引用本文： 姜小飛, 葉芬, 石理, 陳曦, 朱衛民, 張業明. 靶向人血管內皮生長因子A基因小片段干擾RNA慢病毒載體的構建、比較及鑒定. 華西醫學, 2016, 31(1): 1-6. doi: 10.7507/1002-0179.20160001 復制
自上世紀80年代發現血管內皮生長因子（VEGF）以來，VEGF路徑被認為是血管生成過程的關鍵調節者，因此其也被視為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）治療中新生血管生成的一個重要靶點，并在基礎及臨床應用領域進行了大量的研究[1-5]。VEGF相關基因家族包括：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE及胎盤生長因子（PIGF）等6種分泌型的糖蛋白。它們與相應受體結合增加了血管通透性，刺激了脈管生成。其中，VEGFA相對分子質量為45×103，具有強大血管生成活性的糖蛋白[6]。其含有8個外顯子和7個內含子，根據不同的剪切方式形成5種VEGF單體，分別為VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145及VEGF121。
本實驗嘗試使用慢病毒作為載體，設計針對人VEGFA基因的小干擾RNA（siRNA）序列，包裝并作為抑制人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的VEGFA表達的手段，尋求相對高效的siRNA序列。
1 材料與方法
1.1 材料
HUVEC（ATCC@number：CRL-1730TM，由四川大學華西醫院人類疾病相關多肽實驗室饋贈）；ACE2 抗體（美國Santa Cruz公司）；Revert AidTM First St rand cDNA Synthesis Kit（立陶宛MBI公司）；Taq DNA聚合酶、聚合酶鏈反應（PCR）反應緩沖液（10倍）；（北京BioDev生物基因技術公司）；dNTP（美國Promega公司）；Trizol（美國MRC公司）；pGCSIL-GFP載體、dsDNA oligo 及PCR用試劑 primer（R&F）（上海吉凱基因技術有限公司）；人胚腎細胞株（293T細胞）（中科院上海細胞庫）。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組
按照選擇的siRNA的序列不同，分為KD1、KD2、KD3組；每一組再分為：對照組：未感染任何病毒的細胞組；陰性對照組：加不含有siRNA的病毒感染的細胞組；實驗組：加RNAi靶點病毒感染的細胞組。
1.2.2 目的基因RNA干擾慢病毒載體制備
采用 Ambion shRNA分析軟件掃描轉錄本中AA雙核苷酸序列，記錄靠近3’端的19個核苷酸和每一個AA雙核苷酸序列，作為潛在的siRNA目標位點，同時以G/C比率在30%～50%之間作為選擇因素之一。我們結合現有報道對人VEGFA基因 siRNA的設計[
表1
siRNA 基因序列
表2
病毒框架序列
1.2.3 慢病毒的包裝
轉染前24 h，用0.25%的胰酶消化對數生長期的293T細胞，調整細胞密度為1.2×107細胞/20 mL，接種于15 cm 細胞培養皿，培養并待細胞密度達70%～80%時即可用于轉染。取慢病毒載體pGCSIL-siVEGFA 20 μg，pHelper 1.0 15 μg，pHelper 2.0 10 μg，與相應體積的Opti-MEM混合均勻，調整總體積為2.5 mL，再加入100 μL Lipofectamine 2000與2.4 mL Opti-MEM的混合物，以形成DNA與Lipofectamine 2000的混合液，并轉移至293T細胞的培養液中，培養8 h后倒去培養基，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后加入培養基培養48 h。收集感染后的細胞上清液，即為病毒原液，Plus-20離心超濾裝置對病毒液進行濃縮，置于-80℃保存。
1.2.4 病毒滴度測定（孔稀釋法）
將病毒原液用改良Eagle培養基（DMEM）培養液稀釋成每100 μL中含10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6 μL濃度梯度的病毒液，分別感染293T細胞。培養24 h后更換完全培養基100 μL繼續培養，4 d后，用倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達情況。根據熒光圖片中綠色熒光蛋白表達情況，以熒光細胞的個數/病毒原液稀釋的倍數×1 000=病毒原液的滴度，單位為TU/μL。
1.2.5 HUVEC的感染
用含胎牛血清的DMEM培養基將HUVEC制成細胞懸液，并接種于6孔板中（細胞數約為5×104/孔），37℃、5%二氧化碳培養箱培養待細胞融合度達到約30%。按照感染復數=20，加入相應劑量的病毒；12 h后觀察細胞狀態：若無明顯的細胞毒性作用，繼續培養24 h后更換培養基；若有明顯的細胞毒性作用，立即更換培養基；感染3 d后，熒光率＞80%者，分于12孔培養板中繼續培養，待長細胞滿培養板后收集細胞，用于RNA提取；感染效率低于80%的實驗組，重新進行感染實驗。
1.2.6 實時PCR內源性篩查靶點
采用實時PCR的方法檢測VEGFA基因的表達情況。用Trizol試劑提取細胞總RNA，以Takara公司反轉錄試劑盒，取1 μg總RNA反轉成cDNA，采用核苷酸熒光（SYBR Green）染料法在熒光定量PCR儀上檢測目的基因的表達。VEGFA上游引物5’-CAGATGTGACAAGCCGAGG-3，下游引物：5’-CGATGGTGATGGTGTGGTG-3’，目的產物擴增片段144 bp。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物：5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’，目的產物擴增片段121 bp。定量PCR 反應程序：95℃、15 s；變性95℃、5 s；退火延伸60℃、30 s 反應45 個循環。擴增完畢后，進行熔解曲線分析，95℃、1 min，55℃、1 min，55～95℃，4 s，連續監測熒光。擴增結束后分析熔解曲線，在熔解曲線上以具有單峰判斷PCR擴增的單一性。同時設無模板對照，每份標本行3次實時PCR 檢測，取平均值。用隨機附帶的軟件進行目的基因的相對定量表達分析。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行分析。將原始數據（Ct值）換算為基因的相對表達量（2-ΔΔCt），并用均數±標準差表示，兩兩比較用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Age Ⅰ和EcoRⅠ酶切pGCSIL-GFP載體
經酶切后的載體質粒電泳后條帶在7 500 bp附近，克隆酶切完全。見圖 1。
圖1
酶切后載體質粒電泳圖
1：Marker；2：無酶切的載體質粒；3：AgeⅠ和EcoRⅠ酶切線性化后的載體質粒
2.2 陽性克隆PCR的鑒定
KD1組下顎骨4～7泳道的條帶位置在350 bp左右，為陽性克隆；8泳道條帶位置在300 bp左右，為陰性克隆。KD 2組，4、5、7、8泳道為陽性克隆， 6泳道為陰性克隆。KD 3組，4、6、7、8泳道為陽性克隆，5泳道為陰性克隆。見圖 2。
圖2
PCR產物電泳圖
1：陰性對照（ddH2O）；2：自連對照(空載體自連對照組)；3：Marker；4～8：PCR產物 a. KD1組 b. KD2組 c. KD3組
3組陽性克隆的測序結果（圖 3）均與本實驗所設計合成的病毒載體構建框架（表 2）的vshRNA框架序列一致，pGCSIL-vshRNA-GFP載體構建成功。
圖3
陽性克隆測序圖
a. KD1組的陽性克隆測序全片段序列，作用區間為192～248 b. KD2組的陽性克隆測序全片段序列，作用區間為191～251 c. KD3組的陽性克隆測序全片段序列，作用區間為195～255
2.3 Lentivirus 滴度測定結果
KD1組在加入1×10-5 μL病毒原液的孔中觀察到至少20個帶有熒光的細胞，則該病毒的滴度為20/（1×10-5）=2×106 TU/μL，即2×109 TU/mL。KD2組和KD3組可見在加入1×10-5 μL病毒原液的孔中至少觀察到15個帶有熒光的細胞，則病毒滴度均為（1.5×109）TU/mL。見圖 4。
圖4
病毒滴度細胞熒光倒置相差顯微鏡像 4a. KD1組，見至少20個帶有熒光的細胞 4b. KD2組，可見至少15個帶有熒光的細胞 4c. KD3組，可見至少15個帶有熒光的細胞? ?圖 5病毒轉染細胞熒光倒置相差顯微鏡像 5a. 對照組細胞，未見有細胞熒光顯像 5b. 陰性對照組細胞 5c. KD1組細胞 5d. KD2組細胞 5e. KD3組細胞 5b～5e. 明顯可見細胞的熒光顯像
2.4 pGCSIL-GFP-siVEGF的表達情況
病毒在HUVEC細胞的感染效率均可達＞80%，而未加病毒的對照組則無明顯熒光顯像。見圖 5。
2.5 實時PCR內源性靶點鑒定結果
對照組與陰性對照組之間相對表達率差異無統計學意義（t=-0.267，P=0.673），但KD1、KD2、KD3組較對照組明顯降低，差異有統計學意義（t=3.343，P=0.011；t=6.272，P＜0.001；t=8.493，P＜0.001）。進一步兩兩比較發現，KD2、KD3組較KD1組明顯降低（t=29.139，P=0.037；t=23.808，P=0.005），KD3組表達率明顯低于KD2組（t=11.181，P=0.002），見表 3。經過比較發現，KD3組，即GATAGAGCAAGACAAGAAA為相對最有效的siRNA序列。
表3
實時PCR 各組相對表達率統計表
3 討論
血管生成是腫瘤生長轉移和傳播過程中的重要環節，亦是冠心病心肌梗死或缺血后冠狀動脈側支形成的重要機制。在眾多血管再生性因子當中，VEGF及其受體被認為是介導新生血管生成的關鍵因素。大量研究證明，VEGFA可以誘導誘導腫瘤血管的生長，其一直作為研究腫瘤發病機制、抗腫瘤治療以及冠心病心肌血管生成的重要位點[10-14]。作為發揮VEGF血管生成作用的重要信號途徑的VEGF/VEGFR通路的存在在心血管病領域亦受到極大的重視。
早在1998年，Folkman等[15]就提出使用促進血管生成的方法治療缺血性疾病的概念。1999年，Henry等[16]報道了一項冠狀動脈內注射重組人內皮細胞生長因子（rhVEGF）的臨床研究，治療后30 d和60 d進行冠狀動脈造影，顯示5/7的患者側支循環改善，核素單光子發射計算機斷層成像術檢查7/15的患者核素灌注增加，該研究初步顯示了VEGF基因治療預防再狹窄的療效。2003年Hedman等[17]報道了一項經冠狀動脈轉導VEGF基因治療冠心病及預防經皮冠狀動脈介入治療術術后再狹窄的臨床試驗，隨訪6個月均未發現有意義的不良反應，雖然各組在最小管腔直徑及狹窄百分率方面均未見顯著差異，但是腺病毒攜帶VEGF基因組可使心室壁的血流灌注得到明顯改善。同年，治療性血管生成療法也在治療外周血管閉塞性疾病中獲得了一定的成功[1]。近年來，有研究表明心肌梗死區局部給予外源性VEGF，可增加梗死區域內VEGF的濃度，有明顯促進血管再生的作用，從而改善側支循環血流和內皮細胞功能，還可以增加血管通透性和舒張冠狀動脈[3, 18]。
本實驗針對HUVEC的VEGFA基因設計siRNA序列，并進行慢病毒的包裝，以構建高效的VEGFA基因RNA干擾慢病毒載體。慢病毒載體是一種人類免疫缺陷病毒-1為基礎的復制缺陷型逆轉錄病毒載體，具有可感染分裂期與非分裂期細胞、轉移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發宿主免疫反應等優點，因此成為攜帶siRNA的理想載體[19-20]。試驗中選擇了pGCSIL-GFP載體，屬于假型病毒，感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒。因此，該載體是高效而相對安全的siRNA載體。
實驗中發現，使用pGCSIL-GFP載體包裝的3種siRNA均可有效抑制HUVEC的VEGFA mRNA的表達。李麗等[21]報道了使用pRNAT-U6.2慢病毒載體成功包裝了干擾VEGF基因的siRNA，但未進一步報道對靶細胞VEGF mRNA 的沉默效率。Wang等[7]采用了pGenesil-1慢病毒載體序列，并根據Elbashir等[8]報道的siRNA序列進行驗證，發現最為高效的靶點序列與本實驗KD2組所采用的序列一致。Xia等[9]采用pSilencer2.1-U6載體體系成功包裝了干擾VEGF165基因的siRNA，并發現其可以高效抑制常氧或缺氧情況下HUVEC的VEGF mRNA及VEGF蛋白的表達，其使用的siRNA序列與本實驗驗證的認為沉默效率最高的KD3的序列是一致的。
綜上，本實驗選擇的pGCSIL-GFP慢病毒載體體系成功地包裝了靶向VEGF基因的siRNA，并驗證了siRNA序列：GATAGAGCAAGACAAGAAA可以高效抑制VEGF mRNA的表達，為進一步的體外細胞研究提供了實驗工具。
自上世紀80年代發現血管內皮生長因子（VEGF）以來，VEGF路徑被認為是血管生成過程的關鍵調節者，因此其也被視為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）治療中新生血管生成的一個重要靶點，并在基礎及臨床應用領域進行了大量的研究[1-5]。VEGF相關基因家族包括：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE及胎盤生長因子（PIGF）等6種分泌型的糖蛋白。它們與相應受體結合增加了血管通透性，刺激了脈管生成。其中，VEGFA相對分子質量為45×103，具有強大血管生成活性的糖蛋白[6]。其含有8個外顯子和7個內含子，根據不同的剪切方式形成5種VEGF單體，分別為VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145及VEGF121。
本實驗嘗試使用慢病毒作為載體，設計針對人VEGFA基因的小干擾RNA（siRNA）序列，包裝并作為抑制人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的VEGFA表達的手段，尋求相對高效的siRNA序列。
1 材料與方法
1.1 材料
HUVEC（ATCC@number：CRL-1730TM，由四川大學華西醫院人類疾病相關多肽實驗室饋贈）；ACE2 抗體（美國Santa Cruz公司）；Revert AidTM First St rand cDNA Synthesis Kit（立陶宛MBI公司）；Taq DNA聚合酶、聚合酶鏈反應（PCR）反應緩沖液（10倍）；（北京BioDev生物基因技術公司）；dNTP（美國Promega公司）；Trizol（美國MRC公司）；pGCSIL-GFP載體、dsDNA oligo 及PCR用試劑 primer（R&F）（上海吉凱基因技術有限公司）；人胚腎細胞株（293T細胞）（中科院上海細胞庫）。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組
按照選擇的siRNA的序列不同，分為KD1、KD2、KD3組；每一組再分為：對照組：未感染任何病毒的細胞組；陰性對照組：加不含有siRNA的病毒感染的細胞組；實驗組：加RNAi靶點病毒感染的細胞組。
1.2.2 目的基因RNA干擾慢病毒載體制備
采用 Ambion shRNA分析軟件掃描轉錄本中AA雙核苷酸序列，記錄靠近3’端的19個核苷酸和每一個AA雙核苷酸序列，作為潛在的siRNA目標位點，同時以G/C比率在30%～50%之間作為選擇因素之一。我們結合現有報道對人VEGFA基因 siRNA的設計[
表1
siRNA 基因序列
表2
病毒框架序列
1.2.3 慢病毒的包裝
轉染前24 h，用0.25%的胰酶消化對數生長期的293T細胞，調整細胞密度為1.2×107細胞/20 mL，接種于15 cm 細胞培養皿，培養并待細胞密度達70%～80%時即可用于轉染。取慢病毒載體pGCSIL-siVEGFA 20 μg，pHelper 1.0 15 μg，pHelper 2.0 10 μg，與相應體積的Opti-MEM混合均勻，調整總體積為2.5 mL，再加入100 μL Lipofectamine 2000與2.4 mL Opti-MEM的混合物，以形成DNA與Lipofectamine 2000的混合液，并轉移至293T細胞的培養液中，培養8 h后倒去培養基，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后加入培養基培養48 h。收集感染后的細胞上清液，即為病毒原液，Plus-20離心超濾裝置對病毒液進行濃縮，置于-80℃保存。
1.2.4 病毒滴度測定（孔稀釋法）
將病毒原液用改良Eagle培養基（DMEM）培養液稀釋成每100 μL中含10、1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6 μL濃度梯度的病毒液，分別感染293T細胞。培養24 h后更換完全培養基100 μL繼續培養，4 d后，用倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達情況。根據熒光圖片中綠色熒光蛋白表達情況，以熒光細胞的個數/病毒原液稀釋的倍數×1 000=病毒原液的滴度，單位為TU/μL。
1.2.5 HUVEC的感染
用含胎牛血清的DMEM培養基將HUVEC制成細胞懸液，并接種于6孔板中（細胞數約為5×104/孔），37℃、5%二氧化碳培養箱培養待細胞融合度達到約30%。按照感染復數=20，加入相應劑量的病毒；12 h后觀察細胞狀態：若無明顯的細胞毒性作用，繼續培養24 h后更換培養基；若有明顯的細胞毒性作用，立即更換培養基；感染3 d后，熒光率＞80%者，分于12孔培養板中繼續培養，待長細胞滿培養板后收集細胞，用于RNA提取；感染效率低于80%的實驗組，重新進行感染實驗。
1.2.6 實時PCR內源性篩查靶點
采用實時PCR的方法檢測VEGFA基因的表達情況。用Trizol試劑提取細胞總RNA，以Takara公司反轉錄試劑盒，取1 μg總RNA反轉成cDNA，采用核苷酸熒光（SYBR Green）染料法在熒光定量PCR儀上檢測目的基因的表達。VEGFA上游引物5’-CAGATGTGACAAGCCGAGG-3，下游引物：5’-CGATGGTGATGGTGTGGTG-3’，目的產物擴增片段144 bp。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物：5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’，目的產物擴增片段121 bp。定量PCR 反應程序：95℃、15 s；變性95℃、5 s；退火延伸60℃、30 s 反應45 個循環。擴增完畢后，進行熔解曲線分析，95℃、1 min，55℃、1 min，55～95℃，4 s，連續監測熒光。擴增結束后分析熔解曲線，在熔解曲線上以具有單峰判斷PCR擴增的單一性。同時設無模板對照，每份標本行3次實時PCR 檢測，取平均值。用隨機附帶的軟件進行目的基因的相對定量表達分析。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行分析。將原始數據（Ct值）換算為基因的相對表達量（2-ΔΔCt），并用均數±標準差表示，兩兩比較用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Age Ⅰ和EcoRⅠ酶切pGCSIL-GFP載體
經酶切后的載體質粒電泳后條帶在7 500 bp附近，克隆酶切完全。見圖 1。
圖1
酶切后載體質粒電泳圖
1：Marker；2：無酶切的載體質粒；3：AgeⅠ和EcoRⅠ酶切線性化后的載體質粒
2.2 陽性克隆PCR的鑒定
KD1組下顎骨4～7泳道的條帶位置在350 bp左右，為陽性克隆；8泳道條帶位置在300 bp左右，為陰性克隆。KD 2組，4、5、7、8泳道為陽性克隆， 6泳道為陰性克隆。KD 3組，4、6、7、8泳道為陽性克隆，5泳道為陰性克隆。見圖 2。
圖2
PCR產物電泳圖
1：陰性對照（ddH2O）；2：自連對照(空載體自連對照組)；3：Marker；4～8：PCR產物 a. KD1組 b. KD2組 c. KD3組
3組陽性克隆的測序結果（圖 3）均與本實驗所設計合成的病毒載體構建框架（表 2）的vshRNA框架序列一致，pGCSIL-vshRNA-GFP載體構建成功。
圖3
陽性克隆測序圖
a. KD1組的陽性克隆測序全片段序列，作用區間為192～248 b. KD2組的陽性克隆測序全片段序列，作用區間為191～251 c. KD3組的陽性克隆測序全片段序列，作用區間為195～255
2.3 Lentivirus 滴度測定結果
KD1組在加入1×10-5 μL病毒原液的孔中觀察到至少20個帶有熒光的細胞，則該病毒的滴度為20/（1×10-5）=2×106 TU/μL，即2×109 TU/mL。KD2組和KD3組可見在加入1×10-5 μL病毒原液的孔中至少觀察到15個帶有熒光的細胞，則病毒滴度均為（1.5×109）TU/mL。見圖 4。
圖4
病毒滴度細胞熒光倒置相差顯微鏡像 4a. KD1組，見至少20個帶有熒光的細胞 4b. KD2組，可見至少15個帶有熒光的細胞 4c. KD3組，可見至少15個帶有熒光的細胞? ?圖 5病毒轉染細胞熒光倒置相差顯微鏡像 5a. 對照組細胞，未見有細胞熒光顯像 5b. 陰性對照組細胞 5c. KD1組細胞 5d. KD2組細胞 5e. KD3組細胞 5b～5e. 明顯可見細胞的熒光顯像
2.4 pGCSIL-GFP-siVEGF的表達情況
病毒在HUVEC細胞的感染效率均可達＞80%，而未加病毒的對照組則無明顯熒光顯像。見圖 5。
2.5 實時PCR內源性靶點鑒定結果
對照組與陰性對照組之間相對表達率差異無統計學意義（t=-0.267，P=0.673），但KD1、KD2、KD3組較對照組明顯降低，差異有統計學意義（t=3.343，P=0.011；t=6.272，P＜0.001；t=8.493，P＜0.001）。進一步兩兩比較發現，KD2、KD3組較KD1組明顯降低（t=29.139，P=0.037；t=23.808，P=0.005），KD3組表達率明顯低于KD2組（t=11.181，P=0.002），見表 3。經過比較發現，KD3組，即GATAGAGCAAGACAAGAAA為相對最有效的siRNA序列。
表3
實時PCR 各組相對表達率統計表
3 討論
血管生成是腫瘤生長轉移和傳播過程中的重要環節，亦是冠心病心肌梗死或缺血后冠狀動脈側支形成的重要機制。在眾多血管再生性因子當中，VEGF及其受體被認為是介導新生血管生成的關鍵因素。大量研究證明，VEGFA可以誘導誘導腫瘤血管的生長，其一直作為研究腫瘤發病機制、抗腫瘤治療以及冠心病心肌血管生成的重要位點[10-14]。作為發揮VEGF血管生成作用的重要信號途徑的VEGF/VEGFR通路的存在在心血管病領域亦受到極大的重視。
早在1998年，Folkman等[15]就提出使用促進血管生成的方法治療缺血性疾病的概念。1999年，Henry等[16]報道了一項冠狀動脈內注射重組人內皮細胞生長因子（rhVEGF）的臨床研究，治療后30 d和60 d進行冠狀動脈造影，顯示5/7的患者側支循環改善，核素單光子發射計算機斷層成像術檢查7/15的患者核素灌注增加，該研究初步顯示了VEGF基因治療預防再狹窄的療效。2003年Hedman等[17]報道了一項經冠狀動脈轉導VEGF基因治療冠心病及預防經皮冠狀動脈介入治療術術后再狹窄的臨床試驗，隨訪6個月均未發現有意義的不良反應，雖然各組在最小管腔直徑及狹窄百分率方面均未見顯著差異，但是腺病毒攜帶VEGF基因組可使心室壁的血流灌注得到明顯改善。同年，治療性血管生成療法也在治療外周血管閉塞性疾病中獲得了一定的成功[1]。近年來，有研究表明心肌梗死區局部給予外源性VEGF，可增加梗死區域內VEGF的濃度，有明顯促進血管再生的作用，從而改善側支循環血流和內皮細胞功能，還可以增加血管通透性和舒張冠狀動脈[3, 18]。
本實驗針對HUVEC的VEGFA基因設計siRNA序列，并進行慢病毒的包裝，以構建高效的VEGFA基因RNA干擾慢病毒載體。慢病毒載體是一種人類免疫缺陷病毒-1為基礎的復制缺陷型逆轉錄病毒載體，具有可感染分裂期與非分裂期細胞、轉移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發宿主免疫反應等優點，因此成為攜帶siRNA的理想載體[19-20]。試驗中選擇了pGCSIL-GFP載體，屬于假型病毒，感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒。因此，該載體是高效而相對安全的siRNA載體。
實驗中發現，使用pGCSIL-GFP載體包裝的3種siRNA均可有效抑制HUVEC的VEGFA mRNA的表達。李麗等[21]報道了使用pRNAT-U6.2慢病毒載體成功包裝了干擾VEGF基因的siRNA，但未進一步報道對靶細胞VEGF mRNA 的沉默效率。Wang等[7]采用了pGenesil-1慢病毒載體序列，并根據Elbashir等[8]報道的siRNA序列進行驗證，發現最為高效的靶點序列與本實驗KD2組所采用的序列一致。Xia等[9]采用pSilencer2.1-U6載體體系成功包裝了干擾VEGF165基因的siRNA，并發現其可以高效抑制常氧或缺氧情況下HUVEC的VEGF mRNA及VEGF蛋白的表達，其使用的siRNA序列與本實驗驗證的認為沉默效率最高的KD3的序列是一致的。
綜上，本實驗選擇的pGCSIL-GFP慢病毒載體體系成功地包裝了靶向VEGF基因的siRNA，并驗證了siRNA序列：GATAGAGCAAGACAAGAAA可以高效抑制VEGF mRNA的表達，為進一步的體外細胞研究提供了實驗工具。
