壞死是細胞死亡的3種表現形式之一，一直是生命科學的研究熱點和難點。越來越多的研究發現壞死可被調節，并參與了許多疾病的病理生理過程。該文對目前研究涉及的有關細胞程序性壞死的特點、分子機制和病理生理特點加以綜述。將來對其體內具體分子級聯反應過程和分子級聯反應過程的揭示，有利于更好地認識細胞生命過程，拓展包括腫瘤治療在內的生命科學研究新領域。
引用本文： 陳鵬亮, 郭進明, 賴文杰, 李飛, 劉明. 細胞程序性壞死的研究進展. 華西醫學, 2016, 31(8): 1447-1452. doi: 10.7507/1002-0179.201600394 復制
細胞死亡是生物活動中一個非常重要的事件，一直以來是生命科學的研究熱點和難點。通常我們認為細胞的死亡方式包括3種類型：凋亡、自噬和壞死。其中凋亡被用來描述一種以細胞皺縮、核濃縮為主要特征的細胞死亡方式[1]。一系列研究表明凋亡廣泛存在于有機體的各種病理生理活動中，有著獨特的機制[2]。自噬是Ashford和Porter在1962年發現細胞內有“自己吃自己”的現象后提出，表現為自噬小體形成為主要特征的一種細胞死亡方式，包括微自噬、巨自噬和分子伴侶介導的自噬3種常見形式[3]。自噬可實現細胞本身的代謝循環，并與某些細胞器的更新相關，用以完成機體自我調節[4]。長期以來，壞死一直被認為是在嚴重物理、化學損傷下發生的無序細胞死亡過程，無法得以調控，是與程序性壞死（凋亡和自噬）截然不同的細胞死亡過程，典型特征表現為：細胞體積增大，細胞器腫脹和細胞質膜破裂。上個世紀末以來，這個觀點陸續受到越來越多實驗事實的考驗。首先，部分研究發現使用含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）抑制劑能使腫瘤壞死因子（TNF）誘導的細胞凋亡轉而發生細胞壞死[5-6]。2000年Holler等[7]發現，死亡受體Fas在受體相互作用蛋白激酶-1激活的情況下能夠通過Fas結合蛋白和死亡受體結合引起不再依賴caspase的非凋亡性細胞死亡。這表明一部分壞死可能和凋亡同樣是按某種程序發生的，并可以被調節。2005年，Degterev等[8]合成了一種小分子物質necrostatin-1，它可特異性抑制TNF誘導的細胞壞死，從而將這種不同于一般壞死的模式稱作壞死狀凋亡（necroptosis）。由此程序性壞死就被用來描述這類由受體介導、不依賴caspase蛋白酶、高度調節的具有典型壞死性形態特征的細胞死亡過程。隨著研究深入，程序性壞死被發現參與了許多疾病的病理生理過程，并日漸受到關注。本文將重點關注細胞程序性壞死的分子機制和病理生理特點，從而加以概述。
1 細胞程序性壞死的特征
Kerr等[1]1972年首先用“apoptosis這個詞描述了一種有特殊形態特征的亞類型細胞死亡方式，包括：細胞腫脹，染色質濃縮，基底膜破損，核碎裂，細胞碎片和凋亡小體的形成。
與其他細胞程序性死亡的形態學特點不同的是，細胞程序性壞死有著壞死的典型特征：如逐漸透明的細胞質、細胞器的腫脹、核內超微結構改變（核膜腫脹和染色質濃集成小塊）和細胞體積的增大，細胞質膜破裂的時候到底頂點[9]。這既不表現為凋亡的形態（壞死的細胞及細胞核不像凋亡細胞裂解成分離的小塊），也不伴細胞自噬的特點（細胞空泡的形成）。同時，其與一般意義上的壞死不同之處在于：程序性壞死具有可調節的特點，其主要特征是一種能通過分子機制調控的細胞壞死過程。
2 細胞程序性壞死的發生機制
2.1 細胞程序性壞死的啟動
死亡受體的激活可以誘導從恢復到損傷等多種結果，而當其與某些特定的受體[如Fas受體[10]、TNF受體1（TNFR1）、TNF相關凋亡誘導配體受體（TRAILR）1和TRAILR2[10-11]等]結合時，可誘導程序性的細胞死亡。近期研究發現，在凋亡途徑受到抑制時，在一些細胞系中死亡受體能誘導出不依賴caspase的壞死樣細胞死亡（程序性壞死）[12]。當然，能夠誘導程序性壞死的因素有很多，這一過程的啟動可能有多個因素的參與，其下游執行壞死的分子機制也有多條信號通路的參與，而目前被研究最廣泛的程序性壞死模式是由TNFR1所介導。現階段研究認為，TNFR1處于這個復雜信號通路的頂端和中心位置，它可根據細胞內外環境的不同，誘發不同的生物化學級聯反應。
2.2 復合物Ⅰ的形成
當TNF與細胞膜上的TNFR1細胞外死亡結構域結合后，受體可以迅速發生構象變化，并在細胞內募集多種蛋白參與這一級聯反應過程，包括：TNFR1相關死亡域蛋白（TRADD），受體相互作用蛋白-1（RIP1），cIAP1，cIAP2，TNF受體相關因子（TRAF）2，TRAF5等，通常稱它們一起形成的超分子復合物為“TNFR1復合物Ⅰ”[13]。傳統觀點認為，復合物Ⅰ主要通過經典的核因子（NF）-κB途徑激活促存活信號通路[14]。就復合物Ⅰ而言，TRAF通過抑制其自身泛素化穩定酸性磷酸酶（CIAP）（通常情況下不穩定），允許CIAP調節RIP1的K63泛素化[15-16]。最近有研究表明TRAF2在1-磷酸鞘氨酸存在時也能催化RIP1多位點泛素化[17]。而RIP1的泛素化狀態決定其傳遞促存活或是死亡信號，當RIP1的K63結構域泛素化為蛋白激酶TAK1后，就可與TAK1結合蛋白TAB 2和TAB 3相結合，形成TAK1-TAB 2-TAB 3 復合物，進而將下游NF-κB通路激活，進一步引起促細胞生存的基因信號表達[14]。而當去泛素化酶a.k.a. TNFAIP3（A20）和去泛素化酶（CYLD）在NF-κB通路中導致RIP1去泛素化時，又可抑制TAK1-TAB 2-TAB 3 復合物的形成，從而抑制促細胞生存基因的表達。綜上所述，復合物Ⅰ位于細胞存活和死亡的十字路口，能夠根據信號通路或微環境的不同狀態，決定細胞下一步的進展方向。
2.3 復合物Ⅱ的形成
當TNFR1受體從細胞膜上內化，同時TRADD和RIP1從復合物Ⅰ上解離并提供結合位點給Fas相關死亡域蛋白（FADD），caspase-8和RIPK3后形成新的細胞內超分子復合物，通常稱為復合物Ⅱ[13, 18-19]，現已明確其為致死性信號通路，故它也被稱為死亡誘導信號復合物（DISC）。在這之中RIP1的泛素化狀態對復合物Ⅰ能否轉化為復合物Ⅱ尤為重要[18-21]。到目前為止，最為明確的RIP1去泛素化酶為CYLD[22]。當然，其他的去泛素化酶如A20[23]、cezanne（a.k.a. OTUD7B）[24]和泛素化特異性肽酶21（USP21）[25]也有可能與RIP1有著尚不為人知的相互作用關系。研究表明，通過RNA干擾能抑制CYLD，進而阻止RIP1去泛素化，這能夠顯著抑制TNF所誘導的程序性壞死發生[26]。由于凋亡蛋白抑制劑（cIAPS）能起到維持RIP1的泛素化狀態的作用，在人為利用藥物或者基因的手段抑制cIAPS后阻止的RIPS泛素化更容易誘導細胞死亡的出現。由此表明，RIP1的泛素化是決定細胞命運的關鍵要素之一。
當復合物Ⅱ形成后，細胞將面臨兩個不同的結局：凋亡或是程序性壞死。其中當復合物Ⅱ上的caspase-8被激活后，RIP1和RIP3將從復合物Ⅱ上裂解下來并失活，進而激活caspase依賴的細胞凋亡途徑[26-27]。反之，通過藥物和基因手段抑制caspase-8的活性時，復合物Ⅱ轉而傳遞出細胞程序性壞死的信號[7, 10]。
然而，FADD和TRADD在復合物Ⅱ誘導的細胞死亡中的作用尚未完全闡明。缺乏FADD在某些細胞系（如Jurkat T淋巴細胞和原代T細胞）中有促進細胞壞死的作用[7, 28]，而在另一些細胞系，如小鼠胚胎成纖維細胞株（mouse embryonic fibroblasts）卻起著完全相反的作用[29]。由于TRADD敲除的細胞對TNF所誘導的凋亡和程序性壞死均不敏感，這就表明TRADD對復合物Ⅱ的活性的重要性。然而在SMAC與TNFR1結合誘導生成的復合物Ⅱ中TRADD卻不是必須的條件。所有這些表明TRADD對復合物Ⅱ的形成和激活起到的作用并不是一成不變，而是取決于細胞內環境所受刺激的類型[30-31]，也就是細胞微環境的特點。
2.4 壞死小體（RIP1-RIP3復合物）的形成
2005年Degterev等[8]合成了一種可以特異性抑制TNF誘導細胞壞死的小分子物質necrostatin-1，并于2008年鑒定出其作用底物為RIP1。2009年3個獨立的研究小組分別證明RIP3和RIP1相互作用所產生復合體可分別介導3種不同類型的細胞程序性壞死[18-19, 32]，這個復合體被命名為壞死小體（necrosome）。
RIP是一類具備特異性絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，它們有著共同的N端結構域和不同的C端結構域，在調節細胞存活或死亡的信號通路中發揮著重要的作用。研究發現小鼠在接受RIP1敲除后，淋巴和脂肪組織中凋亡反應出現過度激活的現象，導致出生數天后死亡，這進一步證實了RIP1有促進細胞存活的作用。CD95L、TRAIL或TNF+Z-VAD.fmk（caspase抑制劑）等均無法誘導RIP1敲除的T細胞產生程序性壞死，同時在Jurkat T細胞中RIP1的過表達可誘導出程序性壞死[7]，這些研究均說明RIP1在促進細胞死亡中所起的作用。RIP3擁有一個N末端KD結構域，通過與RIP1的C末端RIP同型結構域（RHIM）相結合[33]。RIP3的表達水平被認為在細胞中與TNFR1配體結合的活性有關，在凋亡受到抑制的情況下能激活程序性壞死。然而，與RIP1不同，RIP3不參與NF-κB信號通路，但它是TNFR1誘導程序性壞死發生中不可或缺的部分[18-19, 32]。
由于RIP1和RIP3的結合能被Nec-1所抑制，這表明RIP1酶的活性是RIP1-RIP3壞死小體形成的必備條件之一[18-19]。壞死小體通過調節RIP1和RIP3之間的活性產生促死亡信號，其具體機制很可能通過RIP1在S161位點的自身磷酸化以及RIP3對RIP1直接或間接磷酸化產生[18-19]。但無論是RIP1還是RIP3都有可能不是程序性壞死發生必不可缺的條件。例如，鼠巨細胞病毒感染就能誘導一種需要RIP3而不需RIP1的程序性壞死[34]；可以觀察到在缺乏RIP1的條件下過表達RIP3能獨立誘導程序性壞死[32, 35]。
到底壞死小體下游的作用蛋白是什么？這一謎底直到2012年才被揭示，通過Sun等[36]合成的小分子物質“necrosulfonamide”，可以特異性抑制壞死通路中RIP3下游壞死的激活，并進一步確定其作用底物為混合譜系激酶結構域樣蛋白（MKLK）。同一年，Zhao等[37]發現，在HT-29細胞中敲除MKLK能顯著抑制TNF所誘導的細胞壞死，并可減少活性氧類（ROS）的生成。這些研究都表明，MKLK是程序性壞死通路中RIP3下游路徑中的一個關鍵酶。但MKLK如何導致細胞最終死亡的機制至今仍不明確。
2.5 程序性壞死的執行
RIP1-RIP3壞死小體只是一個上游的促壞死信號，其導致細胞死亡的機制仍不甚明了。對于這個新的領域，關于壞死是如何執行，目前只發現了幾種可能的分子機制，現分述如下。
2.5.1 氧化應激
壞死小體通過調節下游ROS的生成，直接或者通過不同信號通路間接導致細胞死亡發生。在壞死小體形成后，RIP3通過激活一系列代謝相關酶促進線粒體ROS產生并加速能量代謝。2009年Zhang等[32]在NIH3T3細胞中發現RIP3與幾個參與谷氨酰胺和糖原代謝的酶[谷氨酰胺連接酶（GLUL），谷氨酰胺連接酶-1（GLUD-1），糖原磷酸化酶有（PYGL）]相互間有作用關系。RIP3能夠促進GLUL和GLUD-1的活化，從而增加谷氨酸鹽的分解，導致大量α酮二酸產生并進入Krebs循環中，最終引起過多的乳酸鹽堆積[38]。進一步的線粒體谷氨酸鹽分解代謝將導致局部自由氨堆積，然后通過呼吸鏈引起ROS的表達升高[39]。PYGL催化糖原裂解成1-磷酸葡萄糖，然后異構成6磷酸葡萄糖，進而促進糖酵解，促使ROS及細胞毒性丙酮醛的產生[40]。通過抑制GLUL、GLUD-1和PYGL的表達能夠減少TNF +Z-VAD.fmk誘導的ROS產生而產生抗壞死作用。這些結果表明線粒體ROS至少部分參與到程序性壞死的執行中[32]。
線粒體ROS有助于程序性壞死的發生但并不是絕對必須的[19]。線粒體外的ROS來源包括：糖酵解、晚期糖基化終產物以及NADPH氧化酶（NOX）1等。敲除NOX1后能抑制TNF誘導的ROS生成，但未能明顯抑制其誘導的L929細胞壞死，表明類似于線粒體ROS，NOX1誘導的ROS同樣不是壞死狀凋亡發生必不可少的條件[41]。而且在一些實驗研究中ROS清除劑表現出抗程序性壞死作用[42-44]，表明內源或外源性ROS在程序性壞死中的作用是不同的。
2.5.2 能量代謝方面
凋亡和壞死細胞中腺苷三磷酸（ATP）和腺苷二磷酸（ADP）水平不同，這是因為在凋亡細胞中幾個消耗ATP的過程被capases迅速抑制，所以凋亡細胞內的ATP含量不像壞死細胞一樣急劇下降。當一個參與DNA修復和轉錄控制的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）1被ROS損傷的DNA過度激活時，將導致ATP和輔酶Ⅰ（NAD）的耗竭以及PAR堆積，目前認為這與TNF+Z-VAD.fmk誘導的L929細胞程序性壞死有關[45-46]。
高活性的PRAP1能通過PAR介導的信號通路或是由于NAD衰竭，引起凋亡誘導因子（AIF）的釋放。當AIF位于其線粒體膜內正常位置時，發揮合成和維持呼吸反應復合物Ⅰ的活性履行功能。當AIF從線粒體釋放到細胞質中，其迅速進入到細胞核內并介導大范圍不依賴caspase的DNA碎裂，然后進一步激活PARP1，并通過自身級聯放大作用導致細胞死亡[46]。在HT22細胞中用谷氨酸鹽誘導壞死狀凋亡（同時伴隨PARP1過度激活），necrostatin-1能抑制PARP1的活性及線粒體釋放AIF，從而為細胞提供保護[47]。另外，PARP抑制劑同樣能對抗谷氨酸鹽對HT22的細胞毒性，為細胞提供保護[48]。在動物實驗中通過藥物和基因手段抑制PARP1也被證明具有持續的細胞保護作用。實驗中Harlequin變異的小鼠對某些誘導細胞死亡的疾病（如腦缺血）具有更大的耐受性[49]。敲除PARP1和PARP2能抑制TNF+Z-VAD.fmk誘導L929細胞出現壞死狀凋亡[22]。
腺嘌呤核苷酸轉運體被認為能與其他線粒體蛋白相互作用[如：電壓依賴陰離子通道（VDAC），親環素蛋白D（CYPD）]在線粒體膜上合成一個滲透性轉換通道復合體（PTPC）等。生理情況下，PTPC調節線粒體matrix基質和細胞質間能量交換。當受到有害刺激（如ROS，鈣離子超載）時，PTPC轉化成高傳導通道，允許溶質和水不受限的進入線粒體，即所謂的線粒體通透性改變[44]。目前認為CYPD是PTPC中最重要的結構，在僅僅敲除CYPD而不敲除VDAC和CYPD的小鼠中發現了對缺血損傷的神經保護和心肌保護作用[47]。上述這些發現說明線粒體在程序性壞死的執行中扮演著重要的角色。
2.5.3 溶酶體的作用
溶酶體膜的通透性發生改變然后被釋放到細胞質中的過程被認為參與了一部分的內源性凋亡過程[48-51]。超過了細胞清除能力的ROS攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸而產生有毒的醛類物質（如4-羥基壬烯醛），能共價修飾細胞膜上的蛋白和脂質，影響它們的穩定性。在線粒體水平，所帶來惡果有：抑制氧化磷酸化和ATP合成，改變細胞內膜通透性，導致線粒體膜轉運蛋白衰竭，鈣離子緩沖改變，引起溶酶體膜通透性升高（LMP）和細胞水解酶釋放。所有這些都有助于程序性壞死的執行。
體內實驗中，神經元在缺血性損傷下，溶酶體膜的完整性取決于鋅蛋白酶活性，而鋅蛋白酶的激活需要鈣離子。Calpains誘導的LMP導致多種溶酶體水解酶（如組織蛋白水解酶）釋放入細胞質。同caspases一樣，鋅蛋白酶同樣可以裂解，從而導致膜鈉離子-鈣離子交換失活[52]。在此情況下，通過細胞內鈣離子不可逆累積，一個自我激活的環狀通路開始運轉。通過基因手段調控一種能穩定溶酶體膜的熱休克蛋白（HSP）70為LMP在程序性壞死中作用提過了進一步證據。體內實驗發現HSP70可抑制TNF-α、HSP和過氧化氫誘導的程序性壞死[53]。而HSP70的過表達則可以起到保護線粒體免受缺血性損傷的作用。上述這些結果說明了多條部分重疊的機制參與了程序性壞死，與凋亡共用部分通路。
3 細胞程序性壞死與疾病的關系
程序性壞死不但在生物早期發育和成年后機體動態平衡中起作用，還廣泛參與了許多疾病的病理生理過程。在損傷性動物模型中，通過基因和藥物手段抑制程序性壞死相關的蛋白能顯著減輕細胞死亡。缺血再灌注損傷在親環蛋白和胞漿型磷脂酶A2α沉默的小鼠中顯著減輕[54]。而PRAP1沉默的動物較野生型動物更耐受出血性休克、急性胰腺炎和繼發性肺損傷[55]。同樣，蛙皮素誘導的胰泡細胞死亡和胰腺炎在RIP3敲除的小鼠中顯著減輕[19, 32]。在神經退行性疾病、缺血性腦損傷、缺血缺氧性腦損傷[8]、外傷性腦損傷、腎臟疾病和心肌梗死等疾病中，通過Nec-1抑制程序性壞死均表現出明顯的細胞保護作用。所有這些表明通過藥物和基因方式抑制程序性壞死在多種疾病中具有廣大的治療前景。
程序性壞死的缺失或者是相關基因的變異還可能與惡性腫瘤的發生有關。在非霍奇金淋巴瘤患者中已經發現RIP3變異，同時還有TNF和Toll樣受體信號通路的基因改變[56]。CYPD的失活可加速上皮癌細胞的增殖和遷移。程序性壞死還可加速腫瘤細胞死亡，增加其對抗腫瘤藥物的敏感性。一項關于兒童急性淋巴細胞性白血病的研究發現程序性壞死有助于克服急性淋巴細胞性白血病細胞的糖皮質激素抵抗。研究表明程序性壞死參與了由一種新的毒性治療引起的急性髓性白血病的細胞死亡[57]。紫草素可以誘導惡性上皮細胞及白血病細胞發生壞死，并且這一過程不被Z-VAD和3MA所影響，但可被Nec-1完全抑制，表明其誘導的是程序性壞死而不是凋亡。而且在過表達P糖蛋白、BCL-xl和BCL-2等抗凋亡誘導蛋白后，紫草素的抗腫瘤作用并未減弱，進一步說明其是通過程序性壞死發生作用[58]。所有這些結果表明程序性壞死可能是腫瘤化學療法特別是具有化學療法抗藥性腫瘤治療的一個新方向。
敲除RIP3的細胞感染牛痘病毒后明顯更耐受激活的T細胞和TNF-α誘導的細胞死亡，同時TNF-α可以在缺乏zVAD.fmk的情況下誘導牛痘病毒感染的細胞發生程序性壞死，表明程序性壞死在病毒感染的細胞死亡中起著重要的作用[45]。RIP3敲除的小鼠較野生型小鼠更易遭受病毒感染[18]，表明機體通過誘導程序性壞死來清除病毒感染的細胞。而且鼠巨細胞病毒M45蛋白需要通過完整的RHIM結構域與RIP1-RIP3相互作用[34]。上述結果表明程序性壞死可能參與抗病毒的機制。
4 結語
在過去的10余年，壞死作為一個被動的不受調控的細胞死亡方式的概念已經過時。盡管程序性壞死的研究目前才起步，其分子機制仍不明了。越來越多的資料表明壞死和凋亡一樣在許多疾病中具有高度可調節性，臨床應用中有較大的前景。將來的研究重點在于在體內實驗中闡明具體的分子級聯反應過程，并致力于發現類似于Nec-1的新的抑制程序性壞死的細胞保護藥物，以及可以誘導程序性壞死的化學細胞毒性藥物，為今后凋亡抵抗腫瘤的治療提供全新的研究領域。
細胞死亡是生物活動中一個非常重要的事件，一直以來是生命科學的研究熱點和難點。通常我們認為細胞的死亡方式包括3種類型：凋亡、自噬和壞死。其中凋亡被用來描述一種以細胞皺縮、核濃縮為主要特征的細胞死亡方式[1]。一系列研究表明凋亡廣泛存在于有機體的各種病理生理活動中，有著獨特的機制[2]。自噬是Ashford和Porter在1962年發現細胞內有“自己吃自己”的現象后提出，表現為自噬小體形成為主要特征的一種細胞死亡方式，包括微自噬、巨自噬和分子伴侶介導的自噬3種常見形式[3]。自噬可實現細胞本身的代謝循環，并與某些細胞器的更新相關，用以完成機體自我調節[4]。長期以來，壞死一直被認為是在嚴重物理、化學損傷下發生的無序細胞死亡過程，無法得以調控，是與程序性壞死（凋亡和自噬）截然不同的細胞死亡過程，典型特征表現為：細胞體積增大，細胞器腫脹和細胞質膜破裂。上個世紀末以來，這個觀點陸續受到越來越多實驗事實的考驗。首先，部分研究發現使用含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）抑制劑能使腫瘤壞死因子（TNF）誘導的細胞凋亡轉而發生細胞壞死[5-6]。2000年Holler等[7]發現，死亡受體Fas在受體相互作用蛋白激酶-1激活的情況下能夠通過Fas結合蛋白和死亡受體結合引起不再依賴caspase的非凋亡性細胞死亡。這表明一部分壞死可能和凋亡同樣是按某種程序發生的，并可以被調節。2005年，Degterev等[8]合成了一種小分子物質necrostatin-1，它可特異性抑制TNF誘導的細胞壞死，從而將這種不同于一般壞死的模式稱作壞死狀凋亡（necroptosis）。由此程序性壞死就被用來描述這類由受體介導、不依賴caspase蛋白酶、高度調節的具有典型壞死性形態特征的細胞死亡過程。隨著研究深入，程序性壞死被發現參與了許多疾病的病理生理過程，并日漸受到關注。本文將重點關注細胞程序性壞死的分子機制和病理生理特點，從而加以概述。
1 細胞程序性壞死的特征
Kerr等[1]1972年首先用“apoptosis這個詞描述了一種有特殊形態特征的亞類型細胞死亡方式，包括：細胞腫脹，染色質濃縮，基底膜破損，核碎裂，細胞碎片和凋亡小體的形成。
與其他細胞程序性死亡的形態學特點不同的是，細胞程序性壞死有著壞死的典型特征：如逐漸透明的細胞質、細胞器的腫脹、核內超微結構改變（核膜腫脹和染色質濃集成小塊）和細胞體積的增大，細胞質膜破裂的時候到底頂點[9]。這既不表現為凋亡的形態（壞死的細胞及細胞核不像凋亡細胞裂解成分離的小塊），也不伴細胞自噬的特點（細胞空泡的形成）。同時，其與一般意義上的壞死不同之處在于：程序性壞死具有可調節的特點，其主要特征是一種能通過分子機制調控的細胞壞死過程。
2 細胞程序性壞死的發生機制
2.1 細胞程序性壞死的啟動
死亡受體的激活可以誘導從恢復到損傷等多種結果，而當其與某些特定的受體[如Fas受體[10]、TNF受體1（TNFR1）、TNF相關凋亡誘導配體受體（TRAILR）1和TRAILR2[10-11]等]結合時，可誘導程序性的細胞死亡。近期研究發現，在凋亡途徑受到抑制時，在一些細胞系中死亡受體能誘導出不依賴caspase的壞死樣細胞死亡（程序性壞死）[12]。當然，能夠誘導程序性壞死的因素有很多，這一過程的啟動可能有多個因素的參與，其下游執行壞死的分子機制也有多條信號通路的參與，而目前被研究最廣泛的程序性壞死模式是由TNFR1所介導。現階段研究認為，TNFR1處于這個復雜信號通路的頂端和中心位置，它可根據細胞內外環境的不同，誘發不同的生物化學級聯反應。
2.2 復合物Ⅰ的形成
當TNF與細胞膜上的TNFR1細胞外死亡結構域結合后，受體可以迅速發生構象變化，并在細胞內募集多種蛋白參與這一級聯反應過程，包括：TNFR1相關死亡域蛋白（TRADD），受體相互作用蛋白-1（RIP1），cIAP1，cIAP2，TNF受體相關因子（TRAF）2，TRAF5等，通常稱它們一起形成的超分子復合物為“TNFR1復合物Ⅰ”[13]。傳統觀點認為，復合物Ⅰ主要通過經典的核因子（NF）-κB途徑激活促存活信號通路[14]。就復合物Ⅰ而言，TRAF通過抑制其自身泛素化穩定酸性磷酸酶（CIAP）（通常情況下不穩定），允許CIAP調節RIP1的K63泛素化[15-16]。最近有研究表明TRAF2在1-磷酸鞘氨酸存在時也能催化RIP1多位點泛素化[17]。而RIP1的泛素化狀態決定其傳遞促存活或是死亡信號，當RIP1的K63結構域泛素化為蛋白激酶TAK1后，就可與TAK1結合蛋白TAB 2和TAB 3相結合，形成TAK1-TAB 2-TAB 3 復合物，進而將下游NF-κB通路激活，進一步引起促細胞生存的基因信號表達[14]。而當去泛素化酶a.k.a. TNFAIP3（A20）和去泛素化酶（CYLD）在NF-κB通路中導致RIP1去泛素化時，又可抑制TAK1-TAB 2-TAB 3 復合物的形成，從而抑制促細胞生存基因的表達。綜上所述，復合物Ⅰ位于細胞存活和死亡的十字路口，能夠根據信號通路或微環境的不同狀態，決定細胞下一步的進展方向。
2.3 復合物Ⅱ的形成
當TNFR1受體從細胞膜上內化，同時TRADD和RIP1從復合物Ⅰ上解離并提供結合位點給Fas相關死亡域蛋白（FADD），caspase-8和RIPK3后形成新的細胞內超分子復合物，通常稱為復合物Ⅱ[13, 18-19]，現已明確其為致死性信號通路，故它也被稱為死亡誘導信號復合物（DISC）。在這之中RIP1的泛素化狀態對復合物Ⅰ能否轉化為復合物Ⅱ尤為重要[18-21]。到目前為止，最為明確的RIP1去泛素化酶為CYLD[22]。當然，其他的去泛素化酶如A20[23]、cezanne（a.k.a. OTUD7B）[24]和泛素化特異性肽酶21（USP21）[25]也有可能與RIP1有著尚不為人知的相互作用關系。研究表明，通過RNA干擾能抑制CYLD，進而阻止RIP1去泛素化，這能夠顯著抑制TNF所誘導的程序性壞死發生[26]。由于凋亡蛋白抑制劑（cIAPS）能起到維持RIP1的泛素化狀態的作用，在人為利用藥物或者基因的手段抑制cIAPS后阻止的RIPS泛素化更容易誘導細胞死亡的出現。由此表明，RIP1的泛素化是決定細胞命運的關鍵要素之一。
當復合物Ⅱ形成后，細胞將面臨兩個不同的結局：凋亡或是程序性壞死。其中當復合物Ⅱ上的caspase-8被激活后，RIP1和RIP3將從復合物Ⅱ上裂解下來并失活，進而激活caspase依賴的細胞凋亡途徑[26-27]。反之，通過藥物和基因手段抑制caspase-8的活性時，復合物Ⅱ轉而傳遞出細胞程序性壞死的信號[7, 10]。
然而，FADD和TRADD在復合物Ⅱ誘導的細胞死亡中的作用尚未完全闡明。缺乏FADD在某些細胞系（如Jurkat T淋巴細胞和原代T細胞）中有促進細胞壞死的作用[7, 28]，而在另一些細胞系，如小鼠胚胎成纖維細胞株（mouse embryonic fibroblasts）卻起著完全相反的作用[29]。由于TRADD敲除的細胞對TNF所誘導的凋亡和程序性壞死均不敏感，這就表明TRADD對復合物Ⅱ的活性的重要性。然而在SMAC與TNFR1結合誘導生成的復合物Ⅱ中TRADD卻不是必須的條件。所有這些表明TRADD對復合物Ⅱ的形成和激活起到的作用并不是一成不變，而是取決于細胞內環境所受刺激的類型[30-31]，也就是細胞微環境的特點。
2.4 壞死小體（RIP1-RIP3復合物）的形成
2005年Degterev等[8]合成了一種可以特異性抑制TNF誘導細胞壞死的小分子物質necrostatin-1，并于2008年鑒定出其作用底物為RIP1。2009年3個獨立的研究小組分別證明RIP3和RIP1相互作用所產生復合體可分別介導3種不同類型的細胞程序性壞死[18-19, 32]，這個復合體被命名為壞死小體（necrosome）。
RIP是一類具備特異性絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，它們有著共同的N端結構域和不同的C端結構域，在調節細胞存活或死亡的信號通路中發揮著重要的作用。研究發現小鼠在接受RIP1敲除后，淋巴和脂肪組織中凋亡反應出現過度激活的現象，導致出生數天后死亡，這進一步證實了RIP1有促進細胞存活的作用。CD95L、TRAIL或TNF+Z-VAD.fmk（caspase抑制劑）等均無法誘導RIP1敲除的T細胞產生程序性壞死，同時在Jurkat T細胞中RIP1的過表達可誘導出程序性壞死[7]，這些研究均說明RIP1在促進細胞死亡中所起的作用。RIP3擁有一個N末端KD結構域，通過與RIP1的C末端RIP同型結構域（RHIM）相結合[33]。RIP3的表達水平被認為在細胞中與TNFR1配體結合的活性有關，在凋亡受到抑制的情況下能激活程序性壞死。然而，與RIP1不同，RIP3不參與NF-κB信號通路，但它是TNFR1誘導程序性壞死發生中不可或缺的部分[18-19, 32]。
由于RIP1和RIP3的結合能被Nec-1所抑制，這表明RIP1酶的活性是RIP1-RIP3壞死小體形成的必備條件之一[18-19]。壞死小體通過調節RIP1和RIP3之間的活性產生促死亡信號，其具體機制很可能通過RIP1在S161位點的自身磷酸化以及RIP3對RIP1直接或間接磷酸化產生[18-19]。但無論是RIP1還是RIP3都有可能不是程序性壞死發生必不可缺的條件。例如，鼠巨細胞病毒感染就能誘導一種需要RIP3而不需RIP1的程序性壞死[34]；可以觀察到在缺乏RIP1的條件下過表達RIP3能獨立誘導程序性壞死[32, 35]。
到底壞死小體下游的作用蛋白是什么？這一謎底直到2012年才被揭示，通過Sun等[36]合成的小分子物質“necrosulfonamide”，可以特異性抑制壞死通路中RIP3下游壞死的激活，并進一步確定其作用底物為混合譜系激酶結構域樣蛋白（MKLK）。同一年，Zhao等[37]發現，在HT-29細胞中敲除MKLK能顯著抑制TNF所誘導的細胞壞死，并可減少活性氧類（ROS）的生成。這些研究都表明，MKLK是程序性壞死通路中RIP3下游路徑中的一個關鍵酶。但MKLK如何導致細胞最終死亡的機制至今仍不明確。
2.5 程序性壞死的執行
RIP1-RIP3壞死小體只是一個上游的促壞死信號，其導致細胞死亡的機制仍不甚明了。對于這個新的領域，關于壞死是如何執行，目前只發現了幾種可能的分子機制，現分述如下。
2.5.1 氧化應激
壞死小體通過調節下游ROS的生成，直接或者通過不同信號通路間接導致細胞死亡發生。在壞死小體形成后，RIP3通過激活一系列代謝相關酶促進線粒體ROS產生并加速能量代謝。2009年Zhang等[32]在NIH3T3細胞中發現RIP3與幾個參與谷氨酰胺和糖原代謝的酶[谷氨酰胺連接酶（GLUL），谷氨酰胺連接酶-1（GLUD-1），糖原磷酸化酶有（PYGL）]相互間有作用關系。RIP3能夠促進GLUL和GLUD-1的活化，從而增加谷氨酸鹽的分解，導致大量α酮二酸產生并進入Krebs循環中，最終引起過多的乳酸鹽堆積[38]。進一步的線粒體谷氨酸鹽分解代謝將導致局部自由氨堆積，然后通過呼吸鏈引起ROS的表達升高[39]。PYGL催化糖原裂解成1-磷酸葡萄糖，然后異構成6磷酸葡萄糖，進而促進糖酵解，促使ROS及細胞毒性丙酮醛的產生[40]。通過抑制GLUL、GLUD-1和PYGL的表達能夠減少TNF +Z-VAD.fmk誘導的ROS產生而產生抗壞死作用。這些結果表明線粒體ROS至少部分參與到程序性壞死的執行中[32]。
線粒體ROS有助于程序性壞死的發生但并不是絕對必須的[19]。線粒體外的ROS來源包括：糖酵解、晚期糖基化終產物以及NADPH氧化酶（NOX）1等。敲除NOX1后能抑制TNF誘導的ROS生成，但未能明顯抑制其誘導的L929細胞壞死，表明類似于線粒體ROS，NOX1誘導的ROS同樣不是壞死狀凋亡發生必不可少的條件[41]。而且在一些實驗研究中ROS清除劑表現出抗程序性壞死作用[42-44]，表明內源或外源性ROS在程序性壞死中的作用是不同的。
2.5.2 能量代謝方面
凋亡和壞死細胞中腺苷三磷酸（ATP）和腺苷二磷酸（ADP）水平不同，這是因為在凋亡細胞中幾個消耗ATP的過程被capases迅速抑制，所以凋亡細胞內的ATP含量不像壞死細胞一樣急劇下降。當一個參與DNA修復和轉錄控制的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）1被ROS損傷的DNA過度激活時，將導致ATP和輔酶Ⅰ（NAD）的耗竭以及PAR堆積，目前認為這與TNF+Z-VAD.fmk誘導的L929細胞程序性壞死有關[45-46]。
高活性的PRAP1能通過PAR介導的信號通路或是由于NAD衰竭，引起凋亡誘導因子（AIF）的釋放。當AIF位于其線粒體膜內正常位置時，發揮合成和維持呼吸反應復合物Ⅰ的活性履行功能。當AIF從線粒體釋放到細胞質中，其迅速進入到細胞核內并介導大范圍不依賴caspase的DNA碎裂，然后進一步激活PARP1，并通過自身級聯放大作用導致細胞死亡[46]。在HT22細胞中用谷氨酸鹽誘導壞死狀凋亡（同時伴隨PARP1過度激活），necrostatin-1能抑制PARP1的活性及線粒體釋放AIF，從而為細胞提供保護[47]。另外，PARP抑制劑同樣能對抗谷氨酸鹽對HT22的細胞毒性，為細胞提供保護[48]。在動物實驗中通過藥物和基因手段抑制PARP1也被證明具有持續的細胞保護作用。實驗中Harlequin變異的小鼠對某些誘導細胞死亡的疾病（如腦缺血）具有更大的耐受性[49]。敲除PARP1和PARP2能抑制TNF+Z-VAD.fmk誘導L929細胞出現壞死狀凋亡[22]。
腺嘌呤核苷酸轉運體被認為能與其他線粒體蛋白相互作用[如：電壓依賴陰離子通道（VDAC），親環素蛋白D（CYPD）]在線粒體膜上合成一個滲透性轉換通道復合體（PTPC）等。生理情況下，PTPC調節線粒體matrix基質和細胞質間能量交換。當受到有害刺激（如ROS，鈣離子超載）時，PTPC轉化成高傳導通道，允許溶質和水不受限的進入線粒體，即所謂的線粒體通透性改變[44]。目前認為CYPD是PTPC中最重要的結構，在僅僅敲除CYPD而不敲除VDAC和CYPD的小鼠中發現了對缺血損傷的神經保護和心肌保護作用[47]。上述這些發現說明線粒體在程序性壞死的執行中扮演著重要的角色。
2.5.3 溶酶體的作用
溶酶體膜的通透性發生改變然后被釋放到細胞質中的過程被認為參與了一部分的內源性凋亡過程[48-51]。超過了細胞清除能力的ROS攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸而產生有毒的醛類物質（如4-羥基壬烯醛），能共價修飾細胞膜上的蛋白和脂質，影響它們的穩定性。在線粒體水平，所帶來惡果有：抑制氧化磷酸化和ATP合成，改變細胞內膜通透性，導致線粒體膜轉運蛋白衰竭，鈣離子緩沖改變，引起溶酶體膜通透性升高（LMP）和細胞水解酶釋放。所有這些都有助于程序性壞死的執行。
體內實驗中，神經元在缺血性損傷下，溶酶體膜的完整性取決于鋅蛋白酶活性，而鋅蛋白酶的激活需要鈣離子。Calpains誘導的LMP導致多種溶酶體水解酶（如組織蛋白水解酶）釋放入細胞質。同caspases一樣，鋅蛋白酶同樣可以裂解，從而導致膜鈉離子-鈣離子交換失活[52]。在此情況下，通過細胞內鈣離子不可逆累積，一個自我激活的環狀通路開始運轉。通過基因手段調控一種能穩定溶酶體膜的熱休克蛋白（HSP）70為LMP在程序性壞死中作用提過了進一步證據。體內實驗發現HSP70可抑制TNF-α、HSP和過氧化氫誘導的程序性壞死[53]。而HSP70的過表達則可以起到保護線粒體免受缺血性損傷的作用。上述這些結果說明了多條部分重疊的機制參與了程序性壞死，與凋亡共用部分通路。
3 細胞程序性壞死與疾病的關系
程序性壞死不但在生物早期發育和成年后機體動態平衡中起作用，還廣泛參與了許多疾病的病理生理過程。在損傷性動物模型中，通過基因和藥物手段抑制程序性壞死相關的蛋白能顯著減輕細胞死亡。缺血再灌注損傷在親環蛋白和胞漿型磷脂酶A2α沉默的小鼠中顯著減輕[54]。而PRAP1沉默的動物較野生型動物更耐受出血性休克、急性胰腺炎和繼發性肺損傷[55]。同樣，蛙皮素誘導的胰泡細胞死亡和胰腺炎在RIP3敲除的小鼠中顯著減輕[19, 32]。在神經退行性疾病、缺血性腦損傷、缺血缺氧性腦損傷[8]、外傷性腦損傷、腎臟疾病和心肌梗死等疾病中，通過Nec-1抑制程序性壞死均表現出明顯的細胞保護作用。所有這些表明通過藥物和基因方式抑制程序性壞死在多種疾病中具有廣大的治療前景。
程序性壞死的缺失或者是相關基因的變異還可能與惡性腫瘤的發生有關。在非霍奇金淋巴瘤患者中已經發現RIP3變異，同時還有TNF和Toll樣受體信號通路的基因改變[56]。CYPD的失活可加速上皮癌細胞的增殖和遷移。程序性壞死還可加速腫瘤細胞死亡，增加其對抗腫瘤藥物的敏感性。一項關于兒童急性淋巴細胞性白血病的研究發現程序性壞死有助于克服急性淋巴細胞性白血病細胞的糖皮質激素抵抗。研究表明程序性壞死參與了由一種新的毒性治療引起的急性髓性白血病的細胞死亡[57]。紫草素可以誘導惡性上皮細胞及白血病細胞發生壞死，并且這一過程不被Z-VAD和3MA所影響，但可被Nec-1完全抑制，表明其誘導的是程序性壞死而不是凋亡。而且在過表達P糖蛋白、BCL-xl和BCL-2等抗凋亡誘導蛋白后，紫草素的抗腫瘤作用并未減弱，進一步說明其是通過程序性壞死發生作用[58]。所有這些結果表明程序性壞死可能是腫瘤化學療法特別是具有化學療法抗藥性腫瘤治療的一個新方向。
敲除RIP3的細胞感染牛痘病毒后明顯更耐受激活的T細胞和TNF-α誘導的細胞死亡，同時TNF-α可以在缺乏zVAD.fmk的情況下誘導牛痘病毒感染的細胞發生程序性壞死，表明程序性壞死在病毒感染的細胞死亡中起著重要的作用[45]。RIP3敲除的小鼠較野生型小鼠更易遭受病毒感染[18]，表明機體通過誘導程序性壞死來清除病毒感染的細胞。而且鼠巨細胞病毒M45蛋白需要通過完整的RHIM結構域與RIP1-RIP3相互作用[34]。上述結果表明程序性壞死可能參與抗病毒的機制。
4 結語
在過去的10余年，壞死作為一個被動的不受調控的細胞死亡方式的概念已經過時。盡管程序性壞死的研究目前才起步，其分子機制仍不明了。越來越多的資料表明壞死和凋亡一樣在許多疾病中具有高度可調節性，臨床應用中有較大的前景。將來的研究重點在于在體內實驗中闡明具體的分子級聯反應過程，并致力于發現類似于Nec-1的新的抑制程序性壞死的細胞保護藥物，以及可以誘導程序性壞死的化學細胞毒性藥物，為今后凋亡抵抗腫瘤的治療提供全新的研究領域。