引用本文： 李林芳, 胡迎春, 鐘武, 陳睦虎. Yes 激酶相關蛋白 1 在大鼠顱腦損傷中的高表達. 華西醫學, 2017, 32(6): 838-841. doi: 10.7507/1002-0179.201705079 復制
創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是當今威脅人類生命健康的主要疾患之一，是急診急救醫學的常見病、多發病。如何保護、促進神經功能的恢復一直困擾著醫學研究者，其主要原因是對其發生發展的病理生理和分子機制尚未完全清楚[1]。因此本研究前期已經在基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中篩選出大鼠顱腦損傷差異基因，并采用 KOBAS 2.0（http:// kobas.cbi.pku.edu.cn）進行生物學通路分析，發現 Hippo 信號通路表達突出[2]，Hippo 通路對細胞的增殖、凋亡和個體的發育有重要調控作用，作為 Hippo 信號通路的下游關鍵因子，Yes 激酶相關蛋白 1（yes-associated protein 1，YAP1）的表達情況對 Hippo 信號通路的生物學效應有顯著作用。本研究旨在驗證篩選結果，為后期機制研究提供理論基礎。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
18 只雄性Sprague Dawley（SD）大鼠購于西南醫科大學實驗動物中心，體質量 200 g 左右，隨機分為對照組、假手術組、顱腦損傷組，每組 8 只。實驗期間環境濕度適宜，12 h 晝夜規律，自由飲食。所有飼養以及實驗流程符合《西南醫科大學實驗動物倫理審查的基本原則》的規定。
1.2 儀器與耗材
實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（FTC2000，加拿大楓嶺生物公司）；逆轉錄酶（reverse transcriptase，RT）試劑、熒光定量 PCR 試劑、SYBR Green Ⅰ、引物（重慶威斯騰生物醫藥科技有限責任公司）；電泳儀（JY300C，北京君意東方電泳設備有限公司）；蛋白裂解液（北京普利萊基因技術有限公司）；甲醇、電泳緩沖液、轉移緩沖液、封閉液、Triste-HCl+Tween 緩沖液（tris-buffered saline and tween，TBST）、Triste-HCl 緩沖鹽溶液（tris-buffered saline，TBS）、X 線膠片（美國柯達公司）；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（美國 Millipore 公司）、濾紙（英國 Whatman 公司）；顯影液、定影液（上海冠龍照相器材公司）；預染蛋白 marker（美國 Fermentas 公司）；一抗（美國 Santa Cruz 公司）；辣根過氧化物酶二抗、電化學發光試劑（北京普利萊基因技術有限公司）。
1.3 大鼠顱腦損傷模型構建
實驗前飼養禁食過夜，自由飲水。腹腔注射麻醉（戊巴比妥鈉）后，將大鼠頭部固定。制作 TBI 模型[3]時消毒鋪巾，沿正中線切開頭皮并剝離骨膜，暴露右頂骨，于冠狀縫后 1.5 mm、中線右旁 2.5 mm 處紋式鉗擴大一直徑為 4～5 mm 的圓形骨窗（盡量不弄破骨膜），用 Feeney 法按自由落體致傷原理，將撞桿頭端置骨窗處，另用擊錘（20 g）沿外周導管從 30 cm 高處自由落下撞擊撞桿（撞擊深度 3 mm），造成右頂葉腦挫傷，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。假手術組只開顱不撞擊。72 h（以生物信息學原始數據時間為依據，并結合預實驗選擇時間點）后處死 3 組大鼠取腦組織進行后續實驗。
1.4 免疫組織化學法觀察 YAP1 定位表達
大鼠處死后取腦組織石蠟包埋切片，采用 Envision 二步法染色，操作按照說明書進行，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對照。陽性產物為棕黃色或棕褐色，背景為藍色。
1.5 實時熒光定量 PCR 檢測 YAP1 mRNA 表達
取大鼠損傷腦組織旁 2 mm（大鼠生物信息學原始數據來源于挫傷灶旁組織，在前期預實驗中由于損傷組織破壞嚴重，因此無法滿意進行實驗檢測）組織（每只大鼠腦組織取 3 處），使用 TRIzol 法提取總 RNA，反轉錄反應條件的設置：25℃ 10 min， 42℃ 50 min，85℃ 5 min；熒光定量 PCR 擴增條件的設置：94℃ 4 min；94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s 循環 35 次，72℃ 檢測信號。
設計引物：Yap1正向引物：5’-CCCCAGACG CTGATGAACTC-3’；Yap1反向引物：5’-GGG TCCAGCCAGGATGTG-3’；序列長度：122 bp。β-actin正向引物：5’-CCCATCTATGAGGGT TACGC-3’；β-actin 反向引物：5’-TTTAATGTC ACGCACGATTTC-3’，序列長度 150 bp。相對表達量以 2–??Ct計算。
1.6 蛋白質印跡法檢測 YAP1 的蛋白表達水平
取損傷腦組織旁 2 mm 組織剪切成細小的碎片；每 100 毫克組織加入 1 mL RIPA 裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，上下手動勻漿 20 次；離心，取上清液，蛋白濃度測定、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、孵育一抗（鼠抗 1∶1 000）、孵育二抗（兔抗鼠 1∶5 000）、化學發光，顯影，定影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參。
1.7 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 YAP1 蛋白在顱腦損傷組織中的定位表達情況
大鼠顱腦損傷組織旁神經細胞陽性表現為棕黃色或棕褐色，并呈顆粒狀，背景為藍色。YAP1 蛋白主要在神經細胞細胞質中表達，在顱腦損傷組中較對照組和假手術組表達增多。見圖 1。
圖1
大鼠顱腦損傷后 YAP1 蛋白在神經細胞中的定位表達情況
2.2 實時熒光定量 PCR 檢測 YAP1 mRNA 在顱腦損傷腦組織中的定量表達情況
顱腦損傷后 72 h，與對照組、假手術組相比，實時熒光定量 PCR 檢測顱腦損傷腦組織中 YAP1 mRNA 表達上升至 2.3 倍（P=0.037），見圖 2。
圖2
大鼠顱腦損傷后 YAP1 mRNA 在腦組織中的表達情況
2.3 蛋白質印跡法檢測 YAP1 蛋白在顱腦損傷大鼠腦組織中的表達情況
YAP1 蛋白在顱腦損傷組中較假手術組和對照組表達上升（P=0.029），各組 YAP1/GAPDH 均值比分別為 0.46±0.02、0.32±0.03、0.29±0.03，YAP1 蛋白在顱腦損傷組中的表達量是假手術組的 1.4 倍，對照組的 1.58 倍，差異有統計學意義（P=0.035、0.027）。見圖 3。
圖3
大鼠顱腦損傷后 YAP1 蛋白在腦組織中的定量表達情況
3 討論
目前的顱腦損傷臨床治療還無比較滿意的治療措施[4]。因此，需要對其分子機制做大量工作，開發更多的靶向藥物。有研究表明顱腦損傷與炎癥反應有關，其中涉及有 核因子-κB 通路以及潛在靶標糖原合成酶激酶-3β[5]；JAK/STAT 信號通路，其與細胞凋亡有關[6]；Nrf2 信號通路，可調節抗氧化蛋白表達起防止氧化損傷的作用[7]；β-catenin 信號通路，起到保護神經細胞存活以及神經生長的作用[8-9]。
我們前期通過生物信息學技術研究已發現，Hippo 信號通路在顱腦損傷中表達顯著突出。Hippo 信號通路已在腫瘤、神經系統及炎癥領域被發現有重要的生物學效應。YAP1 作為 Hippo 信號通路中的關鍵轉錄因子，在其被磷酸化后與 TAZ 結合并發生核轉位，促進下游因子的表達發生效應。本研究旨在通過實驗驗證前期生物信息學技術，尋找 YAP1 在大鼠顱腦損傷中的表達情況。構建大鼠顱腦損傷模型（Feeney 法是目前公認的較多的制造顱腦損傷模型方法，對于顱腦損傷研究的模型均是采用此模型方法，其可代表重型顱腦損傷模型），其關鍵基因 YAP1 在基因水平及蛋白水平均有升高，提示其表達可能與顱腦損傷的進一步發生發展有關，但其機制有待進一步研究：其磷酸水平如何，促進下游哪些基因表達？在顱腦損傷過程中起保護還是損傷作用還需要后期進一步深入研究。本研究驗證了我們的前期生物信息學技術篩選的信號通路結果，證實了生物信息學技術篩選的準確性，說明其是一種高效的篩選技術。
Hippo 信號通路作為腫瘤抑制通路[10]，協同細胞增殖、死亡、分化途徑而調節組織生長控制[11-13]。研究認為 Hippo 信號通路在心臟發育、損傷、再生等方面起重要作用[14-15]。Hippo 信號通路具有保守的核心模塊通過對其關鍵蛋白 YAP1/TAZ 的磷酸化而調節組織大小，它還調控非腫瘤疾病組織的大小，同時還在組織損傷后的再生起重要作用[16]。有研究報道 YAP1/TAZ 基因在神經慢性損傷中表達升高，在細胞核內集聚[17]；另有研究發現其參與了阿爾茨海默病疾病過程[18]；研究發現改變大鼠 YAP1 基因將導致大鼠胚胎心臟發育缺陷，暗示其與維持心臟的正常形態有關[19]；而 YAP1 的過表達與心肌細胞增殖有關[20]。另有研究發現 YAP1 與創傷后表皮愈合有關[21]。目前，關于 YAP1 的研究主要集中在腫瘤領域，在非腫瘤疾病中研究較少，而且多為基礎實驗，在顱腦損傷中未見報道。本研究組首次報道發現 YAP1 蛋白在大鼠顱腦損傷中表達上升，但其作用機制有待后期實驗研究。
創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是當今威脅人類生命健康的主要疾患之一，是急診急救醫學的常見病、多發病。如何保護、促進神經功能的恢復一直困擾著醫學研究者，其主要原因是對其發生發展的病理生理和分子機制尚未完全清楚[1]。因此本研究前期已經在基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中篩選出大鼠顱腦損傷差異基因，并采用 KOBAS 2.0（http:// kobas.cbi.pku.edu.cn）進行生物學通路分析，發現 Hippo 信號通路表達突出[2]，Hippo 通路對細胞的增殖、凋亡和個體的發育有重要調控作用，作為 Hippo 信號通路的下游關鍵因子，Yes 激酶相關蛋白 1（yes-associated protein 1，YAP1）的表達情況對 Hippo 信號通路的生物學效應有顯著作用。本研究旨在驗證篩選結果，為后期機制研究提供理論基礎。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
18 只雄性Sprague Dawley（SD）大鼠購于西南醫科大學實驗動物中心，體質量 200 g 左右，隨機分為對照組、假手術組、顱腦損傷組，每組 8 只。實驗期間環境濕度適宜，12 h 晝夜規律，自由飲食。所有飼養以及實驗流程符合《西南醫科大學實驗動物倫理審查的基本原則》的規定。
1.2 儀器與耗材
實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（FTC2000，加拿大楓嶺生物公司）；逆轉錄酶（reverse transcriptase，RT）試劑、熒光定量 PCR 試劑、SYBR Green Ⅰ、引物（重慶威斯騰生物醫藥科技有限責任公司）；電泳儀（JY300C，北京君意東方電泳設備有限公司）；蛋白裂解液（北京普利萊基因技術有限公司）；甲醇、電泳緩沖液、轉移緩沖液、封閉液、Triste-HCl+Tween 緩沖液（tris-buffered saline and tween，TBST）、Triste-HCl 緩沖鹽溶液（tris-buffered saline，TBS）、X 線膠片（美國柯達公司）；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（美國 Millipore 公司）、濾紙（英國 Whatman 公司）；顯影液、定影液（上海冠龍照相器材公司）；預染蛋白 marker（美國 Fermentas 公司）；一抗（美國 Santa Cruz 公司）；辣根過氧化物酶二抗、電化學發光試劑（北京普利萊基因技術有限公司）。
1.3 大鼠顱腦損傷模型構建
實驗前飼養禁食過夜，自由飲水。腹腔注射麻醉（戊巴比妥鈉）后，將大鼠頭部固定。制作 TBI 模型[3]時消毒鋪巾，沿正中線切開頭皮并剝離骨膜，暴露右頂骨，于冠狀縫后 1.5 mm、中線右旁 2.5 mm 處紋式鉗擴大一直徑為 4～5 mm 的圓形骨窗（盡量不弄破骨膜），用 Feeney 法按自由落體致傷原理，將撞桿頭端置骨窗處，另用擊錘（20 g）沿外周導管從 30 cm 高處自由落下撞擊撞桿（撞擊深度 3 mm），造成右頂葉腦挫傷，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。假手術組只開顱不撞擊。72 h（以生物信息學原始數據時間為依據，并結合預實驗選擇時間點）后處死 3 組大鼠取腦組織進行后續實驗。
1.4 免疫組織化學法觀察 YAP1 定位表達
大鼠處死后取腦組織石蠟包埋切片，采用 Envision 二步法染色，操作按照說明書進行，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對照。陽性產物為棕黃色或棕褐色，背景為藍色。
1.5 實時熒光定量 PCR 檢測 YAP1 mRNA 表達
取大鼠損傷腦組織旁 2 mm（大鼠生物信息學原始數據來源于挫傷灶旁組織，在前期預實驗中由于損傷組織破壞嚴重，因此無法滿意進行實驗檢測）組織（每只大鼠腦組織取 3 處），使用 TRIzol 法提取總 RNA，反轉錄反應條件的設置：25℃ 10 min， 42℃ 50 min，85℃ 5 min；熒光定量 PCR 擴增條件的設置：94℃ 4 min；94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s 循環 35 次，72℃ 檢測信號。
設計引物：Yap1正向引物：5’-CCCCAGACG CTGATGAACTC-3’；Yap1反向引物：5’-GGG TCCAGCCAGGATGTG-3’；序列長度：122 bp。β-actin正向引物：5’-CCCATCTATGAGGGT TACGC-3’；β-actin 反向引物：5’-TTTAATGTC ACGCACGATTTC-3’，序列長度 150 bp。相對表達量以 2–??Ct計算。
1.6 蛋白質印跡法檢測 YAP1 的蛋白表達水平
取損傷腦組織旁 2 mm 組織剪切成細小的碎片；每 100 毫克組織加入 1 mL RIPA 裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，上下手動勻漿 20 次；離心，取上清液，蛋白濃度測定、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、孵育一抗（鼠抗 1∶1 000）、孵育二抗（兔抗鼠 1∶5 000）、化學發光，顯影，定影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參。
1.7 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 YAP1 蛋白在顱腦損傷組織中的定位表達情況
大鼠顱腦損傷組織旁神經細胞陽性表現為棕黃色或棕褐色，并呈顆粒狀，背景為藍色。YAP1 蛋白主要在神經細胞細胞質中表達，在顱腦損傷組中較對照組和假手術組表達增多。見圖 1。
圖1
大鼠顱腦損傷后 YAP1 蛋白在神經細胞中的定位表達情況
2.2 實時熒光定量 PCR 檢測 YAP1 mRNA 在顱腦損傷腦組織中的定量表達情況
顱腦損傷后 72 h，與對照組、假手術組相比，實時熒光定量 PCR 檢測顱腦損傷腦組織中 YAP1 mRNA 表達上升至 2.3 倍（P=0.037），見圖 2。
圖2
大鼠顱腦損傷后 YAP1 mRNA 在腦組織中的表達情況
2.3 蛋白質印跡法檢測 YAP1 蛋白在顱腦損傷大鼠腦組織中的表達情況
YAP1 蛋白在顱腦損傷組中較假手術組和對照組表達上升（P=0.029），各組 YAP1/GAPDH 均值比分別為 0.46±0.02、0.32±0.03、0.29±0.03，YAP1 蛋白在顱腦損傷組中的表達量是假手術組的 1.4 倍，對照組的 1.58 倍，差異有統計學意義（P=0.035、0.027）。見圖 3。
圖3
大鼠顱腦損傷后 YAP1 蛋白在腦組織中的定量表達情況
3 討論
目前的顱腦損傷臨床治療還無比較滿意的治療措施[4]。因此，需要對其分子機制做大量工作，開發更多的靶向藥物。有研究表明顱腦損傷與炎癥反應有關，其中涉及有 核因子-κB 通路以及潛在靶標糖原合成酶激酶-3β[5]；JAK/STAT 信號通路，其與細胞凋亡有關[6]；Nrf2 信號通路，可調節抗氧化蛋白表達起防止氧化損傷的作用[7]；β-catenin 信號通路，起到保護神經細胞存活以及神經生長的作用[8-9]。
我們前期通過生物信息學技術研究已發現，Hippo 信號通路在顱腦損傷中表達顯著突出。Hippo 信號通路已在腫瘤、神經系統及炎癥領域被發現有重要的生物學效應。YAP1 作為 Hippo 信號通路中的關鍵轉錄因子，在其被磷酸化后與 TAZ 結合并發生核轉位，促進下游因子的表達發生效應。本研究旨在通過實驗驗證前期生物信息學技術，尋找 YAP1 在大鼠顱腦損傷中的表達情況。構建大鼠顱腦損傷模型（Feeney 法是目前公認的較多的制造顱腦損傷模型方法，對于顱腦損傷研究的模型均是采用此模型方法，其可代表重型顱腦損傷模型），其關鍵基因 YAP1 在基因水平及蛋白水平均有升高，提示其表達可能與顱腦損傷的進一步發生發展有關，但其機制有待進一步研究：其磷酸水平如何，促進下游哪些基因表達？在顱腦損傷過程中起保護還是損傷作用還需要后期進一步深入研究。本研究驗證了我們的前期生物信息學技術篩選的信號通路結果，證實了生物信息學技術篩選的準確性，說明其是一種高效的篩選技術。
Hippo 信號通路作為腫瘤抑制通路[10]，協同細胞增殖、死亡、分化途徑而調節組織生長控制[11-13]。研究認為 Hippo 信號通路在心臟發育、損傷、再生等方面起重要作用[14-15]。Hippo 信號通路具有保守的核心模塊通過對其關鍵蛋白 YAP1/TAZ 的磷酸化而調節組織大小，它還調控非腫瘤疾病組織的大小，同時還在組織損傷后的再生起重要作用[16]。有研究報道 YAP1/TAZ 基因在神經慢性損傷中表達升高，在細胞核內集聚[17]；另有研究發現其參與了阿爾茨海默病疾病過程[18]；研究發現改變大鼠 YAP1 基因將導致大鼠胚胎心臟發育缺陷，暗示其與維持心臟的正常形態有關[19]；而 YAP1 的過表達與心肌細胞增殖有關[20]。另有研究發現 YAP1 與創傷后表皮愈合有關[21]。目前，關于 YAP1 的研究主要集中在腫瘤領域，在非腫瘤疾病中研究較少，而且多為基礎實驗，在顱腦損傷中未見報道。本研究組首次報道發現 YAP1 蛋白在大鼠顱腦損傷中表達上升，但其作用機制有待后期實驗研究。
