引用本文： 胡靜, 李立新, 羅俐梅, 李壹, 黃卓春, 彭曉東, 武永康. 全自動間接免疫熒光法分析儀檢測抗核抗體與人工判讀的對比研究. 華西醫學, 2016, 31(6): 1084-1087. doi: 10.7507/1002-0179.201600291 復制
抗核抗體（ANA）是泛指一類具有抗各種細胞成分的自身抗體，現已被證實ANA與某些自身免疫性疾病（如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、系統性硬化癥、干燥綜合征等）的致病機制有關[1-2]。ANA的檢測主要應用于醫學診斷領域，但同時也被認為是一個可以評估預后和指導治療方法的指標[3]。目前，對于實現ANA標準化測試的需求仍然是一個挑戰，因為其分析變異性是很高的[4-7]。目前臨床上有多種檢測ANA的方法，其中間接免疫熒光（IIF）法是ANA檢測的推薦方法[8]，此方法具有較高的靈敏度，能夠檢測出50余種抗體，所以通常作為診斷自身免疫性疾病的首選方法[8-12]。但IIF法熒光載片必須要由有經驗的檢驗人員進行顯微鏡檢查以判斷其核型和滴度，在標本量大的情況下，全部人工顯微鏡檢查任務繁重，并且有一定的主觀性，標準化和自動化程度相對比較低[13-15]。全自動間接免疫熒光法分析儀（HELIOS）是一種全新的IIF實驗處理平臺，可以集熒光實驗前端染色處理與后端圖像采集、判讀于一體，具有通量高、操作速度快、設計人性化、性能穩定、外形小巧等特點。本研究將探討HELIOS對ANA的讀片結果與人工顯微鏡檢查結果的一致性。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 標本來源
選取四川大學華西醫院實驗醫學科2015年2月來院就診的門診及住院患者的標本共281例。
1.1.2 采用試劑及儀器
德國 AESKU.DIAGNOSTICS GmbH&Co.KG公司生產的ANA檢測試劑盒（IIF法）和HELIOS分析儀；Nikon E600 熒光顯微鏡（日本尼康株式會社）。
1.2 方法
用HELIOS檢測ANA，按其儀器操作規程將281例標本上機實驗并自動判讀陰陽性及滴度結果；對比方法：實驗后的載片由專業人員在熒光顯微鏡下進行陰陽性及滴度判讀，在熒光顯微鏡下觀察人喉癌上皮（Hep-2）細胞的熒光染色情況，若無熒光染色為陰性，若有熒光染色，但是不能區分是何種熒光模型則判斷為可疑（±），若有較強的熒光染色并且能判斷熒光模型則為陽性。陽性結果的滴度判斷則與HELIOS的滴度判斷一致，依次為1︰80、1︰160、1︰320、1︰640、1︰1 280、1︰2 560。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。兩種方法陰陽性比較采用配對χ2檢驗；采用kappa值進行一致性檢驗；兩種方法的一致程度用符合率表示，總的符合率= （兩種方法結果一致的總數/樣本總數）×100%，陽性符合率= （兩種方法都陽性的總數/實驗方法的陽性總數） ×100%，陰性符合率=（兩種方法都陰性的總數/實驗方法的陰性總數）×100%；兩種方法各個滴度之間的比較采用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 HELIOS判讀與人工顯微鏡檢查的陰陽性比較
281例樣本中，人工顯微鏡檢查陽性203例，HELIOS陽性者201例，兩者差異無統計學意義（P＞0.05），一致性檢驗kappa值為0.973。通過計算得出總的符合率是98.9%，陽性符合率為99.5%，陰性符合率為97.4%。人工顯微鏡檢查結果和HELIOS判讀結果比較見表 1。
表1
HELIOS判讀與人工顯微鏡檢查的陰陽性比較（例）
2.2 HELIOS判讀與人工顯微鏡檢查的各個滴度比較
HELIOS判讀與人工顯微鏡檢查的各個滴度的差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
HELIOS判讀與人工顯微鏡檢查的各個滴度比較（例）
3 討論
ANA是診斷自身免疫性疾病的重要指標，以Hep-2細胞作為基質的IIF法是檢測ANA的最主要的方法，而此方法結果的準確性除了取決于熒光載片的質量、操作過程的準確，更重要的是實驗室專業人員對熒光載片的顯微鏡檢查。由于實驗室工作人員對于樣本熒光核型的判斷容易出現錯判或漏判，而對于滴度的判斷容易高判或弱判，目前人工實驗滴度準確判斷的唯一途徑是梯度稀釋法，不僅浪費時間、試劑，且臨床應用極少。所以，實現自身抗體的全自動檢測（包括自動化實驗操作與結果判讀）并在此基礎上逐漸實現全過程的標準化是未來的發展趨勢。
ANA的IIF實驗結果判斷包括陰陽性、熒光核型和對應的熒光滴度，其中陰陽性和熒光滴度對于臨床來說最為重要，而熒光核型可以輔助ANA譜對應自身抗體的確認和疾病臨床診斷。從現有IIF自動化結果判斷系統的功能及其狀態來看，所有系統均采用自動化熒光顯微鏡及成像系統，對熒光反應區進行區域多點自動化成像后通過軟件進行結果判讀；大部分系統均可以對陰陽性、熒光滴度和熒光核型進行自動化判讀。Bizzaro等[13]的研究對市場上現存的6種IIF熒光片自動判讀系統進行了單獨Hep-2細胞基質的ANA熒光結果多中心比對試驗，從結果來看，所有系統僅有陰陽性及滴度判斷可應用于臨床，準確度及特異度均可達90%左右；而熒光核型由于其僅能實現針對檢測ANA的Hep-2細胞基質部分單獨熒光模型（最多7種）達到約60%～70%左右準確性的判讀，對于其他模型尤其是廣泛存在的混合模型無法實現自動化判讀，且所有結果均須經過閱片專家確認后方可報告，一定程度上反而增加了檢測實驗的時間精力耗費，因此不建議將其直接應用于臨床檢測。
本研究對同一批臨床隨機常規標本采用HELIOS自動判讀系統與人工顯微鏡檢查進行比較，HELIOS自動判讀系統是將標本檢測和載片判讀（僅限于陰陽性與滴度）集于一體的自動化儀器，從開始檢測到最后儀器自動出讀片結果，可無人值守，但其最后結果也須經閱片專家確認方可報告。
本研究比較了兩種方法的陰陽性結果以及陽性滴度的結果。經過統計分析，配對χ2檢驗差異無統計學意義，方法學比較的一致性檢驗kappa=0.973，表明一致性較好，說明HELIOS自動判讀系統可以用于臨床。但大多數醫院在報告ANA陽性結果時，內容都包含核型和滴度，但這套系統只能用于滴度的判斷，而不能對標本核型進行判讀。所以，如果將這套系統應用于臨床，在儀器自動出結果之后實驗人員需再調取標本相應的圖片，進行滴度的復核，以及核型的判斷。雖然HELIOS自動判讀系統不能完全實現自動化，但是能夠有效篩選出陽性標本，并減少人工判斷滴度的步驟并提高滴度判讀的準確性和穩定性，從目前ANA 的IIF常規標本檢查陽性率10%～30%左右、體檢標本陽性率不超過5%的現狀來看，應用HELIOS確實可以提高工作效率。而且HELIOS通過實驗操作和結果判讀的全過程自動化，所有實驗過程均全部記錄儲存可完整回溯，疑難結果可由專家進行遠程和補充會診確認；而不同實驗室間采用該系統可實現室內結果穩定和室間結果無差別互認，對于IIF的標準化是一個顯著進展。
HELIOS自動判讀系統的自動化程度相對較高，重復性好，可以降低人工判讀所帶來的誤差，提高滴度判讀的準確性。儀器可在無人值守的情況下正常運行，提高工作效率。載片經封片后可長期保存，不影響判讀結果。儀器采集的樣本圖片可永久保存，方便實驗人員對樣本的熒光核型進行再判斷，遇到有疑問或需復查的患者可進行圖片比對。儀器通量較大（可同時檢測最多190個樣本，20張載片），速度較快、外形小巧，既適用于不同規模的臨床實驗檢測，更有利于自身抗體體檢。
綜上所述，本研究認為HELIOS自動判讀系統應用于臨床可以提高工作效率，促進標準統一。
抗核抗體（ANA）是泛指一類具有抗各種細胞成分的自身抗體，現已被證實ANA與某些自身免疫性疾病（如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、系統性硬化癥、干燥綜合征等）的致病機制有關[1-2]。ANA的檢測主要應用于醫學診斷領域，但同時也被認為是一個可以評估預后和指導治療方法的指標[3]。目前，對于實現ANA標準化測試的需求仍然是一個挑戰，因為其分析變異性是很高的[4-7]。目前臨床上有多種檢測ANA的方法，其中間接免疫熒光（IIF）法是ANA檢測的推薦方法[8]，此方法具有較高的靈敏度，能夠檢測出50余種抗體，所以通常作為診斷自身免疫性疾病的首選方法[8-12]。但IIF法熒光載片必須要由有經驗的檢驗人員進行顯微鏡檢查以判斷其核型和滴度，在標本量大的情況下，全部人工顯微鏡檢查任務繁重，并且有一定的主觀性，標準化和自動化程度相對比較低[13-15]。全自動間接免疫熒光法分析儀（HELIOS）是一種全新的IIF實驗處理平臺，可以集熒光實驗前端染色處理與后端圖像采集、判讀于一體，具有通量高、操作速度快、設計人性化、性能穩定、外形小巧等特點。本研究將探討HELIOS對ANA的讀片結果與人工顯微鏡檢查結果的一致性。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 標本來源
選取四川大學華西醫院實驗醫學科2015年2月來院就診的門診及住院患者的標本共281例。
1.1.2 采用試劑及儀器
德國 AESKU.DIAGNOSTICS GmbH&Co.KG公司生產的ANA檢測試劑盒（IIF法）和HELIOS分析儀；Nikon E600 熒光顯微鏡（日本尼康株式會社）。
1.2 方法
用HELIOS檢測ANA，按其儀器操作規程將281例標本上機實驗并自動判讀陰陽性及滴度結果；對比方法：實驗后的載片由專業人員在熒光顯微鏡下進行陰陽性及滴度判讀，在熒光顯微鏡下觀察人喉癌上皮（Hep-2）細胞的熒光染色情況，若無熒光染色為陰性，若有熒光染色，但是不能區分是何種熒光模型則判斷為可疑（±），若有較強的熒光染色并且能判斷熒光模型則為陽性。陽性結果的滴度判斷則與HELIOS的滴度判斷一致，依次為1︰80、1︰160、1︰320、1︰640、1︰1 280、1︰2 560。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。兩種方法陰陽性比較采用配對χ2檢驗；采用kappa值進行一致性檢驗；兩種方法的一致程度用符合率表示，總的符合率= （兩種方法結果一致的總數/樣本總數）×100%，陽性符合率= （兩種方法都陽性的總數/實驗方法的陽性總數） ×100%，陰性符合率=（兩種方法都陰性的總數/實驗方法的陰性總數）×100%；兩種方法各個滴度之間的比較采用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 HELIOS判讀與人工顯微鏡檢查的陰陽性比較
281例樣本中，人工顯微鏡檢查陽性203例，HELIOS陽性者201例，兩者差異無統計學意義（P＞0.05），一致性檢驗kappa值為0.973。通過計算得出總的符合率是98.9%，陽性符合率為99.5%，陰性符合率為97.4%。人工顯微鏡檢查結果和HELIOS判讀結果比較見表 1。
表1
HELIOS判讀與人工顯微鏡檢查的陰陽性比較（例）
2.2 HELIOS判讀與人工顯微鏡檢查的各個滴度比較
HELIOS判讀與人工顯微鏡檢查的各個滴度的差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
HELIOS判讀與人工顯微鏡檢查的各個滴度比較（例）
3 討論
ANA是診斷自身免疫性疾病的重要指標，以Hep-2細胞作為基質的IIF法是檢測ANA的最主要的方法，而此方法結果的準確性除了取決于熒光載片的質量、操作過程的準確，更重要的是實驗室專業人員對熒光載片的顯微鏡檢查。由于實驗室工作人員對于樣本熒光核型的判斷容易出現錯判或漏判，而對于滴度的判斷容易高判或弱判，目前人工實驗滴度準確判斷的唯一途徑是梯度稀釋法，不僅浪費時間、試劑，且臨床應用極少。所以，實現自身抗體的全自動檢測（包括自動化實驗操作與結果判讀）并在此基礎上逐漸實現全過程的標準化是未來的發展趨勢。
ANA的IIF實驗結果判斷包括陰陽性、熒光核型和對應的熒光滴度，其中陰陽性和熒光滴度對于臨床來說最為重要，而熒光核型可以輔助ANA譜對應自身抗體的確認和疾病臨床診斷。從現有IIF自動化結果判斷系統的功能及其狀態來看，所有系統均采用自動化熒光顯微鏡及成像系統，對熒光反應區進行區域多點自動化成像后通過軟件進行結果判讀；大部分系統均可以對陰陽性、熒光滴度和熒光核型進行自動化判讀。Bizzaro等[13]的研究對市場上現存的6種IIF熒光片自動判讀系統進行了單獨Hep-2細胞基質的ANA熒光結果多中心比對試驗，從結果來看，所有系統僅有陰陽性及滴度判斷可應用于臨床，準確度及特異度均可達90%左右；而熒光核型由于其僅能實現針對檢測ANA的Hep-2細胞基質部分單獨熒光模型（最多7種）達到約60%～70%左右準確性的判讀，對于其他模型尤其是廣泛存在的混合模型無法實現自動化判讀，且所有結果均須經過閱片專家確認后方可報告，一定程度上反而增加了檢測實驗的時間精力耗費，因此不建議將其直接應用于臨床檢測。
本研究對同一批臨床隨機常規標本采用HELIOS自動判讀系統與人工顯微鏡檢查進行比較，HELIOS自動判讀系統是將標本檢測和載片判讀（僅限于陰陽性與滴度）集于一體的自動化儀器，從開始檢測到最后儀器自動出讀片結果，可無人值守，但其最后結果也須經閱片專家確認方可報告。
本研究比較了兩種方法的陰陽性結果以及陽性滴度的結果。經過統計分析，配對χ2檢驗差異無統計學意義，方法學比較的一致性檢驗kappa=0.973，表明一致性較好，說明HELIOS自動判讀系統可以用于臨床。但大多數醫院在報告ANA陽性結果時，內容都包含核型和滴度，但這套系統只能用于滴度的判斷，而不能對標本核型進行判讀。所以，如果將這套系統應用于臨床，在儀器自動出結果之后實驗人員需再調取標本相應的圖片，進行滴度的復核，以及核型的判斷。雖然HELIOS自動判讀系統不能完全實現自動化，但是能夠有效篩選出陽性標本，并減少人工判斷滴度的步驟并提高滴度判讀的準確性和穩定性，從目前ANA 的IIF常規標本檢查陽性率10%～30%左右、體檢標本陽性率不超過5%的現狀來看，應用HELIOS確實可以提高工作效率。而且HELIOS通過實驗操作和結果判讀的全過程自動化，所有實驗過程均全部記錄儲存可完整回溯，疑難結果可由專家進行遠程和補充會診確認；而不同實驗室間采用該系統可實現室內結果穩定和室間結果無差別互認，對于IIF的標準化是一個顯著進展。
HELIOS自動判讀系統的自動化程度相對較高，重復性好，可以降低人工判讀所帶來的誤差，提高滴度判讀的準確性。儀器可在無人值守的情況下正常運行，提高工作效率。載片經封片后可長期保存，不影響判讀結果。儀器采集的樣本圖片可永久保存，方便實驗人員對樣本的熒光核型進行再判斷，遇到有疑問或需復查的患者可進行圖片比對。儀器通量較大（可同時檢測最多190個樣本，20張載片），速度較快、外形小巧，既適用于不同規模的臨床實驗檢測，更有利于自身抗體體檢。
綜上所述，本研究認為HELIOS自動判讀系統應用于臨床可以提高工作效率，促進標準統一。
