引用本文： 羅翼, 鄒昌, 張帥, 周勇, 閔理, 張聞力, 石銳, 段宏, 屠重棋. 注射型可吸收氨基酸聚合物/硫酸鈣復合材料動物體內降解吸收及促成骨作用實驗研究. 華西醫學, 2015, 30(12): 2224-2228. doi: 10.7507/1002-0179.20150639 復制
目前，臨床上骨缺損的修復方式主要包括：自體骨移植[1]、同種異體骨移植[2]、金屬假體[3]及人工合成生物替代材料[4]等。而在骨填充修復材料方面，絕大多數的材料為固態型，表面欠規則，需切開顯露方可填充固定，患者需承受較大的手術創傷和風險，且該種材料不易完全充滿整個缺損腔，不能與周圍骨組織表面形成緊密接觸，因此不能有效地促進骨再生[5]。理想的骨移植替代材料應具有良好的成骨性、骨誘導性、骨傳導性、生物相容性和生物可吸收性，臨床應用能夠提供結構支撐并價格低廉[6]。氨基酸聚合物作為生物醫用材料，具有良好的生物相容性和可降解性，廣泛應用于藥物緩釋系統、人工疫苗、基因治療等方面，但其溶解性差別大且降解周期及速度較難控制，應用受限[7]。硫酸鈣早期就已用作填充修復骨缺損，可較快被完全吸收且組織周圍組織炎性反應輕，但其降解速度快[8]。早期研發的氨基酸聚合物/硫酸鈣（PAA/CS）復合材料降解速度可、生物相容性好，具有良好的機械性能及穩定性[9-10]。
四川大學華西醫院骨科和四川國納科技有限公司在既往研究的基礎上，聯合開發了一種新型注射性、可吸收生物活性骨修復材料-PAA/CS復合材料，前期的研究已經證實了其在動物體內的安全性及組織相容性[11]。本實驗在此基礎上，進一步觀察該復合材料在動物體內的降解吸收及促成骨作用。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
粉末狀PAA/CS復合材料充填劑（硫酸鈣含量70%），由四川國納科技有限公司生產提供。
新西蘭大白兔雌雄各半，共48只，由四川大學華西醫院實驗動物中心提供，體質量2.0～2.5 kg。所有動物實驗前在進食、活動方面均良好，皮膚、黏膜無病損，隨機分為空白對照組和實驗組，每組24只。根據抽取的先后順序分別對應4個時間點（術后4、8、12、16周），兩組每個時間點各6只；所有動物均清潔級分籠飼養。
1.2 方法
1.2.1 手術及圍手術期處理
術前1 d將實驗兔稱體質量后，隨機編號，選擇左膝或右膝關節上、下各6 cm去毛備皮，洗凈后過夜。以耳緣靜脈推注10%水合氯醛靜脈麻醉（劑量2.5 mL/kg），術區常規消毒、鋪巾，嚴格無菌操作，手術取膝關節外側髕旁入路，暴露股骨外側髁。定義股骨遠側干骺端距髕股關節面外側端和股骨外髁關節面外側端各0.5 cm處為鉆孔點，以直徑5 mm鉆頭自外向內、垂直于股骨長軸鉆孔，深度約1 cm，注意保留對側骨皮質，防止下肢骨折及人工骨外漏，生理鹽水沖盡骨屑后拭干。
空白對照組：股骨髁鉆孔造缺損后逐層縫合傷口。實驗組：粉末狀PAA/CS用生理鹽水按照1 g︰1 mL混合攪拌均勻后，通過骨水泥注射器經皮穿刺，于骨缺損處注入，充填骨缺損。骨道內人工骨凝固后清除其溢出物，逐層縫合傷口。所有動物術后麻醉蘇醒正常，并逐漸恢復進食、飲水，術后3 d內每日肌肉注射青霉素鈉40萬U/只。
1.2.2 標本的取材和處理
術后4、8、12、16周各時間點，分批處死實驗兔取材，取材范圍為骨缺損側下肢，行X線攝片檢查后，實驗組取缺損骨行組織學檢查，染色方法為蘇木精-伊紅（HE）染色法和馬松三色染色（MASSON）。
1.2.3 觀察指標
一般情況觀察：觀察麻醉清醒后兔下肢活動步態、飲食及傷口愈合（Ⅰ/甲級愈合：愈合優良，無不良反應的初期愈合；Ⅱ/乙級愈合：愈合欠佳，愈合處有炎癥反應，如紅腫、硬結、血腫、積液等但未化膿；Ⅲ/丙級愈合：切口化膿，需切開引流）情況等。X線檢查：術后4、8、12、16周行X線攝片，觀察人工骨分布顯影、新骨形成及材料降解吸收情況。組織學觀察：實驗組各時間點標本取材后，4%多聚甲醛液固定，制作硬組織矢狀位切片，進行HE及MASSON染色，光學顯微鏡下觀察新骨形成、材料降解吸收及材料周圍組織反應情況。
2 結果
2.1 大體形態觀察
兩組動物麻醉清醒后開始負重，所有兔活動和飲食均未見異常，喂養期間未發生死亡，傷口均Ⅰ/甲級愈合。
2.2 影像學觀察
X線片透視顯示：術后4周，實驗組6例骨缺損處與空白組相似，人工骨較周圍骨松質密度低，不顯影，骨缺損處無明顯骨痂生長；空白對照組骨缺損區為低密度影。術后8周，實驗組注射人工骨仍不顯影，5例骨缺損處孔道較術后4周時已不清晰，原缺損區有高密度影，顯示有骨痂生長，周圍骨質仍有硬化；實驗組1例骨缺損處與空白對照組相似，孔道清晰，仍為缺損影。術后12周，實驗組骨缺損區人工骨繼續降解，骨痂繼續生長，5例骨缺損處僅殘留較小低密度區，1例骨缺損處與術后8周時相似；空白對照組骨缺損仍未見明顯修復。術后16周，實驗組5例骨缺損區人工骨完全降解，新骨長入，恢復正常松質骨密度，1例骨缺損處與術后12周時相似；空白對照組2例骨缺損處與實驗組術后8周相似，孔道變小，可見部分修復，剩余4例骨缺損孔道未見明顯修復。見圖 1。
圖1
術后4、8、12、16周兩組兔股骨X線片 1a. 空白對照組術后4周 1b. 實驗組術后4周 1c. 空白對照組術后8周 1d. 實驗組術后8周 1e. 空白對照組術后12周 1f. 實驗組術后12周 1g. 空白對照組術后16周 1h. 實驗組術后16周 圖 2 實驗組術后4、8、12、16周硬組織學切片組織學檢查 2a. 術后4周（HE ×200） 2b. 術后4周（MASSON ×200） 2c. 術后8周（HE ×200） 2d. 術后8周（MASSON ×200） 2e. 術后12周（HE ×200） 2f. 術后12周（MASSON ×200） 2g. 術后16周（HE ×200） 2h. 術后16周（MASSON ×200）
2.3 不脫鈣骨組織學觀察
術后4周，在骨與材料界面可見較多膠原纖維生成，材料開始降解，周圍有較多炎性細胞浸潤，可見異物巨噬細胞，在材料內部可見新生幼稚骨小梁，新生骨小梁周圍可見大量排列整齊的成骨細胞。術后8周，在骨缺損內可見繼續增多的排列不規則的新生骨小梁，材料繼續降解，染色較術后4周變淺，仍有較多炎性細胞浸潤。術后12周，骨缺損內材料大部分降解，新生骨小梁進一步增多、密集并增粗，部分區域編織骨開始轉化為板層骨，已具有正常骨小梁形態。術后16周，骨缺損內材料基本完全降解，被新生骨替代，大部分新生骨已具有正常骨小梁結構。見圖 2。
3 討論
腫瘤性或創傷性骨缺損、骨折不愈合等都需要植骨填充以促進骨修復或骨愈合，臨床對骨移植材料的需求巨大[12]。人工骨材料及骨組織工程支架材料依然是目前生物骨材料研究的重點，由有機高分子聚合物與生物活性無機鹽復合而成的雙相復合材料，具有與正常骨組織相仿的有機/無機雙相復合結構[13]。因具有仿生性能，材料具有良好的生物相容性及生物活性。氨基酸聚合物具有穩定性好、無毒、降解速度可調等諸多優點，可作為許多復合材料的組成部分。硫酸鈣來源廣泛，具有良好的骨傳導性和生物相容性。半水硫酸鈣現已有可注射型并獲準用于臨床[14]，使用前先用水性固化液調和成凝膠狀，直接注射于缺損處，5 min左右硬化并轉變成二水硫酸鈣，盡管該人工骨修復缺損速度明顯提高[15]，但其質地較脆，體內抗壓、抗扭轉等機械強度不足。氨基酸聚合物降解產物為氨基酸、水及其他小分子，對機體無害；在作為組織工程支架時，氨基酸基團能增加材料與組織細胞的親和性，利于種子細胞與材料黏附，且可調節材料的降解速率[16-17]。本實驗利用前期制備的氨基酸硫酸鈣復合材料，通過動物實驗以評估該種復合材料修復骨缺損的能力，特別是降解吸收特性及成骨能力。
聚合物材料的化學成分、植入位置、植入體形狀及降解產物等均可影響其在體內的降解速度。Bell[18]研究發現，將硫酸鈣材料埋入犬肌肉組織內，其最長吸收時間為4.7周。而Nilsso等[19]和Turner等[20]也報道純硫酸鈣在機體骨內完全降解吸收約需6周。針對硫酸鈣復合材料體內存留時間，Stubbs等[21]認為復合材料埋置機體皮質骨、髓腔及肌肉內的位置不同，降解吸收時間存在差異。本實驗所用PAA/CS復合材料，其中硫酸鈣所占的比例為70%，該研究發現，無論是將材料埋入肌肉內，還是植入骨內，在兔肌肉內降解時間為6～8周，8周后肌袋內有少量顆粒狀材料存在。而X線片結果提示骨內降解時間長于8周，這可能是肌肉內材料不斷受到研磨積壓從而加速崩解的緣故，骨缺損內機械活動干擾小，因而材料維持時間更長。此外，肌肉組織與骨在細胞及血供方面的差異也可能導致降解速度不一致。本實驗復合材料動物體內降解時間都長于單一硫酸鈣類材料，說明氨基酸聚合物與硫酸鈣的復合起到了減緩硫酸鈣降解速度的作用，但這種作用的強弱及其可控性仍需進一步的研究。
骨移植材料修復骨缺損是一個復雜的爬行替代過程，需經歷材料的降解吸收、新生血管的長入和新骨形成及改建等過程[22]。目前對骨修復材料植入體內后的存活情況、成骨活性的比較多采用組織學和X線觀察，本實驗術后4、8、12、16周相應檢查結果表明：實驗組X線觀察和組織學觀察基本一致，術后4周，骨缺損內材料周圍有無菌性炎癥反應存在，可見異物巨噬細胞，材料已開始降解吸收，同時較多膠原纖維及部分新生原始骨小梁長入；術后8周，材料繼續降解，骨缺損內新生骨小梁繼續增多，在X線片上可顯示有骨痂生長；術后12、16周，材料逐漸降解吸收完全，新生骨組織代替材料長入骨缺損內，并且新生骨組織逐漸由編織骨變為成熟的板狀骨。在X線片上實驗組骨缺損孔道逐漸消失，被新生骨組織填充，而空白對照組大部分骨缺損孔道術后16周仍較清晰。提示本實驗所用注射型可吸收PAA/CS復合材料具有較好的生物相容性及良好的成骨活性，對臨床骨缺損的修復具有一定的價值。
因此，注射型可吸收PAA/CS復合材料具有良好的體內相容性和生物活性，在體內能夠完全降解、吸收，具備一定的成骨能力，有望成為一種具有發展應用前景的新型、自固化可注射骨修復材料。
目前，臨床上骨缺損的修復方式主要包括：自體骨移植[1]、同種異體骨移植[2]、金屬假體[3]及人工合成生物替代材料[4]等。而在骨填充修復材料方面，絕大多數的材料為固態型，表面欠規則，需切開顯露方可填充固定，患者需承受較大的手術創傷和風險，且該種材料不易完全充滿整個缺損腔，不能與周圍骨組織表面形成緊密接觸，因此不能有效地促進骨再生[5]。理想的骨移植替代材料應具有良好的成骨性、骨誘導性、骨傳導性、生物相容性和生物可吸收性，臨床應用能夠提供結構支撐并價格低廉[6]。氨基酸聚合物作為生物醫用材料，具有良好的生物相容性和可降解性，廣泛應用于藥物緩釋系統、人工疫苗、基因治療等方面，但其溶解性差別大且降解周期及速度較難控制，應用受限[7]。硫酸鈣早期就已用作填充修復骨缺損，可較快被完全吸收且組織周圍組織炎性反應輕，但其降解速度快[8]。早期研發的氨基酸聚合物/硫酸鈣（PAA/CS）復合材料降解速度可、生物相容性好，具有良好的機械性能及穩定性[9-10]。
四川大學華西醫院骨科和四川國納科技有限公司在既往研究的基礎上，聯合開發了一種新型注射性、可吸收生物活性骨修復材料-PAA/CS復合材料，前期的研究已經證實了其在動物體內的安全性及組織相容性[11]。本實驗在此基礎上，進一步觀察該復合材料在動物體內的降解吸收及促成骨作用。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
粉末狀PAA/CS復合材料充填劑（硫酸鈣含量70%），由四川國納科技有限公司生產提供。
新西蘭大白兔雌雄各半，共48只，由四川大學華西醫院實驗動物中心提供，體質量2.0～2.5 kg。所有動物實驗前在進食、活動方面均良好，皮膚、黏膜無病損，隨機分為空白對照組和實驗組，每組24只。根據抽取的先后順序分別對應4個時間點（術后4、8、12、16周），兩組每個時間點各6只；所有動物均清潔級分籠飼養。
1.2 方法
1.2.1 手術及圍手術期處理
術前1 d將實驗兔稱體質量后，隨機編號，選擇左膝或右膝關節上、下各6 cm去毛備皮，洗凈后過夜。以耳緣靜脈推注10%水合氯醛靜脈麻醉（劑量2.5 mL/kg），術區常規消毒、鋪巾，嚴格無菌操作，手術取膝關節外側髕旁入路，暴露股骨外側髁。定義股骨遠側干骺端距髕股關節面外側端和股骨外髁關節面外側端各0.5 cm處為鉆孔點，以直徑5 mm鉆頭自外向內、垂直于股骨長軸鉆孔，深度約1 cm，注意保留對側骨皮質，防止下肢骨折及人工骨外漏，生理鹽水沖盡骨屑后拭干。
空白對照組：股骨髁鉆孔造缺損后逐層縫合傷口。實驗組：粉末狀PAA/CS用生理鹽水按照1 g︰1 mL混合攪拌均勻后，通過骨水泥注射器經皮穿刺，于骨缺損處注入，充填骨缺損。骨道內人工骨凝固后清除其溢出物，逐層縫合傷口。所有動物術后麻醉蘇醒正常，并逐漸恢復進食、飲水，術后3 d內每日肌肉注射青霉素鈉40萬U/只。
1.2.2 標本的取材和處理
術后4、8、12、16周各時間點，分批處死實驗兔取材，取材范圍為骨缺損側下肢，行X線攝片檢查后，實驗組取缺損骨行組織學檢查，染色方法為蘇木精-伊紅（HE）染色法和馬松三色染色（MASSON）。
1.2.3 觀察指標
一般情況觀察：觀察麻醉清醒后兔下肢活動步態、飲食及傷口愈合（Ⅰ/甲級愈合：愈合優良，無不良反應的初期愈合；Ⅱ/乙級愈合：愈合欠佳，愈合處有炎癥反應，如紅腫、硬結、血腫、積液等但未化膿；Ⅲ/丙級愈合：切口化膿，需切開引流）情況等。X線檢查：術后4、8、12、16周行X線攝片，觀察人工骨分布顯影、新骨形成及材料降解吸收情況。組織學觀察：實驗組各時間點標本取材后，4%多聚甲醛液固定，制作硬組織矢狀位切片，進行HE及MASSON染色，光學顯微鏡下觀察新骨形成、材料降解吸收及材料周圍組織反應情況。
2 結果
2.1 大體形態觀察
兩組動物麻醉清醒后開始負重，所有兔活動和飲食均未見異常，喂養期間未發生死亡，傷口均Ⅰ/甲級愈合。
2.2 影像學觀察
X線片透視顯示：術后4周，實驗組6例骨缺損處與空白組相似，人工骨較周圍骨松質密度低，不顯影，骨缺損處無明顯骨痂生長；空白對照組骨缺損區為低密度影。術后8周，實驗組注射人工骨仍不顯影，5例骨缺損處孔道較術后4周時已不清晰，原缺損區有高密度影，顯示有骨痂生長，周圍骨質仍有硬化；實驗組1例骨缺損處與空白對照組相似，孔道清晰，仍為缺損影。術后12周，實驗組骨缺損區人工骨繼續降解，骨痂繼續生長，5例骨缺損處僅殘留較小低密度區，1例骨缺損處與術后8周時相似；空白對照組骨缺損仍未見明顯修復。術后16周，實驗組5例骨缺損區人工骨完全降解，新骨長入，恢復正常松質骨密度，1例骨缺損處與術后12周時相似；空白對照組2例骨缺損處與實驗組術后8周相似，孔道變小，可見部分修復，剩余4例骨缺損孔道未見明顯修復。見圖 1。
圖1
術后4、8、12、16周兩組兔股骨X線片 1a. 空白對照組術后4周 1b. 實驗組術后4周 1c. 空白對照組術后8周 1d. 實驗組術后8周 1e. 空白對照組術后12周 1f. 實驗組術后12周 1g. 空白對照組術后16周 1h. 實驗組術后16周 圖 2 實驗組術后4、8、12、16周硬組織學切片組織學檢查 2a. 術后4周（HE ×200） 2b. 術后4周（MASSON ×200） 2c. 術后8周（HE ×200） 2d. 術后8周（MASSON ×200） 2e. 術后12周（HE ×200） 2f. 術后12周（MASSON ×200） 2g. 術后16周（HE ×200） 2h. 術后16周（MASSON ×200）
2.3 不脫鈣骨組織學觀察
術后4周，在骨與材料界面可見較多膠原纖維生成，材料開始降解，周圍有較多炎性細胞浸潤，可見異物巨噬細胞，在材料內部可見新生幼稚骨小梁，新生骨小梁周圍可見大量排列整齊的成骨細胞。術后8周，在骨缺損內可見繼續增多的排列不規則的新生骨小梁，材料繼續降解，染色較術后4周變淺，仍有較多炎性細胞浸潤。術后12周，骨缺損內材料大部分降解，新生骨小梁進一步增多、密集并增粗，部分區域編織骨開始轉化為板層骨，已具有正常骨小梁形態。術后16周，骨缺損內材料基本完全降解，被新生骨替代，大部分新生骨已具有正常骨小梁結構。見圖 2。
3 討論
腫瘤性或創傷性骨缺損、骨折不愈合等都需要植骨填充以促進骨修復或骨愈合，臨床對骨移植材料的需求巨大[12]。人工骨材料及骨組織工程支架材料依然是目前生物骨材料研究的重點，由有機高分子聚合物與生物活性無機鹽復合而成的雙相復合材料，具有與正常骨組織相仿的有機/無機雙相復合結構[13]。因具有仿生性能，材料具有良好的生物相容性及生物活性。氨基酸聚合物具有穩定性好、無毒、降解速度可調等諸多優點，可作為許多復合材料的組成部分。硫酸鈣來源廣泛，具有良好的骨傳導性和生物相容性。半水硫酸鈣現已有可注射型并獲準用于臨床[14]，使用前先用水性固化液調和成凝膠狀，直接注射于缺損處，5 min左右硬化并轉變成二水硫酸鈣，盡管該人工骨修復缺損速度明顯提高[15]，但其質地較脆，體內抗壓、抗扭轉等機械強度不足。氨基酸聚合物降解產物為氨基酸、水及其他小分子，對機體無害；在作為組織工程支架時，氨基酸基團能增加材料與組織細胞的親和性，利于種子細胞與材料黏附，且可調節材料的降解速率[16-17]。本實驗利用前期制備的氨基酸硫酸鈣復合材料，通過動物實驗以評估該種復合材料修復骨缺損的能力，特別是降解吸收特性及成骨能力。
聚合物材料的化學成分、植入位置、植入體形狀及降解產物等均可影響其在體內的降解速度。Bell[18]研究發現，將硫酸鈣材料埋入犬肌肉組織內，其最長吸收時間為4.7周。而Nilsso等[19]和Turner等[20]也報道純硫酸鈣在機體骨內完全降解吸收約需6周。針對硫酸鈣復合材料體內存留時間，Stubbs等[21]認為復合材料埋置機體皮質骨、髓腔及肌肉內的位置不同，降解吸收時間存在差異。本實驗所用PAA/CS復合材料，其中硫酸鈣所占的比例為70%，該研究發現，無論是將材料埋入肌肉內，還是植入骨內，在兔肌肉內降解時間為6～8周，8周后肌袋內有少量顆粒狀材料存在。而X線片結果提示骨內降解時間長于8周，這可能是肌肉內材料不斷受到研磨積壓從而加速崩解的緣故，骨缺損內機械活動干擾小，因而材料維持時間更長。此外，肌肉組織與骨在細胞及血供方面的差異也可能導致降解速度不一致。本實驗復合材料動物體內降解時間都長于單一硫酸鈣類材料，說明氨基酸聚合物與硫酸鈣的復合起到了減緩硫酸鈣降解速度的作用，但這種作用的強弱及其可控性仍需進一步的研究。
骨移植材料修復骨缺損是一個復雜的爬行替代過程，需經歷材料的降解吸收、新生血管的長入和新骨形成及改建等過程[22]。目前對骨修復材料植入體內后的存活情況、成骨活性的比較多采用組織學和X線觀察，本實驗術后4、8、12、16周相應檢查結果表明：實驗組X線觀察和組織學觀察基本一致，術后4周，骨缺損內材料周圍有無菌性炎癥反應存在，可見異物巨噬細胞，材料已開始降解吸收，同時較多膠原纖維及部分新生原始骨小梁長入；術后8周，材料繼續降解，骨缺損內新生骨小梁繼續增多，在X線片上可顯示有骨痂生長；術后12、16周，材料逐漸降解吸收完全，新生骨組織代替材料長入骨缺損內，并且新生骨組織逐漸由編織骨變為成熟的板狀骨。在X線片上實驗組骨缺損孔道逐漸消失，被新生骨組織填充，而空白對照組大部分骨缺損孔道術后16周仍較清晰。提示本實驗所用注射型可吸收PAA/CS復合材料具有較好的生物相容性及良好的成骨活性，對臨床骨缺損的修復具有一定的價值。
因此，注射型可吸收PAA/CS復合材料具有良好的體內相容性和生物活性，在體內能夠完全降解、吸收，具備一定的成骨能力，有望成為一種具有發展應用前景的新型、自固化可注射骨修復材料。
