與 miR-671 [2-3, 13]；再如調控同源域相互作用蛋白激酶 3 的 circHIPK3，與 miR-124 有多個結合位點，是細胞生長的調節劑，在腫瘤組織中高度表達，與腫瘤進展有關[1, 22]。
1.4.2 和線性 RNA 片段競爭
MBL 可結合其親本基因第 2 外顯子，促進 MBL 的 circRNA （circMbl） 的生物合成；另一方面，circMbl 和其側翼內含子具有 MBL 特異性連接部位，circMbl 與 MBL 結合，降低 MBL 有效濃度，減少 circMbl 生成，反向調節 circRNA 本身的合成[6]。
1.4.3 與 RNA 聚合酶 Ⅱ 作用
含有內含子的 circRNA，可以通過與 RNA 聚合酶 Ⅱ 作用，提高親本基因的轉錄效能。例如 ci-ankrd52，在轉錄位點附近與 RNA 聚合酶 Ⅱ 相互作用，是聚合酶 Ⅱ 復合體的正調節因子，對其母系基因發揮順式調控作用[19]。
1.4.4 翻譯蛋白質
Pamudurti 等[23]研究揭示了一種獨特的作用機制。他們發現，果蠅頭部的 circRNA 利用宿主 mRNA 的起始密碼，可以通過不依賴帽子結構的方式直接翻譯蛋白質。
2 circRNA 在結核病研究中的應用
circRNA 在結核發病中的調控作用已開始受到關注。已發現 circRNA 在人體外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中廣泛表達，并且結核患者 PBMC 所表達的 circRNA 數量顯著高于健康對照[24-27]。Zhuang 等[24]發現血中 hsa_circ_0005836 是鑒別肺結核患者與健康對照的新標志物。Qian 等[25]設計出一個基于 7 個 circRNA 分子的結核指數用于結核與健康對照的鑒別，發現其曲線下面積（area under the curve，AUC）高達 0.946。Huang 等[26]發現 hsa_circRNA_001937 在肺結核患者 PBMC 的表達較肺炎、肺癌、慢性阻塞性肺疾病患者高，且在抗結核治療后指標下降，是一個有前景的標志物。Zhang 等[27]除發現 6 個 circRNA 分子對于肺結核患者與健康對照有鑒別意義外，還建立了 2 個嶄新的 circRNA-miRNA-mRNA 網絡揭示 circRNA 在肺結核發病機制中的作用。第 1 個網絡由 1 721 個 circRNA-miRNA-mRNA 連接組成，其中包含 18 個上調的 circRNA 和 472 個 mRNA 以及 14 個下調的 miRNA；第 2 個網絡有 666 個 circRNA-miRNA-mRNA 連接，包含 6 個下調的 circRNA 和 307 個 mRNA 以及 8 個上調的 miRNA。生物信息學分析（GO 分析和 KEGG 分析）提示 circRNA 通過 circRNA-mirRNA-mRNA 網絡調控相關基因、繼而通過 Fcg 受體 （FcgR）介導的內吞作用、細胞因子受體相互作用、泛素介導的蛋白水解等途徑影響結核的發病[24-27]。具體歸納見表 1。
表1
肺結核患者 PBMC 中 circRNA 的變化
3 circRNA 與其他疾病的關聯研究
他山之石，可以攻玉。了解 circRNA 與其他疾病的關聯研究現狀有助于我們在結核病研究中借鑒與學習。已發現 circRNA 在多種疾病中發揮作用，例如動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、糖尿病、腫瘤、乙型肝炎等。circRNA 與腫瘤的關系研究得較多。Wang 等[28]進行 Meta 分析指出，2012 年—2017 年間共有 19 篇文章涉及 circRNA 與腫瘤的關系，共納入 1 752 例患者，以其他非腫瘤患者為對照，經合并后 circRNA 診斷試驗的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、診斷比值比（diagnostic odds ratio，DOR）及其 95% 置信區間分別為 0.72（0.67，0.76）、0.74（0.69，0.78）、2.80（2.40，3.10）、0.38（0.33，0.44）、7.00（6.00，9.00），AUC 為 0.79，診斷價值尚可；circRNA 在肝細胞癌組織中較其他腫瘤表達水平更高，特異性、DOR、AUC 也更好，提示 circRNA 在肝細胞癌的診斷較其他腫瘤更有價值。對于 circRNA 的下游調控通路也作了一些富有成效的研究。例如，研究者揭示了CiRS-7/miR-7 可通過多條途徑影響腫瘤細胞的增殖。miR-7 可直接作用于一些靶標，在癌癥相關信號通路中下調重要致癌因子的表達，這些因子有表皮生長因子受體、胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）-1、IRS-2[29]等等。近年的 circRNA 與其他疾病的關聯研究舉例歸納于表 2[30-34]。
表2
不同疾病病變組織和血液中 circRNA 的變化舉例
4 問題與展望
目前對 circRNA 的生成、調節、功能仍不甚清楚。circRNA 在結核病方面作用的研究才剛剛興起，數量較少，沒有針對結核病變組織 circRNA 的直接研究，更無針對肺外結核對象的研究；circRNA 在結核發病發展中的具體機制并未闡明，尤其對于 circRNA 的下游通路信號，僅停留在生物信息學研究的層面。
未來可以開展以下方面的研究：① 深入研究 circRNA 對于結核病和結核感染的診斷價值。對基于 circRNA 的結核生物標志物診斷活動性結核和潛伏感染的效能進行大樣本和多中心研究，了解其靈敏度、特異度、陰性預測值、陽性預測值、AUC，并與其他非編碼 RNA 如長鏈非編碼 RNA 的診斷效能進行對比，以期獲得最優的結核生物標志物。鼓勵在有一定量的真實世界研究基礎上作 Meta 等循證醫學分析。② 對 circRNA 調控機制尤其是下游通路進行研究。其下游通路中存在多種與結核病發生發展有關的蛋白質。例如，按照生物信息學分析，FcgR 介導的內吞作用途徑可能受 circRNA 調控；而吞噬細胞中的 Rab 蛋白家族在吞噬體活化中的作用至為關鍵[35]，特定的 circRNA 對 Rab 蛋白家族有無調控作用？對進一步的研究有可能驗證以上科學假說或發現新的作用機制。③ 探索 circRNA 的治療作用。miRNA 的海綿技術被認為是有可能替代基因敲除技術的一種新型技術。參考 Liu 等[36]構建的針對 miR-21 及 miR-221 的 circRNA 海綿導入黑色素瘤細胞株后便顯示出強力的抗癌作用，有希望發展出具有抗結核作用的 circRNA 海綿。
circRNA 有望成為診斷和預后的新型標志物，也可能成為新藥的靶標，這些靶標包括：circRNA-miRNA-目標基因網絡、融合的 circRNA 和外泌體中的 circRNA。對 circRNA 調控機制進行深入研究，可能形成基于結核病非編碼 RNA 調節網絡的新理論。因為 circRNA 的廣泛分布，有望使用血液、腦脊液、胸液乃至無創性標本唾液等各類樣本進行檢測。circRNA 在結核診療應用中有良好的前景。
環狀 RNA（circular RNA，circRNA）是一類以共價封閉環為特征的非編碼 RNA，于 1970 年作為 RNA 轉錄副產品被鑒別出來[1]，可以通過轉錄調控機制影響細胞信號傳導、蛋白質轉錄合成等生物學功能[2-3]。其在多種疾病的發病機制中扮演重要角色，是一類嶄新的疾病生物標志物和藥物治療靶標。現對其結構與功能及其在結核病研究中的應用作一綜述。
1 circRNA 概述
1.1 circRNA 的產生、結構和降解
隨著 RNA 測序技術及其生物信息學的發展，在 15 種不同腫瘤或非腫瘤的細胞鏈中，被發現的 circRNA 超過 47 000 種。circRNA 主要存在于真核細胞內，分布十分廣泛，可出現在包括神經組織、肝臟組織等各種組織中，并且不同組織的 circRNA 差異十分顯著。例如，Guo 等[4]在多種人類細胞系相關的 39 種生物樣本中總共發現了 7 112 種 circRNA。Gene Ontology（GO）分析表明神經細胞內大部分 circRNA 有對應的蛋白編碼基因，能夠參與到疾病發生發展過程中[5]；亦有研究發現，不同神經組織區域中 circRNA 的表達量和表達譜都有明顯差異[6]。
circRNA 生成于細胞核，通過招募信使 RNA（messenger RNA，mRNA）輸出因子，轉移至細胞質并發揮作用，具體機制尚不清楚。Hansen 等[7]研究發現，微 RNA-7（microRNA-7，miR-7）的環狀 RNA 海綿（circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7）定位于細胞質的 P 小體，介導其發揮作用的效應因子蛋白 AGO 也定位于此。
介導 circRNA 產生的基因序列和蛋白包括：側翼內含子與補充序列如 Alu；涉及反向剪接的外顯子；RNA 結合蛋白，例如腺苷脫氨酶、可變因子、盲肌蛋白（muscleblind-like protein，MBL）等[1, 8-10]。其產生可以和轉錄同時發生，也可以發生在轉錄后。生成的方式有兩種：套索驅動的環化和內含子配對驅動的環化，在后一種方式中，circRNA 的側翼內含子含有 Alu 重復序列。circRNA 的生成可能通過剪接和反向剪接的競爭調節線性 RNA 的形成[1]。
circRNA 分子根據其在基因組中的來源及其構成序列的不同分為以下 3 類：外顯子來源的 circRNA 分子（exonic circRNA，ecRNA）、內含子來源的環狀 RNA 分子（intronic circRNA，ciRNA）以及由外顯子和內含子共同組成的環狀 RNA 分子（exon-intron circular RNA，EIciRNA）。ecRNA 主要存在于細胞質內，ciRNA 和 EIciRNA 一般分布在細胞核[1, 11-13]。
circRNA 的降解目前不甚清楚。零星研究提示 ciRS-7 是與 miR-671 結合后降解的[14]。
1.2 circRNA 的研究方法
1.2.1 circRNA 的數據庫
與 circRNA 有關的數據庫已創建不少，包括 findcirc、CIRCexplorer、circRNA_Finder、Circ2Traits、CIRI、circBase、starBase、CircInteractome 和 CircNet 等，是研究 circRNA 的重要生物信息學工具。不同數據庫各有特點，可綜合應用。circBase（http://www. circbase.org/）包含已經發布的 circRNA 數據，提供 circBase 支持的 circRNA ID 號或基因組區域位置信息，或者通過 tablebrowser 進行條件設置，可以查詢相關 circRNA 信息[15]。Circ2Traits（http://gyanxet-beta.com/circdb/）收集了與人類疾病關聯的 circRNA 數據，并通過預測構建了 miRNA-circRNA-gene 相互作用網絡，鑒定了 circRNA 上的 AGO 相互作用位點[16]。CircInteractome（http:// circinteractome.nia.nih.gov/）數據庫可以鑒定出具有 RNA 結合蛋白海綿樣作用的潛在 circRNA，設計小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）以沉默 circRNA [17]。
1.2.2 circRNA 的分子生物學研究方法
分為 3 個方面：① 表達分析技術。包括 RNA 測序、實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qT-PCR）、Northern 雜交、芯片技術、RNA-熒光原位雜交技術和生物素偶聯 circRNA 捕獲技術。其中芯片技術主要用于篩查，qT-PCR 主要用作驗證。生物素偶聯 circRNA 捕獲技術是一種基于多生物素信號放大的 circRNA Northen 印跡技術，具有高靈敏度等特點。② 功能研究。包括通過構建相關載體實現 circRNA 過表達，以及設計 siRNA 和小發夾 RNA 敲低（敲除）circRNA。前者如通過轉染 pcDNA3-ciRS-7 重組質粒入斑馬魚胚胎，來實現 ciRS-7 過表達，發現可對大腦發育產生一定影響。后者如使用 siRNA 技術研究 circRNA 在直結腸癌發病中的作用，發現 hsa_circ_0007534 可以抑制直結腸細胞的增殖，誘發其凋亡[18]。③ circRNA 和 miRNA 相互作用研究。一般通過 AGO 免疫沉淀技術結合 qT-PCR 分析，主要是研究 circRNA 吸附 miRNA 的“海綿”作用，由于 circRNA、miRNA 及 AGO 蛋白可在細胞內共定位結合，故可利用抗體特異性結合純化富集 AGO 蛋白，籍此探索 circRNA 和 miRNA 的數量、變化與互動。
1.3 circRNA 的特點
circRNA 廣泛存在于生物中，具有量大、序列特異性高、組織豐富性和疾病特異性等特點。一是豐富：circRNA 在真核細胞中廣泛表達，circRNA 的表達水平有時甚至超過線性異構體的 10 倍[1]。二是特異性：有時空特異性，如 ciRS-7 主要存在于細胞質，而 circEIF3J 和 ci-ankrd52 則僅聚集于細胞核[2, 19]。又如 hsa_circRNA_2149 只在 CD19+白細胞而非 CD34+白細胞或中性粒細胞中表達；一些 circRNA 在卵母細胞中表達，在胚胎細胞則缺如[20-21]。三是穩定性：無論是在細胞核中還是在細胞質中，circRNA 都是穩定存在的。由于 circRNA 具有共價閉合環結構，缺乏 5’端的帽子結構和 3’末端 poly（A）尾巴，且不易被 RNA 核酸外切酶降解，這使其比 mRNA 分子更穩定。這種特性使得 circRNA 作為生物標志物較線性 RNA 有一定優勢。四是保守性：ciRNA 主要特點是以 1 個 2’,5’-磷酸二酯鍵使首尾相連，而 ecRNA 則以 1 個 3’,5’-磷酸二酯鍵連接首尾兩端，提示特殊的反式剪接具有高度的保守性，同時這兩種產物在進化上也是高度保守的。
1.4 circRNA 的功能與作用機制
1.4.1 作為 miRNA 海綿發揮作用
這是目前研究得最多的作用機制。例如 circCDR1 作為顱內小腦降解相關蛋白 1（cerebellar degeneration related protein 1，CDR1）基因 miRNA 海綿，調節顱內 miR-7 與 miR-671 [2-3, 13]；再如調控同源域相互作用蛋白激酶 3 的 circHIPK3，與 miR-124 有多個結合位點，是細胞生長的調節劑，在腫瘤組織中高度表達，與腫瘤進展有關[1, 22]。
1.4.2 和線性 RNA 片段競爭
MBL 可結合其親本基因第 2 外顯子，促進 MBL 的 circRNA （circMbl） 的生物合成；另一方面，circMbl 和其側翼內含子具有 MBL 特異性連接部位，circMbl 與 MBL 結合，降低 MBL 有效濃度，減少 circMbl 生成，反向調節 circRNA 本身的合成[6]。
1.4.3 與 RNA 聚合酶 Ⅱ 作用
含有內含子的 circRNA，可以通過與 RNA 聚合酶 Ⅱ 作用，提高親本基因的轉錄效能。例如 ci-ankrd52，在轉錄位點附近與 RNA 聚合酶 Ⅱ 相互作用，是聚合酶 Ⅱ 復合體的正調節因子，對其母系基因發揮順式調控作用[19]。
1.4.4 翻譯蛋白質
Pamudurti 等[23]研究揭示了一種獨特的作用機制。他們發現，果蠅頭部的 circRNA 利用宿主 mRNA 的起始密碼，可以通過不依賴帽子結構的方式直接翻譯蛋白質。
2 circRNA 在結核病研究中的應用
circRNA 在結核發病中的調控作用已開始受到關注。已發現 circRNA 在人體外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中廣泛表達，并且結核患者 PBMC 所表達的 circRNA 數量顯著高于健康對照[24-27]。Zhuang 等[24]發現血中 hsa_circ_0005836 是鑒別肺結核患者與健康對照的新標志物。Qian 等[25]設計出一個基于 7 個 circRNA 分子的結核指數用于結核與健康對照的鑒別，發現其曲線下面積（area under the curve，AUC）高達 0.946。Huang 等[26]發現 hsa_circRNA_001937 在肺結核患者 PBMC 的表達較肺炎、肺癌、慢性阻塞性肺疾病患者高，且在抗結核治療后指標下降，是一個有前景的標志物。Zhang 等[27]除發現 6 個 circRNA 分子對于肺結核患者與健康對照有鑒別意義外，還建立了 2 個嶄新的 circRNA-miRNA-mRNA 網絡揭示 circRNA 在肺結核發病機制中的作用。第 1 個網絡由 1 721 個 circRNA-miRNA-mRNA 連接組成，其中包含 18 個上調的 circRNA 和 472 個 mRNA 以及 14 個下調的 miRNA；第 2 個網絡有 666 個 circRNA-miRNA-mRNA 連接，包含 6 個下調的 circRNA 和 307 個 mRNA 以及 8 個上調的 miRNA。生物信息學分析（GO 分析和 KEGG 分析）提示 circRNA 通過 circRNA-mirRNA-mRNA 網絡調控相關基因、繼而通過 Fcg 受體 （FcgR）介導的內吞作用、細胞因子受體相互作用、泛素介導的蛋白水解等途徑影響結核的發病[24-27]。具體歸納見表 1。
表1
肺結核患者 PBMC 中 circRNA 的變化
3 circRNA 與其他疾病的關聯研究
他山之石，可以攻玉。了解 circRNA 與其他疾病的關聯研究現狀有助于我們在結核病研究中借鑒與學習。已發現 circRNA 在多種疾病中發揮作用，例如動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、糖尿病、腫瘤、乙型肝炎等。circRNA 與腫瘤的關系研究得較多。Wang 等[28]進行 Meta 分析指出，2012 年—2017 年間共有 19 篇文章涉及 circRNA 與腫瘤的關系，共納入 1 752 例患者，以其他非腫瘤患者為對照，經合并后 circRNA 診斷試驗的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、診斷比值比（diagnostic odds ratio，DOR）及其 95% 置信區間分別為 0.72（0.67，0.76）、0.74（0.69，0.78）、2.80（2.40，3.10）、0.38（0.33，0.44）、7.00（6.00，9.00），AUC 為 0.79，診斷價值尚可；circRNA 在肝細胞癌組織中較其他腫瘤表達水平更高，特異性、DOR、AUC 也更好，提示 circRNA 在肝細胞癌的診斷較其他腫瘤更有價值。對于 circRNA 的下游調控通路也作了一些富有成效的研究。例如，研究者揭示了CiRS-7/miR-7 可通過多條途徑影響腫瘤細胞的增殖。miR-7 可直接作用于一些靶標，在癌癥相關信號通路中下調重要致癌因子的表達，這些因子有表皮生長因子受體、胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）-1、IRS-2[29]等等。近年的 circRNA 與其他疾病的關聯研究舉例歸納于表 2[30-34]。
表2
不同疾病病變組織和血液中 circRNA 的變化舉例
4 問題與展望
目前對 circRNA 的生成、調節、功能仍不甚清楚。circRNA 在結核病方面作用的研究才剛剛興起，數量較少，沒有針對結核病變組織 circRNA 的直接研究，更無針對肺外結核對象的研究；circRNA 在結核發病發展中的具體機制并未闡明，尤其對于 circRNA 的下游通路信號，僅停留在生物信息學研究的層面。
未來可以開展以下方面的研究：① 深入研究 circRNA 對于結核病和結核感染的診斷價值。對基于 circRNA 的結核生物標志物診斷活動性結核和潛伏感染的效能進行大樣本和多中心研究，了解其靈敏度、特異度、陰性預測值、陽性預測值、AUC，并與其他非編碼 RNA 如長鏈非編碼 RNA 的診斷效能進行對比，以期獲得最優的結核生物標志物。鼓勵在有一定量的真實世界研究基礎上作 Meta 等循證醫學分析。② 對 circRNA 調控機制尤其是下游通路進行研究。其下游通路中存在多種與結核病發生發展有關的蛋白質。例如，按照生物信息學分析，FcgR 介導的內吞作用途徑可能受 circRNA 調控；而吞噬細胞中的 Rab 蛋白家族在吞噬體活化中的作用至為關鍵[35]，特定的 circRNA 對 Rab 蛋白家族有無調控作用？對進一步的研究有可能驗證以上科學假說或發現新的作用機制。③ 探索 circRNA 的治療作用。miRNA 的海綿技術被認為是有可能替代基因敲除技術的一種新型技術。參考 Liu 等[36]構建的針對 miR-21 及 miR-221 的 circRNA 海綿導入黑色素瘤細胞株后便顯示出強力的抗癌作用，有希望發展出具有抗結核作用的 circRNA 海綿。
circRNA 有望成為診斷和預后的新型標志物，也可能成為新藥的靶標，這些靶標包括：circRNA-miRNA-目標基因網絡、融合的 circRNA 和外泌體中的 circRNA。對 circRNA 調控機制進行深入研究，可能形成基于結核病非編碼 RNA 調節網絡的新理論。因為 circRNA 的廣泛分布，有望使用血液、腦脊液、胸液乃至無創性標本唾液等各類樣本進行檢測。circRNA 在結核診療應用中有良好的前景。
