細菌生物膜對慢性傷口的影響和其治療近年來成為傷口護理領域的一大研究熱點，傷口生物膜的存在可能是造成慢性傷口難以愈合的重要原因，其具有復雜的內部結構和多種溝通交流機制，對理化刺激、免疫反應和抗菌藥物都具有很強的抗性，難以被徹底清除；傷口生物膜的治療應該是一整套管理方案，包括基本的傷口管理措施、定期清創和抗菌藥物的使用，以清除生物膜和防止其再生。慢性傷口細菌生物膜的存在值得重視，而現有文獻證據尚不能充分說明其作用機制以及何種治療方案有效，值得進一步進行研究。
引用本文： 鄧欣, 何凌霄, 陳佳麗, 寧寧. 傷口細菌生物膜研究進展. 華西醫學, 2015, 30(10): 1838-1841. doi: 10.7507/1002-0179.20150529 復制
隨著人口老齡化和疾病譜的變化，慢性傷口日漸成為一個嚴重的醫療負擔。在發達國家，1%～2%的人口在一生中將會發生傷口遷延不愈[1]；僅在英國，每年因慢性傷口而產生的治療花費就高達10億英鎊[2]。慢性傷口的病因復雜，其臨床表現和病程也因患者個體特點的不同而呈現較大的差異，其發病機制和治療方式至今仍未完全闡明。近年來，細菌生物膜在傷口慢性化中起到的作用逐漸受到重視[3]，Mustoe等[4]認為傷口的細菌負荷是導致慢性傷口不愈合的機制之一。急性傷口中的細菌一般以游離形式存在并進行繁殖[5]，但對慢性傷口而言，傷口上的細菌常常聚集形成生物膜，附著于傷口床但未深入傷口組織內增殖，既缺少明顯的臨床感染征象[6]，也難以使用局部滅菌劑對其進行殺滅，可能是傷口難以愈合的重要原因。本文從細菌生物膜的定義、特點和處理方式等方面作一簡要介紹，以期為臨床傷口管理提供參考。
1 生物膜概述
1.1 生物膜定義
在自然環境中，細菌傾向于以生物膜的形式存在[7]。所謂生物膜，是指一種或多種微生物的聚合體，它們被包埋在主要由多糖構成的基質內，不可逆（難以用溫和的沖洗去除）地附著于活體組織、醫療器械或者工業管道等的表面[8]。在生物膜中的微生物與游離狀態的微生物的基因表達情況有很大區別，這使得它們具有更強的對于物理因素、化學因素、免疫機制、抗生素等有害因素的耐受性，難以清除或殺滅[3]，是細菌為了促進群體生存而形成的復雜的微生態群落。
1.2 生物膜的形成和結構
生物膜在傷口表面的形成大致可分為5個步驟[9]：① 細菌初步附著于表面，這一過程中的附著主要由黏附因子如鞭毛、菌毛、黏附素等介導，并不牢固，通常可逆[10]；② 細菌在增殖過程中分泌主要由多糖、脂類、蛋白、核酸和酶類構成的細胞外多聚物（EPS），使得菌體之間、菌體與傷口表面的黏附變得更加牢固，形成微菌落；③ 微菌落達到一定大小后群體感應（QS）系統激活，釋放信號分子，啟動特定基因的表達，使得細菌的毒性、運動性、生物膜形成能力等方面發生改變，開始大量分泌EPS，促進生物膜的形成；④ 多個微菌落通過EPS聚集為一個整體，生物膜的結構和功能趨于成熟；⑤ 生物膜的表層釋放出浮游細菌、微生物群落和生物膜碎片，遷移到其他部位并黏附，形成新的生物膜。
成熟的生物膜并非單純的扁平膜樣結構，而是一個三維空間的立體結構[8]。對生物膜的直接觀測表明，生物膜由多個柱狀或蕈狀的微菌落連接構成，微菌落中的菌體被EPS包裹[11]，之間形成充滿液體的通道以輸送氧氣、營養、代謝產物、酶等[8, 12]，此外，生物膜中尚存在大量水分、蛋白、死亡和裂解菌體，乃至宿主的一些成分碎片等。
2 慢性傷口中的生物膜
2.1 普遍存在和難以監測
有學者發現開放傷口在48 h內，周圍皮膚中存在的微生物即會污染傷口[13]。慢性傷口存在微生物是無法避免的，但傷口組織中的細菌以生物膜的形式存在，主要位于生物膜的多糖基質內，而非均勻分布在傷口表面或在傷口組織中大量繁殖，這使得常規采集傷口組織滲液進行培養和活體組織檢查（活檢）的方法難以檢出生物膜中的細菌，尤其是厭氧菌。有研究發現，比起分子生物學技術，傳統的傷口培養結果嚴重低估了傷口中綠膿桿菌數量的存在[14]。菌拭子如果不在2 h內被處理，則往往得不到需要的結果[15]。因為臨床檢查陽性結果的缺乏，對于傷口中生物膜的關注起步較晚，直到2007年才有研究對慢性傷口中的生物膜進行了直接的檢測，研究者對50例慢性傷口和16例急性傷口活檢取樣并使用掃描電子顯微鏡進行觀察，發現慢性傷口中有60%存在細菌生物膜，而急性傷口檢出細菌生物膜的比例僅有6%[16]。同年，Ngo等[17]對8例患者的12處傷口進行檢測，發現其中有7處傷口存在細菌生物膜，且大多存在于傷口表面的壞死組織中。
2.2 對傷口愈合的影響
當細菌在傷口存在并增殖后，會激發傷口的炎癥反應以清除細菌，宿主產生大量的中性粒細胞和巨噬細胞圍繞生物膜，這些炎癥細胞分泌大量的活性氧簇（ROS）和蛋白酶（金屬蛋白酶和彈性蛋白酶）[6]。蛋白酶能夠破壞生物膜和組織間的黏著，使生物膜脫離傷口。但同時ROS和蛋白酶也會損害正常的組織、蛋白和免疫細胞，反過來抑制傷口修復。由于生物膜自身的特殊結構，其難以被機體的免疫反應清除，導致炎癥反應持續，機體的愈合過程停滯，甚至發展為反復發作的慢性感染。
并非所有生物膜的存在都會影響傷口愈合，大多數慢性傷口都無法避免生物膜的存在，但經過規范的病因治療和局部傷口管理，多數慢性傷口能夠順利愈合，只有一部分傷口會因為種種未知原因（其中包括生物膜的存在）而表現為所謂的難愈性傷口[18]，對于這一類傷口，對生物膜的去除可能促進傷口愈合。
2.3 臨床診斷依據
生物膜是一種保護性的生長方式[19]，細菌主要存在于生物膜內部，而感染則是細菌在傷口組織中的大量繁殖和進一步播散，因而二者的臨床表現不盡相同；如果細菌在傷口局部繁殖并阻礙傷口的愈合，但不伴隨明顯的感染征象和陽性的檢查結果，這種狀態被稱為嚴重定植，有觀點認為其實質是傷口床中生物膜的存在[20]。
至今尚無用于診斷生物膜的特異性臨床表現，許多文獻報道的懷疑有細菌生物膜的傷口的癥狀與慢性傷口感染癥狀是重合的，如傷口床蒼白，黃色分泌物，壞死組織，表面黏液和腐敗的氣味等；一些研究把培養出的細菌是否具有形成生物膜的能力作為診斷的標準之一[21]；此外尚有研究把肉芽組織脆弱和傷口顏色鮮紅也作為判斷標準[3]。Percival等[3]在回顧傷口生物膜的相關證據時總結出可能的癥狀主要有：傷口不愈合并伴有腐肉或有光澤的表層；特殊氣味；壞死組織的存在；對抗菌藥物耐藥；傷口分離出的細菌具有形成生物膜的能力；活檢后觀察到微菌落形成、EPS或炎性反應的存在等。但臨床觀察往往是主觀和不確切的，目前認為確認生物膜存在的最可靠方法是某些特殊檢查方法，如激光共聚焦顯微鏡、掃描電子顯微鏡、聚合酶鏈式反應、銀染法等。
2.4 抗逆性和再生能力
生物膜的自身結構決定了其對于外界有害因素具有很高的抗性，主要由以下幾個因素決定：① EPS含水量高，吸收性佳，含有死亡細菌崩解成分，能夠抵御一定的干燥和營養缺乏，同時作為一道物理性的屏障，將細菌包埋于其中，使得吞噬細胞和機體產生的各種抗體無法作用于細菌，足夠成熟的生物膜甚至能夠抵抗小分子抗菌劑的滲透[22]，研究顯示，能夠殺滅或清除細菌生物膜的最低抑菌濃度實際上遠超出抗菌劑的常規使用劑量[23-25]。② 生物膜內細菌常常不止一種，帶有不同基因的細菌分泌的保護性的酶和蛋白不同，但在同一個生物膜結構下可以起到相互保護的作用[26]，同時能通過基因突變和交流相互交換耐藥基因型，不管細菌類型是否為同一種均可交換[27]，從而使其耐藥性變得極其多樣化，這一過程也與細菌的群體感應機制[28]有關。③ 休眠細菌的存在。生物膜從外到內，氧氣濃度梯度逐漸下降，營養成分減少，細菌的繁殖減少、代謝降低，尤其是位于深層的細菌很難獲得養分，處于休眠狀態，代謝幾乎完全停止，對各種理化刺激和抗菌藥物都不敏感。在大部分細菌被殺滅、生物膜結構被破壞后，這部分休眠細菌又能復蘇并快速繁殖，使得生物膜反復出現，難以徹底清除。
生物膜形成時間較短，通常2～4 d就能從細菌初步附著狀態演化為完全成熟的生物膜[29]，在生物膜尚未成熟時（24 h內），細菌對抗菌藥物仍然較為敏感；但48 h后則敏感性大幅降低[30]。體外實驗顯示生物膜遭到破壞后，24 h內能夠重新形成成熟的生物膜[31]；而體內實驗中生物膜重建的時間為48 h[32]。
3 慢性傷口生物膜的治療
傷口中的細菌生物膜難以檢測、容易低估、持續存在和難以清除[33]。Phillips等[6]認為對于存在生物膜的慢性傷口，治療目標主要有：① 去除生物膜對傷口的負擔；② 防止生物膜的再生。而這兩個目標不可能僅憑某一種抗菌藥物或治療方式即可達到，因此需要提出綜合的治療方案。
Wolcott等[34]提出了一套基于生物膜的傷口護理程序（BBWC），其主要流程是：① 對慢性傷口患者進行全面評估；② 處理影響傷口愈合的全身因素；③ 根據傷口的具體情況，給予以清創為主的基礎處理；④ 使用多種抗生物膜的治療策略，干擾從細菌黏附、EPS形成、信號傳遞、細菌代謝等過程，達到抑制生物膜再生的效果。
而針對生物膜的治療策略重點為清創和抗生物膜藥物的使用。也有研究者建議采用輔助療法。根據證據建議[35]，持續規律的清創是有效去除生物膜的最佳方法。清創能去除傷口中的壞死組織、腐肉、異物及其他生物性負荷，為傷口提供良好的愈合環境，常用的有銳器清創[30]、水刀清創[36]等。Wolcott等[34]在BBWC方案下進行的清創為1次/周，效果良好，但目前清創的理想頻率尚不明確。與此同時，為了抑制生物膜的再生，考慮采用廣譜抗菌劑如銀、碘、蜂蜜、鹽酸聚乙縮胍等，已有一些體外和體內試驗支持抗菌劑的使用[37-40]，但受生物膜檢驗方式和人體傷口生物膜的復雜性影響，目前仍缺乏相應的臨床證據，證明某種抗菌劑對抑制傷口生物膜有確定效果。此外，高壓氧、非接觸性低頻超聲、負壓傷口療法等也被認為對生物膜的治療有一定作用[41]。
4 結語
傷口生物膜的存在可能是造成慢性傷口難以愈合的重要原因，其具有復雜的內部結構和多種溝通交流機制，對理化刺激、免疫反應和抗菌藥物都具有很強的抗性，難以被徹底清除；傷口生物膜的治療應該是一整套管理方案，包括基本的傷口管理措施、定期清創和抗菌藥物的使用，以清除生物膜和防止其再生。
隨著人口老齡化和疾病譜的變化，慢性傷口日漸成為一個嚴重的醫療負擔。在發達國家，1%～2%的人口在一生中將會發生傷口遷延不愈[1]；僅在英國，每年因慢性傷口而產生的治療花費就高達10億英鎊[2]。慢性傷口的病因復雜，其臨床表現和病程也因患者個體特點的不同而呈現較大的差異，其發病機制和治療方式至今仍未完全闡明。近年來，細菌生物膜在傷口慢性化中起到的作用逐漸受到重視[3]，Mustoe等[4]認為傷口的細菌負荷是導致慢性傷口不愈合的機制之一。急性傷口中的細菌一般以游離形式存在并進行繁殖[5]，但對慢性傷口而言，傷口上的細菌常常聚集形成生物膜，附著于傷口床但未深入傷口組織內增殖，既缺少明顯的臨床感染征象[6]，也難以使用局部滅菌劑對其進行殺滅，可能是傷口難以愈合的重要原因。本文從細菌生物膜的定義、特點和處理方式等方面作一簡要介紹，以期為臨床傷口管理提供參考。
1 生物膜概述
1.1 生物膜定義
在自然環境中，細菌傾向于以生物膜的形式存在[7]。所謂生物膜，是指一種或多種微生物的聚合體，它們被包埋在主要由多糖構成的基質內，不可逆（難以用溫和的沖洗去除）地附著于活體組織、醫療器械或者工業管道等的表面[8]。在生物膜中的微生物與游離狀態的微生物的基因表達情況有很大區別，這使得它們具有更強的對于物理因素、化學因素、免疫機制、抗生素等有害因素的耐受性，難以清除或殺滅[3]，是細菌為了促進群體生存而形成的復雜的微生態群落。
1.2 生物膜的形成和結構
生物膜在傷口表面的形成大致可分為5個步驟[9]：① 細菌初步附著于表面，這一過程中的附著主要由黏附因子如鞭毛、菌毛、黏附素等介導，并不牢固，通常可逆[10]；② 細菌在增殖過程中分泌主要由多糖、脂類、蛋白、核酸和酶類構成的細胞外多聚物（EPS），使得菌體之間、菌體與傷口表面的黏附變得更加牢固，形成微菌落；③ 微菌落達到一定大小后群體感應（QS）系統激活，釋放信號分子，啟動特定基因的表達，使得細菌的毒性、運動性、生物膜形成能力等方面發生改變，開始大量分泌EPS，促進生物膜的形成；④ 多個微菌落通過EPS聚集為一個整體，生物膜的結構和功能趨于成熟；⑤ 生物膜的表層釋放出浮游細菌、微生物群落和生物膜碎片，遷移到其他部位并黏附，形成新的生物膜。
成熟的生物膜并非單純的扁平膜樣結構，而是一個三維空間的立體結構[8]。對生物膜的直接觀測表明，生物膜由多個柱狀或蕈狀的微菌落連接構成，微菌落中的菌體被EPS包裹[11]，之間形成充滿液體的通道以輸送氧氣、營養、代謝產物、酶等[8, 12]，此外，生物膜中尚存在大量水分、蛋白、死亡和裂解菌體，乃至宿主的一些成分碎片等。
2 慢性傷口中的生物膜
2.1 普遍存在和難以監測
有學者發現開放傷口在48 h內，周圍皮膚中存在的微生物即會污染傷口[13]。慢性傷口存在微生物是無法避免的，但傷口組織中的細菌以生物膜的形式存在，主要位于生物膜的多糖基質內，而非均勻分布在傷口表面或在傷口組織中大量繁殖，這使得常規采集傷口組織滲液進行培養和活體組織檢查（活檢）的方法難以檢出生物膜中的細菌，尤其是厭氧菌。有研究發現，比起分子生物學技術，傳統的傷口培養結果嚴重低估了傷口中綠膿桿菌數量的存在[14]。菌拭子如果不在2 h內被處理，則往往得不到需要的結果[15]。因為臨床檢查陽性結果的缺乏，對于傷口中生物膜的關注起步較晚，直到2007年才有研究對慢性傷口中的生物膜進行了直接的檢測，研究者對50例慢性傷口和16例急性傷口活檢取樣并使用掃描電子顯微鏡進行觀察，發現慢性傷口中有60%存在細菌生物膜，而急性傷口檢出細菌生物膜的比例僅有6%[16]。同年，Ngo等[17]對8例患者的12處傷口進行檢測，發現其中有7處傷口存在細菌生物膜，且大多存在于傷口表面的壞死組織中。
2.2 對傷口愈合的影響
當細菌在傷口存在并增殖后，會激發傷口的炎癥反應以清除細菌，宿主產生大量的中性粒細胞和巨噬細胞圍繞生物膜，這些炎癥細胞分泌大量的活性氧簇（ROS）和蛋白酶（金屬蛋白酶和彈性蛋白酶）[6]。蛋白酶能夠破壞生物膜和組織間的黏著，使生物膜脫離傷口。但同時ROS和蛋白酶也會損害正常的組織、蛋白和免疫細胞，反過來抑制傷口修復。由于生物膜自身的特殊結構，其難以被機體的免疫反應清除，導致炎癥反應持續，機體的愈合過程停滯，甚至發展為反復發作的慢性感染。
并非所有生物膜的存在都會影響傷口愈合，大多數慢性傷口都無法避免生物膜的存在，但經過規范的病因治療和局部傷口管理，多數慢性傷口能夠順利愈合，只有一部分傷口會因為種種未知原因（其中包括生物膜的存在）而表現為所謂的難愈性傷口[18]，對于這一類傷口，對生物膜的去除可能促進傷口愈合。
2.3 臨床診斷依據
生物膜是一種保護性的生長方式[19]，細菌主要存在于生物膜內部，而感染則是細菌在傷口組織中的大量繁殖和進一步播散，因而二者的臨床表現不盡相同；如果細菌在傷口局部繁殖并阻礙傷口的愈合，但不伴隨明顯的感染征象和陽性的檢查結果，這種狀態被稱為嚴重定植，有觀點認為其實質是傷口床中生物膜的存在[20]。
至今尚無用于診斷生物膜的特異性臨床表現，許多文獻報道的懷疑有細菌生物膜的傷口的癥狀與慢性傷口感染癥狀是重合的，如傷口床蒼白，黃色分泌物，壞死組織，表面黏液和腐敗的氣味等；一些研究把培養出的細菌是否具有形成生物膜的能力作為診斷的標準之一[21]；此外尚有研究把肉芽組織脆弱和傷口顏色鮮紅也作為判斷標準[3]。Percival等[3]在回顧傷口生物膜的相關證據時總結出可能的癥狀主要有：傷口不愈合并伴有腐肉或有光澤的表層；特殊氣味；壞死組織的存在；對抗菌藥物耐藥；傷口分離出的細菌具有形成生物膜的能力；活檢后觀察到微菌落形成、EPS或炎性反應的存在等。但臨床觀察往往是主觀和不確切的，目前認為確認生物膜存在的最可靠方法是某些特殊檢查方法，如激光共聚焦顯微鏡、掃描電子顯微鏡、聚合酶鏈式反應、銀染法等。
2.4 抗逆性和再生能力
生物膜的自身結構決定了其對于外界有害因素具有很高的抗性，主要由以下幾個因素決定：① EPS含水量高，吸收性佳，含有死亡細菌崩解成分，能夠抵御一定的干燥和營養缺乏，同時作為一道物理性的屏障，將細菌包埋于其中，使得吞噬細胞和機體產生的各種抗體無法作用于細菌，足夠成熟的生物膜甚至能夠抵抗小分子抗菌劑的滲透[22]，研究顯示，能夠殺滅或清除細菌生物膜的最低抑菌濃度實際上遠超出抗菌劑的常規使用劑量[23-25]。② 生物膜內細菌常常不止一種，帶有不同基因的細菌分泌的保護性的酶和蛋白不同，但在同一個生物膜結構下可以起到相互保護的作用[26]，同時能通過基因突變和交流相互交換耐藥基因型，不管細菌類型是否為同一種均可交換[27]，從而使其耐藥性變得極其多樣化，這一過程也與細菌的群體感應機制[28]有關。③ 休眠細菌的存在。生物膜從外到內，氧氣濃度梯度逐漸下降，營養成分減少，細菌的繁殖減少、代謝降低，尤其是位于深層的細菌很難獲得養分，處于休眠狀態，代謝幾乎完全停止，對各種理化刺激和抗菌藥物都不敏感。在大部分細菌被殺滅、生物膜結構被破壞后，這部分休眠細菌又能復蘇并快速繁殖，使得生物膜反復出現，難以徹底清除。
生物膜形成時間較短，通常2～4 d就能從細菌初步附著狀態演化為完全成熟的生物膜[29]，在生物膜尚未成熟時（24 h內），細菌對抗菌藥物仍然較為敏感；但48 h后則敏感性大幅降低[30]。體外實驗顯示生物膜遭到破壞后，24 h內能夠重新形成成熟的生物膜[31]；而體內實驗中生物膜重建的時間為48 h[32]。
3 慢性傷口生物膜的治療
傷口中的細菌生物膜難以檢測、容易低估、持續存在和難以清除[33]。Phillips等[6]認為對于存在生物膜的慢性傷口，治療目標主要有：① 去除生物膜對傷口的負擔；② 防止生物膜的再生。而這兩個目標不可能僅憑某一種抗菌藥物或治療方式即可達到，因此需要提出綜合的治療方案。
Wolcott等[34]提出了一套基于生物膜的傷口護理程序（BBWC），其主要流程是：① 對慢性傷口患者進行全面評估；② 處理影響傷口愈合的全身因素；③ 根據傷口的具體情況，給予以清創為主的基礎處理；④ 使用多種抗生物膜的治療策略，干擾從細菌黏附、EPS形成、信號傳遞、細菌代謝等過程，達到抑制生物膜再生的效果。
而針對生物膜的治療策略重點為清創和抗生物膜藥物的使用。也有研究者建議采用輔助療法。根據證據建議[35]，持續規律的清創是有效去除生物膜的最佳方法。清創能去除傷口中的壞死組織、腐肉、異物及其他生物性負荷，為傷口提供良好的愈合環境，常用的有銳器清創[30]、水刀清創[36]等。Wolcott等[34]在BBWC方案下進行的清創為1次/周，效果良好，但目前清創的理想頻率尚不明確。與此同時，為了抑制生物膜的再生，考慮采用廣譜抗菌劑如銀、碘、蜂蜜、鹽酸聚乙縮胍等，已有一些體外和體內試驗支持抗菌劑的使用[37-40]，但受生物膜檢驗方式和人體傷口生物膜的復雜性影響，目前仍缺乏相應的臨床證據，證明某種抗菌劑對抑制傷口生物膜有確定效果。此外，高壓氧、非接觸性低頻超聲、負壓傷口療法等也被認為對生物膜的治療有一定作用[41]。
4 結語
傷口生物膜的存在可能是造成慢性傷口難以愈合的重要原因，其具有復雜的內部結構和多種溝通交流機制，對理化刺激、免疫反應和抗菌藥物都具有很強的抗性，難以被徹底清除；傷口生物膜的治療應該是一整套管理方案，包括基本的傷口管理措施、定期清創和抗菌藥物的使用，以清除生物膜和防止其再生。