脊髓損傷是一種全球高發病率、高致殘性和高死亡率的中樞神經系統疾病，不僅嚴重降低患者的生存質量，還給家庭、社會帶來巨大的負擔。脊髓損傷后的細胞應答和生物化學紊亂等病理改變主要依賴于特異性基因的表達或抑制。而微RNA（miRNA）在脊髓損傷后基因表達起著重要的開關作用。miRNA是真核生物中的一類由內源基因編碼的長度為18～25個核苷酸的非編碼RNA。它們在轉錄后水平調控基因表達，在脊椎動物脊髓損傷后病理調控中起重要作用。miRNA能成為調控細胞狀態和分子機制，提高脊髓損傷后功能恢復的有效治療工具。該文主要就miRNA在脊髓損傷后的表達變化及其在脊髓損傷后病理改變過程中的作用予以綜述，探討基于miRNA治療脊髓損傷的可行性，以期改善脊髓損傷的臨床預后。
引用本文： 賀琴琴, 王廷華, 羅朝志. 微RNA在脊髓損傷中的作用及研究進展. 華西醫學, 2016, 31(10): 1782-1789. doi: 10.7507/1002-0179.201600490 復制
脊髓損傷是由各種原因引起的脊髓結構、功能的損害，造成損傷水平以下不同程度的運動、感覺和自主神經功能障礙。在世界范圍內脊髓損傷對臨床醫生仍是巨大挑戰，其高致殘率和高致死率不僅對患者及家庭造成巨大傷害，也給社會帶來沉重的經濟負擔。脊髓損傷一方面因脊髓神經元和血管直接破壞造成原發性損傷，另一方面，在原發性脊髓損傷的基礎之上，還有因多種因素參與出現的序列性組織自毀性的繼發性損傷。繼發性損傷的機制較多，主要有血管機制、自由基氧化學說、氨基酸學說、鈣介導機制、電介質失衡、細胞凋亡等機制等。
近年來研究發現，微RNA（miRNA）可在轉錄后水平調控脊髓損傷后成千上百個基因表達，進而調控細胞狀態和功能，被公認為脊髓損傷后病理生理改變的重要行動者。miRNA是由19～23個核苷酸組成的非編碼RNA，在脊髓損傷后多個生物學過程中發揮重要調控作用，包括神經再生、細胞凋亡和線粒體功能等。由于單個miRNA可以影響到參與單一通路的很多基因，基于miRNA的治療比起靶向于該通路的其他一些致病基因的療法要更優。miRNA作為治療靶點和生物標志物的價值已被公認。探索特定miRNA在脊髓損傷后的分子調控機制，將能夠為臨床上治療脊髓損傷提供新的靶點。現就miRNA在脊髓損傷后的表達變化及其在脊髓損傷后病理改變過程中的作用予以綜述。
1 miRNA的生物學特點
miRNA來源于真核細胞核內內含子編碼，通過RNA聚合酶Ⅱ轉錄產生原始miRNA轉錄本（pri-miRNA），之后在核糖核酸酶Ⅲ Drosha和RNA綁定蛋白-DGCR8剪切下形成約60～70個核苷酸的發卡狀miRNA，稱為前體miRNA（pre-miRNA）[1-2]。隨后，核輸出蛋白Exportin5和Ran-GTP將pre-miRNA轉運至細胞質[3]，由另一個核糖核酸酶Ⅲ Dicer進一步剪切形成20～24個堿基對的雙鏈RNA。這種雙鏈RNA很快被載入RNA誘導沉默復合體（RISC）中，使其中一條單鏈miRNA被降解，另一條成熟的單鏈miRNA分子通過與靶基因mRNA序列互補配對，來調節基因的表達[4]。阻斷或下調miRNA生物合成過程中的關鍵蛋白，如Dicer、Drosha、DGCR8或Exportin5將導致成熟miRNA的降低而pri-miRNA和pre-miRNA的增加[5]。
隨著miRNA的實時定量聚合酶鏈反應、原位雜交技術及miRNA芯片等高通量檢測技術的發展，目前已可以簡便準確地篩查出不同疾病過程中的miRNA表達變化。從最初在線蟲中發現miRNA至今，miRNA序列數據庫miRBase收錄了近3萬個miRNA，其中在人類發現并命名的miRNA超過了1萬個。至少1/3的人類基因與miRNA調控相關，miRNA參與了幾乎所有目前發現的細胞生物活動過程[6]。成熟miRNA與Dicer及Argonaute蛋白等組裝形成RISC對靶基因mRNA具有多種基因調控方式，最常見的基因調控方式為與靶基因mRNA的3’非翻譯區（UTR）互補結合。根據互補程度的不同可抑制靶基因mRNA翻譯，降解，切割靶基因mRNA或導致靶基因甲基化，在轉錄后水平對靶基因進行調節[7]。此外，miRNA也可以與靶基因mRNA的5’UTR[8]、DNA[9]和蛋白質[9]等結合抑制或促進特異性靶基因的表達。
2 miRNA在脊髓損傷后的表達特點
miRNA在脊髓中的表達極為豐富，約有77%已確定的大鼠成熟miRNA可在脊髓中表達[10]。其中大量miRNA，例如miR-1、miR-10a、miR-10b、miR-34a、miR-133a、miR-133b、miR-142-3p、miR-199、miR-219、miR-338、miR-451、miR-486等在脊髓中表達量極高[11-12]。截至2015年11月，已經有84篇研究分析了miRNA在脊髓損傷后的表達及功能。這些研究結果表明miRNA在脊髓損傷后，無論miRNA數目還是miRNA種類都具有顯著的差異[13-16]。這些差異可歸結于脊髓損傷模型的不同，如缺血-再灌注、脊髓全橫斷損傷及脊髓挫傷等[14-18]。其次，miRNA表達隨著脊髓損傷后不同時點呈現動態變化過程。表 1列出了miRNA在鼠科脊髓損傷模型中各時點的動態變化，尤以損傷后第7天miRNA表達降低最為明顯，而脊髓損傷后7 d運動功能也逐漸恢復，這也進一步說明miRNA與脊髓損傷后神經修復的調控密切相關。
表1
大鼠脊髓損傷模型中miRNA各時點的表達變化
實驗動物的不同（如大鼠、小鼠）同樣影響脊髓損傷后的miRNA表達差異[17, 19]。miRNA表達的差異也正恰好反映了不同脊髓損傷的特點，其中損傷嚴重程度是一個重要影響因素，例如miR-129-2和miR-146a被證實與脊髓損傷后的神經功能評分密切相關[17]。此外，在脊椎動物進化過程中，miRNA在脊髓中的表達還具有組織特異性和種屬保守性[19]。這也是miRNA參與脊髓損傷后復雜基因調控、改變特定細胞狀態與功能，決定細胞命運的基礎。Natera-Naranjo等[20]發現miR-15b、miR-16、miR-204和miR-221在交感神經元的遠端軸突表達豐富，調控軸突的蛋白合成，在維持軸突結構功能，神經細胞生長發育過程中起重要作用。miR-125b和miR-124可以誘導骨髓間充質干細胞向神經元分化，促進脊髓損傷后神經干細胞向神經元分化，在神經元分化過程中促進神經軸突生長，在脊髓損傷后神經修復過程中起重要作用[21-23]。Jovi?i?等[24]報道miR-376a和miR-434能促進神經干細胞向神經元分化。miR-223、miR-146a、miR-19和miR-32則在膠質細胞中豐富表達，并促進神經干細胞向膠質細胞分化。miR-23、miR-138、miR-145和miR-17-5p在星形膠質細胞中高表達，在脊髓損傷膠質細胞增生反應中起重要作用[25-27]。miR-219、miR-338、miR-9、miR-199a-5p、miR-145、miR-23和miR-19b在少突膠質細胞細胞增殖、成熟、分化，髓鞘形成中起重要調控作用[28-30]。
3 miRNA在脊髓損傷后的調控作用
脊髓損傷是一種繼發于高能量創傷的中樞神經系統疾病，它可導致損傷平面以下感覺、運動功能的障礙或喪失，還可導致多個器官功能障礙。在脊髓損傷急性期，神經元損傷壞死，軸突斷裂，少突膠質細胞的破壞導致髓鞘脫失，直接導致神經信號傳導障礙[31]。細胞壞死可導致興奮性細胞毒性產物和自由基蓄積。自由基可進一步導致脂質過氧化、脂質蛋白核酸等分子氧化應激，從而導致細胞裂解、細胞骨架改變和細胞器損害，進而導致一系列的血管病變、炎癥損傷、免疫激活，引起多個組織器官功能障礙[32]。在脊髓損傷的慢性期，星形膠質細胞在損傷部位增生可形成密集的膠質瘢痕，阻礙神經軸突再生[33]。miRNA在脊髓損傷后多種生物學過程中發揮重要調控作用，如神經元死亡與再生、膠質增生、細胞應激反應和炎癥[10, 32]。
3.1 miRNA調控脊髓損傷后炎癥反應
脊髓損傷后血-脊髓屏障的破壞將激活體內一系列炎癥反應，包括血中免疫分子滲入損傷部位、小膠質細胞激活和炎癥信號通路的傳導。miRNA在控制炎癥信號通路和動態調控病理性免疫應答中發揮重要作用[34-36]。例如血管細胞黏附分子（VCAM1）受miR-126的調控[37]，其在脊髓損傷后最初幾周急劇上調[38]；嗜中性粒細胞滲透與miR-223上調密切相關[39]；淋巴細胞特異性miR-142上調與脊髓損傷后免疫細胞滲入損傷部位相關[19]。miRNA同樣與小膠質細胞和巨噬細胞的激活相關。miR-124通過作用于CCAAT增強子結合蛋白α使小膠質細胞處于靜息狀態，而脊髓損傷后的miRNA-124的持續下調則與小膠質細胞的激活密切相關[40]。炎癥反應還受到一系列免疫調節分子的調控，例如細胞因子、趨化因子[腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、IL-1β]等，而在脊髓損傷后它們均受到miRNA的調控[35]。在脊髓損傷后，miR-181和miR-125b的下調使促炎因子和促凋亡因子TNF-α的表達水平升高[41]。細胞因子IL-6在脊髓損傷后的升高則受到let-7a和miR-181a的調控[42]。而miR-30b-5p和miR-30c的下調則與IL-1β的升高密切相關[19]。此外，炎癥信號通路同樣受到miRNA的調控。例如脊髓損傷后miR-9和miR-146的下調可能介導了核因子（NF）-κB炎癥信號通路[19, 43]。miR-21也參與NF-κB信號通路的調控，而其作用機制尚不明確。miRNA不僅作用于NF-κB的負性調節因子同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）抑制炎癥反應激活[42]，還通過作用程序性細胞凋亡因子4（PDCD4）促使NF-κB信號通絡激活并且抑制IL-10的表達[44-45]。miR-1則通過調控1型腫瘤壞死因子受體（TNFR1）信號通路，抑制脊髓損傷后的炎癥信號通路[46]。促炎miRNA，例如miR-152、miR-214、miR-206和miR-221在脊髓損傷后顯著變化，甚至在不同的研究中表現出截然相反的趨勢[10, 17, 19]。這些結果均表明miRNA在脊髓損傷后炎癥反應中的作用還有待進一步研究闡明。
3.2 miRNA調控脊髓損傷后細胞死亡
細胞死亡是脊髓損傷后的另一個重要事件。細胞凋亡是脊髓繼發性損傷中基因控制的程序性細胞死亡，受到多種調節因子包括miRNA的調控[47]。在脊髓損傷后多個miRNA可促進或抑制細胞死亡，例如miR-20a在脊髓損傷后24 h即顯著升高，并持續至損傷后1周[15]。脊髓損失后，神經元素-1（Ngn1）是維持細胞存活、自我更新和神經再生的重要因子，而miR-20a抑制Ngn1表達。在健康小鼠的正常脊髓組織中注射miR-20a可產生與脊髓損傷類似的癥狀，包括神經細胞的凋亡，而注射miR-20a抑制劑則可以減少細胞凋亡，減輕組織損傷和改善脊髓功能[10, 15]。類似的，miR-486在脊髓損傷后7 d顯著升高[14]，神經源性分化因子6（NeuroD6）可通過增加氧自由基清除蛋白促進神經元存活，而miR-486可抑制NeuroD6的表達，從而促進神經元凋亡[14]。在正常小鼠脊髓內注射miR-486可產生脊髓損傷類似的表現，包括神經元凋亡的增加，而在脊髓損傷后抑制miR-486表達則可大大減少神經元凋亡，并顯著改善運動功能。因此，在脊髓損傷后抑制miR-486可通過上調NeuroD6表達促進神經再生，從而表明miRNA可作為治療脊髓損傷后的治療手段[14]。許多促凋亡或抗凋亡的miRNA可作用于關鍵的凋亡相關因子，如凋亡蛋白酶（caspases）、Fas/CD95、骨髓細胞瘤病毒癌基因同源物（c-Myc）、TNF-α或者Bcl-2家族成員來調控脊髓損傷后的細胞凋亡。如下調miR-96和miR-146a[10, 17, 19]可上調促凋亡蛋白caspase 3[48]和Fas/CD95[49]，從而促進凋亡；相反，過表達miR-21可通過抑制促凋亡分子Fas配體[50-51]，從而保護細胞免于死亡。miRNA對Bcl-2的調控展現出miRNA在脊髓損失后調控細胞死亡的復雜性。脊髓損傷后miR-15b上調[10]可降低Bcl-2[52]，從而誘導細胞凋亡。然而，miR-138和miR-148b表達下降上調Bcl-2的表達，Bcl-2從而抵消了miR-15b的作用[10, 19]。miRNA的下調可顯著增加脊髓損傷后3 d Bcl-2陽性細胞數，隨著損傷時間的延長Bcl-2陽性細胞數逐漸減少。除了調控凋亡相關基因，miRNA同樣參與調節脊髓繼發損傷中的鈣信號通路紊亂和氧化應激過程。鈣離子（Ca2+）相關基因如Ca2+泵、L-型Ca2+門控通道和Ca2+-轉運谷氨酸鹽[α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）]通道在脊髓損傷后降低，并受到miRNA的調控。miR-223上調可降低N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）及其受體的GluR2亞基和AMPA受體的表達[53]。同樣，L-型Ca2+門控通道的表達下降可能是受到miR-21的調控[54]。這些調控機制可增加脊髓損傷后細胞內Ca2+濃度并引發脊髓繼發性損傷中的細胞死亡。miRNA同樣在調控氧化應激中發揮重要作用。miR-486抑制神經保護蛋白NeuroD6并且增加氧自由基活性氧簇清除蛋白的表達，如谷胱甘肽過氧化物酶、N型硒蛋白和硫氧還蛋白[14]。脊髓損傷后7 d線粒體超氧化物歧化酶2基因上調受到miR-145的調控[55-56]。生物信息學分析表明一些抗氧化基因如超氧化物歧化酶1和過氧化氫酶基因是miR-206、miR-152和miR-214的潛在靶點[10]。此外，miR-1和miR-129下調可阻止有絲分裂后細胞重新進入細胞周期，防止神經細胞異常分裂，從而減少脊髓損傷后細胞凋亡[57]。
3.3 miRNA調控脊髓損傷后軸突再生、髓鞘形成和神經可塑性
miRNA在脊髓損傷后神經再生和髓鞘形成過程中同樣發揮重要作用。中樞神經系統缺乏持續性的再生能力。脊髓損傷后局部微環境的改變是限制神經再生的重要因素，而細胞內特定功能的變化同樣影響神經元的成熟[58]。研究表明，miRNA參與了這些變化的調控[59-60]。在Dicer酶條件性敲除的轉基因小鼠中發現，miRNA在有絲分裂后神經元軸突生長的過程中發揮重要作用[59]。Dicer酶敲除后可抑制miRNA生物學合成，抑制神經元軸突的生長，并減小神經元胞體大小，但不影響神經元存活[59]。在研究脊髓損傷后軸突再生的斑馬魚模型中發現再生神經元中miR-133b表達明顯增加，而抑制miR-133b則減低軸突再生[60]。進一步研究發現，miR-133b可下調鳥苷三磷酸酶依賴的軸突生長抑制因子Rho亞家族蛋白A（RhoA）從而促進軸突再生。在哺乳動物脊髓損傷后1 d和7 d，miR-133b均顯著下降，這可能導致神經再生能力的下降[10, 19]。同樣，miRNA-124也參與了脊髓損傷后神經再生的調控。miR-124在分化的小鼠P19細胞株中高表達可促進神經軸突再生，然而抑制miR-124則降低軸突再生[61]。脊髓損傷后miR-124表達下降可能成為脊髓神經元再生的障礙。
miRNA也可調控脊髓損傷后促神經再生基因的程序性表達[62]。Di Giovanni等[62]發現在脊髓損失后7 d和28 d高表達的基因簇中包含有促神經可塑性和軸突再生的基因，如突觸結合蛋白-1（synaptotagmin-1）基因。而synaptotagmin-1基因則是miR-34a的靶基因。synaptotagmin-1基因在脊髓損傷后的上調與miR-34a在脊髓損傷后3 d和7 d的下調一致[10, 19]。脊髓損傷后損傷周圍區域漸進性的脫髓鞘病變與少突膠質細胞的損傷和髓鞘再生障礙密切相關。研究表明，在成熟少突膠質細胞中抑制Dicer1酶可導致細胞脫髓鞘，并引起神經退變[63]。Shin等[64]發現miR-219在維持髓鞘和促進髓鞘再生中發揮重要作用。miR-219在成熟少突膠質細胞中高表達，抑制Dicer1酶影響miR-219生物合成，可增加miR-219靶基因長鏈脂肪酸7基因表達，從而使脂類物質在髓磷脂豐富的區域聚集，擾亂細胞膜的穩定性。脊髓損失后，miR-219表達顯著下降一方面反映了脊髓損傷后少突膠質細胞的丟失，而進一步研究還需證實miR-219可能參與脊髓損傷后髓鞘脫失與再生的調控，并評價miRNA在脊髓損傷后及其他中樞神經系統病變過程中的治療價值。
3.4 miRNA調控脊髓損傷后膠質增生和瘢痕形成
膠質增生是脊髓損傷后的另一個重要事件，其包括損傷早期的膠質肥厚性增生促進神經保護到脊髓損傷慢性期的膠質過度增生形成膠質瘢痕從而抑制神經再生[65]。越來越多的證據表明miRNA參與調節脊髓損傷后膠質反應，例如miR-21在脊髓損傷后慢性期的星形膠質細胞中高表達[66]。運用轉基因小鼠在星形膠質細胞中高表達miR-21或者抑制miR-21，使miR-21在脊髓損傷后星形膠質細胞增生中的作用得到了深入研究。研究表明在星形膠質細胞中過表達miR-21可阻止嚴重脊髓損傷后星形膠質細胞過度增生；與之相反，抑制miR-21則可增強脊髓損傷后早期和慢性期的膠質細胞增生[66]。miR-125b是調控膠質增生的另一個重要miRNA。miR-125b在脊髓損失后7 d顯著降低并抑制星形膠質細胞增生和聚集[19]。在許多神經病理改變過程中miR-125b高表達與星形膠質細胞的標志物膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）和波形蛋白（vimentin）相關[67]。體外實驗顯示miR-125b可抑制IL-6刺激的反應性膠質細胞增生，增加細胞生長負性調節因子細胞周期依賴激酶抑制劑2A表達，從而抑制細胞增殖。miR-181家族也參與膠質增生的負性調節，減少膠質增生的反應增強因子（如促炎細胞因子），增加膠質反應抑制因子抑炎因子（如IL-10）[68]。與miR-181類似，miR-146a也可抑制膠質細胞對炎性刺激的反應性增生[69]。miR-146a在增生性膠質細胞中高表達并在脊髓損傷后7 d顯著升高[19]。miR-146a可抑制炎癥反應，并顯著降低炎癥信號分子如IL-1β、白細胞介素受體相關激酶（IRAK）-1、IRAK-2和TNF受體相關因子6表達，抑制促炎因子IL-6和環氧化酶2（COX-2）[69]。在IL-1β炎癥信號通路中形成負反饋，阻斷IL-1β炎癥信號通路下游分子的表達。在脊髓損傷后，miR-146a、miR-21和miR-125b的上調可限制膠質細胞增生；相反，下調miR-181家族則可促進膠質細胞增生。這反映了miRNA在調控脊髓損傷后膠質細胞反應的復雜性。表 2列舉了部分脊髓損傷后miRNA在脊髓損傷病理改變過程中的調控作用。
表2
脊髓損傷后miRNA在脊髓損傷病理改變過程中的調控作用
4 臨床運用：基于miRNA治療和診斷脊髓損傷
目前，利用miRNA治療丙型肝炎已經進入Ⅱ期臨床試驗，并且許多基于miRNA的治療疾病的方法也方興未艾[86]。目前可通過人工合成miRNA前體、模擬物、激動劑、miRNA海綿等方式在細胞和活體內增強某種miRNA的功能；通過miRNA抑制劑、拮抗劑等抑制細胞和活體中miRNA的功能。合成miRNA可通過外泌體包裹、局部注射（如表皮、皮下、肌肉、瘤體注射，呼吸道給藥）、腹膜內注射、鞘內給藥、腦室內注射以及靜脈給藥等方式將miRNA帶入體內發揮功能[87]。
miRNA可改變脊髓損傷后神經元、免疫細胞、血管內皮細胞的表型，使miRNA成為治療脊髓損傷的極有希望的手段。基于miRNA治療脊髓損傷進行的大量基礎研究也表明miRNA治療脊髓損傷是可行的。Jee等[15]研究表明在脊髓損傷局部注射miR-20a抑制劑可減少促凋亡基因的表達，促進神經元的存活和脊髓功能的恢復。同樣，Hu等[88]研究發現在蛛網膜下隙注射miR-21抑制劑可使促凋亡基因高表達，增加細胞死亡并抑制脊髓損傷后后肢運動功能的恢復。這兩篇文章均表明miRNA替代治療是可行的。Willemen等[73]研究表明在蛛網膜下隙注射miR-124可防止脊髓損傷后的持續性疼痛，這可能與miR-124調控小膠質細胞活性有關[89]。Im等[16]報道了miR-23b鞘內注射具有類似的效果，恢復脊髓損傷后miR-23b的正常水平可降低炎癥蛋白的表達，尤其是γ-氨基丁酸能神經元中還原型輔酶Ⅱ氧化酶的表達，從而減少細胞死亡，減輕神經病理性疼痛。這些基礎研究均強烈支持基于miRNA治療脊髓損傷具有可行性，盡管miRNA治療脊髓損傷的副作用及用藥時間仍需進一步闡述[90]。另一方面，脊髓損傷后通過外泌體、微泡或者凋亡細胞釋放進入體液的循環miRNA具有穩定性[91]。循環miRNA的改變有望成為診斷脊髓損傷類型及受傷程度及受傷時間的生物標志物。目前，通過對人類和大鼠創傷性腦損傷后循環miRNA的分析，已鑒定出數個潛在生物標志物[92-93]。研究發現，在脊髓休克早期，血漿中神經元特異性miR-124的濃度就顯著升高[94]。當然，由于循環miRNA的濃度通常較低，循環中血細胞的干擾，以及缺乏內參，目前循環miRNA的定量分析仍有一定的局限性。
5 問題與展望
脊髓損傷對神經、免疫和循環系統的細胞和分子造成嚴重影響，其病理生理改變極為復雜。脊髓損傷可引起多個miRNA的表達變化，從而在轉錄后水平調控成千上萬的基因表達。利用微陣列數據的生物信息學分析可以有效發現脊髓損傷后miRNA和mRNA的表達變化，并提示miRNA的表達紊亂所引起的脊髓損傷后的病理變化過程。同時，目前還需要更多的實驗去研究miRNA表達變化對特定細胞的影響，并證實生物信息學預測的可靠性，準確描述miRNA表達變化所引起的特征性改變和這些改變引起的整體功能上的改變。截至目前，我們已經能夠證明某個特定miRNA調控脊髓損傷后的關鍵過程，例如細胞死亡、炎癥和凋亡。這些結果提示miRNA可以調控脊髓損傷后的惡性事件，促進損傷后的再生過程，有助于減輕脊髓損失后的功能障礙。miRNA可成為治療脊髓損傷的極具價值的手段。將miRNA制備成為可用于臨床治療脊髓損傷的核酸藥物是未來的發展趨勢。研究與運用miRNA在生物體內的調控功能將為治療脊髓損傷作出重大貢獻。
脊髓損傷是由各種原因引起的脊髓結構、功能的損害，造成損傷水平以下不同程度的運動、感覺和自主神經功能障礙。在世界范圍內脊髓損傷對臨床醫生仍是巨大挑戰，其高致殘率和高致死率不僅對患者及家庭造成巨大傷害，也給社會帶來沉重的經濟負擔。脊髓損傷一方面因脊髓神經元和血管直接破壞造成原發性損傷，另一方面，在原發性脊髓損傷的基礎之上，還有因多種因素參與出現的序列性組織自毀性的繼發性損傷。繼發性損傷的機制較多，主要有血管機制、自由基氧化學說、氨基酸學說、鈣介導機制、電介質失衡、細胞凋亡等機制等。
近年來研究發現，微RNA（miRNA）可在轉錄后水平調控脊髓損傷后成千上百個基因表達，進而調控細胞狀態和功能，被公認為脊髓損傷后病理生理改變的重要行動者。miRNA是由19～23個核苷酸組成的非編碼RNA，在脊髓損傷后多個生物學過程中發揮重要調控作用，包括神經再生、細胞凋亡和線粒體功能等。由于單個miRNA可以影響到參與單一通路的很多基因，基于miRNA的治療比起靶向于該通路的其他一些致病基因的療法要更優。miRNA作為治療靶點和生物標志物的價值已被公認。探索特定miRNA在脊髓損傷后的分子調控機制，將能夠為臨床上治療脊髓損傷提供新的靶點。現就miRNA在脊髓損傷后的表達變化及其在脊髓損傷后病理改變過程中的作用予以綜述。
1 miRNA的生物學特點
miRNA來源于真核細胞核內內含子編碼，通過RNA聚合酶Ⅱ轉錄產生原始miRNA轉錄本（pri-miRNA），之后在核糖核酸酶Ⅲ Drosha和RNA綁定蛋白-DGCR8剪切下形成約60～70個核苷酸的發卡狀miRNA，稱為前體miRNA（pre-miRNA）[1-2]。隨后，核輸出蛋白Exportin5和Ran-GTP將pre-miRNA轉運至細胞質[3]，由另一個核糖核酸酶Ⅲ Dicer進一步剪切形成20～24個堿基對的雙鏈RNA。這種雙鏈RNA很快被載入RNA誘導沉默復合體（RISC）中，使其中一條單鏈miRNA被降解，另一條成熟的單鏈miRNA分子通過與靶基因mRNA序列互補配對，來調節基因的表達[4]。阻斷或下調miRNA生物合成過程中的關鍵蛋白，如Dicer、Drosha、DGCR8或Exportin5將導致成熟miRNA的降低而pri-miRNA和pre-miRNA的增加[5]。
隨著miRNA的實時定量聚合酶鏈反應、原位雜交技術及miRNA芯片等高通量檢測技術的發展，目前已可以簡便準確地篩查出不同疾病過程中的miRNA表達變化。從最初在線蟲中發現miRNA至今，miRNA序列數據庫miRBase收錄了近3萬個miRNA，其中在人類發現并命名的miRNA超過了1萬個。至少1/3的人類基因與miRNA調控相關，miRNA參與了幾乎所有目前發現的細胞生物活動過程[6]。成熟miRNA與Dicer及Argonaute蛋白等組裝形成RISC對靶基因mRNA具有多種基因調控方式，最常見的基因調控方式為與靶基因mRNA的3’非翻譯區（UTR）互補結合。根據互補程度的不同可抑制靶基因mRNA翻譯，降解，切割靶基因mRNA或導致靶基因甲基化，在轉錄后水平對靶基因進行調節[7]。此外，miRNA也可以與靶基因mRNA的5’UTR[8]、DNA[9]和蛋白質[9]等結合抑制或促進特異性靶基因的表達。
2 miRNA在脊髓損傷后的表達特點
miRNA在脊髓中的表達極為豐富，約有77%已確定的大鼠成熟miRNA可在脊髓中表達[10]。其中大量miRNA，例如miR-1、miR-10a、miR-10b、miR-34a、miR-133a、miR-133b、miR-142-3p、miR-199、miR-219、miR-338、miR-451、miR-486等在脊髓中表達量極高[11-12]。截至2015年11月，已經有84篇研究分析了miRNA在脊髓損傷后的表達及功能。這些研究結果表明miRNA在脊髓損傷后，無論miRNA數目還是miRNA種類都具有顯著的差異[13-16]。這些差異可歸結于脊髓損傷模型的不同，如缺血-再灌注、脊髓全橫斷損傷及脊髓挫傷等[14-18]。其次，miRNA表達隨著脊髓損傷后不同時點呈現動態變化過程。表 1列出了miRNA在鼠科脊髓損傷模型中各時點的動態變化，尤以損傷后第7天miRNA表達降低最為明顯，而脊髓損傷后7 d運動功能也逐漸恢復，這也進一步說明miRNA與脊髓損傷后神經修復的調控密切相關。
表1
大鼠脊髓損傷模型中miRNA各時點的表達變化
實驗動物的不同（如大鼠、小鼠）同樣影響脊髓損傷后的miRNA表達差異[17, 19]。miRNA表達的差異也正恰好反映了不同脊髓損傷的特點，其中損傷嚴重程度是一個重要影響因素，例如miR-129-2和miR-146a被證實與脊髓損傷后的神經功能評分密切相關[17]。此外，在脊椎動物進化過程中，miRNA在脊髓中的表達還具有組織特異性和種屬保守性[19]。這也是miRNA參與脊髓損傷后復雜基因調控、改變特定細胞狀態與功能，決定細胞命運的基礎。Natera-Naranjo等[20]發現miR-15b、miR-16、miR-204和miR-221在交感神經元的遠端軸突表達豐富，調控軸突的蛋白合成，在維持軸突結構功能，神經細胞生長發育過程中起重要作用。miR-125b和miR-124可以誘導骨髓間充質干細胞向神經元分化，促進脊髓損傷后神經干細胞向神經元分化，在神經元分化過程中促進神經軸突生長，在脊髓損傷后神經修復過程中起重要作用[21-23]。Jovi?i?等[24]報道miR-376a和miR-434能促進神經干細胞向神經元分化。miR-223、miR-146a、miR-19和miR-32則在膠質細胞中豐富表達，并促進神經干細胞向膠質細胞分化。miR-23、miR-138、miR-145和miR-17-5p在星形膠質細胞中高表達，在脊髓損傷膠質細胞增生反應中起重要作用[25-27]。miR-219、miR-338、miR-9、miR-199a-5p、miR-145、miR-23和miR-19b在少突膠質細胞細胞增殖、成熟、分化，髓鞘形成中起重要調控作用[28-30]。
3 miRNA在脊髓損傷后的調控作用
脊髓損傷是一種繼發于高能量創傷的中樞神經系統疾病，它可導致損傷平面以下感覺、運動功能的障礙或喪失，還可導致多個器官功能障礙。在脊髓損傷急性期，神經元損傷壞死，軸突斷裂，少突膠質細胞的破壞導致髓鞘脫失，直接導致神經信號傳導障礙[31]。細胞壞死可導致興奮性細胞毒性產物和自由基蓄積。自由基可進一步導致脂質過氧化、脂質蛋白核酸等分子氧化應激，從而導致細胞裂解、細胞骨架改變和細胞器損害，進而導致一系列的血管病變、炎癥損傷、免疫激活，引起多個組織器官功能障礙[32]。在脊髓損傷的慢性期，星形膠質細胞在損傷部位增生可形成密集的膠質瘢痕，阻礙神經軸突再生[33]。miRNA在脊髓損傷后多種生物學過程中發揮重要調控作用，如神經元死亡與再生、膠質增生、細胞應激反應和炎癥[10, 32]。
3.1 miRNA調控脊髓損傷后炎癥反應
脊髓損傷后血-脊髓屏障的破壞將激活體內一系列炎癥反應，包括血中免疫分子滲入損傷部位、小膠質細胞激活和炎癥信號通路的傳導。miRNA在控制炎癥信號通路和動態調控病理性免疫應答中發揮重要作用[34-36]。例如血管細胞黏附分子（VCAM1）受miR-126的調控[37]，其在脊髓損傷后最初幾周急劇上調[38]；嗜中性粒細胞滲透與miR-223上調密切相關[39]；淋巴細胞特異性miR-142上調與脊髓損傷后免疫細胞滲入損傷部位相關[19]。miRNA同樣與小膠質細胞和巨噬細胞的激活相關。miR-124通過作用于CCAAT增強子結合蛋白α使小膠質細胞處于靜息狀態，而脊髓損傷后的miRNA-124的持續下調則與小膠質細胞的激活密切相關[40]。炎癥反應還受到一系列免疫調節分子的調控，例如細胞因子、趨化因子[腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、IL-1β]等，而在脊髓損傷后它們均受到miRNA的調控[35]。在脊髓損傷后，miR-181和miR-125b的下調使促炎因子和促凋亡因子TNF-α的表達水平升高[41]。細胞因子IL-6在脊髓損傷后的升高則受到let-7a和miR-181a的調控[42]。而miR-30b-5p和miR-30c的下調則與IL-1β的升高密切相關[19]。此外，炎癥信號通路同樣受到miRNA的調控。例如脊髓損傷后miR-9和miR-146的下調可能介導了核因子（NF）-κB炎癥信號通路[19, 43]。miR-21也參與NF-κB信號通路的調控，而其作用機制尚不明確。miRNA不僅作用于NF-κB的負性調節因子同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）抑制炎癥反應激活[42]，還通過作用程序性細胞凋亡因子4（PDCD4）促使NF-κB信號通絡激活并且抑制IL-10的表達[44-45]。miR-1則通過調控1型腫瘤壞死因子受體（TNFR1）信號通路，抑制脊髓損傷后的炎癥信號通路[46]。促炎miRNA，例如miR-152、miR-214、miR-206和miR-221在脊髓損傷后顯著變化，甚至在不同的研究中表現出截然相反的趨勢[10, 17, 19]。這些結果均表明miRNA在脊髓損傷后炎癥反應中的作用還有待進一步研究闡明。
3.2 miRNA調控脊髓損傷后細胞死亡
細胞死亡是脊髓損傷后的另一個重要事件。細胞凋亡是脊髓繼發性損傷中基因控制的程序性細胞死亡，受到多種調節因子包括miRNA的調控[47]。在脊髓損傷后多個miRNA可促進或抑制細胞死亡，例如miR-20a在脊髓損傷后24 h即顯著升高，并持續至損傷后1周[15]。脊髓損失后，神經元素-1（Ngn1）是維持細胞存活、自我更新和神經再生的重要因子，而miR-20a抑制Ngn1表達。在健康小鼠的正常脊髓組織中注射miR-20a可產生與脊髓損傷類似的癥狀，包括神經細胞的凋亡，而注射miR-20a抑制劑則可以減少細胞凋亡，減輕組織損傷和改善脊髓功能[10, 15]。類似的，miR-486在脊髓損傷后7 d顯著升高[14]，神經源性分化因子6（NeuroD6）可通過增加氧自由基清除蛋白促進神經元存活，而miR-486可抑制NeuroD6的表達，從而促進神經元凋亡[14]。在正常小鼠脊髓內注射miR-486可產生脊髓損傷類似的表現，包括神經元凋亡的增加，而在脊髓損傷后抑制miR-486表達則可大大減少神經元凋亡，并顯著改善運動功能。因此，在脊髓損傷后抑制miR-486可通過上調NeuroD6表達促進神經再生，從而表明miRNA可作為治療脊髓損傷后的治療手段[14]。許多促凋亡或抗凋亡的miRNA可作用于關鍵的凋亡相關因子，如凋亡蛋白酶（caspases）、Fas/CD95、骨髓細胞瘤病毒癌基因同源物（c-Myc）、TNF-α或者Bcl-2家族成員來調控脊髓損傷后的細胞凋亡。如下調miR-96和miR-146a[10, 17, 19]可上調促凋亡蛋白caspase 3[48]和Fas/CD95[49]，從而促進凋亡；相反，過表達miR-21可通過抑制促凋亡分子Fas配體[50-51]，從而保護細胞免于死亡。miRNA對Bcl-2的調控展現出miRNA在脊髓損失后調控細胞死亡的復雜性。脊髓損傷后miR-15b上調[10]可降低Bcl-2[52]，從而誘導細胞凋亡。然而，miR-138和miR-148b表達下降上調Bcl-2的表達，Bcl-2從而抵消了miR-15b的作用[10, 19]。miRNA的下調可顯著增加脊髓損傷后3 d Bcl-2陽性細胞數，隨著損傷時間的延長Bcl-2陽性細胞數逐漸減少。除了調控凋亡相關基因，miRNA同樣參與調節脊髓繼發損傷中的鈣信號通路紊亂和氧化應激過程。鈣離子（Ca2+）相關基因如Ca2+泵、L-型Ca2+門控通道和Ca2+-轉運谷氨酸鹽[α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）]通道在脊髓損傷后降低，并受到miRNA的調控。miR-223上調可降低N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）及其受體的GluR2亞基和AMPA受體的表達[53]。同樣，L-型Ca2+門控通道的表達下降可能是受到miR-21的調控[54]。這些調控機制可增加脊髓損傷后細胞內Ca2+濃度并引發脊髓繼發性損傷中的細胞死亡。miRNA同樣在調控氧化應激中發揮重要作用。miR-486抑制神經保護蛋白NeuroD6并且增加氧自由基活性氧簇清除蛋白的表達，如谷胱甘肽過氧化物酶、N型硒蛋白和硫氧還蛋白[14]。脊髓損傷后7 d線粒體超氧化物歧化酶2基因上調受到miR-145的調控[55-56]。生物信息學分析表明一些抗氧化基因如超氧化物歧化酶1和過氧化氫酶基因是miR-206、miR-152和miR-214的潛在靶點[10]。此外，miR-1和miR-129下調可阻止有絲分裂后細胞重新進入細胞周期，防止神經細胞異常分裂，從而減少脊髓損傷后細胞凋亡[57]。
3.3 miRNA調控脊髓損傷后軸突再生、髓鞘形成和神經可塑性
miRNA在脊髓損傷后神經再生和髓鞘形成過程中同樣發揮重要作用。中樞神經系統缺乏持續性的再生能力。脊髓損傷后局部微環境的改變是限制神經再生的重要因素，而細胞內特定功能的變化同樣影響神經元的成熟[58]。研究表明，miRNA參與了這些變化的調控[59-60]。在Dicer酶條件性敲除的轉基因小鼠中發現，miRNA在有絲分裂后神經元軸突生長的過程中發揮重要作用[59]。Dicer酶敲除后可抑制miRNA生物學合成，抑制神經元軸突的生長，并減小神經元胞體大小，但不影響神經元存活[59]。在研究脊髓損傷后軸突再生的斑馬魚模型中發現再生神經元中miR-133b表達明顯增加，而抑制miR-133b則減低軸突再生[60]。進一步研究發現，miR-133b可下調鳥苷三磷酸酶依賴的軸突生長抑制因子Rho亞家族蛋白A（RhoA）從而促進軸突再生。在哺乳動物脊髓損傷后1 d和7 d，miR-133b均顯著下降，這可能導致神經再生能力的下降[10, 19]。同樣，miRNA-124也參與了脊髓損傷后神經再生的調控。miR-124在分化的小鼠P19細胞株中高表達可促進神經軸突再生，然而抑制miR-124則降低軸突再生[61]。脊髓損傷后miR-124表達下降可能成為脊髓神經元再生的障礙。
miRNA也可調控脊髓損傷后促神經再生基因的程序性表達[62]。Di Giovanni等[62]發現在脊髓損失后7 d和28 d高表達的基因簇中包含有促神經可塑性和軸突再生的基因，如突觸結合蛋白-1（synaptotagmin-1）基因。而synaptotagmin-1基因則是miR-34a的靶基因。synaptotagmin-1基因在脊髓損傷后的上調與miR-34a在脊髓損傷后3 d和7 d的下調一致[10, 19]。脊髓損傷后損傷周圍區域漸進性的脫髓鞘病變與少突膠質細胞的損傷和髓鞘再生障礙密切相關。研究表明，在成熟少突膠質細胞中抑制Dicer1酶可導致細胞脫髓鞘，并引起神經退變[63]。Shin等[64]發現miR-219在維持髓鞘和促進髓鞘再生中發揮重要作用。miR-219在成熟少突膠質細胞中高表達，抑制Dicer1酶影響miR-219生物合成，可增加miR-219靶基因長鏈脂肪酸7基因表達，從而使脂類物質在髓磷脂豐富的區域聚集，擾亂細胞膜的穩定性。脊髓損失后，miR-219表達顯著下降一方面反映了脊髓損傷后少突膠質細胞的丟失，而進一步研究還需證實miR-219可能參與脊髓損傷后髓鞘脫失與再生的調控，并評價miRNA在脊髓損傷后及其他中樞神經系統病變過程中的治療價值。
3.4 miRNA調控脊髓損傷后膠質增生和瘢痕形成
膠質增生是脊髓損傷后的另一個重要事件，其包括損傷早期的膠質肥厚性增生促進神經保護到脊髓損傷慢性期的膠質過度增生形成膠質瘢痕從而抑制神經再生[65]。越來越多的證據表明miRNA參與調節脊髓損傷后膠質反應，例如miR-21在脊髓損傷后慢性期的星形膠質細胞中高表達[66]。運用轉基因小鼠在星形膠質細胞中高表達miR-21或者抑制miR-21，使miR-21在脊髓損傷后星形膠質細胞增生中的作用得到了深入研究。研究表明在星形膠質細胞中過表達miR-21可阻止嚴重脊髓損傷后星形膠質細胞過度增生；與之相反，抑制miR-21則可增強脊髓損傷后早期和慢性期的膠質細胞增生[66]。miR-125b是調控膠質增生的另一個重要miRNA。miR-125b在脊髓損失后7 d顯著降低并抑制星形膠質細胞增生和聚集[19]。在許多神經病理改變過程中miR-125b高表達與星形膠質細胞的標志物膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）和波形蛋白（vimentin）相關[67]。體外實驗顯示miR-125b可抑制IL-6刺激的反應性膠質細胞增生，增加細胞生長負性調節因子細胞周期依賴激酶抑制劑2A表達，從而抑制細胞增殖。miR-181家族也參與膠質增生的負性調節，減少膠質增生的反應增強因子（如促炎細胞因子），增加膠質反應抑制因子抑炎因子（如IL-10）[68]。與miR-181類似，miR-146a也可抑制膠質細胞對炎性刺激的反應性增生[69]。miR-146a在增生性膠質細胞中高表達并在脊髓損傷后7 d顯著升高[19]。miR-146a可抑制炎癥反應，并顯著降低炎癥信號分子如IL-1β、白細胞介素受體相關激酶（IRAK）-1、IRAK-2和TNF受體相關因子6表達，抑制促炎因子IL-6和環氧化酶2（COX-2）[69]。在IL-1β炎癥信號通路中形成負反饋，阻斷IL-1β炎癥信號通路下游分子的表達。在脊髓損傷后，miR-146a、miR-21和miR-125b的上調可限制膠質細胞增生；相反，下調miR-181家族則可促進膠質細胞增生。這反映了miRNA在調控脊髓損傷后膠質細胞反應的復雜性。表 2列舉了部分脊髓損傷后miRNA在脊髓損傷病理改變過程中的調控作用。
表2
脊髓損傷后miRNA在脊髓損傷病理改變過程中的調控作用
4 臨床運用：基于miRNA治療和診斷脊髓損傷
目前，利用miRNA治療丙型肝炎已經進入Ⅱ期臨床試驗，并且許多基于miRNA的治療疾病的方法也方興未艾[86]。目前可通過人工合成miRNA前體、模擬物、激動劑、miRNA海綿等方式在細胞和活體內增強某種miRNA的功能；通過miRNA抑制劑、拮抗劑等抑制細胞和活體中miRNA的功能。合成miRNA可通過外泌體包裹、局部注射（如表皮、皮下、肌肉、瘤體注射，呼吸道給藥）、腹膜內注射、鞘內給藥、腦室內注射以及靜脈給藥等方式將miRNA帶入體內發揮功能[87]。
miRNA可改變脊髓損傷后神經元、免疫細胞、血管內皮細胞的表型，使miRNA成為治療脊髓損傷的極有希望的手段。基于miRNA治療脊髓損傷進行的大量基礎研究也表明miRNA治療脊髓損傷是可行的。Jee等[15]研究表明在脊髓損傷局部注射miR-20a抑制劑可減少促凋亡基因的表達，促進神經元的存活和脊髓功能的恢復。同樣，Hu等[88]研究發現在蛛網膜下隙注射miR-21抑制劑可使促凋亡基因高表達，增加細胞死亡并抑制脊髓損傷后后肢運動功能的恢復。這兩篇文章均表明miRNA替代治療是可行的。Willemen等[73]研究表明在蛛網膜下隙注射miR-124可防止脊髓損傷后的持續性疼痛，這可能與miR-124調控小膠質細胞活性有關[89]。Im等[16]報道了miR-23b鞘內注射具有類似的效果，恢復脊髓損傷后miR-23b的正常水平可降低炎癥蛋白的表達，尤其是γ-氨基丁酸能神經元中還原型輔酶Ⅱ氧化酶的表達，從而減少細胞死亡，減輕神經病理性疼痛。這些基礎研究均強烈支持基于miRNA治療脊髓損傷具有可行性，盡管miRNA治療脊髓損傷的副作用及用藥時間仍需進一步闡述[90]。另一方面，脊髓損傷后通過外泌體、微泡或者凋亡細胞釋放進入體液的循環miRNA具有穩定性[91]。循環miRNA的改變有望成為診斷脊髓損傷類型及受傷程度及受傷時間的生物標志物。目前，通過對人類和大鼠創傷性腦損傷后循環miRNA的分析，已鑒定出數個潛在生物標志物[92-93]。研究發現，在脊髓休克早期，血漿中神經元特異性miR-124的濃度就顯著升高[94]。當然，由于循環miRNA的濃度通常較低，循環中血細胞的干擾，以及缺乏內參，目前循環miRNA的定量分析仍有一定的局限性。
5 問題與展望
脊髓損傷對神經、免疫和循環系統的細胞和分子造成嚴重影響，其病理生理改變極為復雜。脊髓損傷可引起多個miRNA的表達變化，從而在轉錄后水平調控成千上萬的基因表達。利用微陣列數據的生物信息學分析可以有效發現脊髓損傷后miRNA和mRNA的表達變化，并提示miRNA的表達紊亂所引起的脊髓損傷后的病理變化過程。同時，目前還需要更多的實驗去研究miRNA表達變化對特定細胞的影響，并證實生物信息學預測的可靠性，準確描述miRNA表達變化所引起的特征性改變和這些改變引起的整體功能上的改變。截至目前，我們已經能夠證明某個特定miRNA調控脊髓損傷后的關鍵過程，例如細胞死亡、炎癥和凋亡。這些結果提示miRNA可以調控脊髓損傷后的惡性事件，促進損傷后的再生過程，有助于減輕脊髓損失后的功能障礙。miRNA可成為治療脊髓損傷的極具價值的手段。將miRNA制備成為可用于臨床治療脊髓損傷的核酸藥物是未來的發展趨勢。研究與運用miRNA在生物體內的調控功能將為治療脊髓損傷作出重大貢獻。
