軟骨細胞轉導機械力信號的力轉導過程在關節軟骨生長、發育和骨性關節炎（OA）過程中發揮著重要作用。在關節軟骨中，細胞外基質代謝活動調控著軟骨細胞的基質力學微環境。因此，理解軟骨細胞感受基質力學微環境的力轉導機制能夠通過精準靶向機械力感受器有效建立OA治療策略。近十幾年，大量研究證實力敏感離子通道TRPV4和PIEZOs在關節軟骨細胞中大量表達，而且介導機械力相關的軟骨重塑和損傷響應。本文綜述了軟骨細胞感受基質力學微環境過程中TRPV4和PIEZOs介導的力感受和力響應方面的相關研究，同時也介紹了TRPV4和PIEZOs介導炎癥信號調控骨性關節炎方面的進展。本文為理解關節軟骨發病機制和尋求可能藥物靶點，以及設計細胞誘導性生物材料提供了新思路。
引用本文： 張強, Godfred K Tawiah, 張艷君, 衛小春, 陳維毅, 張全有. TRPV4和PIEZOs介導軟骨細胞力轉導的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(4): 638-644. doi: 10.7507/1001-5515.202301029 復制
0 引言
骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是周期長、難治愈和復發性高的軟骨退行性疾病[1]。隨著人口老齡化不斷加劇，OA不僅是老年人慢性疼痛和殘疾的主要原因，也是心血管疾病和全因死亡的一個風險因素，成為影響全世界5億人口的常見疾病[2]。OA病因涉及年齡、性別、肥胖、關節損傷等因素[3]，但關節軟骨異常或損傷性力學微環境是導致炎癥產生和OA退行性病變的根源之一[4]。關節軟骨是由高度特異性的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）組成的疏松結締組織。軟骨細胞是關節軟骨唯一細胞類型，它的周圍是以VI型膠原為主要成分的周基質（pericellular matrix，PCM）。PCM網狀空間結構定義了軟骨細胞獨特的基質力學和生物學微環境。PCM在基質生物化學和機械力信號向軟骨細胞傳遞的過程中發揮了重要的作用[5]。日常生理活動中，軟骨細胞不僅承受著PCM微環境內拉伸、剪切和滲透壓等動態機械力刺激，還受到ECM硬度和拓撲等物理特性的影響[6]（見圖1）。
圖1
軟骨細胞基質力學微環境中各種力學刺激示意圖
Figure1.
Schematic diagram of various mechanical stimuli in the mechanical microenvironment of chondrocyte
軟骨細胞通過力感受器介導的力轉導（mechanotransduction）過程把機械力信號轉化成細胞代謝和生物合成活動，進而影響軟骨生長、發育和OA退行性病變過程[3, 7]。這些力感受器主要包括integrin、力敏感離子通道（mechanosensitive ion channels，MSCs）和初級纖毛等跨膜蛋白。MSCs最早在1950年被提出[8]，隨后的實驗證實機械力刺激可以激活MSCs[9]。軟骨細胞屬于非興奮細胞，可表達多種離子通道。軟骨細胞瞬時感受器電位離子通道亞家族IV（transient receptor potential vanilloid type 4，TRPV4）和PIEZOs這兩類力敏感鈣離子通道作為OA潛在治療靶點備受科學家們關注[10-11]。TRPV4和PIEZOs可以介導軟骨細胞感受和響應基質力學微環境。理解TRPV4和PIEZOs介導軟骨細胞感受基質微環境的分子機制將有助于揭示OA發病新機制和尋求可能的藥物靶點，也可為當前功能性軟骨組織工程反演細胞基質力學微環境和設計細胞誘導性生物材料提供新思路。
1 TRPV4介導軟骨細胞力轉導
TRPV4是Ca2+通透的非選擇性多模式激活的陽離子通道，廣泛分布在多種生物體組織和細胞中[12]。目前，已經證實TRPV4能對多種機械力信號（如牽張、壓縮、滲透壓、剪切力）做出直接或間接的響應，具有“混雜門控行為”的特征。此外，肌動蛋白和TRPV4通道在某些膜結構中高度共表達，其中還包括微絨毛、絲狀偽足和板足邊緣等[13]。TRPV4作為膜牽張感受器激活后能夠引起以Ca2+為主的內向電流，而且被普遍認為是牽張激活鈣離子進入的導管[14]。研究者們早在十年前就發現豬和狗的關節軟骨細胞可以表達TRPV4通道[10, 15]。
TRP通道家族通過控制細胞內Ca2+濃度調控軟骨細胞基質代謝、體積變化、炎癥響應和細胞功能[16]。譬如，軟骨細胞TRPV4通過調控細胞內Ca2+水平來實現介導軟骨細胞響應低應變和生理機械應力刺激的作用，從而維持關節軟骨正常的基質合成代謝[5]。Sianati等[17]巧妙地利用彈性微柱陣列模擬軟骨細胞在體受到的機械力刺激，發現微柱引起軟骨細胞的變形能激發TRPV4介導的電流。細胞表面TRPV4可能在此過程充當機械力信號的整合器。雖然軟骨細胞TRPV4能夠通過介導生理負荷下的力轉導過程來影響軟骨基質穩態[18]，甚至還直接調控成熟細胞機械力激活的電流[19]，但至今尚無機械力直接激活TRPV4通道的報道。
TRPV4是參與軟骨細胞力轉導和調控關節軟骨發育和疾病的力敏感通道。OA患者膝關節軟骨組織中TRPV4蛋白含量顯著高于正常軟骨組織，這揭示了TRPV4與OA進展關系密切[20]。研究證實TRPV4 基因突變將顯著增加肥胖和衰老導致OA的風險性[21]。小鼠敲除TRPV4不僅能導致低滲刺激下Ca2+響應喪失和年齡相關的OA發生，而且在細胞水平使軟骨細胞喪失了調節性容積回縮響應[7]。OA早期軟骨細胞分泌的促炎因子引起軟骨基質降解，從而導致軟骨基質局部滲透壓下降和細胞體積膨脹[22]。由此激活的TRPV4通道會引起細胞外Ca2+內流，進而通過激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路使白細胞介素（interleukin-1，IL-1）表達水平升高和OA持續惡化[23]。但誘導性條件敲除小鼠TRPV4基因（僅限于成年軟骨）可緩解與年齡相關的OA[5]。
TRPV4與基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達有著密切關系。張力等[24]模擬體外OA環境發現，抑制TRPV4能降低MMP的表達量。由于未分析此時軟骨細胞基質合成基因的表達情況，只能猜測TRPV4可能會通過影響基質降解酶的表達來影響軟骨基質穩態，進而影響OA進程。在生理水平的機械負荷作用下，激活TRPV4能夠導致軟骨細胞Ⅱ型膠原和硫酸糖胺聚糖增加，抑制TRPV4則使軟骨細胞Ⅱ型膠原表達水平顯著降低，而MMP水平顯著升高[25]。近期研究進一步證實，TRPV4激活像生理機械負荷一樣能減少促炎因子和MMP合成[26]。此外，TRPV4是軟骨形成SOX9通路的一個重要調節因子[27]，而SOX9的表達在軟骨細胞的形成、分化以及功能的行使中發揮著重要作用[28]。近期也有研究發現，TRPV4介導胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）調控軟骨細胞合成代謝活動和基質分子的生成，最終影響OA發生[29]。生理水平的IGF-1會增加與肌動蛋白應力纖維形成相關的細胞硬度，而肌動蛋白與TRPV4通道MAP-7結構域的相互作用能夠抑制TRPV4電流和細胞內鈣通量，從而影響軟骨細胞響應機械刺激引起的三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）釋放。近期，Agarwal等[30]揭示了基質黏彈性調控健康和OA軟骨細胞的一種新的力轉導機制。基質黏彈性可以影響TRPV4調控的正常軟骨細胞胞內鈣濃度，進而調控糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）的活性。對于正常老化的軟骨細胞，慢應力松弛會限制細胞體積膨脹，增強TRPV4活性和增加胞內鈣離子濃度，導致GSK3β失活，從而上調多種與炎癥和軟骨降解相關的轉錄因子。由此可推斷，OA軟骨細胞中TRPV4–GSK3β通路功能障礙可能使之不能對基質應力松弛時間的變化做出正常響應，從而喪失了這種感受基質力學特性的能力。因此，TRPV4與OA進展之間的重要聯系使它在預防和緩解OA方面成為一個潛在靶點。
2 PIEZOs介導軟骨細胞力轉導
2010年，Coste等[31]首次在小鼠N2A細胞中發現一種新型機械激活的非選擇性陽離子通道蛋白PIEZO1和PIEZO2。PIEZO1對Ca2+的選擇通透性最高，而且在關節軟骨中強烈表達，并介導力轉導伴隨的Ca2+內流[11]。各種機械力能夠直接激活PIEZO1蛋白，如壓縮、拉伸和流體剪切應力[32]。PIEZO1激活時間小于5 ms，隨后快速失活的時間約為16 ms，是名副其實的機械MSCs[3]。PIEZO1蛋白的空間結構由三個葉片狀體彎曲環繞著中心孔構成，其空間結構與其通道激活密切相關[32]。最近的研究發現，鼠關節軟骨細胞均表達功能性PIEZOs通道，軟骨細胞基因沉默PIEZO1和PIEZO2能消除細胞對機械力的響應。利用原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）懸臂梁探壓豬軟骨細胞能引起細胞內Ca2+增加，而當PIEZO1和PIEZO2被敲除后，這種Ca2+信號顯著降低[31]，并且隨后證實抑制PIEZO1可以完全消除分離原代軟骨細胞高應變誘導的Ca2+震蕩。Sianati等[17]利用彈性微柱陣列也直接證實機械力可以激活軟骨細胞PIEZO1通道。因此，軟骨細胞PIEZOs介導的力轉導路徑可能調節機械力介導的細胞損傷，從而保護軟骨細胞免于機械力引起的細胞死亡。
PIEZOs蛋白在人和豬軟骨細胞中大量表達[32]，并具有機械刺激快速激活的特點，近年來關于PIEZO1與OA的研究也越來越多。凋亡性軟骨細胞死亡與創傷性OA有關，而PIEZOs通道可能是創傷性OA預防和治療的分子靶標。當在軟骨類器官培養中預防性阻斷PIEZO1時，在機械力引起的刺創周圍，軟骨細胞死亡區域顯著減小。此外，在壓縮載荷作用下，PIEZO1介導的細胞內Ca2+積累與軟骨細胞凋亡性死亡有關[3]。當軟骨細胞承受壓縮載荷（如膝關節負重）時，PIEZO2以及其他相關蛋白將被激活。對肥胖人群而言，體重帶來的巨大壓力促使PIEZO2一直處于激活狀態，而這種異常激活狀態將會引發軟骨細胞死亡，增大OA發生的風險。與之相反，抑制PIEZO2可以減少機械力導致的軟骨細胞死亡，進而抑制軟骨損傷。目前，PIEZOs激活在軟骨細胞力學信號轉導機制中的作用及其與軟骨相關疾病的關系雖然尚不明確，但炎癥能夠明確激活PIEZOs通道，而且PIEZOs通道在機械應力啟動凋亡過程中發揮著重要作用[33]。軟骨細胞死亡和炎癥發生是軟骨組織損傷后進行組織再生所面臨的難題。因此，能否通過調控PIEZOs通道逆轉軟骨細胞死亡和炎癥發生對于治療關節軟骨損傷和OA至關重要。
PIEZO1在人退變軟骨細胞中穩定表達，并與機械應力呈時間依賴關系。由于OA患者的軟骨細胞后期會發生細胞凋亡，所以二者存在某些病理上的聯系。目前已證實，PIEZO1介導軟骨細胞響應機械壓應力刺激并引起細胞內Ca2+積累與軟骨細胞凋亡有關[34]。軟骨細胞內Ca2+過量表達引起的線粒體功能障礙和內質網應激是細胞凋亡的關鍵機制和重要因素[3, 34]。PIEZO1離子通道蛋白被超生理水平的機械負荷激活時，膜電流瞬間上升，軟骨細胞發生去極化并激活電壓門控鈣離子通道（voltage-gated calcium channel，VGCC）通道，從而增加了細胞內的Ca2+，引起線粒體功能障礙，導致軟骨細胞凋亡[11, 32]。然而，TRPV4并未參與VGCC激活引起的細胞內鈣信號放大[11, 35]。Ca2+流入細胞內發生去極化和調節激酶級聯反應，而激活與凋亡相關的激酶級聯反應可導致細胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶家族caspase能夠將異常的機械牽張和炎癥信號傳遞到蛋白水解級聯中，裂解并激活其他半胱氨酸蛋白酶類，降解細胞內靶標，引發細胞凋亡。此外，內質網應激標志物caspase-12參與PIEZO1調控的軟骨細胞凋亡。有報道稱，OA軟骨細胞受到超生理水平的機械刺激時，PIEZO1和caspase-12的表達量上調，并且caspase-12的表達量與軟骨細胞凋亡率呈現相關性[11]。這表明，當軟骨細胞受到超生理水平的機械負荷時，PIEZO1激活，細胞發生去極化，引發Ca2+內流，并激活與凋亡相關的激酶級聯反應，使caspase-12表達量上升，內質網應激，最終導致軟骨細胞凋亡。
目前，越來越多的證據表明，軟骨細胞中IL-1與炎癥信號增加具有直接關系。IL-1β引起的異常基質力學微環境導致炎癥產生和OA退行性病變[4]。IL-1α能引起人OA軟骨細胞PIEZO1表達顯著增加[32]，從而導致細胞內Ca2+水平升高。軟骨細胞PIEZO1過表達導致的細胞內Ca2+濃度過高使軟骨細胞肌動蛋白骨架變形和肌動蛋白絲稀化。這就使機械誘導的微損傷變形放大，進而增加了軟骨細胞的機械力敏感性。此外，細胞骨架變形和肌動蛋白絲變稀會很大程度上降低細胞的硬度，相應地也會降低組織硬度，進而導致OA表型明顯增加。因此，在OA發展過程中，PIEZOs介導機械應力的力轉導作用非常明顯。IL-1α引起軟骨細胞PIEZO1表達增強，而這種增強依賴于P38蛋白激酶以及轉錄因子HVF4和AFF2/CREBP1。轉錄因子與近端PIEZO1基因直接結合能導致炎癥基因表達[32]。有趣的是，IL-1α并不影響TRPV4的表達和功能。因此，軟骨細胞在炎癥信號和機械力刺激協同作用下的力轉導機制可能更加復雜。
3 TRPV4和PIEZOs介導軟骨細胞感受基質微環境
3.1 MSCs激活模型
目前，解釋MSCs激活機制通常采用以下兩種理論模型[36-37]：膜張力門控（force-from lipids，FFL）模型和栓繩拉力（force-from-filament，FFF）模型（見圖2）。FFL模型認為脂質雙分子層受機械力作用產生表面張力或彎曲，進而引起MSCs與細胞膜之間發生形變，使平面膜面積擴張，從而驅動離子通道的開放（見圖2a）。膜張力或局部膜曲率變化使通道開放率增加，這就證實通道與其周圍脂質的相互作用力足以激活通道，這類通道被稱為真正的機械力激活離子通道。PIEZOs符合以生物膜結構為基礎的FFL模型[38]。軟骨細胞膜結構在PIEZOs介導的力轉導中也發揮了重要作用，因為PIEZO1開放時的周圍質膜發生變形，如果把PIEZO1引起的局部質膜變形看作圓頂，那么FFL模型引起的激活取決于圓頂突出面積的變化[31]。FFF模型認為MSCs蛋白與細胞內骨架以及ECM分子之間存在某種直接或者間接的物理連接，機械力由此引起離子通道構型發生變化和通道開放。譬如，機械力傳遞至輔助蛋白引起構型變化，與成孔亞基空間作用（見圖2b）。此外，力感受蛋白也可能距離離子通道較遠，通過細胞膜上的受體激活產生二級信號，如擴散性第二信使分子或激酶的激活最終引起離子通道激活。這種通道可能是機械力敏感而非機械門控的。但利用FFL模型很難證實MSCs力敏感性，因為作用力要求細胞內外建立完整的物理結構，而不是簡單在質膜上重構通道所能實現的。
圖2
MSCs激活機制的理論模型
Figure2.
Theoretical model of activation mechanism of MSCs
3.2 TRPV4和PIEZOs激活機制
近期，Wang等[38]認為PIEZOs是以cadherin調控細胞骨架結構為基礎的FFF模型。通過Cadherin-β-catenin-vinculin-F-actin機械傳導復合物與細胞骨架F-actin建立生化與功能連接，PIEZOs可以實現細胞內或細胞間的長距離機械傳導。這一研究極大地推動了我們對PIEZOs機械力敏感分子機制的理解。軟骨細胞肌動蛋白骨架不僅是力學響應的重要組成，也是PIEZOs介導高應變Ca2+震蕩傳導的必要成分[39-40]。此外，細胞-ECM界面相互作用引起細胞骨架張力和質膜變形可能會驅使Ca2+進入，從而使細胞內Ca2+增加和發生超極化[41]，并通過其他正反饋途徑激活TRPV4通道。這可能也是TRPV4通道通過調控Ca2+瞬變介導軟骨細胞感受ECM變形的過程。然而，TRPV4激活也可能是通過細胞表面受體和周圍基質相互作用發生的[42]。不可否認，integrin和MSCs都能介導細胞-ECM界面之間的力轉導過程[43]。軟骨細胞表達多種integrin亞型[44]，實驗證明敲除在體和離體軟骨細胞integrin α1β1亞基α1可抑制低滲刺激下TRPV4介導的細胞內鈣信號[45]。這表明integrin與TRPV4相互物理連接可能是TRPV4介導力轉導過程的一個必要條件。此外，TRPV4也可能間接與其他位于TRPV4通道附近信號傳遞微區的Ca2+敏感蛋白相互作用。
MSCs門控機制具有多樣性，這在很大程度上受到基質微環境生物化學（細胞因子、ATP、Ca2+等）和物理特性（硬度、拓撲和形狀等）的共同影響。譬如，細胞內鈣通量升高導致ATP釋放增加，而ATP釋放是由TRPV4介導軟骨細胞對機械刺激的下游反應，所以會改變軟骨細胞的力敏感性[25, 29]，甚至機械力的刺激模式都可能影響MSCs的門控機制。機械牽張力激活的電流主要由PIEZO1介導，而機械壓力則是由TRPV4和PIEZO1共同介導[3]。但細胞-基底接觸區域的變形可以激活TRPV4通道[19]。TRPV4涉及多種力感受功能[13]，有報道稱TRPV4可能通過FFF模型進行門控[46-47]，但實驗很難證明TRPV4是機械力直接激活通道。此外，我們關于TRPV4和PIEZOs通道對機械力刺激模式以及細胞自身變形模式的依賴性尚不清楚。譬如，TRPV4和PIEZOs對Ca2+信號的調控與基質微環境硬度和牽張應變均有關系[48]。
細胞動態變形過程也可能引起MSCs完全不同的激活方式。Chaudhuri等研究工作證實TRPV4激活介導著細胞體積膨脹，而且細胞體積膨脹與TRPV4激活之間的相互反饋控制著RUNX2蛋白的細胞核定位[49]。我們早期的工作發現，TRPV4在軟骨細胞膨脹和回縮過程中對Ca2+信號的調控完全相反，而Ca2+信號強度與細胞體積膨脹和回縮的變形速率正相關[7]。這可能提示我們，TRPV4和PIEZOs通道的激活模式遠比我們設想的要復雜。除上述兩種較為經典的激活機制理論以外，某些受體的激活或蛋白也可能引起TRPV4和PIEZOs的激活或力敏感性增加。譬如，作為自分泌或旁分泌信號的ATP釋放引起的P2受體激活可能介導PIEZO1通道的力調控過程[50]，以及膜支架蛋白STOML3能夠增加PIEZOs對機械刺激的敏感性。這表明特定支架蛋白共表達可能會改善離子通道的機械力敏感性。
TRPV4和PIEZOs激活或功能與機械力幅值、頻率和加載模式有著密切的關系。TRPV4可介導生理載荷（低牽張應變）的力轉導[48]。如軟骨細胞特異性TRPV4敲除可以預防老年相關的OA，但不能阻止機械創傷引起的OA。與之相反，PIEZO1和PIEZO2作為力傳感器能感受超生理載荷（損傷性機械牽張應變），從而賦予關節軟骨對高應變的力敏感性[48]。PIEZO1和TRPV4至少在體外截然不同地交錯介導著軟骨細胞感受機械應變的力轉導過程，但這種MSCs分工調控機制可能與軟骨細胞受到的機械應變刺激方式有關。
我們推測不同的門控模式可能使細胞能調控對不同力學刺激的響應，而未必與整體細胞膜牽張有關。在體外軟骨細胞中，PIEZO1和TRPV4能夠介導機械力激活的電流，其中拉伸激活的電流只依賴于PIEZO1，而PIEZO1和TRPV4共同調控牽張激活的電流[3]。因此，PIEZO1和TRPV4可能對基底與細胞黏附處機械力信號做出不同的響應，從而導致完全不同的力-電轉導過程[51]。此外，TRPV4調控牽張激活電流的主要部分，但在長期缺失TRPV4的細胞中，PIEZO1通道能部分補償。軟骨細胞感受基質力學微環境的過程中，TRPV4和PIEZOs啟動鈣信號參與細胞力轉導且與多個下游通路相互作用，其中包括磷脂酶Cγ（PLCγ）、GSK3β以及與OA相關的促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）等通路[6]。
4 總結與展望
關節軟骨的各種生理學過程均受到基質微環境中生化和物理信號的調控。目前，基質力學微環境調控炎癥信號通路的分子機制尚不清楚，所以靶向炎癥的抗炎藥物在臨床治療中始終是治標不治本。不可否認，靶向軟骨基質穩態的調控是有效減輕OA的關鍵。軟骨細胞內Ca2+濃度對于維持軟骨基質穩態和逆轉OA至關重要。因此，利用TRPV4和PIEZOs調控Ca2+濃度可能是介導軟骨細胞力學生物學行為最為直接的方法，這也是避免關節損傷或修復軟骨的有效途徑。隨著軟骨細胞感受基質力學微環境的機制研究不斷深入，TRPV4和PIEZOs在軟骨生長和退行性病變中的調控機制也將逐漸明朗。
目前，研究TRPV4和PIEZOs在介導軟骨細胞感受基質微環境的激活機制中所采用的力學刺激模式過于簡單且缺乏生理意義。未來軟骨組織工程研究可以利用三維力敏感生物材料近似反演軟骨細胞基質力學微環境，從而可以更加真實地了解TRPV4和PIEZOs感受基質物理特性的分子機制。值得一提的是，當前研究TRPV4和PIEZOs通過鈣信號介導軟骨細胞力學生物學行為的實驗設計和變量較為簡單，而綜合考慮基質力學特性、力敏感生物材料、促炎因子、動態應變等各種因素協同作用下TRPV4和PIEZOs影響和調控下游信號通路的機制可能更具有現實意義。后續研究可以嘗試以鈣信號為紐帶，進一步認識TRPV4和PIEZOs與其他鈣離子通道協同調控各種信號通路的機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：張強和Godfred K Tawiah撰寫論文初稿，張艷君繪制文中示意圖，衛小春和陳維毅審閱全文并提出建議，張全有撰寫和修改全文。
0 引言
骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是周期長、難治愈和復發性高的軟骨退行性疾病[1]。隨著人口老齡化不斷加劇，OA不僅是老年人慢性疼痛和殘疾的主要原因，也是心血管疾病和全因死亡的一個風險因素，成為影響全世界5億人口的常見疾病[2]。OA病因涉及年齡、性別、肥胖、關節損傷等因素[3]，但關節軟骨異常或損傷性力學微環境是導致炎癥產生和OA退行性病變的根源之一[4]。關節軟骨是由高度特異性的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）組成的疏松結締組織。軟骨細胞是關節軟骨唯一細胞類型，它的周圍是以VI型膠原為主要成分的周基質（pericellular matrix，PCM）。PCM網狀空間結構定義了軟骨細胞獨特的基質力學和生物學微環境。PCM在基質生物化學和機械力信號向軟骨細胞傳遞的過程中發揮了重要的作用[5]。日常生理活動中，軟骨細胞不僅承受著PCM微環境內拉伸、剪切和滲透壓等動態機械力刺激，還受到ECM硬度和拓撲等物理特性的影響[6]（見圖1）。
圖1
軟骨細胞基質力學微環境中各種力學刺激示意圖
Figure1.
Schematic diagram of various mechanical stimuli in the mechanical microenvironment of chondrocyte
軟骨細胞通過力感受器介導的力轉導（mechanotransduction）過程把機械力信號轉化成細胞代謝和生物合成活動，進而影響軟骨生長、發育和OA退行性病變過程[3, 7]。這些力感受器主要包括integrin、力敏感離子通道（mechanosensitive ion channels，MSCs）和初級纖毛等跨膜蛋白。MSCs最早在1950年被提出[8]，隨后的實驗證實機械力刺激可以激活MSCs[9]。軟骨細胞屬于非興奮細胞，可表達多種離子通道。軟骨細胞瞬時感受器電位離子通道亞家族IV（transient receptor potential vanilloid type 4，TRPV4）和PIEZOs這兩類力敏感鈣離子通道作為OA潛在治療靶點備受科學家們關注[10-11]。TRPV4和PIEZOs可以介導軟骨細胞感受和響應基質力學微環境。理解TRPV4和PIEZOs介導軟骨細胞感受基質微環境的分子機制將有助于揭示OA發病新機制和尋求可能的藥物靶點，也可為當前功能性軟骨組織工程反演細胞基質力學微環境和設計細胞誘導性生物材料提供新思路。
1 TRPV4介導軟骨細胞力轉導
TRPV4是Ca2+通透的非選擇性多模式激活的陽離子通道，廣泛分布在多種生物體組織和細胞中[12]。目前，已經證實TRPV4能對多種機械力信號（如牽張、壓縮、滲透壓、剪切力）做出直接或間接的響應，具有“混雜門控行為”的特征。此外，肌動蛋白和TRPV4通道在某些膜結構中高度共表達，其中還包括微絨毛、絲狀偽足和板足邊緣等[13]。TRPV4作為膜牽張感受器激活后能夠引起以Ca2+為主的內向電流，而且被普遍認為是牽張激活鈣離子進入的導管[14]。研究者們早在十年前就發現豬和狗的關節軟骨細胞可以表達TRPV4通道[10, 15]。
TRP通道家族通過控制細胞內Ca2+濃度調控軟骨細胞基質代謝、體積變化、炎癥響應和細胞功能[16]。譬如，軟骨細胞TRPV4通過調控細胞內Ca2+水平來實現介導軟骨細胞響應低應變和生理機械應力刺激的作用，從而維持關節軟骨正常的基質合成代謝[5]。Sianati等[17]巧妙地利用彈性微柱陣列模擬軟骨細胞在體受到的機械力刺激，發現微柱引起軟骨細胞的變形能激發TRPV4介導的電流。細胞表面TRPV4可能在此過程充當機械力信號的整合器。雖然軟骨細胞TRPV4能夠通過介導生理負荷下的力轉導過程來影響軟骨基質穩態[18]，甚至還直接調控成熟細胞機械力激活的電流[19]，但至今尚無機械力直接激活TRPV4通道的報道。
TRPV4是參與軟骨細胞力轉導和調控關節軟骨發育和疾病的力敏感通道。OA患者膝關節軟骨組織中TRPV4蛋白含量顯著高于正常軟骨組織，這揭示了TRPV4與OA進展關系密切[20]。研究證實TRPV4 基因突變將顯著增加肥胖和衰老導致OA的風險性[21]。小鼠敲除TRPV4不僅能導致低滲刺激下Ca2+響應喪失和年齡相關的OA發生，而且在細胞水平使軟骨細胞喪失了調節性容積回縮響應[7]。OA早期軟骨細胞分泌的促炎因子引起軟骨基質降解，從而導致軟骨基質局部滲透壓下降和細胞體積膨脹[22]。由此激活的TRPV4通道會引起細胞外Ca2+內流，進而通過激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路使白細胞介素（interleukin-1，IL-1）表達水平升高和OA持續惡化[23]。但誘導性條件敲除小鼠TRPV4基因（僅限于成年軟骨）可緩解與年齡相關的OA[5]。
TRPV4與基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達有著密切關系。張力等[24]模擬體外OA環境發現，抑制TRPV4能降低MMP的表達量。由于未分析此時軟骨細胞基質合成基因的表達情況，只能猜測TRPV4可能會通過影響基質降解酶的表達來影響軟骨基質穩態，進而影響OA進程。在生理水平的機械負荷作用下，激活TRPV4能夠導致軟骨細胞Ⅱ型膠原和硫酸糖胺聚糖增加，抑制TRPV4則使軟骨細胞Ⅱ型膠原表達水平顯著降低，而MMP水平顯著升高[25]。近期研究進一步證實，TRPV4激活像生理機械負荷一樣能減少促炎因子和MMP合成[26]。此外，TRPV4是軟骨形成SOX9通路的一個重要調節因子[27]，而SOX9的表達在軟骨細胞的形成、分化以及功能的行使中發揮著重要作用[28]。近期也有研究發現，TRPV4介導胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）調控軟骨細胞合成代謝活動和基質分子的生成，最終影響OA發生[29]。生理水平的IGF-1會增加與肌動蛋白應力纖維形成相關的細胞硬度，而肌動蛋白與TRPV4通道MAP-7結構域的相互作用能夠抑制TRPV4電流和細胞內鈣通量，從而影響軟骨細胞響應機械刺激引起的三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）釋放。近期，Agarwal等[30]揭示了基質黏彈性調控健康和OA軟骨細胞的一種新的力轉導機制。基質黏彈性可以影響TRPV4調控的正常軟骨細胞胞內鈣濃度，進而調控糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）的活性。對于正常老化的軟骨細胞，慢應力松弛會限制細胞體積膨脹，增強TRPV4活性和增加胞內鈣離子濃度，導致GSK3β失活，從而上調多種與炎癥和軟骨降解相關的轉錄因子。由此可推斷，OA軟骨細胞中TRPV4–GSK3β通路功能障礙可能使之不能對基質應力松弛時間的變化做出正常響應，從而喪失了這種感受基質力學特性的能力。因此，TRPV4與OA進展之間的重要聯系使它在預防和緩解OA方面成為一個潛在靶點。
2 PIEZOs介導軟骨細胞力轉導
2010年，Coste等[31]首次在小鼠N2A細胞中發現一種新型機械激活的非選擇性陽離子通道蛋白PIEZO1和PIEZO2。PIEZO1對Ca2+的選擇通透性最高，而且在關節軟骨中強烈表達，并介導力轉導伴隨的Ca2+內流[11]。各種機械力能夠直接激活PIEZO1蛋白，如壓縮、拉伸和流體剪切應力[32]。PIEZO1激活時間小于5 ms，隨后快速失活的時間約為16 ms，是名副其實的機械MSCs[3]。PIEZO1蛋白的空間結構由三個葉片狀體彎曲環繞著中心孔構成，其空間結構與其通道激活密切相關[32]。最近的研究發現，鼠關節軟骨細胞均表達功能性PIEZOs通道，軟骨細胞基因沉默PIEZO1和PIEZO2能消除細胞對機械力的響應。利用原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）懸臂梁探壓豬軟骨細胞能引起細胞內Ca2+增加，而當PIEZO1和PIEZO2被敲除后，這種Ca2+信號顯著降低[31]，并且隨后證實抑制PIEZO1可以完全消除分離原代軟骨細胞高應變誘導的Ca2+震蕩。Sianati等[17]利用彈性微柱陣列也直接證實機械力可以激活軟骨細胞PIEZO1通道。因此，軟骨細胞PIEZOs介導的力轉導路徑可能調節機械力介導的細胞損傷，從而保護軟骨細胞免于機械力引起的細胞死亡。
PIEZOs蛋白在人和豬軟骨細胞中大量表達[32]，并具有機械刺激快速激活的特點，近年來關于PIEZO1與OA的研究也越來越多。凋亡性軟骨細胞死亡與創傷性OA有關，而PIEZOs通道可能是創傷性OA預防和治療的分子靶標。當在軟骨類器官培養中預防性阻斷PIEZO1時，在機械力引起的刺創周圍，軟骨細胞死亡區域顯著減小。此外，在壓縮載荷作用下，PIEZO1介導的細胞內Ca2+積累與軟骨細胞凋亡性死亡有關[3]。當軟骨細胞承受壓縮載荷（如膝關節負重）時，PIEZO2以及其他相關蛋白將被激活。對肥胖人群而言，體重帶來的巨大壓力促使PIEZO2一直處于激活狀態，而這種異常激活狀態將會引發軟骨細胞死亡，增大OA發生的風險。與之相反，抑制PIEZO2可以減少機械力導致的軟骨細胞死亡，進而抑制軟骨損傷。目前，PIEZOs激活在軟骨細胞力學信號轉導機制中的作用及其與軟骨相關疾病的關系雖然尚不明確，但炎癥能夠明確激活PIEZOs通道，而且PIEZOs通道在機械應力啟動凋亡過程中發揮著重要作用[33]。軟骨細胞死亡和炎癥發生是軟骨組織損傷后進行組織再生所面臨的難題。因此，能否通過調控PIEZOs通道逆轉軟骨細胞死亡和炎癥發生對于治療關節軟骨損傷和OA至關重要。
PIEZO1在人退變軟骨細胞中穩定表達，并與機械應力呈時間依賴關系。由于OA患者的軟骨細胞后期會發生細胞凋亡，所以二者存在某些病理上的聯系。目前已證實，PIEZO1介導軟骨細胞響應機械壓應力刺激并引起細胞內Ca2+積累與軟骨細胞凋亡有關[34]。軟骨細胞內Ca2+過量表達引起的線粒體功能障礙和內質網應激是細胞凋亡的關鍵機制和重要因素[3, 34]。PIEZO1離子通道蛋白被超生理水平的機械負荷激活時，膜電流瞬間上升，軟骨細胞發生去極化并激活電壓門控鈣離子通道（voltage-gated calcium channel，VGCC）通道，從而增加了細胞內的Ca2+，引起線粒體功能障礙，導致軟骨細胞凋亡[11, 32]。然而，TRPV4并未參與VGCC激活引起的細胞內鈣信號放大[11, 35]。Ca2+流入細胞內發生去極化和調節激酶級聯反應，而激活與凋亡相關的激酶級聯反應可導致細胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶家族caspase能夠將異常的機械牽張和炎癥信號傳遞到蛋白水解級聯中，裂解并激活其他半胱氨酸蛋白酶類，降解細胞內靶標，引發細胞凋亡。此外，內質網應激標志物caspase-12參與PIEZO1調控的軟骨細胞凋亡。有報道稱，OA軟骨細胞受到超生理水平的機械刺激時，PIEZO1和caspase-12的表達量上調，并且caspase-12的表達量與軟骨細胞凋亡率呈現相關性[11]。這表明，當軟骨細胞受到超生理水平的機械負荷時，PIEZO1激活，細胞發生去極化，引發Ca2+內流，并激活與凋亡相關的激酶級聯反應，使caspase-12表達量上升，內質網應激，最終導致軟骨細胞凋亡。
目前，越來越多的證據表明，軟骨細胞中IL-1與炎癥信號增加具有直接關系。IL-1β引起的異常基質力學微環境導致炎癥產生和OA退行性病變[4]。IL-1α能引起人OA軟骨細胞PIEZO1表達顯著增加[32]，從而導致細胞內Ca2+水平升高。軟骨細胞PIEZO1過表達導致的細胞內Ca2+濃度過高使軟骨細胞肌動蛋白骨架變形和肌動蛋白絲稀化。這就使機械誘導的微損傷變形放大，進而增加了軟骨細胞的機械力敏感性。此外，細胞骨架變形和肌動蛋白絲變稀會很大程度上降低細胞的硬度，相應地也會降低組織硬度，進而導致OA表型明顯增加。因此，在OA發展過程中，PIEZOs介導機械應力的力轉導作用非常明顯。IL-1α引起軟骨細胞PIEZO1表達增強，而這種增強依賴于P38蛋白激酶以及轉錄因子HVF4和AFF2/CREBP1。轉錄因子與近端PIEZO1基因直接結合能導致炎癥基因表達[32]。有趣的是，IL-1α并不影響TRPV4的表達和功能。因此，軟骨細胞在炎癥信號和機械力刺激協同作用下的力轉導機制可能更加復雜。
3 TRPV4和PIEZOs介導軟骨細胞感受基質微環境
3.1 MSCs激活模型
目前，解釋MSCs激活機制通常采用以下兩種理論模型[36-37]：膜張力門控（force-from lipids，FFL）模型和栓繩拉力（force-from-filament，FFF）模型（見圖2）。FFL模型認為脂質雙分子層受機械力作用產生表面張力或彎曲，進而引起MSCs與細胞膜之間發生形變，使平面膜面積擴張，從而驅動離子通道的開放（見圖2a）。膜張力或局部膜曲率變化使通道開放率增加，這就證實通道與其周圍脂質的相互作用力足以激活通道，這類通道被稱為真正的機械力激活離子通道。PIEZOs符合以生物膜結構為基礎的FFL模型[38]。軟骨細胞膜結構在PIEZOs介導的力轉導中也發揮了重要作用，因為PIEZO1開放時的周圍質膜發生變形，如果把PIEZO1引起的局部質膜變形看作圓頂，那么FFL模型引起的激活取決于圓頂突出面積的變化[31]。FFF模型認為MSCs蛋白與細胞內骨架以及ECM分子之間存在某種直接或者間接的物理連接，機械力由此引起離子通道構型發生變化和通道開放。譬如，機械力傳遞至輔助蛋白引起構型變化，與成孔亞基空間作用（見圖2b）。此外，力感受蛋白也可能距離離子通道較遠，通過細胞膜上的受體激活產生二級信號，如擴散性第二信使分子或激酶的激活最終引起離子通道激活。這種通道可能是機械力敏感而非機械門控的。但利用FFL模型很難證實MSCs力敏感性，因為作用力要求細胞內外建立完整的物理結構，而不是簡單在質膜上重構通道所能實現的。
圖2
MSCs激活機制的理論模型
Figure2.
Theoretical model of activation mechanism of MSCs
3.2 TRPV4和PIEZOs激活機制
近期，Wang等[38]認為PIEZOs是以cadherin調控細胞骨架結構為基礎的FFF模型。通過Cadherin-β-catenin-vinculin-F-actin機械傳導復合物與細胞骨架F-actin建立生化與功能連接，PIEZOs可以實現細胞內或細胞間的長距離機械傳導。這一研究極大地推動了我們對PIEZOs機械力敏感分子機制的理解。軟骨細胞肌動蛋白骨架不僅是力學響應的重要組成，也是PIEZOs介導高應變Ca2+震蕩傳導的必要成分[39-40]。此外，細胞-ECM界面相互作用引起細胞骨架張力和質膜變形可能會驅使Ca2+進入，從而使細胞內Ca2+增加和發生超極化[41]，并通過其他正反饋途徑激活TRPV4通道。這可能也是TRPV4通道通過調控Ca2+瞬變介導軟骨細胞感受ECM變形的過程。然而，TRPV4激活也可能是通過細胞表面受體和周圍基質相互作用發生的[42]。不可否認，integrin和MSCs都能介導細胞-ECM界面之間的力轉導過程[43]。軟骨細胞表達多種integrin亞型[44]，實驗證明敲除在體和離體軟骨細胞integrin α1β1亞基α1可抑制低滲刺激下TRPV4介導的細胞內鈣信號[45]。這表明integrin與TRPV4相互物理連接可能是TRPV4介導力轉導過程的一個必要條件。此外，TRPV4也可能間接與其他位于TRPV4通道附近信號傳遞微區的Ca2+敏感蛋白相互作用。
MSCs門控機制具有多樣性，這在很大程度上受到基質微環境生物化學（細胞因子、ATP、Ca2+等）和物理特性（硬度、拓撲和形狀等）的共同影響。譬如，細胞內鈣通量升高導致ATP釋放增加，而ATP釋放是由TRPV4介導軟骨細胞對機械刺激的下游反應，所以會改變軟骨細胞的力敏感性[25, 29]，甚至機械力的刺激模式都可能影響MSCs的門控機制。機械牽張力激活的電流主要由PIEZO1介導，而機械壓力則是由TRPV4和PIEZO1共同介導[3]。但細胞-基底接觸區域的變形可以激活TRPV4通道[19]。TRPV4涉及多種力感受功能[13]，有報道稱TRPV4可能通過FFF模型進行門控[46-47]，但實驗很難證明TRPV4是機械力直接激活通道。此外，我們關于TRPV4和PIEZOs通道對機械力刺激模式以及細胞自身變形模式的依賴性尚不清楚。譬如，TRPV4和PIEZOs對Ca2+信號的調控與基質微環境硬度和牽張應變均有關系[48]。
細胞動態變形過程也可能引起MSCs完全不同的激活方式。Chaudhuri等研究工作證實TRPV4激活介導著細胞體積膨脹，而且細胞體積膨脹與TRPV4激活之間的相互反饋控制著RUNX2蛋白的細胞核定位[49]。我們早期的工作發現，TRPV4在軟骨細胞膨脹和回縮過程中對Ca2+信號的調控完全相反，而Ca2+信號強度與細胞體積膨脹和回縮的變形速率正相關[7]。這可能提示我們，TRPV4和PIEZOs通道的激活模式遠比我們設想的要復雜。除上述兩種較為經典的激活機制理論以外，某些受體的激活或蛋白也可能引起TRPV4和PIEZOs的激活或力敏感性增加。譬如，作為自分泌或旁分泌信號的ATP釋放引起的P2受體激活可能介導PIEZO1通道的力調控過程[50]，以及膜支架蛋白STOML3能夠增加PIEZOs對機械刺激的敏感性。這表明特定支架蛋白共表達可能會改善離子通道的機械力敏感性。
TRPV4和PIEZOs激活或功能與機械力幅值、頻率和加載模式有著密切的關系。TRPV4可介導生理載荷（低牽張應變）的力轉導[48]。如軟骨細胞特異性TRPV4敲除可以預防老年相關的OA，但不能阻止機械創傷引起的OA。與之相反，PIEZO1和PIEZO2作為力傳感器能感受超生理載荷（損傷性機械牽張應變），從而賦予關節軟骨對高應變的力敏感性[48]。PIEZO1和TRPV4至少在體外截然不同地交錯介導著軟骨細胞感受機械應變的力轉導過程，但這種MSCs分工調控機制可能與軟骨細胞受到的機械應變刺激方式有關。
我們推測不同的門控模式可能使細胞能調控對不同力學刺激的響應，而未必與整體細胞膜牽張有關。在體外軟骨細胞中，PIEZO1和TRPV4能夠介導機械力激活的電流，其中拉伸激活的電流只依賴于PIEZO1，而PIEZO1和TRPV4共同調控牽張激活的電流[3]。因此，PIEZO1和TRPV4可能對基底與細胞黏附處機械力信號做出不同的響應，從而導致完全不同的力-電轉導過程[51]。此外，TRPV4調控牽張激活電流的主要部分，但在長期缺失TRPV4的細胞中，PIEZO1通道能部分補償。軟骨細胞感受基質力學微環境的過程中，TRPV4和PIEZOs啟動鈣信號參與細胞力轉導且與多個下游通路相互作用，其中包括磷脂酶Cγ（PLCγ）、GSK3β以及與OA相關的促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）等通路[6]。
4 總結與展望
關節軟骨的各種生理學過程均受到基質微環境中生化和物理信號的調控。目前，基質力學微環境調控炎癥信號通路的分子機制尚不清楚，所以靶向炎癥的抗炎藥物在臨床治療中始終是治標不治本。不可否認，靶向軟骨基質穩態的調控是有效減輕OA的關鍵。軟骨細胞內Ca2+濃度對于維持軟骨基質穩態和逆轉OA至關重要。因此，利用TRPV4和PIEZOs調控Ca2+濃度可能是介導軟骨細胞力學生物學行為最為直接的方法，這也是避免關節損傷或修復軟骨的有效途徑。隨著軟骨細胞感受基質力學微環境的機制研究不斷深入，TRPV4和PIEZOs在軟骨生長和退行性病變中的調控機制也將逐漸明朗。
目前，研究TRPV4和PIEZOs在介導軟骨細胞感受基質微環境的激活機制中所采用的力學刺激模式過于簡單且缺乏生理意義。未來軟骨組織工程研究可以利用三維力敏感生物材料近似反演軟骨細胞基質力學微環境，從而可以更加真實地了解TRPV4和PIEZOs感受基質物理特性的分子機制。值得一提的是，當前研究TRPV4和PIEZOs通過鈣信號介導軟骨細胞力學生物學行為的實驗設計和變量較為簡單，而綜合考慮基質力學特性、力敏感生物材料、促炎因子、動態應變等各種因素協同作用下TRPV4和PIEZOs影響和調控下游信號通路的機制可能更具有現實意義。后續研究可以嘗試以鈣信號為紐帶，進一步認識TRPV4和PIEZOs與其他鈣離子通道協同調控各種信號通路的機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：張強和Godfred K Tawiah撰寫論文初稿，張艷君繪制文中示意圖，衛小春和陳維毅審閱全文并提出建議，張全有撰寫和修改全文。
