活性氧族是一類氧衍生的代謝物，被廣泛地認為是多種生理過程以及病理狀態下關鍵的調節劑，在血管系統中主要由還原型輔酶Ⅱ氧化酶生成。慢性創口的愈合涉及2種不同形式的血管新生：血管發生（骨髓來源分化而成的循環內皮祖細胞形成）和血管生成（已存在血管局部內皮細胞的芽生而形成）。活性氧族通過對血管新生過程中所涉及的內皮祖細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞功能的調節，影響創口愈合。
引用本文： 謝飛, 何延政, 劉勇. 活性氧簇對創口愈合過程中血管新生的影響. 華西醫學, 2014, 29(10): 1979-1982. doi: 10.7507/1002-0179.20140599 復制
活性氧簇（ROS）是一類氧衍生的具有較強化學反應的活性分子，包括超氧陰離子、過氧化氫、過氧亞硝基陰離子、次氯酸、羥自由基、一氧化氮等。它的生成是多種刺激因素作用的結果，這些刺激因素包括生長因子、細胞因子、低氧誘導因子、剪切應力等。傳統觀點認為，ROS通過自由基鏈式反應引起生物體的核酸、脂肪、蛋白質等大分子的損害。近幾十年來，大量的研究表明，氧化應激對于血管疾病的發病具有重要的作用，例如與高血壓、動脈粥樣硬化和再狹窄的發生有著密切的關系。近年的研究也表明，對于多種生理活動過程而言，ROS均具有重要的調節作用，細胞內多種重要信號路徑的調節都是由ROS介導的，例如G蛋白偶聯受體、Notch路徑[1]、Wnt-β-catenin路徑[2]、促分裂原活化蛋白激酶路徑、JAK-STAT路徑、核因子κB（NF-κB）、PI3K/AKT路徑等，其調節信號的轉導過程被稱之為可逆性的氧化還原過程。除此之外，ROS還可以激活轉錄因子（例如激活蛋白1、NF-κB自身、c-Jun氨基末端激酶等），調控細胞的生長、分化、遷移、凋亡、衰老等多種生理活動。
創口愈合緩慢會增加醫療負擔，尤其影響老年、糖尿病及肥胖患者。組織損傷及缺血所引起的血管生長對于創口的愈合非常關鍵。目前發現存在2種不同形式的血管新生：血管的發生，由骨髓來源分化而成的循環內皮祖細胞（EPC）所形成；血管的生成，由已存在血管局部內皮細胞（EC）的芽生而形成。創口血管的新生包括血管的發生、生成以及血管平滑肌細胞（VSMC）遷移從而形成血管壁的過程[3]。這一過程涉及EPC的動員和分化、EC的遷移、VSMC表型的轉化等，ROS在其中的作用不可或缺。因此，現就ROS如何影響創口愈合過程中血管的新生進行綜述。
1 ROS的來源與還原型輔酶Ⅱ氧化酶家族（Nox）
ROS來源于包括Nox、黃原呤氧化酶、線粒體呼吸鏈、非耦合的一氧化氮合成酶、髓過氧化物酶、脂氧合酶、環氧合酶、細胞色素P450和血紅素加氧酶的多酶系統。在上述多種能夠產生ROS的氧化酶中，Nox被認為是血管系統中生成ROS的主要氧化酶。
Nox蛋白家族包括Nox 1-5、雙功能氧化酶1及雙功能氧化酶2幾種亞型，其結構由2個組織亞單位p47phox和Noxo1亞基、2種激活亞單位p67phoxa和Noxa1、2個調節亞單位p22phox和p40phox以及結合在Rac蛋白上的調節亞單位組成。Nox蛋白的亞型具有不同的結構，其中Nox1-4蛋白具有60%氨基酸序列的同源性，其N末端有6個保守的跨膜區，也叫跨膜a單環，其C末端包含有NADPH結合位點。Nox5除了具有與Nox1-4相同的基本結構域外，還在其N端有4個被認為是鈣離子結合位點的E-螺旋/F-螺旋手結構域。Duox1和Duox2具有與Nox5相似的結構，并且在其N末端有1個髓過氧化物酶樣的胞外域。Nox蛋白家族成員中，Nox2最先在中性粒細胞和吞噬細胞內被發現，因此它常被稱為吞噬細胞Nox，它的催化亞基gp91Phox和調節亞基p22Phox在細胞膜上形成異二聚體，其他亞基通常位于細胞質，包括p40Phox、p47Phox、p67Phox和小G蛋白Rac。不同的Nox表現出組織分布的特異性并具有不同的功能。脈管系統主要表達Nox1、Nox2、Nox4和Nox5，在血管EC中，ROS主要由Nox2和Nox4產生。
2 ROS與EPC
血管的新生對于創口的愈合起著關鍵作用，在創口血管的新生過程中，來源于骨髓的EPC的動員有助于受損害創口血管的發生。適當水平的ROS對于造血干細胞的衰老和分化具有重要的影響。更為重要的是，ROS調控的信號路徑有助于來源于骨髓的EPC釋放。粒細胞集落刺激因子誘導EPC和其他祖細胞的動員過程能夠被抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸所阻止[4]。有研究表明，在敲除了Nox2基因的后肢缺血老鼠模型中，其缺血誘導的血流恢復減少，EPC的動員受到損害，但是這一損害過程能夠通過移植野生型老鼠的EPC而得到改善[5]。在給予低氧或者促紅細胞生成素刺激的條件下，敲除了Nox2基因的EPC的動員也是減少的，這可能歸因于ROS生成的缺乏，以致于不能激活促紅細胞生成素信號路徑，從而使得EPC的動員減少。在骨髓中，基質的降解和重塑對于EPC的動員和生長因子的釋放十分重要，在骨髓細胞，通過瘦素結合其受體能夠激活由Nox2所誘導的ROS的生成[6]。伴隨著ROS的生成，基質金屬蛋白酶9的表達上調，它能夠通過釋放水溶性Kit配體從而增強EPC的動員。除此之外，ROS的生成有助于血管細胞黏附分子-1在EC的表達，這樣能夠促進造血干細胞亞群Lin-Sca-1+cKit+CD34-（LSKCD34-）的募集和增殖[7]。
3 ROS與EC
創口血管的生成過程包括EC的遷移、增殖和基質的重塑，其受氧化還原信號調控。在敲除了Nox2基因的后肢缺血老鼠模型中，其血管生成的能力以及EC的增殖和遷移能力也是減弱的[8]。
3.1 EC的遷移
當受到創口損害的刺激時，EC遷移并且覆蓋創口中被損害的血管，這一過程涉及復雜的細胞外基質與細胞、細胞與細胞之間的相互作用。血管內皮鈣黏蛋白形成二聚體直接結合于β連環蛋白和p120連環蛋白上，進而與α連環蛋白結合，后者又與肌動蛋白細胞骨架結合形成鈣黏蛋白-連環蛋白復合體。在細胞遷移的起初，位于血管壁上處于靜止狀態的EC首先分解主要由血管內皮鈣黏蛋白組成的細胞間連接。IQGAPl（IQ-domain GTPase-activating protein 1）是一種進化保守的多結構域蛋白，它作為一種細胞骨架蛋白，能夠結合于肌動蛋白、β連環蛋白、微管正端示蹤蛋白CLIP-170、Rac蛋白、Cdc42蛋白、鈣調蛋白以及其他與形成細胞骨架相關的蛋白[9]。當EC受到血管內皮生長因子（VEGF）刺激時，IQGAP1蛋白通過激活血管內皮生長因子受體（VEGFR）以及募集Rac1蛋白和Nox亞單位從而產生ROS； IQGAP1蛋白與VEGFR的結合還能夠進一步激活c-Src蛋白激酶[10]磷酸化IQGAP1蛋白，募集更多的Nox亞單位或者激活Rac交換因子Vav2，從而增加ROS的生成。
3.2 EC的增殖與生存
增殖的EC能夠產生高水平的超氧化物和過氧化氫。通過Nox2和Nox4產生的ROS能夠增強EC的增殖和生存能力，這可能與ROS激活酪氨酸激酶受體以及磷酸化p38、ERK和Akt信號通路有關。在血管EC中，Nox2表達的沉默能夠誘導凋亡的關鍵酶半胱天冬酶3和半胱天冬酶7的激活，而在血清剝奪刺激的情況下，Nox4過表達能夠抑制凋亡酶的激活，這表明來源于各種Nox亞型的ROS能夠發揮抗凋亡效應。在能源不足的條件下，細胞啟動通過溶酶體降解細胞質內受損害成分的促生存機制的過程被稱之為自噬[11]。它不僅是一種細胞死亡方式，同時也是一種細胞自我保護機制，有利于EC的生存。在EC受到應力刺激時，ROS作為信號分子，已被報道參與細胞內自噬的調節[12]和促進EC的生存[13]。抑制線粒體生成ROS能夠減少由趨化素或者2-脫氧-D-葡萄糖誘導EC自噬過程中腺苷酸活化蛋白激酶的激活[14]。此外，在血管生成的過程中，由ROS調節的自噬對于EC的遷移和管狀形成很關鍵[15]。
4 ROS與VSMC
VSMC作為血管壁重要的組成成分，具有收縮和舒張血管、調節血壓以及分配血流的功能，有很強的可塑性。當血管受到損害或處于病理狀態時，VSMC從靜息的可收縮狀態向具有遷移和生物合成能力的狀態分化[16]。在創口血管的生成過程中，ROS能調節VSMC的分化、增殖、遷移等多種功能。ROS能夠通過Nox4、Nrf3、Pla2g7及其他調節蛋白來調控平滑肌細胞（SMC）的分化，還能夠增強血管平滑肌分化/收縮狀態的維持能力。VSMC在受到血紅素[17]和尾加壓素Ⅱ[18]刺激時，能激活Nox和ROS的形成，促進SMC的增殖。
在創口血管生成過程中，VSMC需要遷移并且覆蓋已存在的側支血管網，為成熟的血管提供機械支持與收縮力。ROS促進SMC遷移的機制是多樣的。首先，ROS激活與遷移相關的信號通路，這些通路包括c-Src-PDK1-PAK[19]與c-Src-EGFR-PI3K/ERK[20]。其次，SMC的遷移需要細胞外基質的降解。ROS能夠影響細胞間神經-鈣黏蛋白的脫落，這與其影響EC的血管內皮鈣黏蛋白相似。細胞外基質的降解通常需要基質金屬蛋白酶裂解活性的激活，通過Nox1激活上皮生長因子受體，基質金屬蛋白酶9能夠裂解神經-鈣黏蛋白[21]。創口血管生成時，ROS的生成對于基質金屬蛋白酶的轉錄、激活與合成具有重要的作用[21]，從而促進細胞的遷移。基質金屬蛋白酶2是一種潛在的促進SMC遷移的亞型。最后，ROS的生成能夠進一步調控遷移細胞骨架的重構[22]。在遷移細胞骨架形成過程中，絲切蛋白作為肌動蛋白解聚的調節劑[23]，其活性主要通過磷酸化/去磷酸化來調節。絲切蛋白通過LIM激酶磷酸化和失活，通過磷酸酶SSH-1L去磷酸化而復活[24]。Nox1通過氧化14-3-3蛋白生成ROS，進而釋放磷酸酶SSH-1L激活絲切蛋白，從而調控遷移細胞的細胞骨架重構[25, 26]。除此之外，VSMC胞內產生的ROS能夠通過鈣離子的內流增加細胞鈣離子的動員，增強其收縮能力[27]。
5 結語
近年來，ROS被越來越廣泛地認為是多種正常生理過程或者病理狀態下關鍵的調節劑。創口的愈合過程涉及血管新生，越來越多的研究發現ROS對于創口血管的新生過程是不可或缺的，這一血管新生過程包括EPC的動員和分化，EC和VSMC的遷移、增殖以及分化。在本文中，我們從ROS的來源與Nox家族，ROS與EPC、EC、VSMC等方面討論了ROS對于創口血管新生過程的影響。盡管如此，當前還有許多關于ROS的信號調節問題以及病理生理功能問題亟待解決，尤其是如何避免細胞內ROS過多蓄積從而造成氧化應激損害。因此，更好地了解ROS在不同病理或生理狀態下如何影響血管系統[28]，特別是對血管新生過程中所涉及細胞的調控機制有何影響，有助于我們尋找新的治療途徑以調控創口愈合的血管新生過程。
活性氧簇（ROS）是一類氧衍生的具有較強化學反應的活性分子，包括超氧陰離子、過氧化氫、過氧亞硝基陰離子、次氯酸、羥自由基、一氧化氮等。它的生成是多種刺激因素作用的結果，這些刺激因素包括生長因子、細胞因子、低氧誘導因子、剪切應力等。傳統觀點認為，ROS通過自由基鏈式反應引起生物體的核酸、脂肪、蛋白質等大分子的損害。近幾十年來，大量的研究表明，氧化應激對于血管疾病的發病具有重要的作用，例如與高血壓、動脈粥樣硬化和再狹窄的發生有著密切的關系。近年的研究也表明，對于多種生理活動過程而言，ROS均具有重要的調節作用，細胞內多種重要信號路徑的調節都是由ROS介導的，例如G蛋白偶聯受體、Notch路徑[1]、Wnt-β-catenin路徑[2]、促分裂原活化蛋白激酶路徑、JAK-STAT路徑、核因子κB（NF-κB）、PI3K/AKT路徑等，其調節信號的轉導過程被稱之為可逆性的氧化還原過程。除此之外，ROS還可以激活轉錄因子（例如激活蛋白1、NF-κB自身、c-Jun氨基末端激酶等），調控細胞的生長、分化、遷移、凋亡、衰老等多種生理活動。
創口愈合緩慢會增加醫療負擔，尤其影響老年、糖尿病及肥胖患者。組織損傷及缺血所引起的血管生長對于創口的愈合非常關鍵。目前發現存在2種不同形式的血管新生：血管的發生，由骨髓來源分化而成的循環內皮祖細胞（EPC）所形成；血管的生成，由已存在血管局部內皮細胞（EC）的芽生而形成。創口血管的新生包括血管的發生、生成以及血管平滑肌細胞（VSMC）遷移從而形成血管壁的過程[3]。這一過程涉及EPC的動員和分化、EC的遷移、VSMC表型的轉化等，ROS在其中的作用不可或缺。因此，現就ROS如何影響創口愈合過程中血管的新生進行綜述。
1 ROS的來源與還原型輔酶Ⅱ氧化酶家族（Nox）
ROS來源于包括Nox、黃原呤氧化酶、線粒體呼吸鏈、非耦合的一氧化氮合成酶、髓過氧化物酶、脂氧合酶、環氧合酶、細胞色素P450和血紅素加氧酶的多酶系統。在上述多種能夠產生ROS的氧化酶中，Nox被認為是血管系統中生成ROS的主要氧化酶。
Nox蛋白家族包括Nox 1-5、雙功能氧化酶1及雙功能氧化酶2幾種亞型，其結構由2個組織亞單位p47phox和Noxo1亞基、2種激活亞單位p67phoxa和Noxa1、2個調節亞單位p22phox和p40phox以及結合在Rac蛋白上的調節亞單位組成。Nox蛋白的亞型具有不同的結構，其中Nox1-4蛋白具有60%氨基酸序列的同源性，其N末端有6個保守的跨膜區，也叫跨膜a單環，其C末端包含有NADPH結合位點。Nox5除了具有與Nox1-4相同的基本結構域外，還在其N端有4個被認為是鈣離子結合位點的E-螺旋/F-螺旋手結構域。Duox1和Duox2具有與Nox5相似的結構，并且在其N末端有1個髓過氧化物酶樣的胞外域。Nox蛋白家族成員中，Nox2最先在中性粒細胞和吞噬細胞內被發現，因此它常被稱為吞噬細胞Nox，它的催化亞基gp91Phox和調節亞基p22Phox在細胞膜上形成異二聚體，其他亞基通常位于細胞質，包括p40Phox、p47Phox、p67Phox和小G蛋白Rac。不同的Nox表現出組織分布的特異性并具有不同的功能。脈管系統主要表達Nox1、Nox2、Nox4和Nox5，在血管EC中，ROS主要由Nox2和Nox4產生。
2 ROS與EPC
血管的新生對于創口的愈合起著關鍵作用，在創口血管的新生過程中，來源于骨髓的EPC的動員有助于受損害創口血管的發生。適當水平的ROS對于造血干細胞的衰老和分化具有重要的影響。更為重要的是，ROS調控的信號路徑有助于來源于骨髓的EPC釋放。粒細胞集落刺激因子誘導EPC和其他祖細胞的動員過程能夠被抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸所阻止[4]。有研究表明，在敲除了Nox2基因的后肢缺血老鼠模型中，其缺血誘導的血流恢復減少，EPC的動員受到損害，但是這一損害過程能夠通過移植野生型老鼠的EPC而得到改善[5]。在給予低氧或者促紅細胞生成素刺激的條件下，敲除了Nox2基因的EPC的動員也是減少的，這可能歸因于ROS生成的缺乏，以致于不能激活促紅細胞生成素信號路徑，從而使得EPC的動員減少。在骨髓中，基質的降解和重塑對于EPC的動員和生長因子的釋放十分重要，在骨髓細胞，通過瘦素結合其受體能夠激活由Nox2所誘導的ROS的生成[6]。伴隨著ROS的生成，基質金屬蛋白酶9的表達上調，它能夠通過釋放水溶性Kit配體從而增強EPC的動員。除此之外，ROS的生成有助于血管細胞黏附分子-1在EC的表達，這樣能夠促進造血干細胞亞群Lin-Sca-1+cKit+CD34-（LSKCD34-）的募集和增殖[7]。
3 ROS與EC
創口血管的生成過程包括EC的遷移、增殖和基質的重塑，其受氧化還原信號調控。在敲除了Nox2基因的后肢缺血老鼠模型中，其血管生成的能力以及EC的增殖和遷移能力也是減弱的[8]。
3.1 EC的遷移
當受到創口損害的刺激時，EC遷移并且覆蓋創口中被損害的血管，這一過程涉及復雜的細胞外基質與細胞、細胞與細胞之間的相互作用。血管內皮鈣黏蛋白形成二聚體直接結合于β連環蛋白和p120連環蛋白上，進而與α連環蛋白結合，后者又與肌動蛋白細胞骨架結合形成鈣黏蛋白-連環蛋白復合體。在細胞遷移的起初，位于血管壁上處于靜止狀態的EC首先分解主要由血管內皮鈣黏蛋白組成的細胞間連接。IQGAPl（IQ-domain GTPase-activating protein 1）是一種進化保守的多結構域蛋白，它作為一種細胞骨架蛋白，能夠結合于肌動蛋白、β連環蛋白、微管正端示蹤蛋白CLIP-170、Rac蛋白、Cdc42蛋白、鈣調蛋白以及其他與形成細胞骨架相關的蛋白[9]。當EC受到血管內皮生長因子（VEGF）刺激時，IQGAP1蛋白通過激活血管內皮生長因子受體（VEGFR）以及募集Rac1蛋白和Nox亞單位從而產生ROS； IQGAP1蛋白與VEGFR的結合還能夠進一步激活c-Src蛋白激酶[10]磷酸化IQGAP1蛋白，募集更多的Nox亞單位或者激活Rac交換因子Vav2，從而增加ROS的生成。
3.2 EC的增殖與生存
增殖的EC能夠產生高水平的超氧化物和過氧化氫。通過Nox2和Nox4產生的ROS能夠增強EC的增殖和生存能力，這可能與ROS激活酪氨酸激酶受體以及磷酸化p38、ERK和Akt信號通路有關。在血管EC中，Nox2表達的沉默能夠誘導凋亡的關鍵酶半胱天冬酶3和半胱天冬酶7的激活，而在血清剝奪刺激的情況下，Nox4過表達能夠抑制凋亡酶的激活，這表明來源于各種Nox亞型的ROS能夠發揮抗凋亡效應。在能源不足的條件下，細胞啟動通過溶酶體降解細胞質內受損害成分的促生存機制的過程被稱之為自噬[11]。它不僅是一種細胞死亡方式，同時也是一種細胞自我保護機制，有利于EC的生存。在EC受到應力刺激時，ROS作為信號分子，已被報道參與細胞內自噬的調節[12]和促進EC的生存[13]。抑制線粒體生成ROS能夠減少由趨化素或者2-脫氧-D-葡萄糖誘導EC自噬過程中腺苷酸活化蛋白激酶的激活[14]。此外，在血管生成的過程中，由ROS調節的自噬對于EC的遷移和管狀形成很關鍵[15]。
4 ROS與VSMC
VSMC作為血管壁重要的組成成分，具有收縮和舒張血管、調節血壓以及分配血流的功能，有很強的可塑性。當血管受到損害或處于病理狀態時，VSMC從靜息的可收縮狀態向具有遷移和生物合成能力的狀態分化[16]。在創口血管的生成過程中，ROS能調節VSMC的分化、增殖、遷移等多種功能。ROS能夠通過Nox4、Nrf3、Pla2g7及其他調節蛋白來調控平滑肌細胞（SMC）的分化，還能夠增強血管平滑肌分化/收縮狀態的維持能力。VSMC在受到血紅素[17]和尾加壓素Ⅱ[18]刺激時，能激活Nox和ROS的形成，促進SMC的增殖。
在創口血管生成過程中，VSMC需要遷移并且覆蓋已存在的側支血管網，為成熟的血管提供機械支持與收縮力。ROS促進SMC遷移的機制是多樣的。首先，ROS激活與遷移相關的信號通路，這些通路包括c-Src-PDK1-PAK[19]與c-Src-EGFR-PI3K/ERK[20]。其次，SMC的遷移需要細胞外基質的降解。ROS能夠影響細胞間神經-鈣黏蛋白的脫落，這與其影響EC的血管內皮鈣黏蛋白相似。細胞外基質的降解通常需要基質金屬蛋白酶裂解活性的激活，通過Nox1激活上皮生長因子受體，基質金屬蛋白酶9能夠裂解神經-鈣黏蛋白[21]。創口血管生成時，ROS的生成對于基質金屬蛋白酶的轉錄、激活與合成具有重要的作用[21]，從而促進細胞的遷移。基質金屬蛋白酶2是一種潛在的促進SMC遷移的亞型。最后，ROS的生成能夠進一步調控遷移細胞骨架的重構[22]。在遷移細胞骨架形成過程中，絲切蛋白作為肌動蛋白解聚的調節劑[23]，其活性主要通過磷酸化/去磷酸化來調節。絲切蛋白通過LIM激酶磷酸化和失活，通過磷酸酶SSH-1L去磷酸化而復活[24]。Nox1通過氧化14-3-3蛋白生成ROS，進而釋放磷酸酶SSH-1L激活絲切蛋白，從而調控遷移細胞的細胞骨架重構[25, 26]。除此之外，VSMC胞內產生的ROS能夠通過鈣離子的內流增加細胞鈣離子的動員，增強其收縮能力[27]。
5 結語
近年來，ROS被越來越廣泛地認為是多種正常生理過程或者病理狀態下關鍵的調節劑。創口的愈合過程涉及血管新生，越來越多的研究發現ROS對于創口血管的新生過程是不可或缺的，這一血管新生過程包括EPC的動員和分化，EC和VSMC的遷移、增殖以及分化。在本文中，我們從ROS的來源與Nox家族，ROS與EPC、EC、VSMC等方面討論了ROS對于創口血管新生過程的影響。盡管如此，當前還有許多關于ROS的信號調節問題以及病理生理功能問題亟待解決，尤其是如何避免細胞內ROS過多蓄積從而造成氧化應激損害。因此，更好地了解ROS在不同病理或生理狀態下如何影響血管系統[28]，特別是對血管新生過程中所涉及細胞的調控機制有何影響，有助于我們尋找新的治療途徑以調控創口愈合的血管新生過程。