丹參-降香藥對治療缺血性腦卒中（IS）療效比較顯著，研究丹參-降香藥對治療IS的作用機制是發現對IS有療效候選中藥（TCM）的有效途徑。傳統藥理學方法難以從系統角度全面分析丹參-降香治療IS的效應物質并解釋其作用機制。本研究基于藥物-靶點-癥候-疾病關聯網絡，利用復雜網絡理論進行系統的研究。在利用丹參、降香及IS的關聯信息構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡和“藥對-藥效成分-靶點-IS”網絡的基礎上，分析不同網絡拓撲特征并基于多個中心性指標識別出降香中的福諾尼汀以及丹參中的隱丹參酮和丹參酮IIA為藥效成分；前列腺素G/H合酶2、視黃酸受體RXR-α、鈉通道蛋白5型亞基α、前列腺素G/H合酶1和β-2腎上腺素能受體為核心靶蛋白。進一步，提出一種基于TCM癥候篩選IS候選藥物的方法，利用“藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡發現關鍵TCM癥候和癥候群。結果表明，蒲黃、三棱和澤蘭3味中藥可能是對IS具有潛在治療作用的候選中藥，為治療IS的藥物開發提供了理論參考。
引用本文： 高家璇, 丁彥蕊. 基于藥物-靶點-疾病關聯網絡的丹參-降香藥對治療缺血性腦卒中的作用機制探究及候選中藥識別. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(4): 762-769. doi: 10.7507/1001-5515.202303005 復制
0 引言
在全球范圍內，特別是發達國家中，腦血管疾病已經是僅次于心臟病和癌癥的導致人類死亡的第三大原因[1]，也是成人永久性殘疾的常見原因之一。其中，缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）的發病率高達80%，它是一種由于腦動脈堵塞導致腦組織短時間內失去氧氣、葡萄糖，進而導致腦損傷的腦血管疾病[2]。IS的發病機制十分復雜，主要涉及能量異常、神經損傷、鈣離子超載及炎癥反應[3-4]等，臨床多通過早期注射溶栓藥物恢復腦部血流達到治療效果，但目前被用于急性IS溶栓治療的藥物十分有限。
多年來，中醫累積了大量關于天然產物及其用于治療的臨床信息，這對疾病臨床診斷及治療至關重要[5]，也為從中藥（traditional Chinese medicine，TCM）中分離和開發新藥提供了有前途的策略。研究表明，丹參有抗血栓、抗動脈粥樣硬化和抗炎等作用[6]，降香有抑制血小板聚集、調控能量代謝等作用[7]，二藥配伍有行氣活血、祛瘀通絡、止血降逆等功效[8]，且在臨床上對IS具有較好的療效。Zheng的團隊[9-10]發現，與降香聯合使用后的丹參能提高生物利用度，二者存在協同作用。李斐等[11-12]發現丹參、降香的代表劑型香丹注射液能夠對腦缺血再灌注損傷起到保護作用，且進一步解釋了對這一過程中細胞凋亡的影響。
以往的研究從藥效學、代謝組學等方面研究了二藥配伍抗腦缺血、保護再灌注損傷等作用。由于藥物代謝及功效發揮涉及到整個生理過程，因此，從系統水平綜合性地研究丹參-降香藥對治療腦缺血損傷的作用機制是十分必要的，也為發現對IS有療效的候選中藥提供了有效途徑。中醫提供了大量天然產物及其用于治療的臨床癥候的信息，這些信息是可觀察到的疾病表型，對臨床診斷和治療至關重要。因此，研究中醫癥候及其與TCM和疾病的關系可提供候選線索和篩選方向。
本研究在網絡藥理學的基礎上利用丹參-降香及IS的關聯信息構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡和“藥對-藥效成分-靶點-IS”網絡，通過網絡拓撲分析識別出核心藥效成分及核心靶點。進一步提出了一種基于TCM癥候篩選IS候選藥物的方法，利用“藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡發現關鍵TCM癥候和癥候群并篩選出潛在的IS中藥。
1 材料與方法
1.1 數據集構建
1.1.1 丹參、降香藥效成分數據集構建
利用TCMSP[13]數據庫分別收集到202種丹參的化學成分和98種降香的化學成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）≥?0.3為標準對成分進行篩選，篩選后最終確定45種丹參的藥效成分和27種降香的藥效成分，得到72條“藥對-藥效成分”關聯信息。
1.1.2 靶點數據集構建
通過檢索TCMSP和PubChem[14]數據庫，收集藥效成分潛在的作用靶點。對作用靶點進行預處理，將之統一映射為UniProt[15]數據庫中的Entry ID，只保留物種為智人（homo sapiens）且經過驗證（reviewed）的靶蛋白。最終獲得藥效成分的176個相關靶點，其中兩味中藥公共的相關靶點有65個，進一步分析藥物成分與靶點的關系，確定1 233條“藥效成分-靶點”關聯信息。
檢索TCMSP、GeneCards[16]、OMIM[17]、TTD[18]和CTD數據庫，收集與IS相關的潛在治療靶點，靶點預處理方法同中藥成分潛在作用靶點。最終得到3 122個IS的潛在治療靶點，即3 122條“靶點-IS”關聯信息。
整合“藥效成分-靶點”關聯信息和“靶點-IS”關聯信息，篩選藥效成分潛在作用靶點與IS潛在治療靶點的公共靶點，共獲得128個公共靶蛋白，分布如附件1所示。對于公共靶蛋白，從STRING[19]數據庫獲得它們之間的相互作用關系，共發現371個公共靶蛋白之間的相互作用，稱為“靶點-靶點”關聯信息。同時，考慮STRING數據庫中與128個公共靶蛋白存在相互作用的其他蛋白質，發現了1 015條蛋白質-蛋白質相互作用，稱為“蛋白質-蛋白質”關聯信息。
1.1.3 癥候數據集構建
利用Symmap[20]數據庫，收集與兩味中藥和IS相關的TCM癥候（TCM symptom）以及癥候群（symptoms property；syndrome）的關聯信息，包括：① 丹參、降香的相關TCM癥候；② TCM癥候對應的癥候群；③ IS在中醫中的對應TCM癥候——中風的相關癥候群。共收集到3類關聯信息：116個丹參的相關TCM癥候和46個降香的相關TCM癥候，即162條“藥對-TCM癥候”關聯信息；133條“TCM癥候-癥候群”關聯信息；8條“癥候群-中風”關聯信息。
將丹參、降香和中風的公共癥候群作為關鍵癥候群，對應的TCM癥候作為關鍵TCM癥候，分別收集與關鍵TCM癥候和關鍵癥候群相關的中藥。
1.2 網絡構建
1.2.1 蛋白質相互作用網絡構建
以公共靶蛋白以及相關蛋白質作為節點，所有“蛋白質-蛋白質”關聯信息作為邊構建PPI網絡。
1.2.2 “藥對-藥效成分-靶點-IS”網絡構建
分別以丹參和降香、藥效成分、靶點和IS作為節點，“藥對-藥效成分”、“藥效成分-靶點”、“靶點-靶點”和“靶點-IS”4類關聯信息作為邊構建“藥對-藥效成分-靶點-IS”多層網絡。
1.2.3 “藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡構建
分別以丹參和降香、TCM癥候、癥候群和中風作為節點，“藥對-TCM 癥候”、“TCM癥候-癥候群”及“癥候群-中風”3類關聯信息作為邊構建“藥對-TCM癥候-癥候群-中風”多層網絡。
1.3 網絡拓撲屬性
1.3.1 度
度（degree，D）表示的是與給定節點n存在直接關聯的節點數，度值越大表示直接關聯的節點數量越多，則可認為節點n在藥對丹參-降香治療IS過程中發揮了更重要的作用。
1.3.2 介數中心性
介數中心性（betweenness centrality，BC）在計算時考慮節點s經過節點n關聯到節點t的最短路徑條數，另外它還與s關聯到t的最短路徑總數有關。BC值越高則表示該節點對于維持網絡的聯通性越重要。
 |
其中，N表示網絡中節點總數目，
表示從節點s關聯到節點t的最短路徑的數量，
表示節點s通過節點n與節點t產生關聯的最短路徑的數量。
1.3.3 接近中心性
節點n的接近中心性（closeness centrality，CC）是通過計算節點n與所有其他節點之間的最短路徑得到的。CC體現的是更易或更難關聯到節點的平均趨勢，而不是關于具體節點對的性質的信息。因此，得分越高表明所有其他節點通過較少的節點即可關聯到該節點，即該節點具有積極意義。
 |
其中
表示節點
關聯到其他節點的最短路徑的長度。
1.3.4 特征向量中心性
特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）可以看作一種加權度，不僅與直接關聯的節點個數有關，而且受到直接關聯節點重要性的影響。
 |
其中，
為比例常數，
表示在前一次迭代中節點
的重要性，
經過多次迭代趨于穩定值。
1.3.5 平均最短路徑長度
這里，平均最短路徑長度（average shortest path length，AL）指的是節點關聯到網絡中另一節點的所有最短路徑數量除以節點對數量的值，AL值越小表明節點越靠近網絡中心。
 |
其中
表示節點n關聯到節點m的最短路徑長度。
2 結果
2.1 PPI網絡
蛋白質相互作用網絡是一個包含227個節點、1 015條邊的無向無權網絡，如圖1所示。
圖1
PPI網絡
Figure1.
PPI network
計算網絡中各個節點的拓撲屬性來衡量治療過程中蛋白質的重要性，識別關鍵蛋白質。以D、BC、CC、EC大于平均值以及AL小于平均值作為標準對蛋白質進行篩選，篩選結果作為關鍵靶點蛋白質。經篩選識別出25個關鍵靶蛋白，其中20個屬于藥物和疾病的公共靶蛋白，如附件2所示。另外5個靶點蛋白質分別是細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2，P24941）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B（CDKN1B，P46527）、CREB結合蛋白（CREBBP，Q92793）、組蛋白乙酰轉移酶p300（EP300，Q09472）和核因子NF-κ-B p105亞基（NFKB1，P19838）。
2.2 GO分析與KEGG分析
利用DAVID數據庫[21]對關鍵靶蛋白進行GO生物功能注釋富集分析和KEGG通路分析，依據P值對生物功能和通路進行篩選。在這里，重點關注P值最小前10的GO生物功能和前20的KEGG通路。
2.2.1 GO分析
GO生物學功能注釋主要包括三類：① 250個生物學過程（biological process，GO_BP）；② 23種細胞組分（cellular component，GO_CC）；③ 54個分子功能（molecular function，GO_MF）。當P值 < 0.05時認為該條注釋具有統計學意義，篩選結果表明關鍵靶蛋白與包括核漿、細胞溶質和轉錄因子復合物等17種細胞組分相關；藥對丹參-降香通過影響基因表達的正向調控、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調節、DNA誘導的轉錄的正向調節及細胞對活性氧的反應等207種生物學過程發揮IS的療效；關鍵靶蛋白關系到酶結合、轉錄因子結合和相同的蛋白質結合等48種分子功能，值得注意的是蛋白質結合（protein binding）這一分子功能的P值排名并不在前10，但這一分子功能與20個關鍵靶蛋白均相關。各類GO生物學功能排名前10的條目如圖2所示。
圖2
排名前10的GO生物學功能注釋
Figure2.
Top10 of GO functional enrichment result
2.2.2 KEGG分析
與關鍵靶蛋白相關的生物通路有139條，其中P值 < 0.05的通路有132條，認為具有統計學意義。篩選結果表明藥對丹參-降香通過調控多個基因，參與包括癌癥通路、脂質和動脈粥樣硬化通路在內的多條通路的調節，排名前20的通路如圖3所示。
圖3
排名前20的KEGG通路
Figure3.
Top20 of KEGG enrichment result
2.3 “藥對-藥效成分-靶點-IS”網絡
“藥對-藥效成分-靶點-IS”網絡是一個包含3 245個節點、4 797條邊的多層網絡，計算網絡中“藥效成分”和“靶點”兩類節點的拓撲屬性來識別核心藥效成分以及核心靶點。以D、BC、CC和EC大于平均值以及AL小于平均值作為標準對“藥效成分”和“靶點”進行篩選。綜合各項中心性指標排名，識別出3個核心藥效成分，分別是來源于降香的MOL000392（福諾尼汀）以及來源于丹參的MOL007088（隱丹參酮）和MOL007154（丹參酮IIA），如表1所示。5個核心靶蛋白分別是P35354（前列腺素G/H合酶2）、P19793（視黃酸受體RXR-α）、Q14524（鈉通道蛋白5型亞基α）、P23219（前列腺素G/H合酶1）和P07550（β-2腎上腺素能受體），如表2所示。
表1
核心藥效成分信息
Table1.
Information of core pharmacodynamic ingredient
表2
核心靶蛋白信息
Table2.
Information of core target
2.4 分子對接驗證
對識別出的5個核心靶蛋白和3個核心藥效成分進行分子對接驗證，結果如表3所示。結合能越低，對接結果越穩定，表明分子之間越傾向于發生相互作用。結果表明核心藥效成分與核心靶蛋白之間均存在較強的結合活性，部分分子對接結果如圖4所示。
表3
核心藥效成分和核心靶蛋白對接結果
Table3.
Core pharmacodynamic ingredient docking results with the core target
圖4
分子對接結果
Figure4.
Result of molecular docking
2.5 “藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡
“藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡是一個包含207個節點、303條邊的多層網絡，其中癥狀群中有2個為藥對和疾病的公共癥候群，如圖5所示。
圖5
關于丹參-降香的“藥對-TCM癥候-癥候屬性-中風”網絡
Figure5.
“TCM pair-TCM symptom-symptom property-IS” network of Danshen-Jiangxiang
網絡中發現瘀血和血瘀為2個關鍵癥候群，相關關鍵TCM癥候共14個，另外收集到117味與關鍵TCM癥候相關的中藥及49味與關鍵癥候群相關的中藥。統計關鍵TCM癥候相關中藥出現的頻率，將出現概率大于等于丹參或降香的中藥與關鍵癥候群相關中藥進行對比，發現其中9味中藥為公共中藥，各中藥出現頻率分別為：赤芍、川芎、麝香，6次；蒲黃、益母草、郁金，5次；牛膝、三棱、澤蘭，4次。
3 討論
3.1 PPI網絡分析
25個關鍵靶點蛋白質中，20個屬于藥物和疾病的公共靶點蛋白質。BC、CC和AL排名第一的靶點蛋白質是RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，表明它在網絡中發揮了關鍵的媒介作用，研究表明RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶參與調節血管生成等多種生物過程，目前已經在心血管和神經系統疾病研究方面受到廣泛關注[22]。D和EC排名第一靶點的蛋白質是轉錄因子JUN，這意味著轉錄因子JUN與多個丹參-降香藥對治療IS的相關蛋白質存在相互作用，但目前還缺乏直接關聯的證據。此外，20個公共關鍵靶點蛋白質中可以發現存在兩類蛋白質，一類為半胱天冬酶，包括P42574和Q14790，研究表明它們是參與細胞凋亡執行階段的主要效應物，利于維持炎癥反應穩態[23-24]；另一類是絲裂原活化蛋白激酶，包括P28482、P27361、P45983和Q16539，它們參與MAP激酶信號的轉導過程，有促進炎細胞因子或導致轉錄因子直接激活的物理壓力等作用[25]。這充分顯示了關鍵靶點蛋白質與腦缺血損傷機制涉及的生物過程密切相關。另外5個靶點蛋白質與中藥成分或疾病之間不存在直接關聯，但其中NF-kappa-B蛋白質是一種多效性轉錄因子，與炎癥、細胞生長等生物過程相關且影響MAPK的信號傳導[26]。本研究認為這些靶點間接參與丹參-降香治療IS的過程，是潛在的疾病治療靶點，對后續的研究有啟發意義。
通過對關鍵靶蛋白進行GO生物學功能注釋和KEGG通路富集分析，發現丹參-降香藥對治療IS的過程通過多種細胞組分調節相關分子功能，涉及腦缺血后相關的炎癥反應、動脈粥樣硬化和細胞增殖與凋亡在內的200余條通路，進一步體現了藥對通過多靶點、多通路參與IS治療的過程。
3.2 “藥對-藥效成分-靶點-IS”網絡分析
基于“藥對-藥效成分-靶點-IS”多層網絡，得到了5個核心靶點蛋白質，分別是前列腺素G/H合酶2、視黃酸受體RXR-α、鈉通道蛋白5型亞基α、前列腺素G/H合酶1和β-2腎上腺素能受體；還有3個核心藥效成分，分別是降香中的成分福諾尼汀以及丹參中的成分丹參酮IIA和隱丹參酮。其中，兩種前列腺素G/H合酶可以起到調節炎癥反應的作用[27]；鈉通道蛋白5型亞基α通過影響鈉離子的滲透性調節興奮膜的電壓[28]；視黃酸受體RXR-α通過正向調節microRNA-10a表達從而影響血管內皮細胞中脈動剪切應力的反應[29]。以上靶點蛋白質的功能可影響腦缺血損傷機制涉及的炎癥反應、鈣離子超載等，均體現出明顯的調節腦缺血損傷相關生物過程的功效。β-2腎上腺素能受體主要功能是通過G蛋白的作用介導兒茶酚胺誘導的腺苷酸環化酶的活化[30]，目前沒有明確證據表明它參與到腦缺血損傷的相關過程，本研究為進一步的研究提供了線索。研究表明，核心藥效成分福諾尼汀可以抑制細胞凋亡，起到神經保護的作用[31]；丹參酮IIA和隱丹參酮可以降低腦梗死體積和神經功能缺損評分，有抗炎、鎮痛和血小板抑制等作用[32]。
經分子對接，發現核心藥效成分和核心靶點均有較高的結合能，驗證了核心靶點蛋白質和核心藥效成分之間存在較好的結合活性，也進一步說明了多個核心藥效成分可以與多個靶點結合，藥對丹參-降香是通過多個成分作用于多個靶點發揮治療作用。
3.3 “藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡分析
上述研究均為基于內部分子機制的研究，而“藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡為外部癥狀研究提供了線索。通過癥候相關網絡研究發現，IS在中醫中所對應的中風是TCM癥候中的一種，數據庫中沒有證據表明它與丹參和降香存在直接關聯，但藥物與疾病存在相關的公共癥候群。通過關鍵TCM癥候和關鍵癥候群識別到赤芍、川芎等在內的9味中藥。
研究表明，赤芍、川芎、麝香、益母草和牛膝與IS相關機制密切相關，具有治療效果；郁金則是一味用于IS后遺癥治療的較佳藥用選擇[33]。此外，蒲黃、三棱、澤蘭這3味與IS治療的相關研究較少，本研究結果提示它們可能對IS的治療具有潛在作用，可作為后續研究的候選中藥。
4 結論
本研究基于復雜網絡理論分析藥效物質、作用靶點之間的關系和所涉及的通路，探索了藥對丹參-降香對于缺血性腦卒中的治療機制。與“一種藥物，一個靶點，一種疾病”的單一治療理念不同的是，藥對丹參-降香中包含多種藥效成分，多種成分之間通過相互促進或者相互拮抗的作用，作用于一個或多個靶點，通過調節多個生物學過程或多條信號通路發揮作用，突出了復方中藥特有的“多成分、多靶點、多通路”治療理念的優勢。進一步地，本研究提出了一種利用TCM癥候相關信息構建網絡并進行統計分析的方法，識別出了對IS具有潛在作用的中藥。通過網絡分析識別出的關鍵藥效成分、關鍵靶點和候選中藥為IS的新藥研究提供了方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：丁彥蕊和高家璇進行實驗設計；高家璇進行數據收集；丁彥蕊和高家璇共同進行數據分析和論文寫作。
本文附件見本刊網站的電子版本（biomedeng.cn）。
0 引言
在全球范圍內，特別是發達國家中，腦血管疾病已經是僅次于心臟病和癌癥的導致人類死亡的第三大原因[1]，也是成人永久性殘疾的常見原因之一。其中，缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）的發病率高達80%，它是一種由于腦動脈堵塞導致腦組織短時間內失去氧氣、葡萄糖，進而導致腦損傷的腦血管疾病[2]。IS的發病機制十分復雜，主要涉及能量異常、神經損傷、鈣離子超載及炎癥反應[3-4]等，臨床多通過早期注射溶栓藥物恢復腦部血流達到治療效果，但目前被用于急性IS溶栓治療的藥物十分有限。
多年來，中醫累積了大量關于天然產物及其用于治療的臨床信息，這對疾病臨床診斷及治療至關重要[5]，也為從中藥（traditional Chinese medicine，TCM）中分離和開發新藥提供了有前途的策略。研究表明，丹參有抗血栓、抗動脈粥樣硬化和抗炎等作用[6]，降香有抑制血小板聚集、調控能量代謝等作用[7]，二藥配伍有行氣活血、祛瘀通絡、止血降逆等功效[8]，且在臨床上對IS具有較好的療效。Zheng的團隊[9-10]發現，與降香聯合使用后的丹參能提高生物利用度，二者存在協同作用。李斐等[11-12]發現丹參、降香的代表劑型香丹注射液能夠對腦缺血再灌注損傷起到保護作用，且進一步解釋了對這一過程中細胞凋亡的影響。
以往的研究從藥效學、代謝組學等方面研究了二藥配伍抗腦缺血、保護再灌注損傷等作用。由于藥物代謝及功效發揮涉及到整個生理過程，因此，從系統水平綜合性地研究丹參-降香藥對治療腦缺血損傷的作用機制是十分必要的，也為發現對IS有療效的候選中藥提供了有效途徑。中醫提供了大量天然產物及其用于治療的臨床癥候的信息，這些信息是可觀察到的疾病表型，對臨床診斷和治療至關重要。因此，研究中醫癥候及其與TCM和疾病的關系可提供候選線索和篩選方向。
本研究在網絡藥理學的基礎上利用丹參-降香及IS的關聯信息構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡和“藥對-藥效成分-靶點-IS”網絡，通過網絡拓撲分析識別出核心藥效成分及核心靶點。進一步提出了一種基于TCM癥候篩選IS候選藥物的方法，利用“藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡發現關鍵TCM癥候和癥候群并篩選出潛在的IS中藥。
1 材料與方法
1.1 數據集構建
1.1.1 丹參、降香藥效成分數據集構建
利用TCMSP[13]數據庫分別收集到202種丹參的化學成分和98種降香的化學成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）≥?0.3為標準對成分進行篩選，篩選后最終確定45種丹參的藥效成分和27種降香的藥效成分，得到72條“藥對-藥效成分”關聯信息。
1.1.2 靶點數據集構建
通過檢索TCMSP和PubChem[14]數據庫，收集藥效成分潛在的作用靶點。對作用靶點進行預處理，將之統一映射為UniProt[15]數據庫中的Entry ID，只保留物種為智人（homo sapiens）且經過驗證（reviewed）的靶蛋白。最終獲得藥效成分的176個相關靶點，其中兩味中藥公共的相關靶點有65個，進一步分析藥物成分與靶點的關系，確定1 233條“藥效成分-靶點”關聯信息。
檢索TCMSP、GeneCards[16]、OMIM[17]、TTD[18]和CTD數據庫，收集與IS相關的潛在治療靶點，靶點預處理方法同中藥成分潛在作用靶點。最終得到3 122個IS的潛在治療靶點，即3 122條“靶點-IS”關聯信息。
整合“藥效成分-靶點”關聯信息和“靶點-IS”關聯信息，篩選藥效成分潛在作用靶點與IS潛在治療靶點的公共靶點，共獲得128個公共靶蛋白，分布如附件1所示。對于公共靶蛋白，從STRING[19]數據庫獲得它們之間的相互作用關系，共發現371個公共靶蛋白之間的相互作用，稱為“靶點-靶點”關聯信息。同時，考慮STRING數據庫中與128個公共靶蛋白存在相互作用的其他蛋白質，發現了1 015條蛋白質-蛋白質相互作用，稱為“蛋白質-蛋白質”關聯信息。
1.1.3 癥候數據集構建
利用Symmap[20]數據庫，收集與兩味中藥和IS相關的TCM癥候（TCM symptom）以及癥候群（symptoms property；syndrome）的關聯信息，包括：① 丹參、降香的相關TCM癥候；② TCM癥候對應的癥候群；③ IS在中醫中的對應TCM癥候——中風的相關癥候群。共收集到3類關聯信息：116個丹參的相關TCM癥候和46個降香的相關TCM癥候，即162條“藥對-TCM癥候”關聯信息；133條“TCM癥候-癥候群”關聯信息；8條“癥候群-中風”關聯信息。
將丹參、降香和中風的公共癥候群作為關鍵癥候群，對應的TCM癥候作為關鍵TCM癥候，分別收集與關鍵TCM癥候和關鍵癥候群相關的中藥。
1.2 網絡構建
1.2.1 蛋白質相互作用網絡構建
以公共靶蛋白以及相關蛋白質作為節點，所有“蛋白質-蛋白質”關聯信息作為邊構建PPI網絡。
1.2.2 “藥對-藥效成分-靶點-IS”網絡構建
分別以丹參和降香、藥效成分、靶點和IS作為節點，“藥對-藥效成分”、“藥效成分-靶點”、“靶點-靶點”和“靶點-IS”4類關聯信息作為邊構建“藥對-藥效成分-靶點-IS”多層網絡。
1.2.3 “藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡構建
分別以丹參和降香、TCM癥候、癥候群和中風作為節點，“藥對-TCM 癥候”、“TCM癥候-癥候群”及“癥候群-中風”3類關聯信息作為邊構建“藥對-TCM癥候-癥候群-中風”多層網絡。
1.3 網絡拓撲屬性
1.3.1 度
度（degree，D）表示的是與給定節點n存在直接關聯的節點數，度值越大表示直接關聯的節點數量越多，則可認為節點n在藥對丹參-降香治療IS過程中發揮了更重要的作用。
1.3.2 介數中心性
介數中心性（betweenness centrality，BC）在計算時考慮節點s經過節點n關聯到節點t的最短路徑條數，另外它還與s關聯到t的最短路徑總數有關。BC值越高則表示該節點對于維持網絡的聯通性越重要。
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其中，N表示網絡中節點總數目，表示從節點s關聯到節點t的最短路徑的數量，表示節點s通過節點n與節點t產生關聯的最短路徑的數量。
1.3.3 接近中心性
節點n的接近中心性（closeness centrality，CC）是通過計算節點n與所有其他節點之間的最短路徑得到的。CC體現的是更易或更難關聯到節點的平均趨勢，而不是關于具體節點對的性質的信息。因此，得分越高表明所有其他節點通過較少的節點即可關聯到該節點，即該節點具有積極意義。
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其中表示節點關聯到其他節點的最短路徑的長度。
1.3.4 特征向量中心性
特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）可以看作一種加權度，不僅與直接關聯的節點個數有關，而且受到直接關聯節點重要性的影響。
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其中，為比例常數，表示在前一次迭代中節點的重要性，經過多次迭代趨于穩定值。
1.3.5 平均最短路徑長度
這里，平均最短路徑長度（average shortest path length，AL）指的是節點關聯到網絡中另一節點的所有最短路徑數量除以節點對數量的值，AL值越小表明節點越靠近網絡中心。
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其中表示節點n關聯到節點m的最短路徑長度。
2 結果
2.1 PPI網絡
蛋白質相互作用網絡是一個包含227個節點、1 015條邊的無向無權網絡，如圖1所示。
圖1
PPI網絡
Figure1.
PPI network
計算網絡中各個節點的拓撲屬性來衡量治療過程中蛋白質的重要性，識別關鍵蛋白質。以D、BC、CC、EC大于平均值以及AL小于平均值作為標準對蛋白質進行篩選，篩選結果作為關鍵靶點蛋白質。經篩選識別出25個關鍵靶蛋白，其中20個屬于藥物和疾病的公共靶蛋白，如附件2所示。另外5個靶點蛋白質分別是細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2，P24941）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B（CDKN1B，P46527）、CREB結合蛋白（CREBBP，Q92793）、組蛋白乙酰轉移酶p300（EP300，Q09472）和核因子NF-κ-B p105亞基（NFKB1，P19838）。
2.2 GO分析與KEGG分析
利用DAVID數據庫[21]對關鍵靶蛋白進行GO生物功能注釋富集分析和KEGG通路分析，依據P值對生物功能和通路進行篩選。在這里，重點關注P值最小前10的GO生物功能和前20的KEGG通路。
2.2.1 GO分析
GO生物學功能注釋主要包括三類：① 250個生物學過程（biological process，GO_BP）；② 23種細胞組分（cellular component，GO_CC）；③ 54個分子功能（molecular function，GO_MF）。當P值 < 0.05時認為該條注釋具有統計學意義，篩選結果表明關鍵靶蛋白與包括核漿、細胞溶質和轉錄因子復合物等17種細胞組分相關；藥對丹參-降香通過影響基因表達的正向調控、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調節、DNA誘導的轉錄的正向調節及細胞對活性氧的反應等207種生物學過程發揮IS的療效；關鍵靶蛋白關系到酶結合、轉錄因子結合和相同的蛋白質結合等48種分子功能，值得注意的是蛋白質結合（protein binding）這一分子功能的P值排名并不在前10，但這一分子功能與20個關鍵靶蛋白均相關。各類GO生物學功能排名前10的條目如圖2所示。
圖2
排名前10的GO生物學功能注釋
Figure2.
Top10 of GO functional enrichment result
2.2.2 KEGG分析
與關鍵靶蛋白相關的生物通路有139條，其中P值 < 0.05的通路有132條，認為具有統計學意義。篩選結果表明藥對丹參-降香通過調控多個基因，參與包括癌癥通路、脂質和動脈粥樣硬化通路在內的多條通路的調節，排名前20的通路如圖3所示。
圖3
排名前20的KEGG通路
Figure3.
Top20 of KEGG enrichment result
2.3 “藥對-藥效成分-靶點-IS”網絡
“藥對-藥效成分-靶點-IS”網絡是一個包含3 245個節點、4 797條邊的多層網絡，計算網絡中“藥效成分”和“靶點”兩類節點的拓撲屬性來識別核心藥效成分以及核心靶點。以D、BC、CC和EC大于平均值以及AL小于平均值作為標準對“藥效成分”和“靶點”進行篩選。綜合各項中心性指標排名，識別出3個核心藥效成分，分別是來源于降香的MOL000392（福諾尼汀）以及來源于丹參的MOL007088（隱丹參酮）和MOL007154（丹參酮IIA），如表1所示。5個核心靶蛋白分別是P35354（前列腺素G/H合酶2）、P19793（視黃酸受體RXR-α）、Q14524（鈉通道蛋白5型亞基α）、P23219（前列腺素G/H合酶1）和P07550（β-2腎上腺素能受體），如表2所示。
表1
核心藥效成分信息
Table1.
Information of core pharmacodynamic ingredient
表2
核心靶蛋白信息
Table2.
Information of core target
2.4 分子對接驗證
對識別出的5個核心靶蛋白和3個核心藥效成分進行分子對接驗證，結果如表3所示。結合能越低，對接結果越穩定，表明分子之間越傾向于發生相互作用。結果表明核心藥效成分與核心靶蛋白之間均存在較強的結合活性，部分分子對接結果如圖4所示。
表3
核心藥效成分和核心靶蛋白對接結果
Table3.
Core pharmacodynamic ingredient docking results with the core target
圖4
分子對接結果
Figure4.
Result of molecular docking
2.5 “藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡
“藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡是一個包含207個節點、303條邊的多層網絡，其中癥狀群中有2個為藥對和疾病的公共癥候群，如圖5所示。
圖5
關于丹參-降香的“藥對-TCM癥候-癥候屬性-中風”網絡
Figure5.
“TCM pair-TCM symptom-symptom property-IS” network of Danshen-Jiangxiang
網絡中發現瘀血和血瘀為2個關鍵癥候群，相關關鍵TCM癥候共14個，另外收集到117味與關鍵TCM癥候相關的中藥及49味與關鍵癥候群相關的中藥。統計關鍵TCM癥候相關中藥出現的頻率，將出現概率大于等于丹參或降香的中藥與關鍵癥候群相關中藥進行對比，發現其中9味中藥為公共中藥，各中藥出現頻率分別為：赤芍、川芎、麝香，6次；蒲黃、益母草、郁金，5次；牛膝、三棱、澤蘭，4次。
3 討論
3.1 PPI網絡分析
25個關鍵靶點蛋白質中，20個屬于藥物和疾病的公共靶點蛋白質。BC、CC和AL排名第一的靶點蛋白質是RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，表明它在網絡中發揮了關鍵的媒介作用，研究表明RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶參與調節血管生成等多種生物過程，目前已經在心血管和神經系統疾病研究方面受到廣泛關注[22]。D和EC排名第一靶點的蛋白質是轉錄因子JUN，這意味著轉錄因子JUN與多個丹參-降香藥對治療IS的相關蛋白質存在相互作用，但目前還缺乏直接關聯的證據。此外，20個公共關鍵靶點蛋白質中可以發現存在兩類蛋白質，一類為半胱天冬酶，包括P42574和Q14790，研究表明它們是參與細胞凋亡執行階段的主要效應物，利于維持炎癥反應穩態[23-24]；另一類是絲裂原活化蛋白激酶，包括P28482、P27361、P45983和Q16539，它們參與MAP激酶信號的轉導過程，有促進炎細胞因子或導致轉錄因子直接激活的物理壓力等作用[25]。這充分顯示了關鍵靶點蛋白質與腦缺血損傷機制涉及的生物過程密切相關。另外5個靶點蛋白質與中藥成分或疾病之間不存在直接關聯，但其中NF-kappa-B蛋白質是一種多效性轉錄因子，與炎癥、細胞生長等生物過程相關且影響MAPK的信號傳導[26]。本研究認為這些靶點間接參與丹參-降香治療IS的過程，是潛在的疾病治療靶點，對后續的研究有啟發意義。
通過對關鍵靶蛋白進行GO生物學功能注釋和KEGG通路富集分析，發現丹參-降香藥對治療IS的過程通過多種細胞組分調節相關分子功能，涉及腦缺血后相關的炎癥反應、動脈粥樣硬化和細胞增殖與凋亡在內的200余條通路，進一步體現了藥對通過多靶點、多通路參與IS治療的過程。
3.2 “藥對-藥效成分-靶點-IS”網絡分析
基于“藥對-藥效成分-靶點-IS”多層網絡，得到了5個核心靶點蛋白質，分別是前列腺素G/H合酶2、視黃酸受體RXR-α、鈉通道蛋白5型亞基α、前列腺素G/H合酶1和β-2腎上腺素能受體；還有3個核心藥效成分，分別是降香中的成分福諾尼汀以及丹參中的成分丹參酮IIA和隱丹參酮。其中，兩種前列腺素G/H合酶可以起到調節炎癥反應的作用[27]；鈉通道蛋白5型亞基α通過影響鈉離子的滲透性調節興奮膜的電壓[28]；視黃酸受體RXR-α通過正向調節microRNA-10a表達從而影響血管內皮細胞中脈動剪切應力的反應[29]。以上靶點蛋白質的功能可影響腦缺血損傷機制涉及的炎癥反應、鈣離子超載等，均體現出明顯的調節腦缺血損傷相關生物過程的功效。β-2腎上腺素能受體主要功能是通過G蛋白的作用介導兒茶酚胺誘導的腺苷酸環化酶的活化[30]，目前沒有明確證據表明它參與到腦缺血損傷的相關過程，本研究為進一步的研究提供了線索。研究表明，核心藥效成分福諾尼汀可以抑制細胞凋亡，起到神經保護的作用[31]；丹參酮IIA和隱丹參酮可以降低腦梗死體積和神經功能缺損評分，有抗炎、鎮痛和血小板抑制等作用[32]。
經分子對接，發現核心藥效成分和核心靶點均有較高的結合能，驗證了核心靶點蛋白質和核心藥效成分之間存在較好的結合活性，也進一步說明了多個核心藥效成分可以與多個靶點結合，藥對丹參-降香是通過多個成分作用于多個靶點發揮治療作用。
3.3 “藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡分析
上述研究均為基于內部分子機制的研究，而“藥對-TCM癥候-癥候群-中風”網絡為外部癥狀研究提供了線索。通過癥候相關網絡研究發現，IS在中醫中所對應的中風是TCM癥候中的一種，數據庫中沒有證據表明它與丹參和降香存在直接關聯，但藥物與疾病存在相關的公共癥候群。通過關鍵TCM癥候和關鍵癥候群識別到赤芍、川芎等在內的9味中藥。
研究表明，赤芍、川芎、麝香、益母草和牛膝與IS相關機制密切相關，具有治療效果；郁金則是一味用于IS后遺癥治療的較佳藥用選擇[33]。此外，蒲黃、三棱、澤蘭這3味與IS治療的相關研究較少，本研究結果提示它們可能對IS的治療具有潛在作用，可作為后續研究的候選中藥。
4 結論
本研究基于復雜網絡理論分析藥效物質、作用靶點之間的關系和所涉及的通路，探索了藥對丹參-降香對于缺血性腦卒中的治療機制。與“一種藥物，一個靶點，一種疾病”的單一治療理念不同的是，藥對丹參-降香中包含多種藥效成分，多種成分之間通過相互促進或者相互拮抗的作用，作用于一個或多個靶點，通過調節多個生物學過程或多條信號通路發揮作用，突出了復方中藥特有的“多成分、多靶點、多通路”治療理念的優勢。進一步地，本研究提出了一種利用TCM癥候相關信息構建網絡并進行統計分析的方法，識別出了對IS具有潛在作用的中藥。通過網絡分析識別出的關鍵藥效成分、關鍵靶點和候選中藥為IS的新藥研究提供了方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：丁彥蕊和高家璇進行實驗設計；高家璇進行數據收集；丁彥蕊和高家璇共同進行數據分析和論文寫作。
本文附件見本刊網站的電子版本（biomedeng.cn）。
