引用本文： 唐林, 王琪琳, 王平. 白細胞介素-6 對子宮頸癌細胞株 C-33A 增殖影響的研究. 華西醫學, 2018, 33(4): 423-426. doi: 10.7507/1002-0179.201803148 復制
子宮頸癌是女性常見的腫瘤之一，約占女性生殖系統惡性腫瘤發病率的 2/3，居女性生殖器官惡性腫瘤發病的首位，全球子宮頸癌新發病例數逐年上升，年均增長率達 0.6%[1]，嚴重影響婦女的身心健康。目前研究表明：子宮頸癌的主要病因與人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染有關，主要為 HPV16 和 HPV18，子宮頸癌的發生發展主要是從炎性改變到癌變的一個慢性炎性反應過程，即子宮頸癌是一個與炎性反應相關的腫瘤，與乙型肝炎病毒感染所致肝癌的發生發展過程類似[2]。但絕大多數感染高危型 HPV 的女性并未發展為子宮頸癌，因為機體自身免疫反應能夠清除 HPV 并阻止宮頸病變發生發展[3]。所以高危型 HPV 感染并非子宮頸癌發生發展的單一因素，除已明確的相關因素如社會環境因素（貧困、教育程度低、醫療資源匱乏地區等）、流行病學因素（多個性伴侶、多產史、長時間口服避孕藥、吸煙等）外，免疫缺陷以及局部免疫抑制也是子宮頸癌發生發展的重要因素[4-6]。白細胞介素（interleukin，IL）-6 是一種炎癥因子，由淋巴細胞、巨噬細胞等多種炎性細胞分泌[7]。另外，研究表明：一些腫瘤細胞，如肺癌、胃癌和子宮頸癌的腫瘤細胞也能分泌 IL-6，在腫瘤發生發展的不同階段，IL-6 既可以發揮抗腫瘤作用，亦可以抑制腫瘤細胞增殖[8-9]。為了深入研究 IL-6 與子宮頸癌的發生和發展之間的關系，探討其在子宮頸癌發生和發展過程中可能的生物學意義，本研究利用重組人 IL-6 蛋白處理子宮頸癌細胞 C-33A，旨在探究 IL-6 對子宮頸癌細胞增殖遷移以及上皮-間質轉化的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
子宮頸癌細胞株 C-33A 購自中國科學院上海細胞庫，脂質體 2000 購自美國 Life Technologies 公司，miScript SYBR Green PCR kit（200）試劑盒購自德國 Qiagen 公司，改良 Eagle 培養基（Dulbecco’s modification of Eagle’s medium，DMEM）培養液、胎牛血清購自美國 Hyclone 公司，含 Tween-20 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution with Tween-20，PBST）、Tris 緩沖鹽溶液（tris buffered saline，TBS）和含 Tween-20 的 TBS 緩沖液（TBS with Tween-20，TBST）購于美國 Amresco 公司，Western 發光底物（ECL）顯示試劑盒購于美國 Cell Signaling Technology 公司，重組人 IL-6 蛋白購自美國 ProSpec 公司，上皮鈣黏著蛋白（epithelial-cadherin，E-Cad）、神經鈣黏著蛋白（neural-cadherin，N-Cad）、波形蛋白（vimentin）、轉錄因子 Snail1（transcription factors-snail1，TFs-SNAIL1）檢測試劑盒購于美國 Cell Signaling Technology 公司，mirPremier? microRNA Isolation 試劑盒購自美國 Sigma 公司，光學顯微鏡為日本 Olympus 公司產品；GDS8000 凝膠成像分析系統購于美國 UVP 公司；ABI stepone plus 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）儀為美國 Applied Biosystems 公司產品。
1.2 細胞培養
根據試劑盒說明操作，按 1×105個/孔將子宮頸癌細胞株 C-33A 接種于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養液中培養，放置于 37℃、5% 二氧化碳的培養箱中。
1.3 MTT 檢測細胞增殖活性
將子宮頸癌細胞株 C-33A 以密度為 5×103 個/孔種于 96 孔板中，分為 2 組：IL-6 組和對照組，各組接種 20 孔；24 h 后于 IL-6 組加入 IL-6（50 ng/mL）處理，對照組不加入 IL-6；分別于作用 12、24、48、72 h 后進行 MTT 檢測。MTT 檢測方法參見文獻[10]。在 562 nm 波長處測定各孔吸光度值，比較細胞的增殖活性。
1.4 細胞遷移實驗
采用劃痕實驗檢測子宮頸癌細胞株 C-33A 的遷移能力。在 6 孔板背，均勻地劃橫取 10 條水平線，大約每隔 0.8 cm 一道，橫穿過孔，然后在孔中加入約 5×104 個細胞過夜；第 2 天用 200 μL 槍頭垂至于背后的橫線劃痕，不同孔使用同一只槍頭；PBS 洗細胞，在 IL-6 組加入無血清培養基及 IL-6，對照組僅加入無血清培養基，放入 37℃、5% 二氧化碳培養箱中培養，于 12、24、48 和 72 h 后顯微鏡（×100）下觀察拍照，計算細胞間距離與對照組的劃痕的相對比值。
1.5 RNA 的提取和 RT-qPCR 檢測 E-Cad、N-Cad、vimentin、TFs-SNAIL1 mRNA 的表達
將子宮頸癌細胞株 C-33A 以約 5×104 個細胞接種至 6 孔板中，IL-6 組及對照組各 20 個孔，24 h 后于 IL-6 組加入 IL-6（50 ng/mL）處理，對照組不加入 IL-6，培養 48 h 后提取 RNA 及蛋白。根據試劑盒操作說明，使用 mirPremier? microRNA Isolation 試劑盒提取子宮頸癌細胞 C-33A 總 RNA，微量分光光度計測定 RNA 的純度。檢測 E-Cad、N-Cad、vimentin、TFs-SNAIL1 mRNA 的表達 RT-qPCR 方法參見文獻[11]。
1.6 蛋白質印跡法檢測 E-Cad、N-Cad、vimentin、TFs-SNAIL1 蛋白水平的表達
收集 IL-6 刺激 48 h 后子宮頸癌細胞株 C-33A 細胞，提取其總蛋白，蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。濕轉法將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶封閉轉印膜后，將膜置于含有甘油醛-3-磷酸脫氫酶、E-Cal、N-Cal、vimentin、TFs-SNAIL1 一抗的封閉液中，室溫下放置 0.5 h 后，4℃ 過夜，PBST 洗膜 2 次，TBST 脫色，TBS 漂洗，然后加入二抗稀釋液，2 h 后取出轉印膜，加 ECL 底物顯色液，1 min 后拍照，用 Image J 軟件對蛋白條帶進行灰度分析。
1.7 統計學方法
應用 SPSS 20.0 軟件對數據進行統計分析。計數資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 IL-6 促進子宮頸癌細胞株 C-33A 的增殖
與對照組比較，IL-6 刺激子宮頸癌細胞株 C-33A 后 12、24、48、72 h，IL-6 組細胞的增殖能力明顯增強，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
IL-6 刺激后不同時間子宮頸癌細胞株 C-33A 的增殖情況（562 nm 吸光度值）（n=20，
）
2.2 IL-6 促進子宮頸癌細胞株 C-33A 的遷移能力
與對照組相比，IL-6 刺激子宮頸癌細胞株 C-33A 后 12、24、48、72 h，IL-6 組細胞的遷移能力增強，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
IL-6 刺激后不同時間子宮頸癌細胞株 C-33A 的相對遷移能力（n=20，
）
2.3 IL-6 促進子宮頸癌細胞株 C-33A 間質上皮轉化
IL-6 刺激子宮頸癌細胞株 C-33A 48 h 后，RT-qPCR 檢測發現：與對照組比較，子宮頸癌細胞株 C-33A 的 E-Cad mRNA 表達下降，而 N-Cad、vimentin 和 TFs-SNAIL1 mRNA 表達增加（表 3）；蛋白質印跡檢測表明：E-Cad 蛋白表達水平下降，而 N-Cad、vimentin 和 TFs-SNAIL1 mRNA 表達水平增加（表 4、圖 1）。
表3
IL-6 刺激后子宮頸癌細胞株 C-33A 的 E-Cad、N-Cad、vimentin 和 TFs-SNAIL1 mRNA 的相對表達水平（n=20，
）
表4
IL-6 刺激后子宮頸癌細胞株 C-33A 的 E-Cad、N-Cad、vimentin 和 TFs-SNAIL1 蛋白的相對表達量（n=20，
）
圖1
蛋白質印跡法檢查 IL-6 刺激后子宮頸癌細胞株 C-33A 的 E-Cad、N-Cad、vimentin 和 TFs-SNAIL1 蛋白表達
3 討論
炎癥與腫瘤的關系一直是臨床醫學爭議的話題。現有研究證明炎性反應在胃癌、膀胱癌等腫瘤的發生中發揮著重要作用。在癌前病變的細胞中，IL-1、IL-6、IL-8 等炎性細胞因子可誘導上皮細胞在基因水平的改變，促其腫瘤的發生[12]，通過表皮生長因子激活腫瘤干細胞轉錄因子核因子-κB/轉錄激活因子 3 信號通路，促進腫瘤細胞自我更新、生長、增殖和轉移，促進腫瘤的發生發展[13]。IL-6 主要由淋巴細胞、巨噬細胞及成纖維細胞分泌，在體內的炎癥反應和免疫調節中發揮重要作用[10, 14-15]。本研究發現，IL-6 能夠促進子宮頸癌細胞株 C-33A 的增殖和遷移，降低 E-Cad mRNA 和蛋白的表達，增加 N-Cad、vimentin 和 TFs-SNAIL1 mRNA 及蛋白表達，誘發間質上皮的轉化進程。但在宮頸病變中 IL-6 其相關的信號轉導通路尚不十分明確。有研究顯示 IL-6 很可能是通過下調 miR-152 表達，誘導磷脂酰肌醇 3-激酶表達，從而激活磷脂酰肌醇激酶/絲氨酸激酶信號通路，調控細胞的增殖、遷移和上皮間質轉化等過程，發揮致癌作用[11]。本研究僅提示 IL-6 可能參與子宮頸癌的發生發展過程。另外，孫蘭穎等[16]在對不同類型的子宮頸癌組織切片中 IL-6 含量的測量研究顯示：在子宮頸癌淋巴結轉移者中的 IL-6 表達明顯高于無淋巴結轉移者，在中低分化組的表達明顯高于高分化組的表達。提示 IL-6 與子宮頸癌的發生有關。
雖然炎癥反應在子宮頸癌發生發展中的作用及調控機制目前并不十分清楚，但是，本研究表明了炎癥細胞分泌的 IL-6 與子宮頸癌發生和發展有關，為進一步深入研究闡明炎性反應在子宮頸癌等上皮細胞腫瘤作用機制提供了參考，也可能為今后以炎性反應為靶向性的抗癌治療開辟新的思路。
子宮頸癌是女性常見的腫瘤之一，約占女性生殖系統惡性腫瘤發病率的 2/3，居女性生殖器官惡性腫瘤發病的首位，全球子宮頸癌新發病例數逐年上升，年均增長率達 0.6%[1]，嚴重影響婦女的身心健康。目前研究表明：子宮頸癌的主要病因與人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染有關，主要為 HPV16 和 HPV18，子宮頸癌的發生發展主要是從炎性改變到癌變的一個慢性炎性反應過程，即子宮頸癌是一個與炎性反應相關的腫瘤，與乙型肝炎病毒感染所致肝癌的發生發展過程類似[2]。但絕大多數感染高危型 HPV 的女性并未發展為子宮頸癌，因為機體自身免疫反應能夠清除 HPV 并阻止宮頸病變發生發展[3]。所以高危型 HPV 感染并非子宮頸癌發生發展的單一因素，除已明確的相關因素如社會環境因素（貧困、教育程度低、醫療資源匱乏地區等）、流行病學因素（多個性伴侶、多產史、長時間口服避孕藥、吸煙等）外，免疫缺陷以及局部免疫抑制也是子宮頸癌發生發展的重要因素[4-6]。白細胞介素（interleukin，IL）-6 是一種炎癥因子，由淋巴細胞、巨噬細胞等多種炎性細胞分泌[7]。另外，研究表明：一些腫瘤細胞，如肺癌、胃癌和子宮頸癌的腫瘤細胞也能分泌 IL-6，在腫瘤發生發展的不同階段，IL-6 既可以發揮抗腫瘤作用，亦可以抑制腫瘤細胞增殖[8-9]。為了深入研究 IL-6 與子宮頸癌的發生和發展之間的關系，探討其在子宮頸癌發生和發展過程中可能的生物學意義，本研究利用重組人 IL-6 蛋白處理子宮頸癌細胞 C-33A，旨在探究 IL-6 對子宮頸癌細胞增殖遷移以及上皮-間質轉化的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
子宮頸癌細胞株 C-33A 購自中國科學院上海細胞庫，脂質體 2000 購自美國 Life Technologies 公司，miScript SYBR Green PCR kit（200）試劑盒購自德國 Qiagen 公司，改良 Eagle 培養基（Dulbecco’s modification of Eagle’s medium，DMEM）培養液、胎牛血清購自美國 Hyclone 公司，含 Tween-20 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution with Tween-20，PBST）、Tris 緩沖鹽溶液（tris buffered saline，TBS）和含 Tween-20 的 TBS 緩沖液（TBS with Tween-20，TBST）購于美國 Amresco 公司，Western 發光底物（ECL）顯示試劑盒購于美國 Cell Signaling Technology 公司，重組人 IL-6 蛋白購自美國 ProSpec 公司，上皮鈣黏著蛋白（epithelial-cadherin，E-Cad）、神經鈣黏著蛋白（neural-cadherin，N-Cad）、波形蛋白（vimentin）、轉錄因子 Snail1（transcription factors-snail1，TFs-SNAIL1）檢測試劑盒購于美國 Cell Signaling Technology 公司，mirPremier? microRNA Isolation 試劑盒購自美國 Sigma 公司，光學顯微鏡為日本 Olympus 公司產品；GDS8000 凝膠成像分析系統購于美國 UVP 公司；ABI stepone plus 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）儀為美國 Applied Biosystems 公司產品。
1.2 細胞培養
根據試劑盒說明操作，按 1×105個/孔將子宮頸癌細胞株 C-33A 接種于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養液中培養，放置于 37℃、5% 二氧化碳的培養箱中。
1.3 MTT 檢測細胞增殖活性
將子宮頸癌細胞株 C-33A 以密度為 5×103 個/孔種于 96 孔板中，分為 2 組：IL-6 組和對照組，各組接種 20 孔；24 h 后于 IL-6 組加入 IL-6（50 ng/mL）處理，對照組不加入 IL-6；分別于作用 12、24、48、72 h 后進行 MTT 檢測。MTT 檢測方法參見文獻[10]。在 562 nm 波長處測定各孔吸光度值，比較細胞的增殖活性。
1.4 細胞遷移實驗
采用劃痕實驗檢測子宮頸癌細胞株 C-33A 的遷移能力。在 6 孔板背，均勻地劃橫取 10 條水平線，大約每隔 0.8 cm 一道，橫穿過孔，然后在孔中加入約 5×104 個細胞過夜；第 2 天用 200 μL 槍頭垂至于背后的橫線劃痕，不同孔使用同一只槍頭；PBS 洗細胞，在 IL-6 組加入無血清培養基及 IL-6，對照組僅加入無血清培養基，放入 37℃、5% 二氧化碳培養箱中培養，于 12、24、48 和 72 h 后顯微鏡（×100）下觀察拍照，計算細胞間距離與對照組的劃痕的相對比值。
1.5 RNA 的提取和 RT-qPCR 檢測 E-Cad、N-Cad、vimentin、TFs-SNAIL1 mRNA 的表達
將子宮頸癌細胞株 C-33A 以約 5×104 個細胞接種至 6 孔板中，IL-6 組及對照組各 20 個孔，24 h 后于 IL-6 組加入 IL-6（50 ng/mL）處理，對照組不加入 IL-6，培養 48 h 后提取 RNA 及蛋白。根據試劑盒操作說明，使用 mirPremier? microRNA Isolation 試劑盒提取子宮頸癌細胞 C-33A 總 RNA，微量分光光度計測定 RNA 的純度。檢測 E-Cad、N-Cad、vimentin、TFs-SNAIL1 mRNA 的表達 RT-qPCR 方法參見文獻[11]。
1.6 蛋白質印跡法檢測 E-Cad、N-Cad、vimentin、TFs-SNAIL1 蛋白水平的表達
收集 IL-6 刺激 48 h 后子宮頸癌細胞株 C-33A 細胞，提取其總蛋白，蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。濕轉法將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶封閉轉印膜后，將膜置于含有甘油醛-3-磷酸脫氫酶、E-Cal、N-Cal、vimentin、TFs-SNAIL1 一抗的封閉液中，室溫下放置 0.5 h 后，4℃ 過夜，PBST 洗膜 2 次，TBST 脫色，TBS 漂洗，然后加入二抗稀釋液，2 h 后取出轉印膜，加 ECL 底物顯色液，1 min 后拍照，用 Image J 軟件對蛋白條帶進行灰度分析。
1.7 統計學方法
應用 SPSS 20.0 軟件對數據進行統計分析。計數資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 IL-6 促進子宮頸癌細胞株 C-33A 的增殖
與對照組比較，IL-6 刺激子宮頸癌細胞株 C-33A 后 12、24、48、72 h，IL-6 組細胞的增殖能力明顯增強，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
IL-6 刺激后不同時間子宮頸癌細胞株 C-33A 的增殖情況（562 nm 吸光度值）（n=20，
）
2.2 IL-6 促進子宮頸癌細胞株 C-33A 的遷移能力
與對照組相比，IL-6 刺激子宮頸癌細胞株 C-33A 后 12、24、48、72 h，IL-6 組細胞的遷移能力增強，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
IL-6 刺激后不同時間子宮頸癌細胞株 C-33A 的相對遷移能力（n=20，
）
2.3 IL-6 促進子宮頸癌細胞株 C-33A 間質上皮轉化
IL-6 刺激子宮頸癌細胞株 C-33A 48 h 后，RT-qPCR 檢測發現：與對照組比較，子宮頸癌細胞株 C-33A 的 E-Cad mRNA 表達下降，而 N-Cad、vimentin 和 TFs-SNAIL1 mRNA 表達增加（表 3）；蛋白質印跡檢測表明：E-Cad 蛋白表達水平下降，而 N-Cad、vimentin 和 TFs-SNAIL1 mRNA 表達水平增加（表 4、圖 1）。
表3
IL-6 刺激后子宮頸癌細胞株 C-33A 的 E-Cad、N-Cad、vimentin 和 TFs-SNAIL1 mRNA 的相對表達水平（n=20，
）
表4
IL-6 刺激后子宮頸癌細胞株 C-33A 的 E-Cad、N-Cad、vimentin 和 TFs-SNAIL1 蛋白的相對表達量（n=20，
）
圖1
蛋白質印跡法檢查 IL-6 刺激后子宮頸癌細胞株 C-33A 的 E-Cad、N-Cad、vimentin 和 TFs-SNAIL1 蛋白表達
3 討論
炎癥與腫瘤的關系一直是臨床醫學爭議的話題。現有研究證明炎性反應在胃癌、膀胱癌等腫瘤的發生中發揮著重要作用。在癌前病變的細胞中，IL-1、IL-6、IL-8 等炎性細胞因子可誘導上皮細胞在基因水平的改變，促其腫瘤的發生[12]，通過表皮生長因子激活腫瘤干細胞轉錄因子核因子-κB/轉錄激活因子 3 信號通路，促進腫瘤細胞自我更新、生長、增殖和轉移，促進腫瘤的發生發展[13]。IL-6 主要由淋巴細胞、巨噬細胞及成纖維細胞分泌，在體內的炎癥反應和免疫調節中發揮重要作用[10, 14-15]。本研究發現，IL-6 能夠促進子宮頸癌細胞株 C-33A 的增殖和遷移，降低 E-Cad mRNA 和蛋白的表達，增加 N-Cad、vimentin 和 TFs-SNAIL1 mRNA 及蛋白表達，誘發間質上皮的轉化進程。但在宮頸病變中 IL-6 其相關的信號轉導通路尚不十分明確。有研究顯示 IL-6 很可能是通過下調 miR-152 表達，誘導磷脂酰肌醇 3-激酶表達，從而激活磷脂酰肌醇激酶/絲氨酸激酶信號通路，調控細胞的增殖、遷移和上皮間質轉化等過程，發揮致癌作用[11]。本研究僅提示 IL-6 可能參與子宮頸癌的發生發展過程。另外，孫蘭穎等[16]在對不同類型的子宮頸癌組織切片中 IL-6 含量的測量研究顯示：在子宮頸癌淋巴結轉移者中的 IL-6 表達明顯高于無淋巴結轉移者，在中低分化組的表達明顯高于高分化組的表達。提示 IL-6 與子宮頸癌的發生有關。
雖然炎癥反應在子宮頸癌發生發展中的作用及調控機制目前并不十分清楚，但是，本研究表明了炎癥細胞分泌的 IL-6 與子宮頸癌發生和發展有關，為進一步深入研究闡明炎性反應在子宮頸癌等上皮細胞腫瘤作用機制提供了參考，也可能為今后以炎性反應為靶向性的抗癌治療開辟新的思路。
