引用本文： 汪雷, 宋躍明, 劉立岷, 李濤, 龔全, 楊曦. NEP1-40基因修飾的神經干細胞移植對脊髓損傷大鼠行為學恢復的影響. 華西醫學, 2014, 29(11): 2006-2011. doi: 10.7507/1002-0179.20140609 復制
神經干細胞（NSC）移植是目前治療脊髓損傷最具前景的研究方向[1]，但單純的NSC移植后細胞存活率低下、局部微環境中Nogo蛋白等的存在使新生軸突生長受到抑制等因素使得其療效大大受限[2]。NEP1-40多肽作為Nogo蛋白的拮抗劑能間接促進新生軸突的生長，已成為目前國內外研究的熱點，但是單獨運用也存在諸多不足[3-5]。由此，本研究從基因工程角度出發，在體外制備NEP1-40基因修飾的NSC并移植到大鼠脊髓損傷區，觀察細胞移植后大鼠行為學功能的恢復情況，以期為NSC移植治療脊髓損傷提供一種新的思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1.1.1 實驗動物
清潔級孕18 d Sprague-Dawley（SD）大鼠1只及成年雌性SD大鼠40只，體質量245～268 g，平均250 g，由四川大學華西動物實驗中心提供（動物許可證號：No.scxk [chuan] 2004-14）。本實驗過程中對動物的所有處理均符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》之規定。
1.1.2 主要試劑與儀器
胎牛血清（上海微科生化試劑公司）；重組人表皮生長因子（hEGF）、重組人堿性成纖維細胞生長因子、肝素、神經干細胞基礎培養基（NeuroCult? NS-A Basal Medium）、神經干細胞完全培養基（NeuroCult? NS-A Proliferation Supplements）、神經小球分散試劑盒（NeuroCult? Chemical Dissociation Kit Product Description）（美國Stem Cell公司）；兔多克隆抗體巢蛋白（Nestin）（美國Proteintech group公司），IGO750細胞培養箱（美國Thermo Electron Corporation公司）；GX51倒置相差顯微鏡、BX51TF熒光顯微鏡（日本Olympus公司），5 μL微型注射器（北京英偉達科技公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 慢病毒載體的構建
本研究中我們采用在前期研究中已成功構建的NEP1-40基因慢病毒表達載體[6]。聚合酶鏈式反應（PCR）產物經電泳分析表明成功獲取NEP1-40基因cDNA克隆，測序提示慢病毒轉染質粒連接構建正確；蛋白質印跡法顯示NEP1-40在293T細胞內穩定表達。
1.2.2 NSC的分離培養和基因修飾
脫頸法處死孕18 d SD大鼠后，取出子宮置于預冷的0.1%磷酸鹽緩沖液浸泡5 min，取出胎鼠并在顯微鏡下分離出兩側大腦皮層，轉移至含預冷NSC完全培養基的培養皿內制成細胞懸液后用200目濾網過濾，靜置5 min后棄上清液，細胞重懸于NSC完全培養液（基礎培養基與擴增添加物混合比例為9︰1），培養基中加入hEGF（20 ng/mL）、堿性成纖維細胞生長因子（10 ng/mL）、肝素（2 μg/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）及青霉素（100 μg/mL），活細胞計數后按1×106/L的密度接種于75 cm2培養瓶中，置于37℃、5% CO2孵育箱培養，每3天半量換液。細胞傳代后取第3代細胞進行病毒轉染：800 r/min離心5 min（離心半徑15 cm）后棄上清液收集神經球，加入神經小球分散劑獲取NSC單細胞懸液，按每孔1×105個細胞接種于6孔培養板內，于37℃ 、5% CO2孵育箱內培養，轉染時先按感染復數值=10計算所需加入病毒載體的體積，用計算出的NEP1-40慢病毒載體轉染密度為1×107的NSC，輕輕混勻，置于37 ℃、5% CO2培養箱中過夜培養，24 h后重復感染1次。48 h后觀察熒光表達情況，同時進行反轉錄（RT）-PCR及蛋白質印跡法檢測。
1.2.3 動物模型的建立及細胞移植
40只雌性SD大鼠經切除第8～10胸椎椎板顯露硬脊膜：10只在切除椎板后用生理鹽水沖洗創面并關閉切口，即假手術組，余30只在第9胸椎水平進行脊髓右側半切后間斷縫合硬膜并關閉切口。術畢放置在40 ℃恒溫加熱墊上直至完全蘇醒后放回原籠。30只脊髓半切大鼠在手術7 d后[7]隨機分為3組，每組各10只：脊髓損傷組、神經干細胞移植組（NSC組）和NEP1-40基因修飾神經干細胞移植組（NEP1-40-NSC組）。沿原切口顯露受損脊髓節段后采用局部多點注射法，在3組大鼠脊髓損傷部位用微量注射器分別植入5 μL細胞培養液、NSC懸液及NEP1-40-NSC懸液（濃度約為1×105個細胞/μL），注射位置在距離損傷處頭尾側各約2 mm處[8]，注射速度為0.5 μL/min，注射完畢后留針10 min，縫合硬脊髓和手術切口。
1.3 行為學測試指標
1.3.1 Basso-Beattle-Bresnahan（BBB）測試
又稱為開放領域運動測試，是將大鼠置于一個大小約150 cm×60 cm的平坦橢圓形運動區域，觀察大鼠的運動情況4 min，根據BBB測試評分表對受檢大鼠右后肢的運動功能進行評分，評分范圍為0分（后肢全癱）至21分（后肢完全正常運動）[9]。
1.3.2 網格測試
將大鼠置于一個100 cm×38 cm的懸空網格狀區域（網格開口標準為2 cm×2 cm），讓其自由爬行。為了量化方便，由專人記錄大鼠在通過網格時右后肢摔倒（即肢體無法抓住網格而落入網孔中）的次數并對其進行評價，每只大鼠連續測試3次取平均值作為最終測試結果[10]。
1.4 統計學方法
所有數據均采用SPSS 11.5統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 NSC的體外培養和基因修飾
分離接種的細胞從圓形單細胞逐漸增多匯聚形成大小不一、折光性較好的神經細胞球（圖 1）。傳代培養生成的第3代神經球通過Nestin免疫細胞化學染色后在熒光顯微鏡下可見神經球Nestin染色呈陽性表達（圖 2）。轉染完成后在熒光顯微鏡下觀察證實NEP1-40已進入NSC內，48 h時NEP1-40基因轉染的細胞內可見綠色熒光，說明轉染成功（圖 3）。且上述轉染后的NSC經分化培養后可見NEP1-40慢病毒基因組及空病毒載體組分化后的神經元、星形膠質細胞以及少突膠質細胞中均可見綠色熒光，說明分化后NEP1-40基因可在子代細胞中穩定表達。
圖1
不同培養時期神經干細胞形態 散在的神經干細胞及聚集后形成的神經細胞球（×200） 1a. 1 d 1b. 3 d 1c. 5 d 的神經球 1d. 7 d的細胞團塊 ? ?圖 2 神經球Nestin免疫熒光鑒定 （Nestin染色×200） 2a. 4，6-聯脒-2-苯基吲哚染色顯示細胞核 2b. Nestin染色陽性細胞 2c. 2a與2b合并后圖像 ? ? 圖 3NEP1-40慢病毒載體轉染NSC后熒光顯微鏡像 （免疫熒光染色×200） 可見明顯的熒光信號 3a. 明視野 3b. 熒光視野
RT-PCR檢測結果表明經轉染后的細胞中NEP1-40基因表達明顯上調，且與其他對照組有明顯差異（P＜0.05），用NEP1-40F和綠色熒光蛋白受體引物，擴增片段長度220 bp。蛋白質印跡法檢測結果顯示經轉染后的表達產物相對分子質量為32×103，與融合基因的產物NEP1-40與綠色熒光蛋白（GFP）融合蛋白相對分子質量相吻合，證明NEP1-40基因成功轉入NSC內（圖 4）。
圖4
蛋白質印跡法檢測各組GFP表達情況 1：空白對照組；2：空載體對照組；3：實驗組
2.2 動物模型的建立及細胞移植
術中3只大鼠誤傷及左側半脊髓，2只因麻醉過深導致死亡，術后24 h內1只出現嚴重腹脹而死亡，以上5只均被排除并及時補足。余動物術后約30 min恢復清醒，3 h開始進飲食，大小便正常。除假手術組外，其余動物術后均出現右后肢癱瘓（圖 5）。術后第7天細胞移植操作順利，術后所有動物均恢復清醒和活動，未見明顯不良反應，移植術中及術后均無死亡。
圖5
手術過程 a～c. 切除第8～10胸椎椎板后顯露第9胸椎節段脊髓（白箭） d. 第9胸椎節段脊髓右側半橫斷（白箭） e.假手術組大鼠術后右后肢活動正常 f. 脊髓半切大鼠術后右后肢完全癱瘓
2.3 行為學測試
2.3.1 大體觀察
脊髓半切術后1周時，所有大鼠右后肢仍處于癱瘓狀態，僅少數表現出輕微的恢復（表明嚙齒類動物脊髓損傷后有一定的自我修復能力）。至細胞移植后8周時，脊髓損傷組大鼠右后肢功能僅有輕度恢復，肢體內旋狀且無法支持體重；NSC組右后肢情況有所改善，呈外旋狀但仍然無法支持體重；NEP1-40-NSC組的大鼠則有明顯恢復，在行走時右后肢外旋并能部分負重。假手術組大鼠右后肢功能未見任何異常。
2.3.2 BBB測試
所有脊髓半切大鼠術后即刻BBB評分為0分。術后1周時（細胞移植之前），右后肢均無法完成負重行走，呈拖行狀態，評分為（0.70 ± 0.65）分，明顯低于假手術組（右后肢運動完全正常，BBB評分均為21分），差異有統計學意義（P＜0.01）。細胞移植后8周時，脊髓損傷組、NSC組和NEP1-40-NSC組大鼠評分分別為（3.20 ± 0.65）、（8.70 ± 0.95）和（12.00 ± 1.56）分，3組之間兩兩比較結果差異均有統計學意義（P＜0.05），且均明顯低于假手術組（右后肢運動完全正常，BBB評分均為21分），差異有統計學意義（P＜0.01）。
2.3.3 網格測試
所有脊髓半切大鼠術后即刻網格測試中摔倒次數為（17.20 ± 0.85）次。術后1周時（細胞移植之前）的網格測試中，右后肢仍呈拖行狀態，完全無法負重，經常摔入網格孔中，摔倒次數為（15.50 ± 1.96）次，明顯高于假手術組（右后肢均未見摔倒，評分均為0分） （P＜0.01）差異有統計學意義（P＜0.01）。細胞移植后8周時，脊髓損傷組、NSC組和NEP1-40-NSC組大鼠的摔倒次數則分別為（13.30 ± 1.77）、（7.90 ± 0.99）和（4.5 ± 0.85）次，3組之間兩兩比較結果差異均有統計學意義（P＜0.05），且均明顯高于假手術組（右后肢均未見摔倒，評分均為0分），差異有統計學意義（P＜0.01）。
3 討論
研究發現單純NSC移植后新生神經元的軸突生長受到明顯抑制，這種抑制作用主要有2個來源：一是星形膠質細胞增生形成的膠質瘢痕[11]；二是來源于中樞神經髓鞘的髓磷脂相關抑制物，其中Nogo蛋白的抑制作用最強，且相關研究報道也最多[12]。
自2000年Chen等[13]報道克隆出Nogo基因序列以來，深入研究發現Nogo基因共有3個mRNA轉錄本，其所編碼蛋白質分別為Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C，其中Nogo-A相對分子質量最大且發揮主要作用。這3種蛋白質在其碳末端上2個疏水性基團間均存在1個由66個氨基酸殘基組成的襻狀結構狀結構，稱作Nogo-66。Nogo蛋白抑制軸突生長的機制主要是由Nogo-66與其下游受體分子信號復合物NgR/P75NTR/Lingo-1（或gR/Troy/Lingo-1）結合，啟動了Rho信號傳導途徑[2]。以Nogo-A為靶點通過使用Nogo抗體和Nogo基因敲除等手段，在動物實驗中觀察到中樞神經纖維得到良好再生[14]。2007年Su等[15]研究顯示Nogo-A加強了移植的嗅鞘細胞在病灶處的相互黏附，阻礙了細胞遷移，從而影響了治療效果。2010年Hou等[16]發現Nogo-A在增殖中的NSC上表達較強，它除了抑制軸突的出芽式生長外，還能阻礙NSC向神經元分化。由此看來，Nogo基因及相關蛋白在軸突再生抑制過程中發揮了極其重要的作用。
2002年GrandPré等[17]首次提出Nogo受體拮抗劑的概念，NEP1-40是針對Nogo-66的氨基序列設計的，其結構與Nogo-66氨基端40個氨基酸殘基結構相同，它可與NgR相結合而不激活信號傳導通路，因此可競爭性抑制Nogo-66與NgR的結合，從而阻斷Nogo-66的抑制效應，NEP1-40逐漸成為促軸突再生研究領域的焦點之一。有學者已應用脊髓損傷和腦損傷動物模型證明NEP1-40能夠顯著促進皮質脊髓束的再生。Li等[18]將合成的NEP1-40多肽定位注射大鼠脊髓半橫斷損傷模型，可明顯促進損傷軸突的生長及大鼠運動功能的恢復。由此看來NEP1-40作為NgR拮抗劑有望成為脊髓損傷等軸突再生障礙疾病新的治療手段。然而，目前研究中所使用的NEP1-40都是經人工化學合成，其成本較高，很多學者通過腹腔注射、損傷局部注射等手段將NEP1-40多肽帶到中樞神經損傷處來促進軸突的再生，但由于血腦屏障和血脊膜屏障的存在，大于6個氨基酸的多肽一般不易穿過這些屏障[19]，而損傷局部注射法雖然能使NEP1-40直達病灶但是僅有少量多肽能保留活性并最終發揮作用。這些問題都使得NEP1-40多肽的進一步應用受到了極大的限制。基因工程技術的發展較好的克服了單純NSC移植和NEP1-40多肽應用的局限性。目前已可通過多種手段來獲取NEP1-40基因，使其在病灶處完成NEP1-40蛋白的表達，現已在動物實驗中用于脊髓損傷等疾患的治療，國內學者宮福良等[20]通過基因工程手段從大鼠脊髓中獲取Nogo-66、NEP1-40基因并實現其蛋白的體外表達。本實驗通過基因釣取方法成功的從基因文庫中獲取NEP1-40基因，然后構建攜帶該基因的慢病毒載體，通過病毒轉染的方法成功將NEP1-40基因導入NSC的基因組中，通過脊髓損傷局部的細胞移植進入到宿主的病灶處，并在宿主體內表達NEP1-40而發揮作用，從而克服了上述局限性。
1995年美國Ohio大學研究人員提出了BBB評分法[9]。將大鼠后肢運動分為22個等級，后肢全癱為0分，完全正常為21分，評估觀察時間為4 min。BBB評分表是根據觀察脊髓損傷大鼠經過3個階段的恢復而建立的，其與行為學恢復進展是同步的。分值中第1部分：0～7分，評估恢復早期的后肢關節運動；第2部分：8～13分，評估恢復中期的步態和協調運動；第3部分：14～21分評估運動時爪子的精細運動。該方法的優勢在于操作簡便、可重復性好[21]，其缺點在于評分過程中人為主觀因素對分值的影響很大[11]。此外BBB評分系統并不是一個線性系統，量表中每一個評分區域對評估對象均有一定的側重，這樣在評分過程中難免產生一定差距，尤其是14分以上是對于運動細節的評估[10]。在本研究中，除了假手術組大鼠外，其余動物的評分均在14分以下，意味著所有脊髓半切的大鼠的精細運動均無明顯恢復，這樣就減少了BBB評分系統的缺陷給本研究結果帶來的偏差，增加了實驗結果的客觀性。
脊髓損傷后脊髓下行信號通路的運動控制功能出現故障，由皮質脊髓束所介導的前后肢協調運動和步行節律被破壞，那么在通過網格區域時脊髓損傷大鼠的損傷側后肢就會失去控制落入網格孔中，通過記錄同樣條件下后肢摔落的次數就能評價皮質脊髓束的功能狀況[22]。Metz等[10]曾對網格測試進行了比較詳細的描述，他們記錄了大鼠在1 m長的網格上通行時后肢摔倒的次數，采用四分法對摔倒次數進行評分：3分（0～1次摔倒）、2分（2～5次）、1分（6～9次）、0分（10～20次，20次以上均記為20次）。有學者通過調整網格開口的大小使網格測試適用于不同嚴重程度的損傷。也有學者在同一網格測試中運用大小不同的開口以避免反復實驗后實驗動物對于網格大小適應而產生的評分誤差。該方法的缺點在于通過網格時動物的行走速度、步幅及其緊張程度都會影響實驗結果，動物越緊張、穿過網格的速度越快，則摔倒次數越多[23]。但我們認為在比較性研究中，同一條件下的反復多次實驗結果仍然是具有較強的可比性的，所以在本研究中我們未采用Metz等[10]的四分法進行評分，依然采用記錄后肢摔倒的次數作為分值，對每只大鼠連續做了3次網格測試，取平均值代表最終測試結果。這樣使得各實驗組之間的測試結果有較好的可比性，能更客觀地支持本實驗的結論。
綜上所述，從本實驗中BBB測試和網格測試結果來看，大鼠脊髓半切損傷后單純的NSC移植獲得了較好的行為學功能的恢復，但與之相比，經NEP1-40基因修飾的NSC移植卻獲得了更顯著的恢復效果。由此可見，NEP1-40基因修飾能明顯改善NSC移植對于脊髓損傷的治療效果，為NSC植治療脊髓損傷的研究提供了一個新的思路。
神經干細胞（NSC）移植是目前治療脊髓損傷最具前景的研究方向[1]，但單純的NSC移植后細胞存活率低下、局部微環境中Nogo蛋白等的存在使新生軸突生長受到抑制等因素使得其療效大大受限[2]。NEP1-40多肽作為Nogo蛋白的拮抗劑能間接促進新生軸突的生長，已成為目前國內外研究的熱點，但是單獨運用也存在諸多不足[3-5]。由此，本研究從基因工程角度出發，在體外制備NEP1-40基因修飾的NSC并移植到大鼠脊髓損傷區，觀察細胞移植后大鼠行為學功能的恢復情況，以期為NSC移植治療脊髓損傷提供一種新的思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1.1.1 實驗動物
清潔級孕18 d Sprague-Dawley（SD）大鼠1只及成年雌性SD大鼠40只，體質量245～268 g，平均250 g，由四川大學華西動物實驗中心提供（動物許可證號：No.scxk [chuan] 2004-14）。本實驗過程中對動物的所有處理均符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》之規定。
1.1.2 主要試劑與儀器
胎牛血清（上海微科生化試劑公司）；重組人表皮生長因子（hEGF）、重組人堿性成纖維細胞生長因子、肝素、神經干細胞基礎培養基（NeuroCult? NS-A Basal Medium）、神經干細胞完全培養基（NeuroCult? NS-A Proliferation Supplements）、神經小球分散試劑盒（NeuroCult? Chemical Dissociation Kit Product Description）（美國Stem Cell公司）；兔多克隆抗體巢蛋白（Nestin）（美國Proteintech group公司），IGO750細胞培養箱（美國Thermo Electron Corporation公司）；GX51倒置相差顯微鏡、BX51TF熒光顯微鏡（日本Olympus公司），5 μL微型注射器（北京英偉達科技公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 慢病毒載體的構建
本研究中我們采用在前期研究中已成功構建的NEP1-40基因慢病毒表達載體[6]。聚合酶鏈式反應（PCR）產物經電泳分析表明成功獲取NEP1-40基因cDNA克隆，測序提示慢病毒轉染質粒連接構建正確；蛋白質印跡法顯示NEP1-40在293T細胞內穩定表達。
1.2.2 NSC的分離培養和基因修飾
脫頸法處死孕18 d SD大鼠后，取出子宮置于預冷的0.1%磷酸鹽緩沖液浸泡5 min，取出胎鼠并在顯微鏡下分離出兩側大腦皮層，轉移至含預冷NSC完全培養基的培養皿內制成細胞懸液后用200目濾網過濾，靜置5 min后棄上清液，細胞重懸于NSC完全培養液（基礎培養基與擴增添加物混合比例為9︰1），培養基中加入hEGF（20 ng/mL）、堿性成纖維細胞生長因子（10 ng/mL）、肝素（2 μg/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）及青霉素（100 μg/mL），活細胞計數后按1×106/L的密度接種于75 cm2培養瓶中，置于37℃、5% CO2孵育箱培養，每3天半量換液。細胞傳代后取第3代細胞進行病毒轉染：800 r/min離心5 min（離心半徑15 cm）后棄上清液收集神經球，加入神經小球分散劑獲取NSC單細胞懸液，按每孔1×105個細胞接種于6孔培養板內，于37℃ 、5% CO2孵育箱內培養，轉染時先按感染復數值=10計算所需加入病毒載體的體積，用計算出的NEP1-40慢病毒載體轉染密度為1×107的NSC，輕輕混勻，置于37 ℃、5% CO2培養箱中過夜培養，24 h后重復感染1次。48 h后觀察熒光表達情況，同時進行反轉錄（RT）-PCR及蛋白質印跡法檢測。
1.2.3 動物模型的建立及細胞移植
40只雌性SD大鼠經切除第8～10胸椎椎板顯露硬脊膜：10只在切除椎板后用生理鹽水沖洗創面并關閉切口，即假手術組，余30只在第9胸椎水平進行脊髓右側半切后間斷縫合硬膜并關閉切口。術畢放置在40 ℃恒溫加熱墊上直至完全蘇醒后放回原籠。30只脊髓半切大鼠在手術7 d后[7]隨機分為3組，每組各10只：脊髓損傷組、神經干細胞移植組（NSC組）和NEP1-40基因修飾神經干細胞移植組（NEP1-40-NSC組）。沿原切口顯露受損脊髓節段后采用局部多點注射法，在3組大鼠脊髓損傷部位用微量注射器分別植入5 μL細胞培養液、NSC懸液及NEP1-40-NSC懸液（濃度約為1×105個細胞/μL），注射位置在距離損傷處頭尾側各約2 mm處[8]，注射速度為0.5 μL/min，注射完畢后留針10 min，縫合硬脊髓和手術切口。
1.3 行為學測試指標
1.3.1 Basso-Beattle-Bresnahan（BBB）測試
又稱為開放領域運動測試，是將大鼠置于一個大小約150 cm×60 cm的平坦橢圓形運動區域，觀察大鼠的運動情況4 min，根據BBB測試評分表對受檢大鼠右后肢的運動功能進行評分，評分范圍為0分（后肢全癱）至21分（后肢完全正常運動）[9]。
1.3.2 網格測試
將大鼠置于一個100 cm×38 cm的懸空網格狀區域（網格開口標準為2 cm×2 cm），讓其自由爬行。為了量化方便，由專人記錄大鼠在通過網格時右后肢摔倒（即肢體無法抓住網格而落入網孔中）的次數并對其進行評價，每只大鼠連續測試3次取平均值作為最終測試結果[10]。
1.4 統計學方法
所有數據均采用SPSS 11.5統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 NSC的體外培養和基因修飾
分離接種的細胞從圓形單細胞逐漸增多匯聚形成大小不一、折光性較好的神經細胞球（圖 1）。傳代培養生成的第3代神經球通過Nestin免疫細胞化學染色后在熒光顯微鏡下可見神經球Nestin染色呈陽性表達（圖 2）。轉染完成后在熒光顯微鏡下觀察證實NEP1-40已進入NSC內，48 h時NEP1-40基因轉染的細胞內可見綠色熒光，說明轉染成功（圖 3）。且上述轉染后的NSC經分化培養后可見NEP1-40慢病毒基因組及空病毒載體組分化后的神經元、星形膠質細胞以及少突膠質細胞中均可見綠色熒光，說明分化后NEP1-40基因可在子代細胞中穩定表達。
圖1
不同培養時期神經干細胞形態 散在的神經干細胞及聚集后形成的神經細胞球（×200） 1a. 1 d 1b. 3 d 1c. 5 d 的神經球 1d. 7 d的細胞團塊 ? ?圖 2 神經球Nestin免疫熒光鑒定 （Nestin染色×200） 2a. 4，6-聯脒-2-苯基吲哚染色顯示細胞核 2b. Nestin染色陽性細胞 2c. 2a與2b合并后圖像 ? ? 圖 3NEP1-40慢病毒載體轉染NSC后熒光顯微鏡像 （免疫熒光染色×200） 可見明顯的熒光信號 3a. 明視野 3b. 熒光視野
RT-PCR檢測結果表明經轉染后的細胞中NEP1-40基因表達明顯上調，且與其他對照組有明顯差異（P＜0.05），用NEP1-40F和綠色熒光蛋白受體引物，擴增片段長度220 bp。蛋白質印跡法檢測結果顯示經轉染后的表達產物相對分子質量為32×103，與融合基因的產物NEP1-40與綠色熒光蛋白（GFP）融合蛋白相對分子質量相吻合，證明NEP1-40基因成功轉入NSC內（圖 4）。
圖4
蛋白質印跡法檢測各組GFP表達情況 1：空白對照組；2：空載體對照組；3：實驗組
2.2 動物模型的建立及細胞移植
術中3只大鼠誤傷及左側半脊髓，2只因麻醉過深導致死亡，術后24 h內1只出現嚴重腹脹而死亡，以上5只均被排除并及時補足。余動物術后約30 min恢復清醒，3 h開始進飲食，大小便正常。除假手術組外，其余動物術后均出現右后肢癱瘓（圖 5）。術后第7天細胞移植操作順利，術后所有動物均恢復清醒和活動，未見明顯不良反應，移植術中及術后均無死亡。
圖5
手術過程 a～c. 切除第8～10胸椎椎板后顯露第9胸椎節段脊髓（白箭） d. 第9胸椎節段脊髓右側半橫斷（白箭） e.假手術組大鼠術后右后肢活動正常 f. 脊髓半切大鼠術后右后肢完全癱瘓
2.3 行為學測試
2.3.1 大體觀察
脊髓半切術后1周時，所有大鼠右后肢仍處于癱瘓狀態，僅少數表現出輕微的恢復（表明嚙齒類動物脊髓損傷后有一定的自我修復能力）。至細胞移植后8周時，脊髓損傷組大鼠右后肢功能僅有輕度恢復，肢體內旋狀且無法支持體重；NSC組右后肢情況有所改善，呈外旋狀但仍然無法支持體重；NEP1-40-NSC組的大鼠則有明顯恢復，在行走時右后肢外旋并能部分負重。假手術組大鼠右后肢功能未見任何異常。
2.3.2 BBB測試
所有脊髓半切大鼠術后即刻BBB評分為0分。術后1周時（細胞移植之前），右后肢均無法完成負重行走，呈拖行狀態，評分為（0.70 ± 0.65）分，明顯低于假手術組（右后肢運動完全正常，BBB評分均為21分），差異有統計學意義（P＜0.01）。細胞移植后8周時，脊髓損傷組、NSC組和NEP1-40-NSC組大鼠評分分別為（3.20 ± 0.65）、（8.70 ± 0.95）和（12.00 ± 1.56）分，3組之間兩兩比較結果差異均有統計學意義（P＜0.05），且均明顯低于假手術組（右后肢運動完全正常，BBB評分均為21分），差異有統計學意義（P＜0.01）。
2.3.3 網格測試
所有脊髓半切大鼠術后即刻網格測試中摔倒次數為（17.20 ± 0.85）次。術后1周時（細胞移植之前）的網格測試中，右后肢仍呈拖行狀態，完全無法負重，經常摔入網格孔中，摔倒次數為（15.50 ± 1.96）次，明顯高于假手術組（右后肢均未見摔倒，評分均為0分） （P＜0.01）差異有統計學意義（P＜0.01）。細胞移植后8周時，脊髓損傷組、NSC組和NEP1-40-NSC組大鼠的摔倒次數則分別為（13.30 ± 1.77）、（7.90 ± 0.99）和（4.5 ± 0.85）次，3組之間兩兩比較結果差異均有統計學意義（P＜0.05），且均明顯高于假手術組（右后肢均未見摔倒，評分均為0分），差異有統計學意義（P＜0.01）。
3 討論
研究發現單純NSC移植后新生神經元的軸突生長受到明顯抑制，這種抑制作用主要有2個來源：一是星形膠質細胞增生形成的膠質瘢痕[11]；二是來源于中樞神經髓鞘的髓磷脂相關抑制物，其中Nogo蛋白的抑制作用最強，且相關研究報道也最多[12]。
自2000年Chen等[13]報道克隆出Nogo基因序列以來，深入研究發現Nogo基因共有3個mRNA轉錄本，其所編碼蛋白質分別為Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C，其中Nogo-A相對分子質量最大且發揮主要作用。這3種蛋白質在其碳末端上2個疏水性基團間均存在1個由66個氨基酸殘基組成的襻狀結構狀結構，稱作Nogo-66。Nogo蛋白抑制軸突生長的機制主要是由Nogo-66與其下游受體分子信號復合物NgR/P75NTR/Lingo-1（或gR/Troy/Lingo-1）結合，啟動了Rho信號傳導途徑[2]。以Nogo-A為靶點通過使用Nogo抗體和Nogo基因敲除等手段，在動物實驗中觀察到中樞神經纖維得到良好再生[14]。2007年Su等[15]研究顯示Nogo-A加強了移植的嗅鞘細胞在病灶處的相互黏附，阻礙了細胞遷移，從而影響了治療效果。2010年Hou等[16]發現Nogo-A在增殖中的NSC上表達較強，它除了抑制軸突的出芽式生長外，還能阻礙NSC向神經元分化。由此看來，Nogo基因及相關蛋白在軸突再生抑制過程中發揮了極其重要的作用。
2002年GrandPré等[17]首次提出Nogo受體拮抗劑的概念，NEP1-40是針對Nogo-66的氨基序列設計的，其結構與Nogo-66氨基端40個氨基酸殘基結構相同，它可與NgR相結合而不激活信號傳導通路，因此可競爭性抑制Nogo-66與NgR的結合，從而阻斷Nogo-66的抑制效應，NEP1-40逐漸成為促軸突再生研究領域的焦點之一。有學者已應用脊髓損傷和腦損傷動物模型證明NEP1-40能夠顯著促進皮質脊髓束的再生。Li等[18]將合成的NEP1-40多肽定位注射大鼠脊髓半橫斷損傷模型，可明顯促進損傷軸突的生長及大鼠運動功能的恢復。由此看來NEP1-40作為NgR拮抗劑有望成為脊髓損傷等軸突再生障礙疾病新的治療手段。然而，目前研究中所使用的NEP1-40都是經人工化學合成，其成本較高，很多學者通過腹腔注射、損傷局部注射等手段將NEP1-40多肽帶到中樞神經損傷處來促進軸突的再生，但由于血腦屏障和血脊膜屏障的存在，大于6個氨基酸的多肽一般不易穿過這些屏障[19]，而損傷局部注射法雖然能使NEP1-40直達病灶但是僅有少量多肽能保留活性并最終發揮作用。這些問題都使得NEP1-40多肽的進一步應用受到了極大的限制。基因工程技術的發展較好的克服了單純NSC移植和NEP1-40多肽應用的局限性。目前已可通過多種手段來獲取NEP1-40基因，使其在病灶處完成NEP1-40蛋白的表達，現已在動物實驗中用于脊髓損傷等疾患的治療，國內學者宮福良等[20]通過基因工程手段從大鼠脊髓中獲取Nogo-66、NEP1-40基因并實現其蛋白的體外表達。本實驗通過基因釣取方法成功的從基因文庫中獲取NEP1-40基因，然后構建攜帶該基因的慢病毒載體，通過病毒轉染的方法成功將NEP1-40基因導入NSC的基因組中，通過脊髓損傷局部的細胞移植進入到宿主的病灶處，并在宿主體內表達NEP1-40而發揮作用，從而克服了上述局限性。
1995年美國Ohio大學研究人員提出了BBB評分法[9]。將大鼠后肢運動分為22個等級，后肢全癱為0分，完全正常為21分，評估觀察時間為4 min。BBB評分表是根據觀察脊髓損傷大鼠經過3個階段的恢復而建立的，其與行為學恢復進展是同步的。分值中第1部分：0～7分，評估恢復早期的后肢關節運動；第2部分：8～13分，評估恢復中期的步態和協調運動；第3部分：14～21分評估運動時爪子的精細運動。該方法的優勢在于操作簡便、可重復性好[21]，其缺點在于評分過程中人為主觀因素對分值的影響很大[11]。此外BBB評分系統并不是一個線性系統，量表中每一個評分區域對評估對象均有一定的側重，這樣在評分過程中難免產生一定差距，尤其是14分以上是對于運動細節的評估[10]。在本研究中，除了假手術組大鼠外，其余動物的評分均在14分以下，意味著所有脊髓半切的大鼠的精細運動均無明顯恢復，這樣就減少了BBB評分系統的缺陷給本研究結果帶來的偏差，增加了實驗結果的客觀性。
脊髓損傷后脊髓下行信號通路的運動控制功能出現故障，由皮質脊髓束所介導的前后肢協調運動和步行節律被破壞，那么在通過網格區域時脊髓損傷大鼠的損傷側后肢就會失去控制落入網格孔中，通過記錄同樣條件下后肢摔落的次數就能評價皮質脊髓束的功能狀況[22]。Metz等[10]曾對網格測試進行了比較詳細的描述，他們記錄了大鼠在1 m長的網格上通行時后肢摔倒的次數，采用四分法對摔倒次數進行評分：3分（0～1次摔倒）、2分（2～5次）、1分（6～9次）、0分（10～20次，20次以上均記為20次）。有學者通過調整網格開口的大小使網格測試適用于不同嚴重程度的損傷。也有學者在同一網格測試中運用大小不同的開口以避免反復實驗后實驗動物對于網格大小適應而產生的評分誤差。該方法的缺點在于通過網格時動物的行走速度、步幅及其緊張程度都會影響實驗結果，動物越緊張、穿過網格的速度越快，則摔倒次數越多[23]。但我們認為在比較性研究中，同一條件下的反復多次實驗結果仍然是具有較強的可比性的，所以在本研究中我們未采用Metz等[10]的四分法進行評分，依然采用記錄后肢摔倒的次數作為分值，對每只大鼠連續做了3次網格測試，取平均值代表最終測試結果。這樣使得各實驗組之間的測試結果有較好的可比性，能更客觀地支持本實驗的結論。
綜上所述，從本實驗中BBB測試和網格測試結果來看，大鼠脊髓半切損傷后單純的NSC移植獲得了較好的行為學功能的恢復，但與之相比，經NEP1-40基因修飾的NSC移植卻獲得了更顯著的恢復效果。由此可見，NEP1-40基因修飾能明顯改善NSC移植對于脊髓損傷的治療效果，為NSC植治療脊髓損傷的研究提供了一個新的思路。
