引用本文： 馬孝湘, 陳曉平, 程幼夫, 何霞, 帥平, 楊雁華, 肖仙, 劉玉萍. 中國四川漢族人群乙醛脫氫酶2基因多態性與頸動脈內膜中膜厚度的關系. 華西醫學, 2015, 30(3): 401-406. doi: 10.7507/1002-0179.20150119 復制
動脈粥樣硬化（AS）是腦卒中的主要原因之一，頸動脈與AS之間存在著密切關系，可作為反映冠狀動脈及全身AS的一個窗口[1]。頸動脈內膜中膜厚度（IMT）增厚是AS的早期標志和心血管疾病的獨立危險因素，也是心血管疾病評估、干預、療效判斷的重要指標[2]。乙醛脫氫酶2（ALDH2）不僅是乙醇代謝過程中關鍵酶之一，而且是重要的抗氧化應激分子，可減少乙醛及其他脂肪族醛類的細胞毒性，延緩AS的進程，具有重要的心血管保護作用[3]，已成為心血管疾病生物化學標志物研究的新熱點。研究發現，AS病變為多基因遺傳病，其發病是環境和遺傳因素共同作用的結果，一些基因的變化可引起頸動脈IMT變化，促進AS的發生和發展[4]。頸動脈IMT增厚的影響因素較多，ALDH2對其是否有影響目前國內外尚缺乏有關報道。本研究采用DNA微陣列芯片法和頸動脈彩色多普勒超聲檢查技術，對中國四川漢族人群ALDH2基因多態性與頸動脈IMT增厚的相關性進行對比研究，以期探討ALDH2基因多態性與頸動脈IMT的關系，為臨床早期進行干預性防治AS提供可靠的理論依據。
1 資料與方法
1.1 一般資料
隨機選擇2013年4月－2014年2月在四川省人民醫院體檢中心進行體檢的頸動脈IMT增厚的成年人310例作為觀察組（IMT增厚組），男180例，女130例；年齡30～70歲，平均（52.6±14.3）歲。選擇同期在本院體檢頸動脈IMT正常的健康成年人280例作為對照組。所有研究對象均來自四川漢族人群，無血緣關系。受試者均自愿參加試驗并簽署書面知情同意書。本研究通過四川省人民醫院醫學倫理委員會批準。
排除標準：高血壓、心腦血管疾病、周圍血管病、糖尿病、高脂血癥、甲狀腺功能亢進或減退等內分泌代謝疾病、結締組織疾病及各種原因導致的心、肝、腎功能不全等疾患。
1.2 主要試劑和儀器
西門子Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀、Eppendorf 5417R高速冷凍離心機、Thermo Finnpipette Freshman移液器、杭州博日HB-100金屬浴、ABI9700聚合酶鏈式反應（PCR）儀、BaiO E-Hyb全自動雜交儀；BaiO血細胞DNA提取試劑盒、BaiO ALDH2基因檢測試劑盒。
1.3 頸動脈多普勒超聲檢查
由指定超聲診斷醫師專門負責檢查，使用西門子Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率3～9 MHz。受試者取仰臥位，平靜呼吸，雙肩墊枕，頭頸部盡量仰伸，頭轉向對側，在雙側頸總動脈、頸內動脈等處沿血管長軸測定6個部位：頸總動脈IMT測量部位（頸總動脈距頸動脈竇2 cm處）；頸內動脈IMT測量部位（頸內動脈距頸動脈竇1 cm處）；頸外動脈IMT測量部位（頸外動脈距頸動脈竇1 cm處）。取6個部位IMT的平均值作為該患者的頸動脈IMT[5]。IMT數值均在心室舒張末期（心電圖R波頂端）測量，測3個心動周期，取其平均值。目前IMT增厚國內外標準尚未統一，參考國內外研究，本研究中以頸動脈系統的任一點IMT≥0.9 mm為IMT增厚[6]。
1.4 基因組DNA提取
所有受試者均于檢查日清晨禁食12 h、禁水8 h后抽取外周血1 mL，加至乙二胺四乙酸抗凝管中，-20℃冰箱暫存，經由3 000 r/min高速離心機離心后取上層血清。血清及抗凝全血分別置入-80℃超低溫冰箱保存。
1.5 PCR
使用基因組DNA提取試劑盒提取DNA后在BaiO E-Hyb儀器自帶的軟件中輸入相關基因信息，設置引物條件，儀器自動搜索配對的上下游引物若干對，并標注配對引物分值，可根據所檢測突變位點上下游相關的基因信息選擇適當的引物對以及測序引物（上游引物：5c-TATGATGTGTTTGGAGCCCA GTC-3c；下游引物：5c-ACACTGATGGCCTCAAGC ATG-3c；且帶生物素標記。測序引物：GCTGCAGG CATACACT）進行PCR擴增。反應體系為25 μL。按下列條件擴增：50℃ 5 min；90℃ 5 min；94℃ 25 s，60℃ 25 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃5 min。取5 μL擴增產物，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察擴增產物為360堿基對（bp）。取10 μL擴增產物，參照試劑盒說明書方法，與芯片上的檢測探針雜交并酶促顯色，通過BE-2.0生物芯片識讀儀對芯片進行掃描分析得到樣本ALDH2基因型。
1.6 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。群體基因型經Hardy-Weinberg平衡檢驗，以檢驗樣本的代表性；組間等位基因型頻率的比較采用χ2檢驗。以頸動脈IMT增厚為因變量，以ALDH2基因型為自變量，進行單因素二分類logistic回歸分析；再增加性別、年齡、血壓進行多因素二分類logistic回歸分析，并計算比值比（OR）及其95%置信區間（CI）。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 兩組一般資料比較
IMT增厚組和對照組除頸動脈IMT差異有統計學意義外（P＜0.05），兩組在年齡、性別、吸煙和飲酒情況、總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、體質量指數、收縮壓、舒張壓、空腹血糖等方面差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
IMT增厚組與對照組一般資料比較
2.2 兩組ALDH2基因型結果判斷
參照圖 1～3判斷結果，進行ALDH2基因分型：野生型純合子ALDH2*1/*1（GG型），被消化成2條片段，分別為112、23 bp；突變型純合子ALDH2*2/* 2（AA型），不被酶切為153 bp；而突變型雜合子ALDH2*1/* 2（AG型），消化后為3條帶，分別為153、112、23 bp。
圖1
野生型純合子ALDH2*1/*1（GG型）
圖2
變型純合子ALDH2*2/*2（AA型）
圖3
突變型雜合子ALDH2*1/*2（AG型）
2.3 兩組ALDH2基因型和等位基因頻率分布
ALDH2基因型有3種：野生型純合子GG型、突變型雜合子AG型、突變型純合子AA型，兩組ALDH2基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，說明樣本具有群體代表性。IMT增厚組GG型頻率為32.6%，AA/AG型頻率為67.4%；對照組GG型頻率為58.9%，AA/AG型頻率為41.1%。兩組間AA/AG型、GG型頻率分布差異有統計學意義（χ2=41.251，P＜0.001）。A等位基因頻率在IMT增厚組為37.9%，正常對照組為22.3%；G等位基因頻率在IMT增厚組為62.5%，正常對照組為77.7%，兩組間總的等位基因頻率分布差異有統計學意義（χ2=36.696，P＜0.001）。見表 2。
表2
IMT增厚組與對照組基因型分布及等位基因分布頻率比較[例（%）]
2.4 logistic回歸分析
以ALDH2基因型為自變量，頸動脈IMT增厚為因變量進行logistic回歸分析，結果顯示ALDH2基因多態性與頸動脈IMT增厚相關[OR=2.381，95%CI（1.356，4.213），P=0.004]，對性別、收縮壓、舒張壓、年齡多因素調整后結果仍然有統計學意義[OR=3.179，95%CI（2.234，10.114），P=0.030]，顯示ALDH2基因型是頸動脈IMT增厚發生的獨立危險因素。
3 討論
隨著人們生活方式、飲食結構的改變，AS發病率及死亡率在我國乃至全世界均居各種疾病之首，因此AS的防治是人類面臨的重大公共衛生問題[7]。目前研究發現盡管AS的發生與吸煙、高血壓、糖尿病、血脂異常等多種危險因素相關[8]，但這些因素只能解釋部分患者的發病。越來越多的證據表明，遺傳因素是AS發生的重要原因[9]。許多特定的基因多態性會影響上述危險因素的變化，進而促進AS的發生和發展。
AS的病變主要在動脈內膜，頸動脈是AS最常累及的部位[10]。頸動脈IMT與許多心血管病的危險因素密切相關[11]。頸動脈IMT的增厚及斑塊形成是AS的明顯特征，頸動脈IMT增厚早于頸動脈斑塊的形成，可初步了解重要器官動脈硬化情況[12]。頸動脈IMT正常厚度應≤0.5 mm，其增厚到何種程度為異常，目前標準不統一，多數研究結果認為頸總動脈IMT值高于0.8～1.0 mm即為異常[13]，《歐洲高血壓指南》中將IMT＞0.9 mm作為AS靶器官損害的標志[14]。本研究將頸動脈系統的任一點IMT≥0.9 mm為IMT增厚。臨床上動脈多普勒超聲檢查是目前診斷AS的重要無創手段，IMT是動脈硬化的明確超聲標志，并可以反映全身AS狀況[15]。使用高分辨率B型多普勒超聲測定頸動脈IMT能精確和形象地描述頸AS引起的血管壁改變，是衡量AS早期改變的可靠指標[16]。
乙醛脫氫酶（ALDH）是一類存在于細胞質內的酶，廣泛分布在不同組織[17]，ALDH2為其中的亞型，主要位于線粒體內，由位于12號染色體的ALDH2基因編碼。ALDH2基因存在高度遺傳多態性[7]，ALDH2基因包含13個外顯子，在12號外顯子第457位的堿基發生突變，出現堿基置換：鳥嘌呤（G）突變為腺嘌呤（A）而使整個分子的空間結構發生變化，導致了ALDH2酶活性的喪失，削弱ALDH2的生物學功能。因此，ALDH2基因型出現3種組合方式：野生型純合子GG型、突變型雜合子AG型、突變型純合子AA型[18]。ALDH2基因在亞洲人群中的突變率顯著高于歐美白種人，包括中國人群在內，亞洲人群中ALDH2的突變比例達30%～50%[19]。本研究采用DNA微陣列芯片法和頸動脈彩色多普勒超聲檢查技術對中國四川漢族310例頸動脈IMT增厚的成年人和280例頸動脈IMT正常的健康者的ALDH2基因型進行了分析，結果顯示，頸動脈IMT增厚組ALDH2基因AA/AG基因型和A等位基因頻率明顯增加，兩組AA/AG型、GG型和A等位基因頻率分布差異均有統計學意義（P＜0.001）；同時，logistic回歸顯示ALDH2基因多態性與頸動脈IMT增厚相關[OR=2.381，95%CI（1.356，4.213），P=0.004]。提示ALDH2基因型可能是頸動脈IMT增厚的易感基因型，ALDH2基因多態性可能與頸動脈IMT增厚有相關性。分析其原因，可能與以下機制有關：動脈壁的損傷和修復以及AS均伴隨有炎癥反應發生[20]，氧化應激是AS血管炎癥中的多種信號轉導系統的主要調節者，氧化應激可導致AS的發生和發展。4-羥基壬烯醛（4-HNE）是脂質過氧化反應醛基產物中最具代表性的物質，可破壞線粒體功能，造成AS血管損傷[21]。ALDH2野生型可防止乙醛對膜的脂質過氧化，減輕4-HNE對細胞的氧化損傷作用，發揮抗氧化作用，改善內皮功能，減少AS的發生和減緩其進展[22]。
總之，本研究結果顯示，ALDH2的A等位基因的存在增加了頸動脈IMT增厚發生的危險性，因此通過檢測ALDH2基因型篩查頸動脈IMT增厚高危人群，對及早發現和及時預防AS具有重要意義。但由于考慮到基因的易感性可能與樣本來源的民族和地域的差異有關，因此還需要更多人群來證明ALDH2基因型與頸動脈IMT增厚的關系和進一步的作用機制。
動脈粥樣硬化（AS）是腦卒中的主要原因之一，頸動脈與AS之間存在著密切關系，可作為反映冠狀動脈及全身AS的一個窗口[1]。頸動脈內膜中膜厚度（IMT）增厚是AS的早期標志和心血管疾病的獨立危險因素，也是心血管疾病評估、干預、療效判斷的重要指標[2]。乙醛脫氫酶2（ALDH2）不僅是乙醇代謝過程中關鍵酶之一，而且是重要的抗氧化應激分子，可減少乙醛及其他脂肪族醛類的細胞毒性，延緩AS的進程，具有重要的心血管保護作用[3]，已成為心血管疾病生物化學標志物研究的新熱點。研究發現，AS病變為多基因遺傳病，其發病是環境和遺傳因素共同作用的結果，一些基因的變化可引起頸動脈IMT變化，促進AS的發生和發展[4]。頸動脈IMT增厚的影響因素較多，ALDH2對其是否有影響目前國內外尚缺乏有關報道。本研究采用DNA微陣列芯片法和頸動脈彩色多普勒超聲檢查技術，對中國四川漢族人群ALDH2基因多態性與頸動脈IMT增厚的相關性進行對比研究，以期探討ALDH2基因多態性與頸動脈IMT的關系，為臨床早期進行干預性防治AS提供可靠的理論依據。
1 資料與方法
1.1 一般資料
隨機選擇2013年4月－2014年2月在四川省人民醫院體檢中心進行體檢的頸動脈IMT增厚的成年人310例作為觀察組（IMT增厚組），男180例，女130例；年齡30～70歲，平均（52.6±14.3）歲。選擇同期在本院體檢頸動脈IMT正常的健康成年人280例作為對照組。所有研究對象均來自四川漢族人群，無血緣關系。受試者均自愿參加試驗并簽署書面知情同意書。本研究通過四川省人民醫院醫學倫理委員會批準。
排除標準：高血壓、心腦血管疾病、周圍血管病、糖尿病、高脂血癥、甲狀腺功能亢進或減退等內分泌代謝疾病、結締組織疾病及各種原因導致的心、肝、腎功能不全等疾患。
1.2 主要試劑和儀器
西門子Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀、Eppendorf 5417R高速冷凍離心機、Thermo Finnpipette Freshman移液器、杭州博日HB-100金屬浴、ABI9700聚合酶鏈式反應（PCR）儀、BaiO E-Hyb全自動雜交儀；BaiO血細胞DNA提取試劑盒、BaiO ALDH2基因檢測試劑盒。
1.3 頸動脈多普勒超聲檢查
由指定超聲診斷醫師專門負責檢查，使用西門子Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率3～9 MHz。受試者取仰臥位，平靜呼吸，雙肩墊枕，頭頸部盡量仰伸，頭轉向對側，在雙側頸總動脈、頸內動脈等處沿血管長軸測定6個部位：頸總動脈IMT測量部位（頸總動脈距頸動脈竇2 cm處）；頸內動脈IMT測量部位（頸內動脈距頸動脈竇1 cm處）；頸外動脈IMT測量部位（頸外動脈距頸動脈竇1 cm處）。取6個部位IMT的平均值作為該患者的頸動脈IMT[5]。IMT數值均在心室舒張末期（心電圖R波頂端）測量，測3個心動周期，取其平均值。目前IMT增厚國內外標準尚未統一，參考國內外研究，本研究中以頸動脈系統的任一點IMT≥0.9 mm為IMT增厚[6]。
1.4 基因組DNA提取
所有受試者均于檢查日清晨禁食12 h、禁水8 h后抽取外周血1 mL，加至乙二胺四乙酸抗凝管中，-20℃冰箱暫存，經由3 000 r/min高速離心機離心后取上層血清。血清及抗凝全血分別置入-80℃超低溫冰箱保存。
1.5 PCR
使用基因組DNA提取試劑盒提取DNA后在BaiO E-Hyb儀器自帶的軟件中輸入相關基因信息，設置引物條件，儀器自動搜索配對的上下游引物若干對，并標注配對引物分值，可根據所檢測突變位點上下游相關的基因信息選擇適當的引物對以及測序引物（上游引物：5c-TATGATGTGTTTGGAGCCCA GTC-3c；下游引物：5c-ACACTGATGGCCTCAAGC ATG-3c；且帶生物素標記。測序引物：GCTGCAGG CATACACT）進行PCR擴增。反應體系為25 μL。按下列條件擴增：50℃ 5 min；90℃ 5 min；94℃ 25 s，60℃ 25 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃5 min。取5 μL擴增產物，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察擴增產物為360堿基對（bp）。取10 μL擴增產物，參照試劑盒說明書方法，與芯片上的檢測探針雜交并酶促顯色，通過BE-2.0生物芯片識讀儀對芯片進行掃描分析得到樣本ALDH2基因型。
1.6 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。群體基因型經Hardy-Weinberg平衡檢驗，以檢驗樣本的代表性；組間等位基因型頻率的比較采用χ2檢驗。以頸動脈IMT增厚為因變量，以ALDH2基因型為自變量，進行單因素二分類logistic回歸分析；再增加性別、年齡、血壓進行多因素二分類logistic回歸分析，并計算比值比（OR）及其95%置信區間（CI）。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 兩組一般資料比較
IMT增厚組和對照組除頸動脈IMT差異有統計學意義外（P＜0.05），兩組在年齡、性別、吸煙和飲酒情況、總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、體質量指數、收縮壓、舒張壓、空腹血糖等方面差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
IMT增厚組與對照組一般資料比較
2.2 兩組ALDH2基因型結果判斷
參照圖 1～3判斷結果，進行ALDH2基因分型：野生型純合子ALDH2*1/*1（GG型），被消化成2條片段，分別為112、23 bp；突變型純合子ALDH2*2/* 2（AA型），不被酶切為153 bp；而突變型雜合子ALDH2*1/* 2（AG型），消化后為3條帶，分別為153、112、23 bp。
圖1
野生型純合子ALDH2*1/*1（GG型）
圖2
變型純合子ALDH2*2/*2（AA型）
圖3
突變型雜合子ALDH2*1/*2（AG型）
2.3 兩組ALDH2基因型和等位基因頻率分布
ALDH2基因型有3種：野生型純合子GG型、突變型雜合子AG型、突變型純合子AA型，兩組ALDH2基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，說明樣本具有群體代表性。IMT增厚組GG型頻率為32.6%，AA/AG型頻率為67.4%；對照組GG型頻率為58.9%，AA/AG型頻率為41.1%。兩組間AA/AG型、GG型頻率分布差異有統計學意義（χ2=41.251，P＜0.001）。A等位基因頻率在IMT增厚組為37.9%，正常對照組為22.3%；G等位基因頻率在IMT增厚組為62.5%，正常對照組為77.7%，兩組間總的等位基因頻率分布差異有統計學意義（χ2=36.696，P＜0.001）。見表 2。
表2
IMT增厚組與對照組基因型分布及等位基因分布頻率比較[例（%）]
2.4 logistic回歸分析
以ALDH2基因型為自變量，頸動脈IMT增厚為因變量進行logistic回歸分析，結果顯示ALDH2基因多態性與頸動脈IMT增厚相關[OR=2.381，95%CI（1.356，4.213），P=0.004]，對性別、收縮壓、舒張壓、年齡多因素調整后結果仍然有統計學意義[OR=3.179，95%CI（2.234，10.114），P=0.030]，顯示ALDH2基因型是頸動脈IMT增厚發生的獨立危險因素。
3 討論
隨著人們生活方式、飲食結構的改變，AS發病率及死亡率在我國乃至全世界均居各種疾病之首，因此AS的防治是人類面臨的重大公共衛生問題[7]。目前研究發現盡管AS的發生與吸煙、高血壓、糖尿病、血脂異常等多種危險因素相關[8]，但這些因素只能解釋部分患者的發病。越來越多的證據表明，遺傳因素是AS發生的重要原因[9]。許多特定的基因多態性會影響上述危險因素的變化，進而促進AS的發生和發展。
AS的病變主要在動脈內膜，頸動脈是AS最常累及的部位[10]。頸動脈IMT與許多心血管病的危險因素密切相關[11]。頸動脈IMT的增厚及斑塊形成是AS的明顯特征，頸動脈IMT增厚早于頸動脈斑塊的形成，可初步了解重要器官動脈硬化情況[12]。頸動脈IMT正常厚度應≤0.5 mm，其增厚到何種程度為異常，目前標準不統一，多數研究結果認為頸總動脈IMT值高于0.8～1.0 mm即為異常[13]，《歐洲高血壓指南》中將IMT＞0.9 mm作為AS靶器官損害的標志[14]。本研究將頸動脈系統的任一點IMT≥0.9 mm為IMT增厚。臨床上動脈多普勒超聲檢查是目前診斷AS的重要無創手段，IMT是動脈硬化的明確超聲標志，并可以反映全身AS狀況[15]。使用高分辨率B型多普勒超聲測定頸動脈IMT能精確和形象地描述頸AS引起的血管壁改變，是衡量AS早期改變的可靠指標[16]。
乙醛脫氫酶（ALDH）是一類存在于細胞質內的酶，廣泛分布在不同組織[17]，ALDH2為其中的亞型，主要位于線粒體內，由位于12號染色體的ALDH2基因編碼。ALDH2基因存在高度遺傳多態性[7]，ALDH2基因包含13個外顯子，在12號外顯子第457位的堿基發生突變，出現堿基置換：鳥嘌呤（G）突變為腺嘌呤（A）而使整個分子的空間結構發生變化，導致了ALDH2酶活性的喪失，削弱ALDH2的生物學功能。因此，ALDH2基因型出現3種組合方式：野生型純合子GG型、突變型雜合子AG型、突變型純合子AA型[18]。ALDH2基因在亞洲人群中的突變率顯著高于歐美白種人，包括中國人群在內，亞洲人群中ALDH2的突變比例達30%～50%[19]。本研究采用DNA微陣列芯片法和頸動脈彩色多普勒超聲檢查技術對中國四川漢族310例頸動脈IMT增厚的成年人和280例頸動脈IMT正常的健康者的ALDH2基因型進行了分析，結果顯示，頸動脈IMT增厚組ALDH2基因AA/AG基因型和A等位基因頻率明顯增加，兩組AA/AG型、GG型和A等位基因頻率分布差異均有統計學意義（P＜0.001）；同時，logistic回歸顯示ALDH2基因多態性與頸動脈IMT增厚相關[OR=2.381，95%CI（1.356，4.213），P=0.004]。提示ALDH2基因型可能是頸動脈IMT增厚的易感基因型，ALDH2基因多態性可能與頸動脈IMT增厚有相關性。分析其原因，可能與以下機制有關：動脈壁的損傷和修復以及AS均伴隨有炎癥反應發生[20]，氧化應激是AS血管炎癥中的多種信號轉導系統的主要調節者，氧化應激可導致AS的發生和發展。4-羥基壬烯醛（4-HNE）是脂質過氧化反應醛基產物中最具代表性的物質，可破壞線粒體功能，造成AS血管損傷[21]。ALDH2野生型可防止乙醛對膜的脂質過氧化，減輕4-HNE對細胞的氧化損傷作用，發揮抗氧化作用，改善內皮功能，減少AS的發生和減緩其進展[22]。
總之，本研究結果顯示，ALDH2的A等位基因的存在增加了頸動脈IMT增厚發生的危險性，因此通過檢測ALDH2基因型篩查頸動脈IMT增厚高危人群，對及早發現和及時預防AS具有重要意義。但由于考慮到基因的易感性可能與樣本來源的民族和地域的差異有關，因此還需要更多人群來證明ALDH2基因型與頸動脈IMT增厚的關系和進一步的作用機制。
