引用本文： 王露, 王文志, 徐建, 夏進, 梁宗安. 淫羊藿苷對NCI-H446細胞增殖和凋亡的影響. 華西醫學, 2015, 30(8): 1401-1405. doi: 10.7507/1002-0179.20150404 復制
上世紀60年代以來，化學療法（化療）藥物治療肺癌獲得了巨大成功，推動了國內外腫瘤治療研究的進展，但化療藥物易引起嚴重副作用，如急性肝、腎損傷等，若不及時診治可危及生命[1]。因此，尋找新的高效低毒分化誘導劑與分化療法，已成為腫瘤基礎與臨床研究的重點之一。淫羊藿為歷代常用的補益中藥，淫羊藿苷是其主要活性成分之一[2]，其具有抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的作用[3]，而肺癌的發生被認為是細胞凋亡與細胞增殖平衡失調的結果[4]。本研究以小細胞肺癌細胞株NCI-H446為靶細胞，探討淫羊藿苷對其的作用及作用機制。
1 材料與方法
1.1 藥品與試劑
淫羊藿苷（南京替斯艾么中藥研究所，批號20121109）。Roswell Park紀念研究所（RPMI）1640培養基（美國Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；12孔培養板（美國Falcon公司）；β-actin抗體[艾比瑪特生物醫藥（上海）有限公司]；Janus激酶2（JAK2）、信號轉導子與轉錄激活子3（STAT3）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）（美國Cell Signal Technology公司）；Bcl-2、Bax（美國Abclonal公司）；TRIzol reagent（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒（美國GeneCopoeia公司）；SYBRgreen（日本Takara公司）；實時定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）引物（北京擎科生物技術有限公司）；放射免疫沉淀實驗（RIPA）蛋白裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；蛋白酶抑制劑cocktail及蛋白質印跡法凝膠制備試劑盒（武漢谷歌生物公司）。
1.2 儀器
二氧化碳細胞培養箱（美國Forma scientific公司）；倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；RT-qPCR儀（美國拜力公司），酶標儀、紫外分光光度計測量濃度（美國Thermo Fisher公司）；硝酸纖維素膜（瑞士Roche公司），電致化學發光（ECL）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），膠片及化學發光儀（美國柯達公司）。
1.3 細胞培養
NCI-H446細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，加入青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL），在37 ℃、5%二氧化碳飽和濕度培養箱中培養。
1.4 噻唑藍（MTT）檢測NCI-H446細胞增殖
取對數生長期NCI-H446細胞，接種于12孔板內，調整密度為2×105/mL，90 μL/孔，實驗組加入淫羊藿苷（8 μmol/L），對照組細胞不加藥物，另設空白組（只加培養基，不加細胞和藥物），每組均設3個復孔。12孔板置于37℃、5%二氧化碳培養箱培養48 h后，加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL/孔，繼續培養4 h，然后加入三聯裂解液[10%十二烷基硫酸鈉+5%異丁醇+1%三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（10 mol/L），100 μL/孔]，37℃放置過夜后，用酶標儀于波長570 nm處讀取吸光度[A（舊稱光密度（OD）]值，細胞增殖抑制率=[對照孔A值-實驗孔A值]/[對照孔A值-空白孔A值]×100%。
1.5 Annexin-V雙染法檢測細胞凋亡
取對數生長期的NCI-H446細胞接種于6孔板中，調整密度為1×105/mL。實驗分為2組：對照組細胞常規培養；淫羊藿苷組細胞培養體系中加入淫羊藿苷多糖，終質量濃度為0.4 g/L。培養48 h后，收集各組所有懸浮細胞，調整細胞密度為1×105/mL，取1 mL細胞懸液，離心力3 000×g，離心5 min，去培養基，加RNA酶，37℃水浴1 h，放入冰浴加入0.5 mg/L 碘化丙啶及Annexin-V，流式細胞儀檢測。采用CELIQUEST軟件分析細胞凋亡率。
1.6 蛋白質印跡法檢測NCI-H446細胞JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3，BCL-2和Bax表達
將各組收集的細胞用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，按照蛋白裂解液RIPA操作說明提取蛋白，BCA法進行蛋白定量，將各組蛋白濃度調成一致，沸水煮5 min，待用。取各組細胞總蛋白樣品80 μg，以樣品中的β-actin為內參，經雙相十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，然后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h，分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋JAK2抗體（1︰1 000）、p-JAK2（1︰500）、STAT3（1︰1 000）、p-STAT3（1︰500）、BCL-2（1︰500）、Bax（1︰500）、β-actin（1︰3 000）抗體，4 ℃孵育過夜。PBS洗膜3次，10 min/次，根據一抗的來源，再分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（1︰500）、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG（1︰5 000）室溫下作用2 h，PBS洗膜3次，10 min/次，ECL化學發光顯色、壓片、顯影、定影、膠片掃描保存。利用Ge-l Pro Analyzer（Ver.3.0）軟件測定JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和β-actin蛋白條帶灰度值，以JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白灰度值與β-actin內參條帶灰度值的比值代表上述蛋白的表達量化。
1.7 RT-qPCR檢測JAK2和STAT3
按照總RNA提取試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測量濃度，逆轉錄以及擴增反應按試劑盒說明書進行，RT-qPCR引物均由美國Invitrogen公司合成（表 1）。管家基因β-actin作為內參對照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCT計算相對表達量。
表1
RT-qPCR檢測的引物序列
1.8 統計學方法
采用SPSS 12.0統計軟件包進行資料分析。實驗結果采用均數±標準差表示，淫羊藿苷組與對照組均數比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 淫羊藿苷明顯抑制對NCI-H446細胞增殖
MTT檢測實驗結果顯示，淫羊藿苷組與對照組增殖率分別為（94±5）%、（41±3）%，淫羊藿苷組與對照組相比增殖率明顯降低（t=15.712，P＜0.001）。見表 2。
表2
各組NCI-H446細胞增殖的影響（n=3，2.2 淫羊藿苷促進NCI-H446細胞凋亡
流式細胞術檢測實驗結果顯示，淫羊藿苷組與對照組細胞凋亡率分別為（8±3）%、（75±7）%，給予淫羊藿苷的實驗組細胞凋亡率明顯增高，差異有統計學意義（t=-15.238，P＜0.001）。見圖 1。
圖1
流式細胞術檢測淫羊藿苷對NCI-H446 細胞凋亡的影響
a. 對照組 b. 淫羊藿苷組
2.3 淫羊藿苷對NCI-H446細胞JAK2、STAT3 mRNA表達的影響
RT-qPCR檢測結果顯示，對照組細胞JAK2、STAT3 mRNA的表達水平與淫羊藿苷處理組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見表 3。
表3
各組NCI-H446細胞JAK2、STAT3 mRNA表達的影響（n=3，2.4 淫羊藿苷對NCI-H446細胞p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達的影響
蛋白質印跡法檢測顯示，與對照組相比，經淫羊藿苷作用NCI-H446細胞48 h后，JAK2、STAT3蛋白無明顯變化（P＞0.05），p-JAK2、p-STAT3明顯增加（P＜0.05），見圖 2、表 4。
圖2
蛋白質印跡法檢測對照組與淫羊藿苷組NCI-H446細胞p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達的電泳圖
表4
各組NCI-H446細胞p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達（n=3，2.5 淫羊藿苷對NCI-H446細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響
蛋白質印跡法檢測顯示，與對照組相比，經淫羊藿苷作用NCI-H446細胞16 h后，Bcl-2明顯減少（P＜0.05），Bax表達明顯增加（P＜0.05）。見圖 3、表 5。
圖3
蛋白質印跡法檢測對照組與淫羊藿苷組NCI-H446細胞BCL-2和Bax蛋白表達的電泳圖
表5
各組NCI-H446細胞BCL-2和Bax蛋白表達的影響（n=3，3 討論
肺癌又稱支氣管肺癌，發病率和死亡率均高。研究發現肺癌不僅是增殖、分化異常的疾病，同時也是凋亡受阻的疾病，細胞凋亡的減少可引起肺癌的發生，且通過逃避凋亡而促進細胞的惡性轉化[4]。JAK2/STAT3是在多種細胞發揮介導作用的信號通路，信號通路涉及細胞生長、細胞凋亡（促凋亡）、細胞周期進程、分化、轉錄、翻譯和糖代謝[5]。目前研究發現JAK2/STAT3信號通路可以調節腫瘤細胞增[6]、分化、凋亡，尤其與肺癌密切相關[6-8]。目前對肺癌治療大多仍采用傳統的大劑量聯合化學療法和手術切除，但此療法不良反應大，尤其對肝臟和腎臟損害很大，且復發率高[1]。
從祖國醫學寶庫中挖掘抑制肺癌細胞惡性增殖的方法是研發高效低毒的抗肺癌藥物的有效途徑之一[2]。淫羊藿是一種常見中藥，因其具有免疫調節、延緩衰老、減輕骨質疏松以及記憶保護作用，因而被廣泛應用于臨床。目前研究發現淫羊藿苷具有促進細胞凋亡、抑制細胞增殖的作用[3]，在肝癌、乳腺癌、前列腺癌研究中，淫羊藿苷可抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡，以及削弱癌細胞的遷徙，因而具有明顯的抗癌活性[9-15]。但淫羊藿苷對肺癌的作用及其機制尚不清楚。國外研究發現淫羊藿苷可調節JAK2/STAT3信號通路的活性[3, 16-17]，而JAK2/STAT3信號通路在肺癌的惡性增殖和凋亡受阻扮演重要角色。
本試驗中我們通過MTT檢測發現淫羊藿苷可以明顯抑制NCI-H446細胞增殖，通過流式細胞術發現淫羊藿苷明顯增加NCI-H446細胞凋亡率，蛋白質印跡法檢測發現淫羊藿苷對JAK2和STAT3表達無明顯改變，而促進JAK2和STAT3的磷酸化修飾增加，抗凋亡蛋白BCL-2表達明顯減少，促凋亡蛋白Bax表達增加。因此我們推測淫羊藿苷可能通過結構修飾激活JAK2/STAT3信號通路，而非增加JAK2和STAT3的表達量下調NCI-H446增殖，促進NCI-H446凋亡，從而達到治療肺癌的目的。
綜上所述，淫羊藿苷可能是通過激活JAK2/STAT3信號通路來抑制NCI-H446細胞增殖和促進細胞凋亡。然而淫羊藿苷是否直接作用于JAK2信號分子還是通過調節其上游激酶和（或）信號分子而間接發揮作用仍不清楚，尚需進行更深入的研究。
上世紀60年代以來，化學療法（化療）藥物治療肺癌獲得了巨大成功，推動了國內外腫瘤治療研究的進展，但化療藥物易引起嚴重副作用，如急性肝、腎損傷等，若不及時診治可危及生命[1]。因此，尋找新的高效低毒分化誘導劑與分化療法，已成為腫瘤基礎與臨床研究的重點之一。淫羊藿為歷代常用的補益中藥，淫羊藿苷是其主要活性成分之一[2]，其具有抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的作用[3]，而肺癌的發生被認為是細胞凋亡與細胞增殖平衡失調的結果[4]。本研究以小細胞肺癌細胞株NCI-H446為靶細胞，探討淫羊藿苷對其的作用及作用機制。
1 材料與方法
1.1 藥品與試劑
淫羊藿苷（南京替斯艾么中藥研究所，批號20121109）。Roswell Park紀念研究所（RPMI）1640培養基（美國Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；12孔培養板（美國Falcon公司）；β-actin抗體[艾比瑪特生物醫藥（上海）有限公司]；Janus激酶2（JAK2）、信號轉導子與轉錄激活子3（STAT3）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）（美國Cell Signal Technology公司）；Bcl-2、Bax（美國Abclonal公司）；TRIzol reagent（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒（美國GeneCopoeia公司）；SYBRgreen（日本Takara公司）；實時定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）引物（北京擎科生物技術有限公司）；放射免疫沉淀實驗（RIPA）蛋白裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；蛋白酶抑制劑cocktail及蛋白質印跡法凝膠制備試劑盒（武漢谷歌生物公司）。
1.2 儀器
二氧化碳細胞培養箱（美國Forma scientific公司）；倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；RT-qPCR儀（美國拜力公司），酶標儀、紫外分光光度計測量濃度（美國Thermo Fisher公司）；硝酸纖維素膜（瑞士Roche公司），電致化學發光（ECL）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），膠片及化學發光儀（美國柯達公司）。
1.3 細胞培養
NCI-H446細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，加入青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL），在37 ℃、5%二氧化碳飽和濕度培養箱中培養。
1.4 噻唑藍（MTT）檢測NCI-H446細胞增殖
取對數生長期NCI-H446細胞，接種于12孔板內，調整密度為2×105/mL，90 μL/孔，實驗組加入淫羊藿苷（8 μmol/L），對照組細胞不加藥物，另設空白組（只加培養基，不加細胞和藥物），每組均設3個復孔。12孔板置于37℃、5%二氧化碳培養箱培養48 h后，加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL/孔，繼續培養4 h，然后加入三聯裂解液[10%十二烷基硫酸鈉+5%異丁醇+1%三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（10 mol/L），100 μL/孔]，37℃放置過夜后，用酶標儀于波長570 nm處讀取吸光度[A（舊稱光密度（OD）]值，細胞增殖抑制率=[對照孔A值-實驗孔A值]/[對照孔A值-空白孔A值]×100%。
1.5 Annexin-V雙染法檢測細胞凋亡
取對數生長期的NCI-H446細胞接種于6孔板中，調整密度為1×105/mL。實驗分為2組：對照組細胞常規培養；淫羊藿苷組細胞培養體系中加入淫羊藿苷多糖，終質量濃度為0.4 g/L。培養48 h后，收集各組所有懸浮細胞，調整細胞密度為1×105/mL，取1 mL細胞懸液，離心力3 000×g，離心5 min，去培養基，加RNA酶，37℃水浴1 h，放入冰浴加入0.5 mg/L 碘化丙啶及Annexin-V，流式細胞儀檢測。采用CELIQUEST軟件分析細胞凋亡率。
1.6 蛋白質印跡法檢測NCI-H446細胞JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3，BCL-2和Bax表達
將各組收集的細胞用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，按照蛋白裂解液RIPA操作說明提取蛋白，BCA法進行蛋白定量，將各組蛋白濃度調成一致，沸水煮5 min，待用。取各組細胞總蛋白樣品80 μg，以樣品中的β-actin為內參，經雙相十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，然后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h，分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋JAK2抗體（1︰1 000）、p-JAK2（1︰500）、STAT3（1︰1 000）、p-STAT3（1︰500）、BCL-2（1︰500）、Bax（1︰500）、β-actin（1︰3 000）抗體，4 ℃孵育過夜。PBS洗膜3次，10 min/次，根據一抗的來源，再分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（1︰500）、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG（1︰5 000）室溫下作用2 h，PBS洗膜3次，10 min/次，ECL化學發光顯色、壓片、顯影、定影、膠片掃描保存。利用Ge-l Pro Analyzer（Ver.3.0）軟件測定JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和β-actin蛋白條帶灰度值，以JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白灰度值與β-actin內參條帶灰度值的比值代表上述蛋白的表達量化。
1.7 RT-qPCR檢測JAK2和STAT3
按照總RNA提取試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測量濃度，逆轉錄以及擴增反應按試劑盒說明書進行，RT-qPCR引物均由美國Invitrogen公司合成（表 1）。管家基因β-actin作為內參對照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCT計算相對表達量。
表1
RT-qPCR檢測的引物序列
1.8 統計學方法
采用SPSS 12.0統計軟件包進行資料分析。實驗結果采用均數±標準差表示，淫羊藿苷組與對照組均數比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 淫羊藿苷明顯抑制對NCI-H446細胞增殖
MTT檢測實驗結果顯示，淫羊藿苷組與對照組增殖率分別為（94±5）%、（41±3）%，淫羊藿苷組與對照組相比增殖率明顯降低（t=15.712，P＜0.001）。見表 2。
表2
各組NCI-H446細胞增殖的影響（n=3，2.2 淫羊藿苷促進NCI-H446細胞凋亡
流式細胞術檢測實驗結果顯示，淫羊藿苷組與對照組細胞凋亡率分別為（8±3）%、（75±7）%，給予淫羊藿苷的實驗組細胞凋亡率明顯增高，差異有統計學意義（t=-15.238，P＜0.001）。見圖 1。
圖1
流式細胞術檢測淫羊藿苷對NCI-H446 細胞凋亡的影響
a. 對照組 b. 淫羊藿苷組
2.3 淫羊藿苷對NCI-H446細胞JAK2、STAT3 mRNA表達的影響
RT-qPCR檢測結果顯示，對照組細胞JAK2、STAT3 mRNA的表達水平與淫羊藿苷處理組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見表 3。
表3
各組NCI-H446細胞JAK2、STAT3 mRNA表達的影響（n=3，2.4 淫羊藿苷對NCI-H446細胞p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達的影響
蛋白質印跡法檢測顯示，與對照組相比，經淫羊藿苷作用NCI-H446細胞48 h后，JAK2、STAT3蛋白無明顯變化（P＞0.05），p-JAK2、p-STAT3明顯增加（P＜0.05），見圖 2、表 4。
圖2
蛋白質印跡法檢測對照組與淫羊藿苷組NCI-H446細胞p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達的電泳圖
表4
各組NCI-H446細胞p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3蛋白表達（n=3，2.5 淫羊藿苷對NCI-H446細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響
蛋白質印跡法檢測顯示，與對照組相比，經淫羊藿苷作用NCI-H446細胞16 h后，Bcl-2明顯減少（P＜0.05），Bax表達明顯增加（P＜0.05）。見圖 3、表 5。
圖3
蛋白質印跡法檢測對照組與淫羊藿苷組NCI-H446細胞BCL-2和Bax蛋白表達的電泳圖
表5
各組NCI-H446細胞BCL-2和Bax蛋白表達的影響（n=3，3 討論
肺癌又稱支氣管肺癌，發病率和死亡率均高。研究發現肺癌不僅是增殖、分化異常的疾病，同時也是凋亡受阻的疾病，細胞凋亡的減少可引起肺癌的發生，且通過逃避凋亡而促進細胞的惡性轉化[4]。JAK2/STAT3是在多種細胞發揮介導作用的信號通路，信號通路涉及細胞生長、細胞凋亡（促凋亡）、細胞周期進程、分化、轉錄、翻譯和糖代謝[5]。目前研究發現JAK2/STAT3信號通路可以調節腫瘤細胞增[6]、分化、凋亡，尤其與肺癌密切相關[6-8]。目前對肺癌治療大多仍采用傳統的大劑量聯合化學療法和手術切除，但此療法不良反應大，尤其對肝臟和腎臟損害很大，且復發率高[1]。
從祖國醫學寶庫中挖掘抑制肺癌細胞惡性增殖的方法是研發高效低毒的抗肺癌藥物的有效途徑之一[2]。淫羊藿是一種常見中藥，因其具有免疫調節、延緩衰老、減輕骨質疏松以及記憶保護作用，因而被廣泛應用于臨床。目前研究發現淫羊藿苷具有促進細胞凋亡、抑制細胞增殖的作用[3]，在肝癌、乳腺癌、前列腺癌研究中，淫羊藿苷可抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡，以及削弱癌細胞的遷徙，因而具有明顯的抗癌活性[9-15]。但淫羊藿苷對肺癌的作用及其機制尚不清楚。國外研究發現淫羊藿苷可調節JAK2/STAT3信號通路的活性[3, 16-17]，而JAK2/STAT3信號通路在肺癌的惡性增殖和凋亡受阻扮演重要角色。
本試驗中我們通過MTT檢測發現淫羊藿苷可以明顯抑制NCI-H446細胞增殖，通過流式細胞術發現淫羊藿苷明顯增加NCI-H446細胞凋亡率，蛋白質印跡法檢測發現淫羊藿苷對JAK2和STAT3表達無明顯改變，而促進JAK2和STAT3的磷酸化修飾增加，抗凋亡蛋白BCL-2表達明顯減少，促凋亡蛋白Bax表達增加。因此我們推測淫羊藿苷可能通過結構修飾激活JAK2/STAT3信號通路，而非增加JAK2和STAT3的表達量下調NCI-H446增殖，促進NCI-H446凋亡，從而達到治療肺癌的目的。
綜上所述，淫羊藿苷可能是通過激活JAK2/STAT3信號通路來抑制NCI-H446細胞增殖和促進細胞凋亡。然而淫羊藿苷是否直接作用于JAK2信號分子還是通過調節其上游激酶和（或）信號分子而間接發揮作用仍不清楚，尚需進行更深入的研究。
