本研究旨在探究手性自組裝短肽R-LIFE-1對外泌體的包裹控釋作用。采用原子力顯微鏡、透射電鏡及冷凍掃描電鏡等觀察短肽R-LIFE-1的成膠能力及形態結構；采用光鏡觀察及熒光染色探究R-LIFE-1的生物相容性；采用超濾離心法提取外泌體并采用Western blot、納米粒徑追蹤分析（NTA）、透射電鏡檢測外泌體質量；采用激光共聚焦顯微鏡及BCA蛋白定量探究短肽水凝膠對外泌體的控釋效果。結果顯示手性自組裝短肽R-LIFE-1能夠在離子觸發下快速自組裝形成穩定的納米纖維網絡膜片狀結構，具有良好的生物相容性，能夠負載外泌體對它進行包裹控釋，提高外泌體的利用效率。本研究證明短肽R-LIFE-1可對外泌體進行控釋，是一種理想的組織工程材料。
引用本文： 羅欣怡, 蘇迪, 盧娜, 萬源, 劉桂岑, 羅忠禮. 新型手性自組裝短肽R-LIFE-1的理化性質及其對外泌體的控釋研究. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(4): 770-777. doi: 10.7507/1001-5515.202207056 復制
0 引言
外泌體作為一類具有雙層膜結構的細胞外微小囊泡[1]，直徑在30～150 nm，這種微小囊泡內含有各種細胞特異的蛋白、脂質、核酸，能夠作為信號分子傳遞給其他細胞[2]，在很多病理生理過程中發揮著重要作用[3–6]，包括免疫調節[7]、細胞生長和分化[8]、組織修復[9]等。近年來，越來越多的研究將外泌體應用于各類組織的修復，包括骨組織[10]、血管組織[11]、神經組織[9]、心肌組織[12]等，展現出了十分優秀的修復能力[13-14]，同時作為一種細胞替代療法，能夠減少干細胞修復產生的免疫、炎癥風險[15]。成纖維細胞是構成皮膚真皮層的主要細胞[16]，功能活動旺盛，具有明顯的蛋白質合成和分泌活動[17]。研究表明人真皮成纖維細胞（human dermal fibroblast，HDF）來源的外泌體在光老化[18]、糖尿病皮膚創傷[19]、缺血性創傷[20]等方面均有著優秀的修復能力。
手性自組裝短肽（chiral self-assembling peptide，CSAP）是一種高分子納米材料，能夠在離子觸發下自組裝形成有序的納米纖維支架[21]，形成含水量十分豐富的水凝膠支架，不僅具有良好的力學性能[22]，還具有很好的生物相容性[23]，因此自從Zhang等[24]合成這種納米材料以來，CSAP已被廣泛應用于各個領域，包括多種組織細胞和干細胞的三維培養、再生醫學和組織工程、3D組織打印、小分子和生長因子等的持續釋放[21, 25-26]。本課題組此前已經研究過CSAP在皮膚[27]、子宮[28]、心肌[29]、軟骨[30]等組織中的修復作用，在這些組織中CSAP均展現出了優越的修復能力。因此我們有理由認為新合成的包含十個氨基酸序列的手性自組裝短肽R-LIFE-1能夠形成納米三維網絡結構，并且具有控釋外泌體的作用。
本研究選用新型短肽R-LIFE-1作為研究主體，旨在觀察它在離子觸發下自組裝形成納米水凝膠的過程、形成后的納米膜片的宏觀及微觀結構，以及作為生物材料的生物相容性等方面的性能。其次，本課題希望結合目前廣泛應用于組織修復的外泌體，為外泌體提供納米支架載體，控制它的釋放，以期達到更穩定的體內濃度和更快速的修復速度。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑
短肽R-LIFE-1（純度>95%），其氨基酸序列為：Arg Leu Glu Cys Lys Ile Asp Phe Cys Glu，成都賽恩貝生物科技有限公司贈送。DMEM培養基購于美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶購于美國Hyclone公司；胎牛血清購于中國依科賽生物科技有限公司；BCA試劑盒、Calcein-AM/PI雙染試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；剛果紅、苯胺藍染液購于北京索萊寶科技有限公司；鼠抗人CD9、CD63抗體及羊抗鼠抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司；PVDF膜、超濾離心管、針頭過濾器購于美國Millipore公司；HDF購于武漢普諾賽生命科技有限公司。
1.1.2 主要儀器
CO2細胞培養箱、超凈工作臺、酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國），倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS公司，日本），透射電子顯微鏡（JEOL公司，日本），納米顆粒追蹤分析儀（Malvern公司，英國），原子力顯微鏡（布魯克公司，德國），冷凍掃描電鏡（日立公司，日本）。
1.2 方法
1.2.1 剛果紅、苯胺藍染色
用PBS將R-LIFE-1短肽母液稀釋至2.5 mg/mL，自組裝0、24、48 h；取10 μL稀釋后的短肽溶液滴加在載玻片上，分別取10 μL剛果紅和苯胺藍染色液滴加到短肽液滴上，染色30 s，將載玻片置于光學顯微鏡下觀察并拍照。
1.2.2 原子力顯微鏡
用PBS將短肽R-LIFE-1母液稀釋至5 mg/mL，放入4℃冰箱冷藏，待短肽自組裝24 h后進行原子力顯微鏡檢測；取15 μL短肽水凝膠滴加到新撕開的云母片表面上，靜置60 s后用ddH2O反復沖洗，用濾紙吸干云母片表面水分，自然晾干；上機檢測，選取合適位置及視野拍照。
1.2.3 透射電鏡
用PBS將短肽R-LIFE-1母液稀釋至2.5 mg/mL，放入4 ℃冰箱冷藏，待短肽自組裝24 h后進行透射電鏡檢測；超聲分散5 min，用移液器取10 μL短肽水凝膠滴加在銅網上，10 min后用濾紙吸走多余液體，待銅網自然晾干1 h；開機，調節參數至合適，選擇合適的視野及放大倍數并拍照。
1.2.4 短肽水凝膠三維培養HDF
根據實驗需求，每孔取3 000個處于對數生長期的HDF于離心管中，加入100 μL/孔的完全培養基，吹打混合均勻，制成分散均勻的細胞懸液；每孔取100 μL細胞懸液，接種于96孔板中，再在每個孔內加入25 μL的PBS，為后續短肽成膠提供離子；每孔添加25 μL短肽母液，添加進去后立即吹打混勻，使細胞包裹進短肽水凝膠中，置于細胞培養箱中培養；24 h后，記為鋪板第一天。
1.2.5 HDF三維培養的Live/Dead染色
鋪板方法同上，HDF在細胞培養箱（37 ℃，5% CO2）分別培養3、5、7天后取出進行染色；吸出舊培養基后PBS清洗2次，多聚甲醛（20 μL/孔）固定細胞約10 min，PBS清洗2次；按每個復孔加入100 μL現配制的Calcein-AM/PI熒光染色液，加入PBS緩沖液清洗，熒光顯微鏡采圖。
1.2.6 外泌體的提取
選取處于生長對數期的HDF，接種于T75細胞培養瓶內，觀察細胞生長到70%左右時，PBS清洗三遍，更換為不含FBS的高糖DMEM培養基，培養72 h；收集HDF培養72 h后的上清液，3 000 g離心20 min，收集上清液并用0.22 μm針頭過濾器過濾一遍，將過濾后的上清液轉移到超濾離心管內，3 000 g離心20 min；將超濾離心管上層內剩余的液體轉移到EP管內，即為提取純化后的外泌體，短期內儲存于?80 ℃。
1.2.7 透射電鏡鑒定外泌體形態
將新鮮提取的HDF來源外泌體（HDF-Exo）用PBS稀釋十倍；用移液器取10 μL樣品滴加在銅網上，10 min后用濾紙吸走多余液體；用移液器吸取10 μL的3%磷鎢酸滴在銅網上，3 min后用濾紙吸走多余液體；干燥，靜置1 h，待銅網自然晾干；上機檢測，選擇合適視野拍照。
1.2.8 Western-blot鑒定外泌體標記性蛋白
將提取得到的外泌體裂解提取總蛋白，采用BCA蛋白定量法測定外泌體樣本的蛋白濃度，采用10% SDS-PAGE膠電泳分離，200 mA轉膜1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，PVDF膜正面朝上分別投入稀釋的CD61、CD9、Tsg101一抗，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯影。
1.2.9 NTA鑒定外泌體粒徑及濃度
提取新鮮HDF-Exo100 μL進行檢測；ddH2O清洗樣本池；校準儀器；PBS清洗樣本池HDF-Exo以PBS稀釋十倍后上機檢測。
1.2.10 短肽水凝膠對外泌體的控釋曲線
提取外泌體，并采用BCA蛋白測定法測定所提取外泌體的蛋白濃度；將50 μL外泌體懸液與50 μL PBS在孔內混勻，再添加50 μL短肽母液混勻，待短肽形成水凝膠后往孔內緩慢加入50 μL PBS，重復3個復孔；分別待12、24、48、72、96、144、192、240 h時吸取10 μL上層PBS采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，計算并繪制控釋曲線。
2 結果
2.1 手性自組裝短肽R-LIFE-1的物理性質分析
在離子的觸發下，液態的短肽母液在短時間的自組裝后形成了水凝膠形態，凝結在管底，倒置離心管后在重力的作用下水凝膠無法下流，初步證明它已經改變液體形態轉化為水凝膠形態。R-LIFE-1的結構模擬圖可揭示它由十個氨基酸序列構成，可在離子觸發下通過氫鍵、分子間作用力、交替的親疏水性及交替的正負電荷等作用力完成分子間的自組裝（見圖1a）。
圖1
手性自組裝短肽R-LIFE-1的物理性質
a. R-LIFE-1短肽自組裝形成水凝膠及R-LIFE-1結構模擬圖；b. 短肽R-LIFE-1成膠過程（剛果紅染色、苯胺藍染色，× 100）；c. 自組裝短肽R-LIFE-1的原子力顯微鏡圖
Figure1. Physical properties of self-assembling peptide R-LIFE-1a. R-LIFE-1 self-assembled hydrogel and structure simulation diagram of R-LIFE-1; b. R- LIFE-1 gelatinization process (Congo red staining, aniline blue staining, × 100); c. atomic force microscopy of self-assembling peptide R-LIFE-1
剛果紅染色結果（見圖1b）顯示：R-LIFE-1在0 h便可觀察到纖維膜片狀結構的出現；自組裝24 h后形成了大量且致密的纖維薄膜狀結構；自組裝48 h后纖維薄膜結構依然存在且完整，且有增多的趨勢，并且水凝膠所形成的結構更致密，邊界更清晰，苯胺藍染色結果進一步印證了剛果紅染色的結果。表明R-LIFE-1具有快速形成水凝膠的能力，同時成膠效果很好。
原子力顯微鏡結果（見圖1c）顯示，R-LIFE-1經過24 h自組裝后形成了納米纖維結構，這些納米纖維長度約為200 nm，直徑約為30 nm，且納米纖維之間相互交聯，形成了纖維網絡狀物理結構，纖維結構穩定，相互交織成網，形成大片的網狀膜片。表明短肽水凝膠膜片能夠為細胞的三維培養以及外泌體的包裹釋放提供穩固的空間支架與負載材料。
2.2 采用R-LIFE-1短肽水凝膠構建三維培養及其生物相容性研究
HDF細胞在二維培養的環境下表現為貼壁生長，培養3天后，可以觀察到視野下細胞全部長滿，細胞邊緣模糊，生長狀態較差，并產生部分凋亡細胞。HDF細胞在R-LIFE-1水凝膠基質中進行三維培養時，細胞表現為圓球形多層空間生長，培養3天時，R-LIFE-1水凝膠組可見細胞仍呈圓球形多層空間生長，且細胞邊緣清晰，折光性強，生長狀態良好。證明短肽水凝膠可以為細胞培養及外泌體的包裹提供穩定的空間支架，并且具有良好的生物相容性(見圖2a）。
圖2
手性自組裝短肽R-LIFE-1水凝膠構建的HDF細胞三維培養模型
a. 光鏡下觀察HDF細胞在二維和三維環境下的生長情況（× 100）；b. Live/Dead染色觀察HDF細胞在二維和三維環境下的生長情況（× 40）
Figure2. 3D culture model of HDF cells constructed by R-LIFE-1a. observation of the growth of HDF cells in 2D and 3D environment under light microscope (× 100); b. observation of the growth of HDF cells in 2D and 3D environment with Live/Dead staining (× 40)
活/死細胞染色結果(見圖2b）顯示：HDF細胞二維培養第1天，細胞基本綠染，呈星形扁平狀細胞結構，生長狀態良好；第3天，細胞大多數綠染，結構模糊，出現部分紅色死亡細胞；第5天細胞密度進一步增加，視野中出現大部分為紅染的死亡細胞；第7天細胞生長十分擁擠，紅染的死亡細胞密集分布。HDF細胞連續三維培養7天，可見細胞呈現三維空間分布，基本為綠染的活細胞，且綠染的活細胞數量逐日增多，而紅染的死亡細胞較少，散在分布。證明短肽R-LIFE-1水凝膠具有良好的生物相容性，是一種理想的組織工程支架。
2.3 外泌體的提取及鑒定
本研究采用超濾離心法從HDF的培養上清中分離細胞外泌體。外泌體的透射電鏡結果(見圖3a）顯示，本研究提取的外泌體呈現單面凹陷的茶托樣結構，能觀察到典型的囊泡狀雙層膜結構，符合外泌體的形態特征，可用作后續實驗。
圖3
HDF來源外泌體的鑒定
a. 外泌體的透射電鏡圖；b. Western blot法檢測外泌體CD9、CD63和Tsg101的表達；c. 納米粒徑追蹤分析檢測外泌體粒徑分布
Figure3. Identification of exosome derived from human dermal fibroblastsa. TEM images of exosomes; b. the expressions of CD9, CD63 and Tsg101 in exosomes were detected by Western blot; c. the particle size distribution of exosomes was detected by nanoparticle tracking analysis
為了進一步檢測本研究所提取的外泌體是否符合標準，我們采用了Western blot檢測HDF-Exo表面特異性蛋白CD9、CD63、Tsg101，結果顯示外泌體組的CD9、CD63、Tsg101條帶明顯陽性(見圖3b）；采用納米粒徑追蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）檢測外泌體粒徑大小，結果顯示樣本粒徑分布在40～200 nm之間，平均粒徑為122.3 nm，濃度在4.33 × 109 particle/mL(見圖3c）。Western blot及NTA結果證明我們提取得到的外泌體質量符合標準，可用作后續實驗。
2.4 R-LIFE-1短肽水凝膠對外泌體的包裹、控釋作用
短肽水凝膠及水凝膠包裹外泌體后的冷凍掃描電鏡結果(見圖4a）可以看到，短肽水凝膠形成了納米纖維網絡狀結構，外泌體附著在水凝膠的纖維膜片結構上，外泌體形態未發生改變，短肽水凝膠的膜片結構也未受影響。證明短肽水凝膠能夠為外泌體包裹控釋提供網絡狀的物理支架結構。
圖4
R-LIFE-1短肽水凝膠對外泌體的包裹、控釋作用
a. R-LIFE-1短肽水凝膠包裹外泌體后的冷凍掃描電鏡圖；b. R-LIFE-1短肽水凝膠對外泌體的控釋曲線
Figure4. The encapsulation and controlled release of R-LIFE-1 hydrogel on exosomesa. cryo-scanning electron microscopy image of R-LIFE-1 CSAP hydrogel; b. control release curve of R-LIFE-1 CSAP hydrogel for exosomes
短肽水凝膠對外泌體的控釋曲線(見圖4b）顯示，將外泌體包裹于水凝膠內之后的12 h，外泌體的釋放率為20%，24 h后釋放率為34%，此后6天內釋放率逐漸上升，到第十天釋放率達到99%。因此R-LIFE-1水凝膠能夠有效包裹外泌體，控制其平穩釋放，延長外泌體的半衰期，提高外泌體的利用效率。
3 討論
外泌體是一種具有雙層膜結構的細胞外微小囊泡，能夠被大多數細胞所分泌，直徑在30～150 nm，這種微小囊泡內含有各種細胞特異的蛋白、脂質、核酸，能夠作為信號分子傳遞給其他細胞，在很多病理生理過程中發揮著重要作用。
CSAP作為一類具有生物功能的三維仿生材料，具有獨特的優勢，可應用于原代細胞和干細胞的三維培養，小分子、生長因子的持續釋放，以及再生修復和組織工程領域中。Onak等[31]證明了CSAP形成的三維環境促進了人間充質干細胞的增殖和成骨分化，可應用于骨組織修復；Chow等[32]證明加入血管生成區肽段的CSAP能促進血管生成和傷口愈合；Bruggeman等[33]證明了CSAP可有效控釋生長因子，對再生醫學有重要意義；Ligorio等[34]證明了CSAP可作為一種3D可注射細胞遞送平臺。
本研究結果顯示，短肽R-LIFE-1由十個氨基酸合成，在各種離子的觸發下可以自發地組裝，形成納米纖維，納米纖維相互交聯形成納米纖維網絡狀結構，納米纖維網進一步相互交聯形成層疊狀膜片結構，能夠為細胞的三維培養以及外泌體的包裹釋放提供穩固的空間支架與負載材料。同時，從材料來源上看，短肽R-LIFE-1水凝膠具有極為優秀的生物相容性，采用水凝膠進行細胞三維培養的結果也證明細胞在水凝膠中生長狀態良好。因此，我們可以證明短肽R-LIFE-1水凝膠是一種十分理想的組織工程支架材料，能夠為細胞的三維培養及外泌體的控制釋放提供一種有前景的納米水凝膠材料。
本研究可初步表明新型短肽R-LIFE-1水凝膠可包裹外泌體，對外泌體產生控釋作用，但對外泌體的功能作用未進行進一步的研究，并且對短肽水凝膠的修復作用也未進行探究，后續還將研究外泌體對相關組織損傷的修復作用以及聯合短肽水凝膠是否能夠協同外泌體發揮作用。
4 結論
綜上所述，HDF來源的外泌體是一種比干細胞外泌體更易得、產量更大的外泌體。R-LIFE-1短肽水凝膠能夠快速形成三維網絡支架，穩定負載細胞及外泌體，具有良好的生物相容性和較小的細胞毒性，是一種理想的可應用于組織修復的組織工程材料。外泌體及水凝膠均具有修復組織損傷的能力，因此采用水凝膠負載外泌體為組織工程提供了一種新的研究思路，未來可應用于包括皮膚、黏膜、血管等組織的快速修復，具有廣闊的臨床應用前景。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：羅欣怡主要參與實驗設計、數據收集、數據分析和論文寫作的全過程，蘇迪主要參與數據收集、數據分析和論文寫作過程，盧娜主要參與數據收集、數據分析和論文寫作過程，萬源主要參與數據分析和論文寫作過程，劉桂岑主要參與數據分析和論文寫作過程，羅忠禮主要參與實驗設計、數據分析和論文寫作過程并進行了技術指導支持及材料支持。
致謝：感謝成都賽恩貝外科學研究院對本課題的大力支持。
0 引言
外泌體作為一類具有雙層膜結構的細胞外微小囊泡[1]，直徑在30～150 nm，這種微小囊泡內含有各種細胞特異的蛋白、脂質、核酸，能夠作為信號分子傳遞給其他細胞[2]，在很多病理生理過程中發揮著重要作用[3–6]，包括免疫調節[7]、細胞生長和分化[8]、組織修復[9]等。近年來，越來越多的研究將外泌體應用于各類組織的修復，包括骨組織[10]、血管組織[11]、神經組織[9]、心肌組織[12]等，展現出了十分優秀的修復能力[13-14]，同時作為一種細胞替代療法，能夠減少干細胞修復產生的免疫、炎癥風險[15]。成纖維細胞是構成皮膚真皮層的主要細胞[16]，功能活動旺盛，具有明顯的蛋白質合成和分泌活動[17]。研究表明人真皮成纖維細胞（human dermal fibroblast，HDF）來源的外泌體在光老化[18]、糖尿病皮膚創傷[19]、缺血性創傷[20]等方面均有著優秀的修復能力。
手性自組裝短肽（chiral self-assembling peptide，CSAP）是一種高分子納米材料，能夠在離子觸發下自組裝形成有序的納米纖維支架[21]，形成含水量十分豐富的水凝膠支架，不僅具有良好的力學性能[22]，還具有很好的生物相容性[23]，因此自從Zhang等[24]合成這種納米材料以來，CSAP已被廣泛應用于各個領域，包括多種組織細胞和干細胞的三維培養、再生醫學和組織工程、3D組織打印、小分子和生長因子等的持續釋放[21, 25-26]。本課題組此前已經研究過CSAP在皮膚[27]、子宮[28]、心肌[29]、軟骨[30]等組織中的修復作用，在這些組織中CSAP均展現出了優越的修復能力。因此我們有理由認為新合成的包含十個氨基酸序列的手性自組裝短肽R-LIFE-1能夠形成納米三維網絡結構，并且具有控釋外泌體的作用。
本研究選用新型短肽R-LIFE-1作為研究主體，旨在觀察它在離子觸發下自組裝形成納米水凝膠的過程、形成后的納米膜片的宏觀及微觀結構，以及作為生物材料的生物相容性等方面的性能。其次，本課題希望結合目前廣泛應用于組織修復的外泌體，為外泌體提供納米支架載體，控制它的釋放，以期達到更穩定的體內濃度和更快速的修復速度。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑
短肽R-LIFE-1（純度>95%），其氨基酸序列為：Arg Leu Glu Cys Lys Ile Asp Phe Cys Glu，成都賽恩貝生物科技有限公司贈送。DMEM培養基購于美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶購于美國Hyclone公司；胎牛血清購于中國依科賽生物科技有限公司；BCA試劑盒、Calcein-AM/PI雙染試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；剛果紅、苯胺藍染液購于北京索萊寶科技有限公司；鼠抗人CD9、CD63抗體及羊抗鼠抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司；PVDF膜、超濾離心管、針頭過濾器購于美國Millipore公司；HDF購于武漢普諾賽生命科技有限公司。
1.1.2 主要儀器
CO2細胞培養箱、超凈工作臺、酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國），倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS公司，日本），透射電子顯微鏡（JEOL公司，日本），納米顆粒追蹤分析儀（Malvern公司，英國），原子力顯微鏡（布魯克公司，德國），冷凍掃描電鏡（日立公司，日本）。
1.2 方法
1.2.1 剛果紅、苯胺藍染色
用PBS將R-LIFE-1短肽母液稀釋至2.5 mg/mL，自組裝0、24、48 h；取10 μL稀釋后的短肽溶液滴加在載玻片上，分別取10 μL剛果紅和苯胺藍染色液滴加到短肽液滴上，染色30 s，將載玻片置于光學顯微鏡下觀察并拍照。
1.2.2 原子力顯微鏡
用PBS將短肽R-LIFE-1母液稀釋至5 mg/mL，放入4℃冰箱冷藏，待短肽自組裝24 h后進行原子力顯微鏡檢測；取15 μL短肽水凝膠滴加到新撕開的云母片表面上，靜置60 s后用ddH2O反復沖洗，用濾紙吸干云母片表面水分，自然晾干；上機檢測，選取合適位置及視野拍照。
1.2.3 透射電鏡
用PBS將短肽R-LIFE-1母液稀釋至2.5 mg/mL，放入4 ℃冰箱冷藏，待短肽自組裝24 h后進行透射電鏡檢測；超聲分散5 min，用移液器取10 μL短肽水凝膠滴加在銅網上，10 min后用濾紙吸走多余液體，待銅網自然晾干1 h；開機，調節參數至合適，選擇合適的視野及放大倍數并拍照。
1.2.4 短肽水凝膠三維培養HDF
根據實驗需求，每孔取3 000個處于對數生長期的HDF于離心管中，加入100 μL/孔的完全培養基，吹打混合均勻，制成分散均勻的細胞懸液；每孔取100 μL細胞懸液，接種于96孔板中，再在每個孔內加入25 μL的PBS，為后續短肽成膠提供離子；每孔添加25 μL短肽母液，添加進去后立即吹打混勻，使細胞包裹進短肽水凝膠中，置于細胞培養箱中培養；24 h后，記為鋪板第一天。
1.2.5 HDF三維培養的Live/Dead染色
鋪板方法同上，HDF在細胞培養箱（37 ℃，5% CO2）分別培養3、5、7天后取出進行染色；吸出舊培養基后PBS清洗2次，多聚甲醛（20 μL/孔）固定細胞約10 min，PBS清洗2次；按每個復孔加入100 μL現配制的Calcein-AM/PI熒光染色液，加入PBS緩沖液清洗，熒光顯微鏡采圖。
1.2.6 外泌體的提取
選取處于生長對數期的HDF，接種于T75細胞培養瓶內，觀察細胞生長到70%左右時，PBS清洗三遍，更換為不含FBS的高糖DMEM培養基，培養72 h；收集HDF培養72 h后的上清液，3 000 g離心20 min，收集上清液并用0.22 μm針頭過濾器過濾一遍，將過濾后的上清液轉移到超濾離心管內，3 000 g離心20 min；將超濾離心管上層內剩余的液體轉移到EP管內，即為提取純化后的外泌體，短期內儲存于?80 ℃。
1.2.7 透射電鏡鑒定外泌體形態
將新鮮提取的HDF來源外泌體（HDF-Exo）用PBS稀釋十倍；用移液器取10 μL樣品滴加在銅網上，10 min后用濾紙吸走多余液體；用移液器吸取10 μL的3%磷鎢酸滴在銅網上，3 min后用濾紙吸走多余液體；干燥，靜置1 h，待銅網自然晾干；上機檢測，選擇合適視野拍照。
1.2.8 Western-blot鑒定外泌體標記性蛋白
將提取得到的外泌體裂解提取總蛋白，采用BCA蛋白定量法測定外泌體樣本的蛋白濃度，采用10% SDS-PAGE膠電泳分離，200 mA轉膜1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，PVDF膜正面朝上分別投入稀釋的CD61、CD9、Tsg101一抗，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯影。
1.2.9 NTA鑒定外泌體粒徑及濃度
提取新鮮HDF-Exo100 μL進行檢測；ddH2O清洗樣本池；校準儀器；PBS清洗樣本池HDF-Exo以PBS稀釋十倍后上機檢測。
1.2.10 短肽水凝膠對外泌體的控釋曲線
提取外泌體，并采用BCA蛋白測定法測定所提取外泌體的蛋白濃度；將50 μL外泌體懸液與50 μL PBS在孔內混勻，再添加50 μL短肽母液混勻，待短肽形成水凝膠后往孔內緩慢加入50 μL PBS，重復3個復孔；分別待12、24、48、72、96、144、192、240 h時吸取10 μL上層PBS采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，計算并繪制控釋曲線。
2 結果
2.1 手性自組裝短肽R-LIFE-1的物理性質分析
在離子的觸發下，液態的短肽母液在短時間的自組裝后形成了水凝膠形態，凝結在管底，倒置離心管后在重力的作用下水凝膠無法下流，初步證明它已經改變液體形態轉化為水凝膠形態。R-LIFE-1的結構模擬圖可揭示它由十個氨基酸序列構成，可在離子觸發下通過氫鍵、分子間作用力、交替的親疏水性及交替的正負電荷等作用力完成分子間的自組裝（見圖1a）。
圖1
手性自組裝短肽R-LIFE-1的物理性質
a. R-LIFE-1短肽自組裝形成水凝膠及R-LIFE-1結構模擬圖；b. 短肽R-LIFE-1成膠過程（剛果紅染色、苯胺藍染色，× 100）；c. 自組裝短肽R-LIFE-1的原子力顯微鏡圖
Figure1. Physical properties of self-assembling peptide R-LIFE-1a. R-LIFE-1 self-assembled hydrogel and structure simulation diagram of R-LIFE-1; b. R- LIFE-1 gelatinization process (Congo red staining, aniline blue staining, × 100); c. atomic force microscopy of self-assembling peptide R-LIFE-1
剛果紅染色結果（見圖1b）顯示：R-LIFE-1在0 h便可觀察到纖維膜片狀結構的出現；自組裝24 h后形成了大量且致密的纖維薄膜狀結構；自組裝48 h后纖維薄膜結構依然存在且完整，且有增多的趨勢，并且水凝膠所形成的結構更致密，邊界更清晰，苯胺藍染色結果進一步印證了剛果紅染色的結果。表明R-LIFE-1具有快速形成水凝膠的能力，同時成膠效果很好。
原子力顯微鏡結果（見圖1c）顯示，R-LIFE-1經過24 h自組裝后形成了納米纖維結構，這些納米纖維長度約為200 nm，直徑約為30 nm，且納米纖維之間相互交聯，形成了纖維網絡狀物理結構，纖維結構穩定，相互交織成網，形成大片的網狀膜片。表明短肽水凝膠膜片能夠為細胞的三維培養以及外泌體的包裹釋放提供穩固的空間支架與負載材料。
2.2 采用R-LIFE-1短肽水凝膠構建三維培養及其生物相容性研究
HDF細胞在二維培養的環境下表現為貼壁生長，培養3天后，可以觀察到視野下細胞全部長滿，細胞邊緣模糊，生長狀態較差，并產生部分凋亡細胞。HDF細胞在R-LIFE-1水凝膠基質中進行三維培養時，細胞表現為圓球形多層空間生長，培養3天時，R-LIFE-1水凝膠組可見細胞仍呈圓球形多層空間生長，且細胞邊緣清晰，折光性強，生長狀態良好。證明短肽水凝膠可以為細胞培養及外泌體的包裹提供穩定的空間支架，并且具有良好的生物相容性(見圖2a）。
圖2
手性自組裝短肽R-LIFE-1水凝膠構建的HDF細胞三維培養模型
a. 光鏡下觀察HDF細胞在二維和三維環境下的生長情況（× 100）；b. Live/Dead染色觀察HDF細胞在二維和三維環境下的生長情況（× 40）
Figure2. 3D culture model of HDF cells constructed by R-LIFE-1a. observation of the growth of HDF cells in 2D and 3D environment under light microscope (× 100); b. observation of the growth of HDF cells in 2D and 3D environment with Live/Dead staining (× 40)
活/死細胞染色結果(見圖2b）顯示：HDF細胞二維培養第1天，細胞基本綠染，呈星形扁平狀細胞結構，生長狀態良好；第3天，細胞大多數綠染，結構模糊，出現部分紅色死亡細胞；第5天細胞密度進一步增加，視野中出現大部分為紅染的死亡細胞；第7天細胞生長十分擁擠，紅染的死亡細胞密集分布。HDF細胞連續三維培養7天，可見細胞呈現三維空間分布，基本為綠染的活細胞，且綠染的活細胞數量逐日增多，而紅染的死亡細胞較少，散在分布。證明短肽R-LIFE-1水凝膠具有良好的生物相容性，是一種理想的組織工程支架。
2.3 外泌體的提取及鑒定
本研究采用超濾離心法從HDF的培養上清中分離細胞外泌體。外泌體的透射電鏡結果(見圖3a）顯示，本研究提取的外泌體呈現單面凹陷的茶托樣結構，能觀察到典型的囊泡狀雙層膜結構，符合外泌體的形態特征，可用作后續實驗。
圖3
HDF來源外泌體的鑒定
a. 外泌體的透射電鏡圖；b. Western blot法檢測外泌體CD9、CD63和Tsg101的表達；c. 納米粒徑追蹤分析檢測外泌體粒徑分布
Figure3. Identification of exosome derived from human dermal fibroblastsa. TEM images of exosomes; b. the expressions of CD9, CD63 and Tsg101 in exosomes were detected by Western blot; c. the particle size distribution of exosomes was detected by nanoparticle tracking analysis
為了進一步檢測本研究所提取的外泌體是否符合標準，我們采用了Western blot檢測HDF-Exo表面特異性蛋白CD9、CD63、Tsg101，結果顯示外泌體組的CD9、CD63、Tsg101條帶明顯陽性(見圖3b）；采用納米粒徑追蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）檢測外泌體粒徑大小，結果顯示樣本粒徑分布在40～200 nm之間，平均粒徑為122.3 nm，濃度在4.33 × 109 particle/mL(見圖3c）。Western blot及NTA結果證明我們提取得到的外泌體質量符合標準，可用作后續實驗。
2.4 R-LIFE-1短肽水凝膠對外泌體的包裹、控釋作用
短肽水凝膠及水凝膠包裹外泌體后的冷凍掃描電鏡結果(見圖4a）可以看到，短肽水凝膠形成了納米纖維網絡狀結構，外泌體附著在水凝膠的纖維膜片結構上，外泌體形態未發生改變，短肽水凝膠的膜片結構也未受影響。證明短肽水凝膠能夠為外泌體包裹控釋提供網絡狀的物理支架結構。
圖4
R-LIFE-1短肽水凝膠對外泌體的包裹、控釋作用
a. R-LIFE-1短肽水凝膠包裹外泌體后的冷凍掃描電鏡圖；b. R-LIFE-1短肽水凝膠對外泌體的控釋曲線
Figure4. The encapsulation and controlled release of R-LIFE-1 hydrogel on exosomesa. cryo-scanning electron microscopy image of R-LIFE-1 CSAP hydrogel; b. control release curve of R-LIFE-1 CSAP hydrogel for exosomes
短肽水凝膠對外泌體的控釋曲線(見圖4b）顯示，將外泌體包裹于水凝膠內之后的12 h，外泌體的釋放率為20%，24 h后釋放率為34%，此后6天內釋放率逐漸上升，到第十天釋放率達到99%。因此R-LIFE-1水凝膠能夠有效包裹外泌體，控制其平穩釋放，延長外泌體的半衰期，提高外泌體的利用效率。
3 討論
外泌體是一種具有雙層膜結構的細胞外微小囊泡，能夠被大多數細胞所分泌，直徑在30～150 nm，這種微小囊泡內含有各種細胞特異的蛋白、脂質、核酸，能夠作為信號分子傳遞給其他細胞，在很多病理生理過程中發揮著重要作用。
CSAP作為一類具有生物功能的三維仿生材料，具有獨特的優勢，可應用于原代細胞和干細胞的三維培養，小分子、生長因子的持續釋放，以及再生修復和組織工程領域中。Onak等[31]證明了CSAP形成的三維環境促進了人間充質干細胞的增殖和成骨分化，可應用于骨組織修復；Chow等[32]證明加入血管生成區肽段的CSAP能促進血管生成和傷口愈合；Bruggeman等[33]證明了CSAP可有效控釋生長因子，對再生醫學有重要意義；Ligorio等[34]證明了CSAP可作為一種3D可注射細胞遞送平臺。
本研究結果顯示，短肽R-LIFE-1由十個氨基酸合成，在各種離子的觸發下可以自發地組裝，形成納米纖維，納米纖維相互交聯形成納米纖維網絡狀結構，納米纖維網進一步相互交聯形成層疊狀膜片結構，能夠為細胞的三維培養以及外泌體的包裹釋放提供穩固的空間支架與負載材料。同時，從材料來源上看，短肽R-LIFE-1水凝膠具有極為優秀的生物相容性，采用水凝膠進行細胞三維培養的結果也證明細胞在水凝膠中生長狀態良好。因此，我們可以證明短肽R-LIFE-1水凝膠是一種十分理想的組織工程支架材料，能夠為細胞的三維培養及外泌體的控制釋放提供一種有前景的納米水凝膠材料。
本研究可初步表明新型短肽R-LIFE-1水凝膠可包裹外泌體，對外泌體產生控釋作用，但對外泌體的功能作用未進行進一步的研究，并且對短肽水凝膠的修復作用也未進行探究，后續還將研究外泌體對相關組織損傷的修復作用以及聯合短肽水凝膠是否能夠協同外泌體發揮作用。
4 結論
綜上所述，HDF來源的外泌體是一種比干細胞外泌體更易得、產量更大的外泌體。R-LIFE-1短肽水凝膠能夠快速形成三維網絡支架，穩定負載細胞及外泌體，具有良好的生物相容性和較小的細胞毒性，是一種理想的可應用于組織修復的組織工程材料。外泌體及水凝膠均具有修復組織損傷的能力，因此采用水凝膠負載外泌體為組織工程提供了一種新的研究思路，未來可應用于包括皮膚、黏膜、血管等組織的快速修復，具有廣闊的臨床應用前景。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：羅欣怡主要參與實驗設計、數據收集、數據分析和論文寫作的全過程，蘇迪主要參與數據收集、數據分析和論文寫作過程，盧娜主要參與數據收集、數據分析和論文寫作過程，萬源主要參與數據分析和論文寫作過程，劉桂岑主要參與數據分析和論文寫作過程，羅忠禮主要參與實驗設計、數據分析和論文寫作過程并進行了技術指導支持及材料支持。
致謝：感謝成都賽恩貝外科學研究院對本課題的大力支持。
