引用本文： 周章明, 楚勝華. 短發夾核糖核酸沉默EZH2基因對人腦膠質瘤細胞增殖和侵襲的影響. 華西醫學, 2014, 29(11): 2001-2005. doi: 10.7507/1002-0179.20140608 復制
果蠅zeste基因增強子人類同源物（EZH2）是多疏基因家族中一個主要維持同源異型基因沉默狀態的基因，EZH2高表達于包括膠質瘤在內的多種腫瘤細胞中[1, 2]。已有研究表明，EZH2高表達可促進前列腺腫瘤細胞的增殖、運動、侵襲和轉移，并與預后相關[3]，推測其可能成為腫瘤預后的分子標記物和潛在治療靶點。本研究采用針對EZH2短發夾核糖核酸（shRNA）轉染高表達EZH2的人膠質瘤細胞株U251，觀察其對細胞增殖和侵襲能力的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
選用人膠質瘤U25l細胞株（中國典型培養物保藏中心）、人膠質瘤SHG44細胞（中國上海基免生物科技有限公司），聚合酶鏈反應（PCR）體系試劑（加拿大Fermentas公司），逆轉錄（RT）-PCR引物（上海生工生物技術有限公司合成品），EZH2抗體（美國CST公司），四甲基偶氮唑藍（MTT）（美國Sigma公司），細胞周期蛋白D1（CyclinD1）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養和重組質粒轉染
U251細胞生長于含10%新生牛血清的RMPI 1640培養基中，加青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L，置于5%二氧化碳、飽和濕度、37℃培養箱內培養，取對數生長期細胞進行實驗。根據文獻[4]，合成EZH2特異性shRNA序列5’-AAGACTCTGAATGCAGTTGCT-3’，陰性對照shRNA序列為5’-TCTTAATCGCGTATAAGGC-3’。在560 V，60 txs電擊1次的條件下電穿孔轉染。實驗分為對照組、control-shRNA-GFP空載體轉染組和EZH2-shRNA重組質粒轉染組。
1.2.2 RT-PCR檢測轉染后細胞EZH2
mRNA表達轉染48 h后用Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。以逆轉錄后cDNA為模板（20 ng），分別擴增β-actin和EZH2基因。EZH2引物序列：上游5’-GCGGGACTAGGGAGTGTTC-3’，下游3’-AGCAACTGCATTCAGAGTCTT-5’，產物大小為83 bp。β-actin引物序列：上游5’-GACACGATGCAGAAGGAGATTACT-3’，下游5’-TGATCCACA TCTGCTGGAAGGT-3’，產物大小為141 bp。以EZH2/β-actin擴增條帶的灰度比值表示EZH2 mRNA的表達水平。
1.2.3 蛋白質印跡法檢測EZH2蛋白的表達
收集細胞，采用細胞裂解液處理細胞，離心后取上清液，用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，聚丙烯酞胺凝膠電泳，將蛋白電轉至硝酸纖維膜上，與EZH2抗體結合，之后用辣根過氧化物酶結合的二抗結合，增強化學發生法顯色后照相。最后以Image-proplus 4.5圖像分析系統測定各條帶的灰度值，以此反映EZH2蛋白的表達程度。
1.2.4 MTT法檢測細胞增殖
按上法處理細胞24、48、72 h后，分別行MTT法染色，以酶標儀于570 nm處讀取各孔吸光度值（A570），計算細胞增殖抑制率。每組設定3個復孔。腫瘤細胞抑制率=（空白對照組平均A570-處理組平均A570）/空白對照組平均A570。
1.2.5 蛋白質印跡法檢測轉染后蛋白激酶B（PKB/Akt）、磷酸化Akt、磷酸化叉頭框蛋白O1（FoxO1）及下游Cyclin D1、p27蛋白的表達
轉染48 h后提取細胞總蛋白，實驗步驟同上，一抗分別為鼠抗Akt、免抗磷酸化Akt、兔抗磷酸化FoxO1、兔抗Cyclin D1、鼠抗p27一抗（均1︰500），二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗鼠抗體（1︰2 000）。
1.2.6 細胞體外侵襲能力測定
在Transwell小室（美國Corning Costar公司）中進行。以50 μL含5 μg纖維連接蛋白的磷酸鹽緩沖液處理Transwell小室的聚碳酸濾膜下表面。基質膠用體積分數為0.1%的小牛血清的RPMI 1640培養基稀釋成100 mg/L，加入濾膜上表面。將細胞消化后，重懸于含0.1%牛血清白蛋白的RPMI 1640培養基中，取1×105個/mL細胞100 μL 加入至上室，600 μL體積分數為0.1%的小牛血清培養基加入下室。常規培養24 h后，行蘇木精-伊紅（HE）染色。去除濾膜上層細胞，鏡下計數濾膜下表面細胞數，隨機計數5個視野中的細胞數目，每個標本重復3次，以侵襲細胞的相對數目來表示腫瘤細胞的侵襲能力。
1.3 統計學方法
應用SPSS 15.0軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間對比采用方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 EZH2 shRNA轉染細胞后EZH2 mRNA和蛋白表達的變化
RT-PCR結果顯示，與對照組（1.13 ± 0.05）、control-shRNA-GFP空載體轉染組（1.15 ± 0.05）比較，EZH2-shRNA重組質粒轉染組（0.19 ± 0.02）的U251細胞EZH2 mRNA的表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 1。蛋白質印跡法實驗結果顯示，與對照組（1.03 ± 0.03）、control-shRNA-GFP空載體轉染組（0.97 ± 0.06）比較，EZH2-shRNA重組質粒轉染組（0.20 ± 0.02）的U251細胞EZH2蛋白的表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 2。
圖1
轉染48 h后U251細胞EZH2 mRNA的表達RT-PCR電泳圖 1：對照組；2：control-shRNA-GFP空載體轉染組；3：EZH2-shRNA重組質粒轉染組
圖2
轉染48 h后U251細胞EZH2蛋白及增殖相關蛋白的表達蛋白質印跡法電泳圖 1：對照組；2：control-shRNA-GFP空載體轉染組；3：EZH2-shRNA重組質粒轉染組
2.2 EZH2 shRNA轉染對U251細胞增殖率的影響
MTT法檢測結果顯示，轉染24 h后，與對照組（100.00% ± 9.31%）、control-shRNA-GFP空載體轉染組（100.03% ± 9.35%）比較，EZH2-shRNA重組質粒轉染組的U251細胞增殖率（60.13% ± 3.15%）下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。轉染48 h后，與對照組（100.00% ± 9.13%）、control-shRNA-GFP空載體轉染組（99.58% ± 9.27%）比較，EZH2-shRNA重組質粒轉染組（53.01% ± 3.14%）的U251細胞增殖率下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。
2.3 EZH2 shRNA轉染對細胞增殖相關蛋白表達的影響
轉染48 h后提取細胞總蛋白，蛋白質印跡法實驗結果顯示，與對照組、control-shRNA-GFP空載體轉染組比較，EZH2-shRNA重組質粒轉染組U251細胞Akt表達無明顯變化，而磷酸化Akt、磷酸化FoxO1水平降低，Cyclin D1蛋白表達減少，p27蛋白表達增多，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2、3。
圖3
轉染48 h后U251、SHG44細胞增殖相關蛋白的表達水平 *與對照組和空載體轉染組比較，P＜0.05
2.4 體外侵襲能力測定
EZH2 shRNA轉染U251細胞后U251細胞侵襲重建基底膜能力受到顯著的抑制，侵襲至Transwell小室濾膜下表面的細胞數在EZH2-shRNA重組質粒轉染組[（46.00 ± 2.82）個]低于對照組[（60.67 ± 5.71）個]和control-shRNA-GFP空載體轉染組[（61.00 ± 2.48）個]，差異有統計學意義（P＜0.01）。
3 討論
EZH2基因是果蠅zeste基因增強子的人類同源基因，定位于人類染色體7q35，是聚疏蛋白復合物（PcG）基因家族的重要成員之一。PcG蛋白控制細胞的轉錄系統，能通過抑制轉錄，維持同源異形基因的失活狀態。EZH2基因能促進細胞增殖，抑制分化，與腫瘤的發生有密切關系。研究表明，EZH2蛋白在侵襲性前列腺癌惡性演變過程中明顯上調，EZH2高表達的乳腺癌患者手術治療后，無腫瘤復發的間歇期短，生存率低，病死率高[5]。EZH2高表達的腎癌患者預后明顯比低表達患者差[6]。目前已有研究發現在前列腺癌、胃腺、直腸癌等多種高度惡性轉移性腫瘤中EZH2過度表達[7-10]。
RNA干擾（RNAi）技術是目前研究應用較多的現代分子生物學技術，是由21-25 nt雙鏈RNA介導的序列特異性轉錄后的基因沉默過程。這些短鏈RNA可以在細胞內形成蛋白復合物，結合并裂解特定的靶mRNA，從而抑制蛋白質的表達。我們應用RNAi技術沉默神經膠質瘤U251細胞的EZH2基因，抑制EZH2的表達，以探討利用載體構建體內合成shRNA能否有效地促使腫瘤細胞產生RNAi，從而為EZH2的基因治療提供新的策略。目前國內外尚未見關于RNA；抑制人腦膠質瘤細胞EZH2基因的研究報道，本研究合成EZH2特異性shRNA，采用轉染效率較高的電穿孔法轉染，特異性地下調人膠質瘤細胞系U251中EZH2的表達，結果顯示膠質瘤細胞系U251中EZH2 mRNA和蛋白表達均被有效抑制。本研究表明EZH2表達下調后U25I細胞增殖率顯著降低，轉染后第48小時EZH2-shRNA重組質粒轉染組與對照組、control-shRNA-GFP空質粒轉染組的細胞增殖率差異最明顯，這提示EZH2在促進膠質瘤細胞增殖方面有重要作用。文獻報道EZH2基因在多種實體性腫瘤如乳腺癌、膠質瘤中異常表達并促進腫瘤的細胞增殖和病程進展[1, 2]。本研究結果，提示EZH2可參與膠質瘤細胞的增殖調控，EZH2已成為多種腫瘤的治療靶點，亦可能成為膠質瘤分子治療的靶點，為探討膠質瘤的增殖機制及臨床治療提供了理論依據。
本研究結果顯示EZH2-shRNA重組質粒轉染組p27蛋白表達明顯升高，Cyclin D1蛋白表達降低。目前已知Cyclin D1在腦膠質瘤中表達增高[11]，并與膠質瘤細胞的異常增殖、侵襲和預后有關；p27蛋白負性調節細胞周期，其水平的降低會促進腫瘤細胞從G1期進入S期，而提高細胞增殖的速度。因此，本研究結果表明EZH2 shRNA轉染U251細胞后可能調控其下游與細胞增殖密切相關基因的表達，從而導致膠質瘤細胞的增殖受抑制。本研究結果顯示EZH2-shRNA重組質粒轉染組細胞總Akt蛋白水平沒有明顯變化，Akt和FoxO1磷酸化水平明顯下降。而目前已知激活的Akt可磷酸化FoxO1，導致有腫瘤抑制功能的FoxO1轉錄活性被抑制[12]。因此，本研究表明EZH2 shRNA轉染U251細胞后可導致Akt信號通路被抑制和下游靶蛋白FoxO1轉錄活性增強。此外，Akt可以調節細胞周期，影響細胞增殖，促使p27磷酸化使其失活，從而抑制p27介導的G1期阻滯。本研究表明，在膠質瘤細胞中下調EZH2表達后可通過抑制Akt/FoxO1信號通路繼而調控其下游與增殖相關的信號通路蛋白的表達。此外，本研究利用體外侵襲能力測定還顯示EZH2 shRNA轉染U251細胞后使U251細胞侵襲重建基底膜能力受到顯著的抑制，表明沉默EZH2基因后膠質瘤細胞的侵襲能力減低。
綜上所述，本研究表明針對EZH2的RNAi可明顯抑制轉染人膠質瘤細胞系U25l細胞EZH2的表達和細胞增殖、侵襲，可能與抑制Akt/FoxO1信號通路，調控下游Cyclin D1、p27蛋白的表達有關。本研究結果表明，EZH2基因的異常表達可能是腦膠質瘤發生、發展中的重要事件，EZH2 shRNA可作為膠質瘤治療的途徑之一，具有一定的臨床潛在應用價值。但膠質瘤為多基因共同作用結果[13-16]，沉默單個基因并不能完全抑制腫瘤，進一步探討多基因多靶點的沉默可能是更好的解決方法。
果蠅zeste基因增強子人類同源物（EZH2）是多疏基因家族中一個主要維持同源異型基因沉默狀態的基因，EZH2高表達于包括膠質瘤在內的多種腫瘤細胞中[1, 2]。已有研究表明，EZH2高表達可促進前列腺腫瘤細胞的增殖、運動、侵襲和轉移，并與預后相關[3]，推測其可能成為腫瘤預后的分子標記物和潛在治療靶點。本研究采用針對EZH2短發夾核糖核酸（shRNA）轉染高表達EZH2的人膠質瘤細胞株U251，觀察其對細胞增殖和侵襲能力的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
選用人膠質瘤U25l細胞株（中國典型培養物保藏中心）、人膠質瘤SHG44細胞（中國上海基免生物科技有限公司），聚合酶鏈反應（PCR）體系試劑（加拿大Fermentas公司），逆轉錄（RT）-PCR引物（上海生工生物技術有限公司合成品），EZH2抗體（美國CST公司），四甲基偶氮唑藍（MTT）（美國Sigma公司），細胞周期蛋白D1（CyclinD1）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養和重組質粒轉染
U251細胞生長于含10%新生牛血清的RMPI 1640培養基中，加青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L，置于5%二氧化碳、飽和濕度、37℃培養箱內培養，取對數生長期細胞進行實驗。根據文獻[4]，合成EZH2特異性shRNA序列5’-AAGACTCTGAATGCAGTTGCT-3’，陰性對照shRNA序列為5’-TCTTAATCGCGTATAAGGC-3’。在560 V，60 txs電擊1次的條件下電穿孔轉染。實驗分為對照組、control-shRNA-GFP空載體轉染組和EZH2-shRNA重組質粒轉染組。
1.2.2 RT-PCR檢測轉染后細胞EZH2
mRNA表達轉染48 h后用Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。以逆轉錄后cDNA為模板（20 ng），分別擴增β-actin和EZH2基因。EZH2引物序列：上游5’-GCGGGACTAGGGAGTGTTC-3’，下游3’-AGCAACTGCATTCAGAGTCTT-5’，產物大小為83 bp。β-actin引物序列：上游5’-GACACGATGCAGAAGGAGATTACT-3’，下游5’-TGATCCACA TCTGCTGGAAGGT-3’，產物大小為141 bp。以EZH2/β-actin擴增條帶的灰度比值表示EZH2 mRNA的表達水平。
1.2.3 蛋白質印跡法檢測EZH2蛋白的表達
收集細胞，采用細胞裂解液處理細胞，離心后取上清液，用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，聚丙烯酞胺凝膠電泳，將蛋白電轉至硝酸纖維膜上，與EZH2抗體結合，之后用辣根過氧化物酶結合的二抗結合，增強化學發生法顯色后照相。最后以Image-proplus 4.5圖像分析系統測定各條帶的灰度值，以此反映EZH2蛋白的表達程度。
1.2.4 MTT法檢測細胞增殖
按上法處理細胞24、48、72 h后，分別行MTT法染色，以酶標儀于570 nm處讀取各孔吸光度值（A570），計算細胞增殖抑制率。每組設定3個復孔。腫瘤細胞抑制率=（空白對照組平均A570-處理組平均A570）/空白對照組平均A570。
1.2.5 蛋白質印跡法檢測轉染后蛋白激酶B（PKB/Akt）、磷酸化Akt、磷酸化叉頭框蛋白O1（FoxO1）及下游Cyclin D1、p27蛋白的表達
轉染48 h后提取細胞總蛋白，實驗步驟同上，一抗分別為鼠抗Akt、免抗磷酸化Akt、兔抗磷酸化FoxO1、兔抗Cyclin D1、鼠抗p27一抗（均1︰500），二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗鼠抗體（1︰2 000）。
1.2.6 細胞體外侵襲能力測定
在Transwell小室（美國Corning Costar公司）中進行。以50 μL含5 μg纖維連接蛋白的磷酸鹽緩沖液處理Transwell小室的聚碳酸濾膜下表面。基質膠用體積分數為0.1%的小牛血清的RPMI 1640培養基稀釋成100 mg/L，加入濾膜上表面。將細胞消化后，重懸于含0.1%牛血清白蛋白的RPMI 1640培養基中，取1×105個/mL細胞100 μL 加入至上室，600 μL體積分數為0.1%的小牛血清培養基加入下室。常規培養24 h后，行蘇木精-伊紅（HE）染色。去除濾膜上層細胞，鏡下計數濾膜下表面細胞數，隨機計數5個視野中的細胞數目，每個標本重復3次，以侵襲細胞的相對數目來表示腫瘤細胞的侵襲能力。
1.3 統計學方法
應用SPSS 15.0軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間對比采用方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 EZH2 shRNA轉染細胞后EZH2 mRNA和蛋白表達的變化
RT-PCR結果顯示，與對照組（1.13 ± 0.05）、control-shRNA-GFP空載體轉染組（1.15 ± 0.05）比較，EZH2-shRNA重組質粒轉染組（0.19 ± 0.02）的U251細胞EZH2 mRNA的表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 1。蛋白質印跡法實驗結果顯示，與對照組（1.03 ± 0.03）、control-shRNA-GFP空載體轉染組（0.97 ± 0.06）比較，EZH2-shRNA重組質粒轉染組（0.20 ± 0.02）的U251細胞EZH2蛋白的表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 2。
圖1
轉染48 h后U251細胞EZH2 mRNA的表達RT-PCR電泳圖 1：對照組；2：control-shRNA-GFP空載體轉染組；3：EZH2-shRNA重組質粒轉染組
圖2
轉染48 h后U251細胞EZH2蛋白及增殖相關蛋白的表達蛋白質印跡法電泳圖 1：對照組；2：control-shRNA-GFP空載體轉染組；3：EZH2-shRNA重組質粒轉染組
2.2 EZH2 shRNA轉染對U251細胞增殖率的影響
MTT法檢測結果顯示，轉染24 h后，與對照組（100.00% ± 9.31%）、control-shRNA-GFP空載體轉染組（100.03% ± 9.35%）比較，EZH2-shRNA重組質粒轉染組的U251細胞增殖率（60.13% ± 3.15%）下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。轉染48 h后，與對照組（100.00% ± 9.13%）、control-shRNA-GFP空載體轉染組（99.58% ± 9.27%）比較，EZH2-shRNA重組質粒轉染組（53.01% ± 3.14%）的U251細胞增殖率下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。
2.3 EZH2 shRNA轉染對細胞增殖相關蛋白表達的影響
轉染48 h后提取細胞總蛋白，蛋白質印跡法實驗結果顯示，與對照組、control-shRNA-GFP空載體轉染組比較，EZH2-shRNA重組質粒轉染組U251細胞Akt表達無明顯變化，而磷酸化Akt、磷酸化FoxO1水平降低，Cyclin D1蛋白表達減少，p27蛋白表達增多，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2、3。
圖3
轉染48 h后U251、SHG44細胞增殖相關蛋白的表達水平 *與對照組和空載體轉染組比較，P＜0.05
2.4 體外侵襲能力測定
EZH2 shRNA轉染U251細胞后U251細胞侵襲重建基底膜能力受到顯著的抑制，侵襲至Transwell小室濾膜下表面的細胞數在EZH2-shRNA重組質粒轉染組[（46.00 ± 2.82）個]低于對照組[（60.67 ± 5.71）個]和control-shRNA-GFP空載體轉染組[（61.00 ± 2.48）個]，差異有統計學意義（P＜0.01）。
3 討論
EZH2基因是果蠅zeste基因增強子的人類同源基因，定位于人類染色體7q35，是聚疏蛋白復合物（PcG）基因家族的重要成員之一。PcG蛋白控制細胞的轉錄系統，能通過抑制轉錄，維持同源異形基因的失活狀態。EZH2基因能促進細胞增殖，抑制分化，與腫瘤的發生有密切關系。研究表明，EZH2蛋白在侵襲性前列腺癌惡性演變過程中明顯上調，EZH2高表達的乳腺癌患者手術治療后，無腫瘤復發的間歇期短，生存率低，病死率高[5]。EZH2高表達的腎癌患者預后明顯比低表達患者差[6]。目前已有研究發現在前列腺癌、胃腺、直腸癌等多種高度惡性轉移性腫瘤中EZH2過度表達[7-10]。
RNA干擾（RNAi）技術是目前研究應用較多的現代分子生物學技術，是由21-25 nt雙鏈RNA介導的序列特異性轉錄后的基因沉默過程。這些短鏈RNA可以在細胞內形成蛋白復合物，結合并裂解特定的靶mRNA，從而抑制蛋白質的表達。我們應用RNAi技術沉默神經膠質瘤U251細胞的EZH2基因，抑制EZH2的表達，以探討利用載體構建體內合成shRNA能否有效地促使腫瘤細胞產生RNAi，從而為EZH2的基因治療提供新的策略。目前國內外尚未見關于RNA；抑制人腦膠質瘤細胞EZH2基因的研究報道，本研究合成EZH2特異性shRNA，采用轉染效率較高的電穿孔法轉染，特異性地下調人膠質瘤細胞系U251中EZH2的表達，結果顯示膠質瘤細胞系U251中EZH2 mRNA和蛋白表達均被有效抑制。本研究表明EZH2表達下調后U25I細胞增殖率顯著降低，轉染后第48小時EZH2-shRNA重組質粒轉染組與對照組、control-shRNA-GFP空質粒轉染組的細胞增殖率差異最明顯，這提示EZH2在促進膠質瘤細胞增殖方面有重要作用。文獻報道EZH2基因在多種實體性腫瘤如乳腺癌、膠質瘤中異常表達并促進腫瘤的細胞增殖和病程進展[1, 2]。本研究結果，提示EZH2可參與膠質瘤細胞的增殖調控，EZH2已成為多種腫瘤的治療靶點，亦可能成為膠質瘤分子治療的靶點，為探討膠質瘤的增殖機制及臨床治療提供了理論依據。
本研究結果顯示EZH2-shRNA重組質粒轉染組p27蛋白表達明顯升高，Cyclin D1蛋白表達降低。目前已知Cyclin D1在腦膠質瘤中表達增高[11]，并與膠質瘤細胞的異常增殖、侵襲和預后有關；p27蛋白負性調節細胞周期，其水平的降低會促進腫瘤細胞從G1期進入S期，而提高細胞增殖的速度。因此，本研究結果表明EZH2 shRNA轉染U251細胞后可能調控其下游與細胞增殖密切相關基因的表達，從而導致膠質瘤細胞的增殖受抑制。本研究結果顯示EZH2-shRNA重組質粒轉染組細胞總Akt蛋白水平沒有明顯變化，Akt和FoxO1磷酸化水平明顯下降。而目前已知激活的Akt可磷酸化FoxO1，導致有腫瘤抑制功能的FoxO1轉錄活性被抑制[12]。因此，本研究表明EZH2 shRNA轉染U251細胞后可導致Akt信號通路被抑制和下游靶蛋白FoxO1轉錄活性增強。此外，Akt可以調節細胞周期，影響細胞增殖，促使p27磷酸化使其失活，從而抑制p27介導的G1期阻滯。本研究表明，在膠質瘤細胞中下調EZH2表達后可通過抑制Akt/FoxO1信號通路繼而調控其下游與增殖相關的信號通路蛋白的表達。此外，本研究利用體外侵襲能力測定還顯示EZH2 shRNA轉染U251細胞后使U251細胞侵襲重建基底膜能力受到顯著的抑制，表明沉默EZH2基因后膠質瘤細胞的侵襲能力減低。
綜上所述，本研究表明針對EZH2的RNAi可明顯抑制轉染人膠質瘤細胞系U25l細胞EZH2的表達和細胞增殖、侵襲，可能與抑制Akt/FoxO1信號通路，調控下游Cyclin D1、p27蛋白的表達有關。本研究結果表明，EZH2基因的異常表達可能是腦膠質瘤發生、發展中的重要事件，EZH2 shRNA可作為膠質瘤治療的途徑之一，具有一定的臨床潛在應用價值。但膠質瘤為多基因共同作用結果[13-16]，沉默單個基因并不能完全抑制腫瘤，進一步探討多基因多靶點的沉默可能是更好的解決方法。
