引用本文： 王大山. 水溶性殼聚糖對脂多糖誘導的巨噬細胞凋亡的影響. 華西醫學, 2017, 32(1): 1-4. doi: 10.7507/1002-0179.201504030 復制
殼聚糖是甲殼質的主要衍生物，也是天然多糖中唯一的堿性陽離子多糖[1]。殼聚糖經過化學修飾、酶解等方式可得到水溶性殼聚糖（water soluble chitosan，WSC），WSC 水溶性較好，其應用范圍得到極大擴展[2]。殼聚糖能夠刺激 T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞等免疫細胞活化，促進細胞因子釋放[3]。而且 WSC 對巨噬細胞有雙向免疫調節的作用，其既能活化靜息的巨噬細胞，促進腫瘤壞死因子-α 的分泌[4]，亦能弱化激活的巨噬細胞，抑制腫瘤壞死因子-α 和白細胞介素-1 等炎癥因子的釋放[5-6]。細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，細胞凋亡調控異常可導致多種疾病的發生。巨噬細胞作為一種重要的免疫細胞，發揮多種免疫功能，巨噬細胞凋亡的異常，穩態的打破，與感染、自身免疫病等疾病相關[7]。本研究將探討 WSC 是否可以弱化脂多糖誘導的巨噬細胞凋亡。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
WSC（濟南海得貝海洋生物工程有限公司），清潔級 Balb/c 小鼠（9 只，6～8 周齡，體質量 18～22 g，雄性）購于山東大學實驗動物中心，杜爾貝科改良伊格爾培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）（美國 Gibco 公司），新生牛血清（美國 Gibco 公司），脂多糖（美國 Sigma 公司），細胞凋亡檢測試劑盒（美國 BD Pharmingen 公司），異硫氰酸熒光素標記的活化胱天蛋白酶（caspase）-3（美國 BD Pharmingen 公司）。本實驗中所有實驗動物的處理方法和操作程序均符合科技部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。
1.2 實驗方法
1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養 將小鼠處死，浸泡于 75% 乙醇消毒后，腹腔注射 5 mL 洛斯維
1.2.2 實驗分組 小鼠腹腔巨噬細胞接種于 96 孔培養板（約 5×104 個/孔），分為 3 組，其中磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）組為空白對照組，陽性對照組加入 1 μg/mL 脂多糖，WSC 與脂多糖共同作用組加入 1 μg/mL 脂多糖和 50 μg/mL WSC。24 h 后，檢測細胞凋亡情況及相關信號分子。每組 3 個復孔。
1.2.3 膜聯蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-碘化丙啶（propidium iodide，PI）法檢測凋亡 各組細胞培養 24 h 后，取出細胞，用 PBS 洗滌，計數，調整至相同細胞數（2×104），用凋亡孵育緩沖液洗滌、離心，加入 200 μL 的孵育緩沖液，5 μL Annexin Ⅴ和 5 μL PI，混勻，避光孵育 15 min，加入 200 μL 的孵育緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
1.2.4 一氧化氮的測定 取 100 μL 培養液上清液與等體積的 Griess 試劑（A 液與 B 液使用前等體積混勻）混勻，避光，微型振蕩器振蕩反應 10 min 后，酶標儀 490 nm 處測吸光度。
1.2.5 活化 caspase-3 檢測 取 2×105 個細胞，用 PBS 洗滌細胞，離心，棄上清液；加入 cytofixTM Fixation 緩沖液 200 μL，充分混勻，避光孵育 15 min；加入 1 mL PBS 洗滌，離心，棄上清液；依次加入 200 μL PhosflowTM Perm 緩沖液Ⅲ和 5 μL 異硫氰酸熒光素標記的活化 caspase-3，同型對照管加 200 μL PhosflowTM Perm 緩沖液Ⅲ和 5 μL 同型對照抗體，充分混勻，4 ℃ 避光孵育 30 min；加 1 mL 的 PBS 洗滌，離心，棄上清液；加入 400 μL PBS 重懸細胞，流式細胞儀檢測。
1.3 統計學方法
采用 Prism 5.01 分析軟件進行統計分析并繪制圖表。實驗數據以均數±標準差表示，不同處理組間比較使用單因素方差分析。檢驗水準α = 0.05。
2 結果
2.1 WSC對脂多糖誘導的巨噬細胞凋亡的影響
Annexin Ⅴ/PI 雙染色，流式細胞術檢測細胞凋亡，見圖 1。PBS 空白對照組、脂多糖刺激組、WSC 與脂多糖共同作用組凋亡的巨噬細胞比例分別為（16.33±4.37）%、（56.67±5.55）%、（31.67±6.64）%。脂多糖刺激組凋亡的巨噬細胞較 PBS 空白對照組明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01）；WSC 與脂多糖共同作用組凋亡的細胞較脂多糖刺激組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）。
圖1
流式細胞儀對巨噬細胞凋亡的檢測結果 圖中數值代表細胞比例
2.2 WSC 對脂多糖激活巨噬細胞一氧化氮釋放的影響
Griess 法檢測表明 PBS 空白對照組、脂多糖刺激組、WSC 與脂多糖共同作用組一氧化氮的釋放量分別為（8.67±4.26）、（27.67±3.76）、（15.33±2.33）μmol/L。脂多糖刺激組巨噬細胞的一氧化氮釋放量較 PBS 空白對照組明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）；WSC 與脂多糖共同作用后，巨噬細胞的一氧化氮釋放量較脂多糖刺激組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.3 WSC 對脂多糖激活巨噬細胞活化 caspase-3 的影響
與脂多糖刺激組相比，WSC 與脂多糖共同作用組活化 caspase-3 表達明顯降低，見圖 2。
圖2
流式細胞儀對巨噬細胞活化 caspase-3 表達的檢測結果 圖中數值代表細胞比例
3 討論
殼聚糖是一種具有多種生物功能的高分子多糖，在生物醫藥領域有廣泛用途。WSC 是通過引入親水基團、酶解等方法得到水溶性好并保持其原有生物功能的多糖，因易溶于水使其應用更加廣泛[8]。研究表明，殼聚糖類多糖具有比較強的抗菌功能，可促進免疫細胞分泌各種免疫活性因子，上調免疫細胞的功能[9]。但近年來也有報道殼聚糖亦能抑制炎癥處激活的免疫細胞的生物學作用，減輕免疫細胞浸潤，例如殼聚糖可以顯著抑制傷口處的炎癥反應，促進傷口愈合，這表明殼聚糖具有雙向免疫調節作用[10]。殼聚糖還可與巨噬細胞表面的甘露糖受體結合，發揮免疫調節功能[4]。有觀點認為，免疫細胞的狀態可能決定了殼聚糖發揮何種免疫調節作用，例如殼聚糖既可刺激靜息狀態下炎癥因子的釋放，亦能抑制干擾素激活的巨噬細胞炎癥因子的釋放[3]。本研究中，我們發現 WSC 可以顯著提高脂多糖刺激的巨噬細胞的活力，抑制脂多糖誘導的細胞凋亡。WSC 可以抑制活化狀態下巨噬細胞的凋亡。
細胞凋亡是一種由多種分子及細胞因子共同作用的細胞程序性死亡方式，機體可通過細胞凋亡來清除衰老、損傷和突變的細胞，以維持機體的穩態平衡[11]。巨噬細胞是一種重要的固有免疫細胞，可通過吞噬病原微生物、提呈抗原、分泌多種細胞因子發揮生物學效應。巨噬細胞凋亡的異常可能與許多病理現象相關[12]。一氧化氮是脂多糖刺激巨噬細胞后產生的主要炎癥因子，也是脂多糖導致機體損傷的主要效應分子。脂多糖刺激巨噬細胞后，可促進一氧化氮的釋放，一氧化氮既可以促進炎癥反應，也會對巨噬細胞本身產生毒性效應，通過細胞凋亡的方式導致巨噬細胞死亡[13]。本研究結果表明，與脂多糖刺激組相比，WSC 與脂多糖共同作用組巨噬細胞一氧化氮的釋放量顯著下降，WSC 可能通過抑制一氧化氮的釋放保護巨噬細胞。
細胞凋亡的途徑比較復雜，主要有死亡受體途徑（外在途徑）、線粒體途徑（內在途徑）、內質網應激途徑[14]。雖然 3 種細胞凋亡途徑的上游信號不盡相同，但是它們最終都要通過激活 caspase 發揮凋亡效應。caspase 大部分是以無活性的酶原形式存在，需要通過級聯的酶促反應、裂解得以活化[15]。① 死亡受體途徑：死亡受體為腫瘤壞死因子受體超家族成員，死亡受體途徑主要包括Fas/FasL途徑、腫瘤壞死因子受體途徑和腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體途徑。死亡受體與配體結合之后，可使死亡受體活化，募集銜接蛋白，銜接蛋白通過死亡效應區募集 caspase-8，使 caspase-8 裂解成有活性的 cleaved caspase-8，進一步通過酶促反應激活 caspase-3 導致細胞凋亡[16]。② 線粒體途徑：當細胞受到外界凋亡信號刺激后，由線粒體外膜的電壓依賴性離子通道和內膜的胸腺核苷酸易位子構成的線粒體 PT 孔打開，形成巨大滲透性通道，PT 孔的開放可導致線粒體結構破壞和功能紊亂，如線粒體滲透壓失衡、膜電位的改變，并最終導致線粒體的內外膜依次裂解，細胞色素 C 釋放，放大細胞凋亡效應[17]。從線粒體釋放出來的細胞色素 C 與 caspase-9 和凋亡蛋白酶激活因子 1 組成凋亡體，進一步水解 caspase-9 為具有酶活性的 cleaved caspase-9，cleaved caspase-9 進一步使 caspase-3 被水解成 cleaved caspase-3，最終導致細胞凋亡[18]。③ 內質網途徑：主要由于內質網鈣離子平衡破壞后，可使定位于內質網的 caspase-12 活化，進一步使 caspase-3 活化，導致細胞凋亡[19]。3 種凋亡途徑的發生，最終都要通過酶解 caspase-3 成有活性的 caspase-3 片段使細胞凋亡[20]。本研究中，我們發現與脂多糖刺激組相比，WSC 與脂多糖共同刺激的巨噬細胞活化 caspase-3 的表達顯著降低，WSC 可能抑制 capase-3 的活化阻止巨噬細胞凋亡。
綜上所述，WSC 可抑制脂多糖激活狀態下巨噬細胞的凋亡，其機制可能是 WSC 抑制了脂多糖激活巨噬細胞的一氧化氮的釋放和 capase-3 的活化。WSC 負向調控了脂多糖誘導的巨噬細胞的凋亡。殼聚糖對巨噬細胞參與的天然免疫具有良好的調節作用，這為殼聚糖用于調節天然免疫功能紊亂提供了重要的實驗依據。
殼聚糖是甲殼質的主要衍生物，也是天然多糖中唯一的堿性陽離子多糖[1]。殼聚糖經過化學修飾、酶解等方式可得到水溶性殼聚糖（water soluble chitosan，WSC），WSC 水溶性較好，其應用范圍得到極大擴展[2]。殼聚糖能夠刺激 T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞等免疫細胞活化，促進細胞因子釋放[3]。而且 WSC 對巨噬細胞有雙向免疫調節的作用，其既能活化靜息的巨噬細胞，促進腫瘤壞死因子-α 的分泌[4]，亦能弱化激活的巨噬細胞，抑制腫瘤壞死因子-α 和白細胞介素-1 等炎癥因子的釋放[5-6]。細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，細胞凋亡調控異常可導致多種疾病的發生。巨噬細胞作為一種重要的免疫細胞，發揮多種免疫功能，巨噬細胞凋亡的異常，穩態的打破，與感染、自身免疫病等疾病相關[7]。本研究將探討 WSC 是否可以弱化脂多糖誘導的巨噬細胞凋亡。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
WSC（濟南海得貝海洋生物工程有限公司），清潔級 Balb/c 小鼠（9 只，6～8 周齡，體質量 18～22 g，雄性）購于山東大學實驗動物中心，杜爾貝科改良伊格爾培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）（美國 Gibco 公司），新生牛血清（美國 Gibco 公司），脂多糖（美國 Sigma 公司），細胞凋亡檢測試劑盒（美國 BD Pharmingen 公司），異硫氰酸熒光素標記的活化胱天蛋白酶（caspase）-3（美國 BD Pharmingen 公司）。本實驗中所有實驗動物的處理方法和操作程序均符合科技部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。
1.2 實驗方法
1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養 將小鼠處死，浸泡于 75% 乙醇消毒后，腹腔注射 5 mL 洛斯維
1.2.2 實驗分組 小鼠腹腔巨噬細胞接種于 96 孔培養板（約 5×104 個/孔），分為 3 組，其中磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）組為空白對照組，陽性對照組加入 1 μg/mL 脂多糖，WSC 與脂多糖共同作用組加入 1 μg/mL 脂多糖和 50 μg/mL WSC。24 h 后，檢測細胞凋亡情況及相關信號分子。每組 3 個復孔。
1.2.3 膜聯蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-碘化丙啶（propidium iodide，PI）法檢測凋亡 各組細胞培養 24 h 后，取出細胞，用 PBS 洗滌，計數，調整至相同細胞數（2×104），用凋亡孵育緩沖液洗滌、離心，加入 200 μL 的孵育緩沖液，5 μL Annexin Ⅴ和 5 μL PI，混勻，避光孵育 15 min，加入 200 μL 的孵育緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
1.2.4 一氧化氮的測定 取 100 μL 培養液上清液與等體積的 Griess 試劑（A 液與 B 液使用前等體積混勻）混勻，避光，微型振蕩器振蕩反應 10 min 后，酶標儀 490 nm 處測吸光度。
1.2.5 活化 caspase-3 檢測 取 2×105 個細胞，用 PBS 洗滌細胞，離心，棄上清液；加入 cytofixTM Fixation 緩沖液 200 μL，充分混勻，避光孵育 15 min；加入 1 mL PBS 洗滌，離心，棄上清液；依次加入 200 μL PhosflowTM Perm 緩沖液Ⅲ和 5 μL 異硫氰酸熒光素標記的活化 caspase-3，同型對照管加 200 μL PhosflowTM Perm 緩沖液Ⅲ和 5 μL 同型對照抗體，充分混勻，4 ℃ 避光孵育 30 min；加 1 mL 的 PBS 洗滌，離心，棄上清液；加入 400 μL PBS 重懸細胞，流式細胞儀檢測。
1.3 統計學方法
采用 Prism 5.01 分析軟件進行統計分析并繪制圖表。實驗數據以均數±標準差表示，不同處理組間比較使用單因素方差分析。檢驗水準α = 0.05。
2 結果
2.1 WSC對脂多糖誘導的巨噬細胞凋亡的影響
Annexin Ⅴ/PI 雙染色，流式細胞術檢測細胞凋亡，見圖 1。PBS 空白對照組、脂多糖刺激組、WSC 與脂多糖共同作用組凋亡的巨噬細胞比例分別為（16.33±4.37）%、（56.67±5.55）%、（31.67±6.64）%。脂多糖刺激組凋亡的巨噬細胞較 PBS 空白對照組明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01）；WSC 與脂多糖共同作用組凋亡的細胞較脂多糖刺激組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）。
圖1
流式細胞儀對巨噬細胞凋亡的檢測結果 圖中數值代表細胞比例
2.2 WSC 對脂多糖激活巨噬細胞一氧化氮釋放的影響
Griess 法檢測表明 PBS 空白對照組、脂多糖刺激組、WSC 與脂多糖共同作用組一氧化氮的釋放量分別為（8.67±4.26）、（27.67±3.76）、（15.33±2.33）μmol/L。脂多糖刺激組巨噬細胞的一氧化氮釋放量較 PBS 空白對照組明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）；WSC 與脂多糖共同作用后，巨噬細胞的一氧化氮釋放量較脂多糖刺激組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.3 WSC 對脂多糖激活巨噬細胞活化 caspase-3 的影響
與脂多糖刺激組相比，WSC 與脂多糖共同作用組活化 caspase-3 表達明顯降低，見圖 2。
圖2
流式細胞儀對巨噬細胞活化 caspase-3 表達的檢測結果 圖中數值代表細胞比例
3 討論
殼聚糖是一種具有多種生物功能的高分子多糖，在生物醫藥領域有廣泛用途。WSC 是通過引入親水基團、酶解等方法得到水溶性好并保持其原有生物功能的多糖，因易溶于水使其應用更加廣泛[8]。研究表明，殼聚糖類多糖具有比較強的抗菌功能，可促進免疫細胞分泌各種免疫活性因子，上調免疫細胞的功能[9]。但近年來也有報道殼聚糖亦能抑制炎癥處激活的免疫細胞的生物學作用，減輕免疫細胞浸潤，例如殼聚糖可以顯著抑制傷口處的炎癥反應，促進傷口愈合，這表明殼聚糖具有雙向免疫調節作用[10]。殼聚糖還可與巨噬細胞表面的甘露糖受體結合，發揮免疫調節功能[4]。有觀點認為，免疫細胞的狀態可能決定了殼聚糖發揮何種免疫調節作用，例如殼聚糖既可刺激靜息狀態下炎癥因子的釋放，亦能抑制干擾素激活的巨噬細胞炎癥因子的釋放[3]。本研究中，我們發現 WSC 可以顯著提高脂多糖刺激的巨噬細胞的活力，抑制脂多糖誘導的細胞凋亡。WSC 可以抑制活化狀態下巨噬細胞的凋亡。
細胞凋亡是一種由多種分子及細胞因子共同作用的細胞程序性死亡方式，機體可通過細胞凋亡來清除衰老、損傷和突變的細胞，以維持機體的穩態平衡[11]。巨噬細胞是一種重要的固有免疫細胞，可通過吞噬病原微生物、提呈抗原、分泌多種細胞因子發揮生物學效應。巨噬細胞凋亡的異常可能與許多病理現象相關[12]。一氧化氮是脂多糖刺激巨噬細胞后產生的主要炎癥因子，也是脂多糖導致機體損傷的主要效應分子。脂多糖刺激巨噬細胞后，可促進一氧化氮的釋放，一氧化氮既可以促進炎癥反應，也會對巨噬細胞本身產生毒性效應，通過細胞凋亡的方式導致巨噬細胞死亡[13]。本研究結果表明，與脂多糖刺激組相比，WSC 與脂多糖共同作用組巨噬細胞一氧化氮的釋放量顯著下降，WSC 可能通過抑制一氧化氮的釋放保護巨噬細胞。
細胞凋亡的途徑比較復雜，主要有死亡受體途徑（外在途徑）、線粒體途徑（內在途徑）、內質網應激途徑[14]。雖然 3 種細胞凋亡途徑的上游信號不盡相同，但是它們最終都要通過激活 caspase 發揮凋亡效應。caspase 大部分是以無活性的酶原形式存在，需要通過級聯的酶促反應、裂解得以活化[15]。① 死亡受體途徑：死亡受體為腫瘤壞死因子受體超家族成員，死亡受體途徑主要包括Fas/FasL途徑、腫瘤壞死因子受體途徑和腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體途徑。死亡受體與配體結合之后，可使死亡受體活化，募集銜接蛋白，銜接蛋白通過死亡效應區募集 caspase-8，使 caspase-8 裂解成有活性的 cleaved caspase-8，進一步通過酶促反應激活 caspase-3 導致細胞凋亡[16]。② 線粒體途徑：當細胞受到外界凋亡信號刺激后，由線粒體外膜的電壓依賴性離子通道和內膜的胸腺核苷酸易位子構成的線粒體 PT 孔打開，形成巨大滲透性通道，PT 孔的開放可導致線粒體結構破壞和功能紊亂，如線粒體滲透壓失衡、膜電位的改變，并最終導致線粒體的內外膜依次裂解，細胞色素 C 釋放，放大細胞凋亡效應[17]。從線粒體釋放出來的細胞色素 C 與 caspase-9 和凋亡蛋白酶激活因子 1 組成凋亡體，進一步水解 caspase-9 為具有酶活性的 cleaved caspase-9，cleaved caspase-9 進一步使 caspase-3 被水解成 cleaved caspase-3，最終導致細胞凋亡[18]。③ 內質網途徑：主要由于內質網鈣離子平衡破壞后，可使定位于內質網的 caspase-12 活化，進一步使 caspase-3 活化，導致細胞凋亡[19]。3 種凋亡途徑的發生，最終都要通過酶解 caspase-3 成有活性的 caspase-3 片段使細胞凋亡[20]。本研究中，我們發現與脂多糖刺激組相比，WSC 與脂多糖共同刺激的巨噬細胞活化 caspase-3 的表達顯著降低，WSC 可能抑制 capase-3 的活化阻止巨噬細胞凋亡。
綜上所述，WSC 可抑制脂多糖激活狀態下巨噬細胞的凋亡，其機制可能是 WSC 抑制了脂多糖激活巨噬細胞的一氧化氮的釋放和 capase-3 的活化。WSC 負向調控了脂多糖誘導的巨噬細胞的凋亡。殼聚糖對巨噬細胞參與的天然免疫具有良好的調節作用，這為殼聚糖用于調節天然免疫功能紊亂提供了重要的實驗依據。
