引用本文： 毛志遠, 熊梅, 任力, 李煒, 李德昌, 岳穎, 鄭吉春. DNA倍體分析在良惡性支氣管刷片或支氣管灌洗液中的診斷價值. 華西醫學, 2014, 29(12): 2226-2229. doi: 10.7507/1002-0179.20140673 復制
支氣管鏡檢查是呼吸系統疾病常用的檢查方法，大多數肺部及氣道疾病，如腫瘤、間質性肺病、肉芽腫性疾病以及某些感染性疾病需要通過經支氣管鏡活體組織檢查（活檢）術來確定診斷[1]，檢查過程中常規行支氣管刷檢或支氣管灌洗及活檢，但有時病變位置較深，無法進行活檢，只能依靠細胞學檢查來診斷腫瘤的良惡性[2]。但當支氣管刷檢或者支氣管灌洗液中細胞無或較少，一些分化較好的惡性腫瘤與炎癥性病變或者良性腫瘤不易鑒別時，常規細胞學檢查無論是特異度還是靈敏度都較低[3]，而采用定量細胞學方法測定支氣管刷檢或者支氣管灌洗液中細胞的DNA含量的變化來判斷病變的良惡性已經成為細胞學診斷的新的研究領域。本研究通過采用DNA倍體全自動圖像分析儀對支氣管刷檢或支氣管灌洗液細胞進行DNA含量測定，用以探討該技術對良惡性支氣管刷片或支氣管灌洗液的診斷價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
2012年6月－2013年6月期間由我院臨床送檢，96例經病理診斷明確的呼吸系統疾病患者，均進行支氣管鏡檢查，并在檢查過程中行支氣管刷檢或支氣管灌洗及活檢。良性病變49例，男31例，女18例；年齡32～76歲，平均56歲；主要為肺感染性病變。惡性病變47例，男32例，女15例；年齡45～82歲，平均61歲；主要為原發性肺癌，其中肺鱗狀細胞癌28例，肺腺癌16例，肺小細胞癌3例。
1.2 方法
1.2.1 支氣管刷片
支氣管刷片是肺部疾病的早期診斷方法之一，本研究共78例行支氣管刷片檢查。由臨床醫生行支氣管鏡（Olympus BF10型，日本奧林巴斯公司）檢查時刷取，并均勻涂于載玻片上，取足夠量細胞，制成支氣管刷片2張，其中1張自然干燥，95%乙醇固定10 min，蘇木精-伊紅（HE）染色，行常規細胞學檢查；另外1張經Feulgen染色，用DNA倍體全自動圖像分析儀進行DNA倍體分析。去除可能干擾結果的重疊細胞或雜質。
1.2.2 支氣管灌洗液
支氣管灌洗液是常規用于疾病診斷的方法，本研究共18例行支氣管灌洗液檢查。50～150 mL/例支氣管灌洗液經離心（離心半徑3 cm，轉速2 500 r/min，離心時間10 min）取適量上清液，用細胞涂片離心機（湖南湘儀TXD3）離心涂片，制成2張薄層細胞片，其中1張用HE染色進行常規細胞學檢查，另外1張用Feulgen染色，用DNA倍體全自動圖像分析儀進行DNA倍體分析。去除可能干擾結果的重疊細胞或雜質。
1.3 結果判定
1.3.1 常規細胞學診斷
無論是支氣管刷片還是支氣管灌洗液，均經有經驗的病理醫師判讀結果。結果分為：① 良性（包括急慢性炎癥、支氣管上皮細胞等）；② 可疑惡性；③ 惡性（包括惡性腫瘤細胞）。
1.3.2 DNA倍體全自動圖像分析儀
對每例支氣管刷片或支氣管灌洗液在20倍鏡下腫瘤區域的4 000個以上的細胞進行自動聚焦分析，根據每個細胞核的79個核特征參數值，自動進行受檢細胞的分類和計數，自動計算出DNA倍體分析直方圖和細胞點陣分布圖。二倍體細胞（G1/G0）的DNA含量為2C，當DNA含量為4C時，多為四倍體細胞（G2/M期）。當有3個以上DNA含量為＞5C的細胞或當異倍體細胞DNA含量在2C～4C之間形成峰時，即可診斷為惡性支氣管刷片或者惡性支氣管灌洗液[4]。
1.4 統計學方法
應用SPSS 19.0軟件進行統計處理。計數資料組間比較用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 常規細胞學檢查
常規細胞學對96例支氣管刷片或支氣管灌洗液進行診斷，在49例良性病變中，42例診斷為良性，鏡下可見大量支氣管黏膜上皮細胞，少量泡沫細胞、炎細胞及組織細胞，未見惡性腫瘤細胞；7例為可疑惡性，可見少許成團異型細胞，建議活檢；無患者診斷為惡性。在47例惡性病變中，32例鏡下可見成團及散在的異型性明顯腫瘤細胞，形態符合惡性；5例可見核異質細胞；10例鏡下未見惡性腫瘤細胞。見表 1。
表1
常規細胞學與DNA倍體分析診斷結果
2.2 DNA倍體全自動圖像分析
DNA倍體全自動圖像分析儀對96例支氣管刷片或支氣管灌洗液進行診斷，49例良性病變均為陰性結果，未見DNA倍體異常細胞，良性病變未見DNA倍體異常細胞及DNA含量＞5C的細胞，正常僅可見2C處形成峰，增生性病變可見2C和4C處形成2個峰（圖 1、2）。在47例惡性病變中，43例可見DNA倍體異常細胞，考慮為惡性腫瘤細胞，其中29例有較多的DNA含量＞5C的異倍體細胞（圖 3），14例可見少量DNA倍體異常細胞；4例為陰性，其中3例為原發性肺腺癌，1例為原發性肺鱗狀細胞癌。見表 1。
圖1
正常支氣管刷片或支氣管灌洗液DNA倍體分析結果 1a. 細胞均為二倍體，無DNA＞5C的細胞 1b. 細胞核面積與DNA倍體的關系 1c. 細胞根據DNA含量由大至小排列，DNA含量＜5C異倍體細胞 1d. DNA倍體全自動圖像分析儀自動掃描顯微鏡視野下細胞形態 ? ?圖 2 良性增生性病變支氣管刷片或支氣管灌洗液DNA倍體分析結果 2a. 細胞為二倍體和四倍體，無DNA＞5C的細胞，四倍體處形成峰，考慮良性增生性病變 2b. 細胞核面積與DNA倍體的關系 2c. 細胞根據DNA含量由大至小排列，DNA含量＜5C異倍體細胞2d. DNA倍體全自動圖像分析儀自動掃描顯微鏡視野下細胞形態 ? ? 圖 3惡性支氣管刷片或支氣管灌洗液DNA倍體分析結果 3a. 出現大量異倍體，可見DNA＞5C的細胞，并形成峰 3b. 細胞核面積與DNA倍體的關系 3c.細胞根據DNA含量由大至小排列，DNA含量＞5C異倍體細胞 3d. DNA倍體全自動圖像分析儀自動掃描顯微鏡視野下細胞形態
表2
常規細胞學與DNA倍體分析評價（%）
2.3 結果分析
常規細胞學對支氣管刷片或支氣管灌洗液良惡性診斷的特異度、靈敏度、準確率分別為85.7%、78.7%及77.1%，而DNA倍體分析的特異度、靈敏度、準確率分別為100.0%、91.5%及95.8%，兩種方法之間差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
3 討論
對于呼吸系統病變的患者，如何選擇危險性小且能夠明確診斷的檢查方法是十分必要的。目前針對呼吸系統病變的檢查，能夠進行病理活檢的方法主要有支氣管鏡和CT引導下穿刺。對于中央型肺癌，有研究報道支氣管鏡的檢出率和陽性率均較肺穿刺高，但支氣管鏡檢查存在咯血等并發癥，且支氣管鏡檢查在某些情況下確診難度較大，如病變位置較深，取材不當或太小，取材過程中受活檢鉗擠壓組織細胞嚴重變形而難以準確分類等[5]，這時支氣管鏡檢查過程中進行的支氣管刷檢或支氣管灌洗液的細胞學檢查就顯得尤為重要。對于周圍型肺癌，CT引導下穿刺出現并發癥的可能明顯升高，而有研究表明，通過細胞學檢查，能夠提高周圍型肺癌的診斷率[6]。我們希望找到一種能夠提高細胞學診斷陽性率且操作簡便的方法，使患者減少重復檢查的痛苦。
本研究結果顯示，在47例惡性支氣管刷片或支氣管灌洗液中，DNA倍體分析發現存在DNA異倍體細胞43例，特異度、靈敏度和準確率均明顯高于常規細胞學檢查。但是DNA倍體分析仍然存在漏診的現象，分析主要原因為：① 由于漏診病例主要為腺癌，故可能與腺癌的生物學行為有關，且腺癌細胞常常聚集成團，由于DNA倍體分析技術方面的限制，對于成團的細胞難以識別，因此可能會出現漏診的情況。② 1例鱗狀細胞癌被漏診，分析可能原因是由于腫瘤壞死較多，支氣管刷片上細胞數量不足，后經組織病理學證實本例伴有腫瘤壞死。③ 標本處理不及時，對于支氣管刷片，如果暴露于外界時間過久，可能會導致細胞破壞；對于支氣管灌洗液，如果時間過久，可能導致細胞溶解。這些都有可能致使腫瘤細胞核的DNA喪失。因此，進一步對DNA倍體分析進行改進，提高對成團細胞的識別能力，并對標本進行及時準確的處理，將會大大提高支氣管刷片和支氣管灌洗液的陽性率。
一些研究應用流式細胞技術對癌細胞進行分析發現，癌細胞由于不斷克隆增生，染色體會出現變異和缺失，只要檢測出細胞的DNA變化，就能提示細胞的良惡性[7]。本研究采用DNA倍體分析儀，同樣也是利用檢測細胞的DNA變化來達到診斷細胞良惡性的目的，且與流式細胞技術相比，此方法標本采集安全、操作簡便、檢測結果精確快速。目前，DNA倍體分析儀已應用于臨床許多學科的細胞學檢測領域，且都取得良好效果[8-17]。同時，DNA倍體分析儀也在新領域里不斷地探索，聯合其他檢查手段[18, 19]，使活檢與細胞學診斷互補，能更好地提高陽性率。
綜上所述，DNA倍體分析能夠提高支氣管刷片或支氣管灌洗液的陽性檢出率，并且在診斷良惡性病變中較常規細胞學更特異、更敏感，具有較高的價值。
支氣管鏡檢查是呼吸系統疾病常用的檢查方法，大多數肺部及氣道疾病，如腫瘤、間質性肺病、肉芽腫性疾病以及某些感染性疾病需要通過經支氣管鏡活體組織檢查（活檢）術來確定診斷[1]，檢查過程中常規行支氣管刷檢或支氣管灌洗及活檢，但有時病變位置較深，無法進行活檢，只能依靠細胞學檢查來診斷腫瘤的良惡性[2]。但當支氣管刷檢或者支氣管灌洗液中細胞無或較少，一些分化較好的惡性腫瘤與炎癥性病變或者良性腫瘤不易鑒別時，常規細胞學檢查無論是特異度還是靈敏度都較低[3]，而采用定量細胞學方法測定支氣管刷檢或者支氣管灌洗液中細胞的DNA含量的變化來判斷病變的良惡性已經成為細胞學診斷的新的研究領域。本研究通過采用DNA倍體全自動圖像分析儀對支氣管刷檢或支氣管灌洗液細胞進行DNA含量測定，用以探討該技術對良惡性支氣管刷片或支氣管灌洗液的診斷價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
2012年6月－2013年6月期間由我院臨床送檢，96例經病理診斷明確的呼吸系統疾病患者，均進行支氣管鏡檢查，并在檢查過程中行支氣管刷檢或支氣管灌洗及活檢。良性病變49例，男31例，女18例；年齡32～76歲，平均56歲；主要為肺感染性病變。惡性病變47例，男32例，女15例；年齡45～82歲，平均61歲；主要為原發性肺癌，其中肺鱗狀細胞癌28例，肺腺癌16例，肺小細胞癌3例。
1.2 方法
1.2.1 支氣管刷片
支氣管刷片是肺部疾病的早期診斷方法之一，本研究共78例行支氣管刷片檢查。由臨床醫生行支氣管鏡（Olympus BF10型，日本奧林巴斯公司）檢查時刷取，并均勻涂于載玻片上，取足夠量細胞，制成支氣管刷片2張，其中1張自然干燥，95%乙醇固定10 min，蘇木精-伊紅（HE）染色，行常規細胞學檢查；另外1張經Feulgen染色，用DNA倍體全自動圖像分析儀進行DNA倍體分析。去除可能干擾結果的重疊細胞或雜質。
1.2.2 支氣管灌洗液
支氣管灌洗液是常規用于疾病診斷的方法，本研究共18例行支氣管灌洗液檢查。50～150 mL/例支氣管灌洗液經離心（離心半徑3 cm，轉速2 500 r/min，離心時間10 min）取適量上清液，用細胞涂片離心機（湖南湘儀TXD3）離心涂片，制成2張薄層細胞片，其中1張用HE染色進行常規細胞學檢查，另外1張用Feulgen染色，用DNA倍體全自動圖像分析儀進行DNA倍體分析。去除可能干擾結果的重疊細胞或雜質。
1.3 結果判定
1.3.1 常規細胞學診斷
無論是支氣管刷片還是支氣管灌洗液，均經有經驗的病理醫師判讀結果。結果分為：① 良性（包括急慢性炎癥、支氣管上皮細胞等）；② 可疑惡性；③ 惡性（包括惡性腫瘤細胞）。
1.3.2 DNA倍體全自動圖像分析儀
對每例支氣管刷片或支氣管灌洗液在20倍鏡下腫瘤區域的4 000個以上的細胞進行自動聚焦分析，根據每個細胞核的79個核特征參數值，自動進行受檢細胞的分類和計數，自動計算出DNA倍體分析直方圖和細胞點陣分布圖。二倍體細胞（G1/G0）的DNA含量為2C，當DNA含量為4C時，多為四倍體細胞（G2/M期）。當有3個以上DNA含量為＞5C的細胞或當異倍體細胞DNA含量在2C～4C之間形成峰時，即可診斷為惡性支氣管刷片或者惡性支氣管灌洗液[4]。
1.4 統計學方法
應用SPSS 19.0軟件進行統計處理。計數資料組間比較用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 常規細胞學檢查
常規細胞學對96例支氣管刷片或支氣管灌洗液進行診斷，在49例良性病變中，42例診斷為良性，鏡下可見大量支氣管黏膜上皮細胞，少量泡沫細胞、炎細胞及組織細胞，未見惡性腫瘤細胞；7例為可疑惡性，可見少許成團異型細胞，建議活檢；無患者診斷為惡性。在47例惡性病變中，32例鏡下可見成團及散在的異型性明顯腫瘤細胞，形態符合惡性；5例可見核異質細胞；10例鏡下未見惡性腫瘤細胞。見表 1。
表1
常規細胞學與DNA倍體分析診斷結果
2.2 DNA倍體全自動圖像分析
DNA倍體全自動圖像分析儀對96例支氣管刷片或支氣管灌洗液進行診斷，49例良性病變均為陰性結果，未見DNA倍體異常細胞，良性病變未見DNA倍體異常細胞及DNA含量＞5C的細胞，正常僅可見2C處形成峰，增生性病變可見2C和4C處形成2個峰（圖 1、2）。在47例惡性病變中，43例可見DNA倍體異常細胞，考慮為惡性腫瘤細胞，其中29例有較多的DNA含量＞5C的異倍體細胞（圖 3），14例可見少量DNA倍體異常細胞；4例為陰性，其中3例為原發性肺腺癌，1例為原發性肺鱗狀細胞癌。見表 1。
圖1
正常支氣管刷片或支氣管灌洗液DNA倍體分析結果 1a. 細胞均為二倍體，無DNA＞5C的細胞 1b. 細胞核面積與DNA倍體的關系 1c. 細胞根據DNA含量由大至小排列，DNA含量＜5C異倍體細胞 1d. DNA倍體全自動圖像分析儀自動掃描顯微鏡視野下細胞形態 ? ?圖 2 良性增生性病變支氣管刷片或支氣管灌洗液DNA倍體分析結果 2a. 細胞為二倍體和四倍體，無DNA＞5C的細胞，四倍體處形成峰，考慮良性增生性病變 2b. 細胞核面積與DNA倍體的關系 2c. 細胞根據DNA含量由大至小排列，DNA含量＜5C異倍體細胞2d. DNA倍體全自動圖像分析儀自動掃描顯微鏡視野下細胞形態 ? ? 圖 3惡性支氣管刷片或支氣管灌洗液DNA倍體分析結果 3a. 出現大量異倍體，可見DNA＞5C的細胞，并形成峰 3b. 細胞核面積與DNA倍體的關系 3c.細胞根據DNA含量由大至小排列，DNA含量＞5C異倍體細胞 3d. DNA倍體全自動圖像分析儀自動掃描顯微鏡視野下細胞形態
表2
常規細胞學與DNA倍體分析評價（%）
2.3 結果分析
常規細胞學對支氣管刷片或支氣管灌洗液良惡性診斷的特異度、靈敏度、準確率分別為85.7%、78.7%及77.1%，而DNA倍體分析的特異度、靈敏度、準確率分別為100.0%、91.5%及95.8%，兩種方法之間差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
3 討論
對于呼吸系統病變的患者，如何選擇危險性小且能夠明確診斷的檢查方法是十分必要的。目前針對呼吸系統病變的檢查，能夠進行病理活檢的方法主要有支氣管鏡和CT引導下穿刺。對于中央型肺癌，有研究報道支氣管鏡的檢出率和陽性率均較肺穿刺高，但支氣管鏡檢查存在咯血等并發癥，且支氣管鏡檢查在某些情況下確診難度較大，如病變位置較深，取材不當或太小，取材過程中受活檢鉗擠壓組織細胞嚴重變形而難以準確分類等[5]，這時支氣管鏡檢查過程中進行的支氣管刷檢或支氣管灌洗液的細胞學檢查就顯得尤為重要。對于周圍型肺癌，CT引導下穿刺出現并發癥的可能明顯升高，而有研究表明，通過細胞學檢查，能夠提高周圍型肺癌的診斷率[6]。我們希望找到一種能夠提高細胞學診斷陽性率且操作簡便的方法，使患者減少重復檢查的痛苦。
本研究結果顯示，在47例惡性支氣管刷片或支氣管灌洗液中，DNA倍體分析發現存在DNA異倍體細胞43例，特異度、靈敏度和準確率均明顯高于常規細胞學檢查。但是DNA倍體分析仍然存在漏診的現象，分析主要原因為：① 由于漏診病例主要為腺癌，故可能與腺癌的生物學行為有關，且腺癌細胞常常聚集成團，由于DNA倍體分析技術方面的限制，對于成團的細胞難以識別，因此可能會出現漏診的情況。② 1例鱗狀細胞癌被漏診，分析可能原因是由于腫瘤壞死較多，支氣管刷片上細胞數量不足，后經組織病理學證實本例伴有腫瘤壞死。③ 標本處理不及時，對于支氣管刷片，如果暴露于外界時間過久，可能會導致細胞破壞；對于支氣管灌洗液，如果時間過久，可能導致細胞溶解。這些都有可能致使腫瘤細胞核的DNA喪失。因此，進一步對DNA倍體分析進行改進，提高對成團細胞的識別能力，并對標本進行及時準確的處理，將會大大提高支氣管刷片和支氣管灌洗液的陽性率。
一些研究應用流式細胞技術對癌細胞進行分析發現，癌細胞由于不斷克隆增生，染色體會出現變異和缺失，只要檢測出細胞的DNA變化，就能提示細胞的良惡性[7]。本研究采用DNA倍體分析儀，同樣也是利用檢測細胞的DNA變化來達到診斷細胞良惡性的目的，且與流式細胞技術相比，此方法標本采集安全、操作簡便、檢測結果精確快速。目前，DNA倍體分析儀已應用于臨床許多學科的細胞學檢測領域，且都取得良好效果[8-17]。同時，DNA倍體分析儀也在新領域里不斷地探索，聯合其他檢查手段[18, 19]，使活檢與細胞學診斷互補，能更好地提高陽性率。
綜上所述，DNA倍體分析能夠提高支氣管刷片或支氣管灌洗液的陽性檢出率，并且在診斷良惡性病變中較常規細胞學更特異、更敏感，具有較高的價值。
