引用本文： 陳雪梅, 丁雨, 吳思思. 兩種實時定量聚合酶鏈反應方法檢測血漿微量微 RNA 的比較. 華西醫學, 2017, 32(5): 699-704. doi: 10.7507/1002-0179.201604236 復制
微 RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼的、內源性的小分子 RNA，長約 19～24 nt[1]，主要通過信使 RNA（messenger RNA， mRNA）的直接剪切或間接抑制翻譯，在轉錄后水平調控靶基因的表達[2]。miRNA 在生物發育過程中存在組織特異性表達，參與形成并維持組織特異性。近年來，miRNA 作為新一代腫瘤診斷和分子靶向治療的標志物而成為研究熱點。初級轉錄本 miRNA（primary transcript miRNA，pri-miRNA）在核內經 Drosha 酶和其輔助因子 Pasha 作用處理后成為大約 70 nt 的帶有莖環結構的前體 miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA），這些 pre-miRNA 在 Exportin-5 幫助下轉運到細胞核外，再由細胞質 Dicer 酶進行處理，酶切后成為成熟的 miRNA[3]。因此，miRNA 檢測的重點在于有效地區分其成熟體和前體，加之 miRNA 長度很短，miRNA 的檢測相對 mRNA 難度更大。目前 miRNA 的檢測方法主要有雜交法、微陣列法、實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）法[4]。Northern 雜交法易于操作，但所需樣本量很大，存在錯配等問題；芯片法同樣需要大量的樣本，很難區分 pre-miRNA 與成熟的 miRNA，基因芯片的制作和檢測需要昂貴的儀器設備，重復性較差[5]。
關于癌癥特異性 miRNA 表達的早期研究僅限于腫瘤組織樣品，在癌癥組織中異常表達的許多 miRNA 在癌癥發生和發展中具有重要作用，組織樣本不容易獲得，這阻礙了 miRNA 在各類癌癥診斷和預后中的應用。研究表明，miRNA 是血液中小核苷酸物質的主要部分，能抵抗消化酶核糖核酸酶A[6]。miRNA 可穩定地存在于血液中，尤其在惡性腫瘤患者的血清中，其表達水平可為臨床檢測提供依據，用于腫瘤患者早期診斷[7]。研究發現 miR-200b 與 miR-126 在胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌等組織中表達量有明顯變化[8-9]，miR-126 過表達可抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲[8]；另外，胃癌患者血清 miR-200b 水平明顯降低，并且與臨床分期和淋巴結轉移密切相關[10]。miRNA 與很多生理病理現象密切相關，加之血液標本采集相對方便，具無創性，故血液 miRNA 檢測有望成為疾病早期診斷及預后判斷的無創性生物標志物[11]。
莖環和多腺苷酸聚合酶（poly A polymerase，PAP）實時定量法目前已成為研究 miRNA 常用的檢測方法[12]。兩種方法原理不同，各具優缺點，對于微量 miRNA 的檢測，相關的選擇原則目前還未見文獻報道。而關于 miRNA 檢測的內參選擇鮮有報道，至今無統一規范，常見的內參基因包括：5SrRNA、U6 核內小分子 RNA（SnRNA）、同種屬的 RNA（miR-103）[13]，本實驗針對常用的內參基因 U6 和同一種屬的 miRNA 進行了內參穩定性的對比，并通過莖環和 PAP 實時定量 PCR 法建立一套穩定可行的血液微量樣本 miR-200b 和 miR-126 的檢測方法。本實驗取 1.5 mL 大鼠全血分離血漿，提取<200 bp 的 miRNA，再使用莖環和 PAP 加尾 2 種方法分別進行逆轉錄、熒光定量 PCR 檢測，并在靈敏度、特異度、引物擴增效率、內參穩定性、操作繁復等方面進行綜合比較，希望為更多科研工作者提供更好的選擇依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
選擇成年遠交群（Sprague Dawley，SD）大鼠急性胰腺炎造模后 2、12、24 h 的血液樣本 3 例、人源結腸管狀腺瘤組織 1 例（標本取自四川大學華西醫院消化內科收治患者，已確診，男性，57 歲）。
試劑：miRNA 提取試劑盒 mirVanaTM miRNA Isolation Kit（AM1561、AM1560，美國 Ambion 公司），PAP 法檢測試劑盒：miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR Starter kit（158001，丹麥Exiqon 公司）、miDETECT A TrackTM miRNA qRT-PCR Starter Kit（N1208，廣州銳博生物科技有限公司）；逆轉錄酶（c81401190，美國 Invitrogen 公司），SYBR Green Super mix （420638，美國 Bio-Rad 公司），莖環實時定量 PCR 法相關引物由成都擎科生物科技有限公司合成，序列如表 1。
表1
莖環實時定量 PCR 引物
1.2 方法
1.2.1 miRNA 提取 ① 大鼠血液組織：成年 SD 大鼠處死后及時進行膽道采血，使用抗凝采血管收集大鼠急性胰腺炎造模后 2、12、24 h 的血液 1.5 mL，4 500 r/min，4℃，15 min 離心，收集血漿，加等體積裂解液，再加入等體積酚氯仿抽提，2 次乙醇沉淀，過柱純化得到<200 bp 的 miRNA，存于–80℃。
② 人結腸管狀腺瘤組織：組織取樣后立即存于–80°冰箱，采用液氮研磨的方式破碎組織，加入 500 μL 裂解液，其次加入 1/10 倍體積的 miRNA Homogenate Additive，冰上裂解 10 min，再加入等體積酚氯仿抽提，2 次乙醇沉淀，過柱純化得到<200 bp 的 miRNA，存于–80℃。
③ RNA 濃度及純度鑒定：采用 Thermo Nano Drop 2000 全波長酶標儀測定 RNA 濃度及純度，根據 MIQE 實時熒光定量 PCR 國際化標準，RNA 純度在 1.8～2.0 之間；15% 聚丙烯酰胺變性凝膠電泳鑒定 RNA 完整性，Bio-Rad ChemiDoc MP imaging system 成像。
④ RNA 逆轉錄血液樣本：miRNA 經 PAP 加尾逆轉錄參照 miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR Starter kit 說明書合成互補 DNA（complementary DNA，cDNA），管狀腺瘤組織 miRNA 加尾逆轉錄參照 miDETECT A TrackTM miRNA qRT-PCR Starter Kit 說明書；莖環法逆轉錄 miRNA 樣本使用美國 Invitrogen 公司逆轉錄酶進行逆轉，莖環逆轉錄引物 2 μL（10 μmol/L），分別加入特異引物逆轉錄 miRNA。
1.2.2 實時 PCR 2×SYBR Green super Mix 10 μL；正向引物（10 μmol/L）1 μL；反向引物（10 μmol/L）1 μL；待測模板 2 μL；無核酸酶水補至 20 μL。Bio-Rad CFX96 實時定量 PCR 檢測程序：95℃10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，循環 40 次；循環結束后從 65℃ 開始每 5 秒上升 0.5℃ 取熒光值繪制溶解曲線確定擴增產物的特異性。
1.2.3 觀察指標 實時熒光定量 PCR 檢測 rno-miR-200b、rno-miR-126、U6、rno-miR-103a、has-miR-1，根據檢測樣本的引物擴增效率和熔解曲線確定熒光定量 PCR 的特異度及可靠性，根據 MIQE 實時熒光定量 PCR 國際化標準，引物擴增效率需在 90%～105% 之間，同時熔解曲線需為特異單峰；莖環法和 PAP 法靈敏度比較，即為能夠檢測到的最低 RNA 濃度，取 12 h 血液樣本逆轉錄合成的 cDNA 按 10 倍濃度依次倍比稀釋，最終稀釋 105 倍，取不同稀釋比例的 cDNA 為模板進行熒光定量 PCR 反應，分別檢測 rno-miR-200b 和 rno-miR-126 能檢測到循環閾值（cycle threshold，Ct ）的最大稀釋比例。采用 rno-miR-103a-3p 和 U6 作為內參，采用 2△Ct 法計算比較兩種實時定量方法和內參的選擇。
2 結果
2.1 miRNA 濃度及完整性檢測
提取 1.5 mL 成年 SD 大鼠血液中的 miRNA（<200 bp），可見血漿 miRNA 條帶極其微弱，標示量很少，而腺瘤 miRNA 的條帶明顯（圖 1）。血液樣本 RNA 濃度為 12.6～33.8 ng/μL，濃度偏低；而腺瘤組織濃度達到 165.3 ng/μL。樣品純度在 2.01～2.10 之間，純度基本達實驗要求。見表 2。
圖1
15% 聚丙烯酰胺變性凝膠檢測 miRNA 完整性電泳圖
表2
miRNA 濃度及純度
2.2 靈敏度比較
分別采用莖環法和 PAP 加尾法檢測血液中 miRNA 含量。莖環法檢測血漿中 rno-miR-126 時 Ct 值在 25.97～28.42，而 PAP 法檢測 rno-miR-126 時 Ct 值在 28.42～32.26，莖環法的檢測效率高出約 12倍；血漿中 rno-miR-200b 和 rno-miR-126 莖環法擴增效率分別為 97% 和 98%，而 PAP 法擴增效率分別為 108% 和 126%。見表 3。
表3
樣本檢測結果（Ct值）（n=3，
）
挑取 12 h 血液樣本使用莖環法和 PAP 法 RNA 逆轉錄合成 cDNA，分別 10 倍倍比稀釋 cDNA 樣本，進行實時熒光定量 PCR 反應，可見針對同一 cDNA 模板檢測 rno-miR-200b，稀釋 100 倍后，PAP 法已檢測不到 Ct 值；檢測 rno-miR-126 時，cDNA 稀釋 104 倍后，PAP 法檢測不到 Ct 值。按 100% 的逆轉錄效率換算，莖環法得到 rno-miR-200b 和 rno-miR-126 的 RNA 的最低檢測限分別為 3.3×10–1 ng/μL 和 3.3×10–3 ng/μL；PAP 法得到 rno-miR-200b 和 rno-miR-126 的 RNA 的最低檢測限分別為 3.3 ng/μL 和 3.3×10–2 ng/μL。與 PAP 法比較，莖環法在 rno-miR-200b 和 rno-miR-126 的檢測靈敏度增加了 10 倍。見表 4。
表4
熒光定量 PCR 檢測靈敏度比較（Ct值）（n=3，
）
2.3 引物特異性比較
采用莖環法和 PAP 法在檢測血液樣本 miRNA 表達量時的 PCR 產物特異性比較，可見 PAP 法（A）出現了雙峰，PCR 過程中存在非特異擴增，產物不特異，引物特異性較差；而莖環法熔解曲線（B）的峰型為單峰，PCR 產物單一，引物特異。見圖 2。
圖2
Bio-Rad CFX manager 軟件溶解曲線分析圖
黑線 A 代表 PAP 實時定量 PCR 法產物溶解曲線峰圖；黑線 B 代表莖環實時定量 PCR 法熔解曲線峰圖；橫線為檢測基線，處于基線以上的擴增方可認為是有效擴增，基線以下為無效擴增
2.4 參照基因比較
莖環法和 PAP 法分別檢測內參基因 rno-miR-103a 和 U6 的穩定性。莖環法或 PAP 法分別檢測 rno-mir-103a 內參基因的表達，Ct 值的范圍分別是 25.31～28.93 和 24.73～35.18 ，效率分別是 97% 和 95%。而 U6 作為內參時 Ct 值的范圍是 19.24～20.18。可見莖環法在靈敏度上優于 PAP 加尾法，U6 作為內參 Ct 值比較一致，重復性好，穩定性高。見表 5。
表5
內參比較（Ct值）（n=3，
）
2.5 miRNA 含量豐富的人源組織檢測
取人來源的結腸管狀腺瘤組織 1 例，使用美國 Ambion 公司的 miRNA 提取試劑盒提取 miRNA，其 RNA 濃度遠遠高于成年 SD 大鼠血漿中提取得量，分別采用莖環法和 PAP 加尾法進行 miRNA 逆轉錄，結果用莖環法和 PAP 加尾法檢測 hsa-miR-1-3p 的 Ct 值分別為 28.06 和 28.25，兩種方法均能在富含 miRNA 的組織中達到很好的檢測效果，同時 PCR 擴增效率分別為 96.4% 和 93.2%。
3 討論
miRNA 廣泛存在于生物體中，調控靶基因的表達，外周血中的循環 miRNA 被認為是一種極具潛力的診斷腫瘤等疾病和判斷預后的分子標志物[14]，因而針對 miRNA 的研究必不可少，選擇適當的檢測方法尤為重要。本實驗采用目前最常用的實時定量 PCR 技術在方法學上進行相關的探究，發現莖環實時定量 PCR 法適合檢測 miRNA 豐度很低的血液樣本，而 PAP 加尾實時定量 PCR 法更適合于大樣本量和高豐量樣本的 miRNA 檢測。在內參選擇上，U6 內參適合于所有豐度類型的樣本。
進行 miRNA 的實時定量 PCR 檢測，首先必須得到高質量的 miRNA。Gilad 等[15]將血清樣本置于室溫 4 h 后檢測其 miRNA，發現與立刻檢測樣本相比 miRNA 量并未發生顯著改變；而且即便血清經過 2 次凍融處理，miRNA 的量只是稍有變化，也并不影響對疾病的診斷。Chen 等[16]也探索了極端條件下血清 miRNA 的穩定性，發現將 miRNA 置于 pH 值為 1 和 13 的環境中處理 3 h，血清中 miRNA 仍表現出良好的穩定性。也有研究者嘗試采用體液中生物分子進行標準化，如血液和尿液中采用肌酐進行標準化，值得進一步深入研究。本實驗成年 SD 大鼠采全血 1.5 mL，由于血漿中的 miRNA 含量非常低，實際操作時可以適當增加血量，切忌出現凝血的現象，已有文獻報道，選擇乙二胺四乙酸作為抗凝劑更好，因為肝素抗凝會抑制 miRNA 的定量檢測[17]，若采到的全血發黑，或者有血凝塊，基本上不能提取出有效濃度的 miRNA；最后要選擇提取效率較高的試劑，本實驗選擇美國 Ambion 公司的 miRNA 提取試劑盒，在提取過程中仍然有很多需要注意的細節，尤其是 2 次沉淀，必須嚴格按照體積比加入無水乙醇。
目前對于 miRNA 內參的選擇并無統一的標準，有文獻指出選擇同種屬表達量恒定的 miRNA 作為內參定量可能更準確[5]，也有文獻報道可以在 RNA 提取時加入人工合成的 cel-miR-39，用以控制實驗誤差[17]。在內參的選擇方面，本實驗比較了最常用的 2 種 miRNA 定量的內參——U6 和 rno-miR-103a，進行 2 種內參在不同病變時間的血液樣本中表達穩定性的探究，結果顯示，U6 的表達量較為恒定，而無論是采用莖環法還是 PAP 加尾法檢測 rno-miR-103a，其 Ct 值波動范圍均較大，且 rno-miR-103a 的檢測結果也表明了莖環法在檢測靈敏度上的優勢。總體來說，本實驗血液中微量 miRNA 的檢測更適合選擇 U6 作為內參進行相對定量。在實際研究過程中，建議先選擇 2～3 種內參進行穩定性以及定量準確性的摸索，最終選擇一個最合適的內參。
本實驗采用了 2 種不同的方法進行 miRNA 的逆轉錄，人為地延長了逆轉錄產物的長度，達到了檢測目的，莖環法的引物[18]可以有效地區分 miRNA 前體與成熟體，3′末端加入的逆轉錄莖環序列適用于各種屬來源 miRNA 的檢測，靈敏度高，特異性好，擴增效率接近 100%，在檢測低豐度 miRNA 的樣品時具有很強的可選擇性，但其缺點在于操作繁瑣，耗時長，不適用于大量樣本的檢測，雖然 PAP 加尾法的特異性及靈敏度稍差，極低豐度 miRNA 可能檢測不出，或者不能得到準確有效的檢測結果，但在檢測較高豐度 miRNA 時，該方法也能達到很好的檢測目的，考慮到人力物力成本、檢測通量及檢測時效性方面，PAP 加尾法更適合于大量的組織樣本的檢測。實時熒光定量 PCR 法包括染料法和探針法[19]，探針法主要采用 TaqMan 熒光探針，特異性高于染料法，但其成本也高，本實驗采用的莖環法相對更具優勢。
莖環實時定量PCR 法鑒定出的引物能夠較為有效地檢測樣本中目標 miRNA 的表達量，同時 U6 內參的選擇能夠真實地進行校正，以上方法的建立及內參的選擇為今后各類型微量 miRNA 的表達研究奠定了基礎。
微 RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼的、內源性的小分子 RNA，長約 19～24 nt[1]，主要通過信使 RNA（messenger RNA， mRNA）的直接剪切或間接抑制翻譯，在轉錄后水平調控靶基因的表達[2]。miRNA 在生物發育過程中存在組織特異性表達，參與形成并維持組織特異性。近年來，miRNA 作為新一代腫瘤診斷和分子靶向治療的標志物而成為研究熱點。初級轉錄本 miRNA（primary transcript miRNA，pri-miRNA）在核內經 Drosha 酶和其輔助因子 Pasha 作用處理后成為大約 70 nt 的帶有莖環結構的前體 miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA），這些 pre-miRNA 在 Exportin-5 幫助下轉運到細胞核外，再由細胞質 Dicer 酶進行處理，酶切后成為成熟的 miRNA[3]。因此，miRNA 檢測的重點在于有效地區分其成熟體和前體，加之 miRNA 長度很短，miRNA 的檢測相對 mRNA 難度更大。目前 miRNA 的檢測方法主要有雜交法、微陣列法、實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）法[4]。Northern 雜交法易于操作，但所需樣本量很大，存在錯配等問題；芯片法同樣需要大量的樣本，很難區分 pre-miRNA 與成熟的 miRNA，基因芯片的制作和檢測需要昂貴的儀器設備，重復性較差[5]。
關于癌癥特異性 miRNA 表達的早期研究僅限于腫瘤組織樣品，在癌癥組織中異常表達的許多 miRNA 在癌癥發生和發展中具有重要作用，組織樣本不容易獲得，這阻礙了 miRNA 在各類癌癥診斷和預后中的應用。研究表明，miRNA 是血液中小核苷酸物質的主要部分，能抵抗消化酶核糖核酸酶A[6]。miRNA 可穩定地存在于血液中，尤其在惡性腫瘤患者的血清中，其表達水平可為臨床檢測提供依據，用于腫瘤患者早期診斷[7]。研究發現 miR-200b 與 miR-126 在胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌等組織中表達量有明顯變化[8-9]，miR-126 過表達可抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲[8]；另外，胃癌患者血清 miR-200b 水平明顯降低，并且與臨床分期和淋巴結轉移密切相關[10]。miRNA 與很多生理病理現象密切相關，加之血液標本采集相對方便，具無創性，故血液 miRNA 檢測有望成為疾病早期診斷及預后判斷的無創性生物標志物[11]。
莖環和多腺苷酸聚合酶（poly A polymerase，PAP）實時定量法目前已成為研究 miRNA 常用的檢測方法[12]。兩種方法原理不同，各具優缺點，對于微量 miRNA 的檢測，相關的選擇原則目前還未見文獻報道。而關于 miRNA 檢測的內參選擇鮮有報道，至今無統一規范，常見的內參基因包括：5SrRNA、U6 核內小分子 RNA（SnRNA）、同種屬的 RNA（miR-103）[13]，本實驗針對常用的內參基因 U6 和同一種屬的 miRNA 進行了內參穩定性的對比，并通過莖環和 PAP 實時定量 PCR 法建立一套穩定可行的血液微量樣本 miR-200b 和 miR-126 的檢測方法。本實驗取 1.5 mL 大鼠全血分離血漿，提取<200 bp 的 miRNA，再使用莖環和 PAP 加尾 2 種方法分別進行逆轉錄、熒光定量 PCR 檢測，并在靈敏度、特異度、引物擴增效率、內參穩定性、操作繁復等方面進行綜合比較，希望為更多科研工作者提供更好的選擇依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
選擇成年遠交群（Sprague Dawley，SD）大鼠急性胰腺炎造模后 2、12、24 h 的血液樣本 3 例、人源結腸管狀腺瘤組織 1 例（標本取自四川大學華西醫院消化內科收治患者，已確診，男性，57 歲）。
試劑：miRNA 提取試劑盒 mirVanaTM miRNA Isolation Kit（AM1561、AM1560，美國 Ambion 公司），PAP 法檢測試劑盒：miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR Starter kit（158001，丹麥Exiqon 公司）、miDETECT A TrackTM miRNA qRT-PCR Starter Kit（N1208，廣州銳博生物科技有限公司）；逆轉錄酶（c81401190，美國 Invitrogen 公司），SYBR Green Super mix （420638，美國 Bio-Rad 公司），莖環實時定量 PCR 法相關引物由成都擎科生物科技有限公司合成，序列如表 1。
表1
莖環實時定量 PCR 引物
1.2 方法
1.2.1 miRNA 提取 ① 大鼠血液組織：成年 SD 大鼠處死后及時進行膽道采血，使用抗凝采血管收集大鼠急性胰腺炎造模后 2、12、24 h 的血液 1.5 mL，4 500 r/min，4℃，15 min 離心，收集血漿，加等體積裂解液，再加入等體積酚氯仿抽提，2 次乙醇沉淀，過柱純化得到<200 bp 的 miRNA，存于–80℃。
② 人結腸管狀腺瘤組織：組織取樣后立即存于–80°冰箱，采用液氮研磨的方式破碎組織，加入 500 μL 裂解液，其次加入 1/10 倍體積的 miRNA Homogenate Additive，冰上裂解 10 min，再加入等體積酚氯仿抽提，2 次乙醇沉淀，過柱純化得到<200 bp 的 miRNA，存于–80℃。
③ RNA 濃度及純度鑒定：采用 Thermo Nano Drop 2000 全波長酶標儀測定 RNA 濃度及純度，根據 MIQE 實時熒光定量 PCR 國際化標準，RNA 純度在 1.8～2.0 之間；15% 聚丙烯酰胺變性凝膠電泳鑒定 RNA 完整性，Bio-Rad ChemiDoc MP imaging system 成像。
④ RNA 逆轉錄血液樣本：miRNA 經 PAP 加尾逆轉錄參照 miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR Starter kit 說明書合成互補 DNA（complementary DNA，cDNA），管狀腺瘤組織 miRNA 加尾逆轉錄參照 miDETECT A TrackTM miRNA qRT-PCR Starter Kit 說明書；莖環法逆轉錄 miRNA 樣本使用美國 Invitrogen 公司逆轉錄酶進行逆轉，莖環逆轉錄引物 2 μL（10 μmol/L），分別加入特異引物逆轉錄 miRNA。
1.2.2 實時 PCR 2×SYBR Green super Mix 10 μL；正向引物（10 μmol/L）1 μL；反向引物（10 μmol/L）1 μL；待測模板 2 μL；無核酸酶水補至 20 μL。Bio-Rad CFX96 實時定量 PCR 檢測程序：95℃10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，循環 40 次；循環結束后從 65℃ 開始每 5 秒上升 0.5℃ 取熒光值繪制溶解曲線確定擴增產物的特異性。
1.2.3 觀察指標 實時熒光定量 PCR 檢測 rno-miR-200b、rno-miR-126、U6、rno-miR-103a、has-miR-1，根據檢測樣本的引物擴增效率和熔解曲線確定熒光定量 PCR 的特異度及可靠性，根據 MIQE 實時熒光定量 PCR 國際化標準，引物擴增效率需在 90%～105% 之間，同時熔解曲線需為特異單峰；莖環法和 PAP 法靈敏度比較，即為能夠檢測到的最低 RNA 濃度，取 12 h 血液樣本逆轉錄合成的 cDNA 按 10 倍濃度依次倍比稀釋，最終稀釋 105 倍，取不同稀釋比例的 cDNA 為模板進行熒光定量 PCR 反應，分別檢測 rno-miR-200b 和 rno-miR-126 能檢測到循環閾值（cycle threshold，Ct ）的最大稀釋比例。采用 rno-miR-103a-3p 和 U6 作為內參，采用 2△Ct 法計算比較兩種實時定量方法和內參的選擇。
2 結果
2.1 miRNA 濃度及完整性檢測
提取 1.5 mL 成年 SD 大鼠血液中的 miRNA（<200 bp），可見血漿 miRNA 條帶極其微弱，標示量很少，而腺瘤 miRNA 的條帶明顯（圖 1）。血液樣本 RNA 濃度為 12.6～33.8 ng/μL，濃度偏低；而腺瘤組織濃度達到 165.3 ng/μL。樣品純度在 2.01～2.10 之間，純度基本達實驗要求。見表 2。
圖1
15% 聚丙烯酰胺變性凝膠檢測 miRNA 完整性電泳圖
表2
miRNA 濃度及純度
2.2 靈敏度比較
分別采用莖環法和 PAP 加尾法檢測血液中 miRNA 含量。莖環法檢測血漿中 rno-miR-126 時 Ct 值在 25.97～28.42，而 PAP 法檢測 rno-miR-126 時 Ct 值在 28.42～32.26，莖環法的檢測效率高出約 12倍；血漿中 rno-miR-200b 和 rno-miR-126 莖環法擴增效率分別為 97% 和 98%，而 PAP 法擴增效率分別為 108% 和 126%。見表 3。
表3
樣本檢測結果（Ct值）（n=3，
）
挑取 12 h 血液樣本使用莖環法和 PAP 法 RNA 逆轉錄合成 cDNA，分別 10 倍倍比稀釋 cDNA 樣本，進行實時熒光定量 PCR 反應，可見針對同一 cDNA 模板檢測 rno-miR-200b，稀釋 100 倍后，PAP 法已檢測不到 Ct 值；檢測 rno-miR-126 時，cDNA 稀釋 104 倍后，PAP 法檢測不到 Ct 值。按 100% 的逆轉錄效率換算，莖環法得到 rno-miR-200b 和 rno-miR-126 的 RNA 的最低檢測限分別為 3.3×10–1 ng/μL 和 3.3×10–3 ng/μL；PAP 法得到 rno-miR-200b 和 rno-miR-126 的 RNA 的最低檢測限分別為 3.3 ng/μL 和 3.3×10–2 ng/μL。與 PAP 法比較，莖環法在 rno-miR-200b 和 rno-miR-126 的檢測靈敏度增加了 10 倍。見表 4。
表4
熒光定量 PCR 檢測靈敏度比較（Ct值）（n=3，
）
2.3 引物特異性比較
采用莖環法和 PAP 法在檢測血液樣本 miRNA 表達量時的 PCR 產物特異性比較，可見 PAP 法（A）出現了雙峰，PCR 過程中存在非特異擴增，產物不特異，引物特異性較差；而莖環法熔解曲線（B）的峰型為單峰，PCR 產物單一，引物特異。見圖 2。
圖2
Bio-Rad CFX manager 軟件溶解曲線分析圖
黑線 A 代表 PAP 實時定量 PCR 法產物溶解曲線峰圖；黑線 B 代表莖環實時定量 PCR 法熔解曲線峰圖；橫線為檢測基線，處于基線以上的擴增方可認為是有效擴增，基線以下為無效擴增
2.4 參照基因比較
莖環法和 PAP 法分別檢測內參基因 rno-miR-103a 和 U6 的穩定性。莖環法或 PAP 法分別檢測 rno-mir-103a 內參基因的表達，Ct 值的范圍分別是 25.31～28.93 和 24.73～35.18 ，效率分別是 97% 和 95%。而 U6 作為內參時 Ct 值的范圍是 19.24～20.18。可見莖環法在靈敏度上優于 PAP 加尾法，U6 作為內參 Ct 值比較一致，重復性好，穩定性高。見表 5。
表5
內參比較（Ct值）（n=3，
）
2.5 miRNA 含量豐富的人源組織檢測
取人來源的結腸管狀腺瘤組織 1 例，使用美國 Ambion 公司的 miRNA 提取試劑盒提取 miRNA，其 RNA 濃度遠遠高于成年 SD 大鼠血漿中提取得量，分別采用莖環法和 PAP 加尾法進行 miRNA 逆轉錄，結果用莖環法和 PAP 加尾法檢測 hsa-miR-1-3p 的 Ct 值分別為 28.06 和 28.25，兩種方法均能在富含 miRNA 的組織中達到很好的檢測效果，同時 PCR 擴增效率分別為 96.4% 和 93.2%。
3 討論
miRNA 廣泛存在于生物體中，調控靶基因的表達，外周血中的循環 miRNA 被認為是一種極具潛力的診斷腫瘤等疾病和判斷預后的分子標志物[14]，因而針對 miRNA 的研究必不可少，選擇適當的檢測方法尤為重要。本實驗采用目前最常用的實時定量 PCR 技術在方法學上進行相關的探究，發現莖環實時定量 PCR 法適合檢測 miRNA 豐度很低的血液樣本，而 PAP 加尾實時定量 PCR 法更適合于大樣本量和高豐量樣本的 miRNA 檢測。在內參選擇上，U6 內參適合于所有豐度類型的樣本。
進行 miRNA 的實時定量 PCR 檢測，首先必須得到高質量的 miRNA。Gilad 等[15]將血清樣本置于室溫 4 h 后檢測其 miRNA，發現與立刻檢測樣本相比 miRNA 量并未發生顯著改變；而且即便血清經過 2 次凍融處理，miRNA 的量只是稍有變化，也并不影響對疾病的診斷。Chen 等[16]也探索了極端條件下血清 miRNA 的穩定性，發現將 miRNA 置于 pH 值為 1 和 13 的環境中處理 3 h，血清中 miRNA 仍表現出良好的穩定性。也有研究者嘗試采用體液中生物分子進行標準化，如血液和尿液中采用肌酐進行標準化，值得進一步深入研究。本實驗成年 SD 大鼠采全血 1.5 mL，由于血漿中的 miRNA 含量非常低，實際操作時可以適當增加血量，切忌出現凝血的現象，已有文獻報道，選擇乙二胺四乙酸作為抗凝劑更好，因為肝素抗凝會抑制 miRNA 的定量檢測[17]，若采到的全血發黑，或者有血凝塊，基本上不能提取出有效濃度的 miRNA；最后要選擇提取效率較高的試劑，本實驗選擇美國 Ambion 公司的 miRNA 提取試劑盒，在提取過程中仍然有很多需要注意的細節，尤其是 2 次沉淀，必須嚴格按照體積比加入無水乙醇。
目前對于 miRNA 內參的選擇并無統一的標準，有文獻指出選擇同種屬表達量恒定的 miRNA 作為內參定量可能更準確[5]，也有文獻報道可以在 RNA 提取時加入人工合成的 cel-miR-39，用以控制實驗誤差[17]。在內參的選擇方面，本實驗比較了最常用的 2 種 miRNA 定量的內參——U6 和 rno-miR-103a，進行 2 種內參在不同病變時間的血液樣本中表達穩定性的探究，結果顯示，U6 的表達量較為恒定，而無論是采用莖環法還是 PAP 加尾法檢測 rno-miR-103a，其 Ct 值波動范圍均較大，且 rno-miR-103a 的檢測結果也表明了莖環法在檢測靈敏度上的優勢。總體來說，本實驗血液中微量 miRNA 的檢測更適合選擇 U6 作為內參進行相對定量。在實際研究過程中，建議先選擇 2～3 種內參進行穩定性以及定量準確性的摸索，最終選擇一個最合適的內參。
本實驗采用了 2 種不同的方法進行 miRNA 的逆轉錄，人為地延長了逆轉錄產物的長度，達到了檢測目的，莖環法的引物[18]可以有效地區分 miRNA 前體與成熟體，3′末端加入的逆轉錄莖環序列適用于各種屬來源 miRNA 的檢測，靈敏度高，特異性好，擴增效率接近 100%，在檢測低豐度 miRNA 的樣品時具有很強的可選擇性，但其缺點在于操作繁瑣，耗時長，不適用于大量樣本的檢測，雖然 PAP 加尾法的特異性及靈敏度稍差，極低豐度 miRNA 可能檢測不出，或者不能得到準確有效的檢測結果，但在檢測較高豐度 miRNA 時，該方法也能達到很好的檢測目的，考慮到人力物力成本、檢測通量及檢測時效性方面，PAP 加尾法更適合于大量的組織樣本的檢測。實時熒光定量 PCR 法包括染料法和探針法[19]，探針法主要采用 TaqMan 熒光探針，特異性高于染料法，但其成本也高，本實驗采用的莖環法相對更具優勢。
莖環實時定量PCR 法鑒定出的引物能夠較為有效地檢測樣本中目標 miRNA 的表達量，同時 U6 內參的選擇能夠真實地進行校正，以上方法的建立及內參的選擇為今后各類型微量 miRNA 的表達研究奠定了基礎。
