踝蛋白（Talin）的F0結構域與Ras相關蛋白1b（Rap1b）的結合對血栓形成至關重要。然而Talin作為一種力敏感蛋白，力能否調控Talin-F0/Rap1b的相互作用以及如何調控，尚不明晰。為探究力對Talin-F0/Rap1b結合親和力的影響以及相應動力學機制，采用拉伸分子模擬的手段，以Talin-F0/Rap1b復合物結構為對象，觀察并比較分析不同作用力下復合物功能-構象信息的變化情況。結果表明，復合物受力解離過程至少存在兩種路徑且兩者機械強度有顯著差異，決定機械強度差異的關鍵事件是F0結構域的β4片層是否從原先的β1-β4片層平行結構被拉出。隨著力的增大，復合物的相互作用將先增強后減弱，表現出“逆鎖-滑移鍵”的特性。ASP54-ARG41、GLN18-THR65這兩對殘基的相互作用受到力學信號的調控，20 pN的機械力能顯著增強這些殘基的作用指數，從而導致復合物結合親和力大幅提升。本研究預報了胞內環境中力對Talin-F0/Rap1b相互作用的調控機制，為相關疾病的治療和藥物的開發提供了新的思路。
引用本文： 余哲, 姬彥儒, 黃文華, 方穎, 吳建華. 力調控Talin與Rap1b相互作用的分子動力學模擬. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(4): 645-653. doi: 10.7507/1001-5515.202208022 復制
0 引言
整合素αIIbβ3是跨膜受體整合素家族的一員，在止血和病理性血栓形成過程中扮演著重要角色。血小板表面的αIIbβ3在被激活后與纖維蛋白原結合，介導血小板聚集，最終形成血小板栓塞[1]。踝蛋白（Talin）是激活αIIbβ3的關鍵適配蛋白，充當著橋梁連接整合素與肌動蛋白[2]，它能感受配體施加的機械力并將之轉變成生化信號，因此，Talin在胞內信號傳導過程中是不可或缺的。Talin在哺乳動物中有兩種表達亞型，分別為Talin-1和Talin-2，在血小板中表達的是Talin-1[3]。既往研究表明，Talin-1通過其F3結構域上的整合素結合位點與整合素β亞基胞質尾部保守的近膜端NPxY基序相互作用并誘導整合素構象改變，從而激活αIIbβ3[4]。然而，靜息狀態下的Talin-1自身構象處于自抑制狀態，此時F3結構域的整合素結合位點被遮蔽[5]。近幾年研究發現，錨定在膜上的Ras相關蛋白1b（ras-associated protein 1，Rap1b）通過與Talin-1的F0結構域相互作用，幫助Talin-1被招募到細胞膜上并解除自抑制，進而介導整合素活化[6-10]。
除了以生化“激活劑”的形式發揮作用外，Talin作為分子離合器的關鍵成分之一，還具有十分重要的機械特性[11-13]。Talin能感受到外基質施加的張力和肌球蛋白產生的收縮力[14]。研究表明，Talin在這些力的影響下會發生構象轉變，暴露出關鍵結合位點；而且，在一定范圍內，力以逆鎖鍵機制調控Talin與其配體的相互作用[15-17]。由于Talin構象對力的敏感性，猜測力同樣能調控Talin-F0/Rap1b的相互作用。此外，Zhu等[8]發現，在溶液中Talin-F0/Rap1b的結合親和力較弱，而膜錨定的Rap1b對Talin-F0的結合能力提高了兩個數量級，但相關機制至今尚未明晰。類似地，Talin-F3與整合素、Talin的C端與肌動蛋白在溶液中的結合親和力同樣很弱[18-20]，而對Talin施加與骨架力相當的力時，它們的相互作用會大幅增強。因此，有理由相信，膜錨定的Rap1b與Talin結合親和力的提高與機械力有一定關聯性。本研究以Talin-F0/Rap1b的復合物作為研究對象，采用分子動力學模擬技術，研究力調節Talin-F0/Rap1b結合親和力的動力學機制及分子基礎，以期深化對胞內機械信號傳導的認知，為針對Talin-F0/Rap1b相互作用的新型抗血栓藥物靶標的設計提供方向。
1 材料與方法
1.1 搭建體系
分子體系選自蛋白質數據庫（protein data bank，PDB）中Talin-F0/Rap1b復合物結構，代碼為6BA6[8]。該結構包含鼠源Talin-F0結構域的1～86號殘基，以及人源Rap1b的1～167號殘基。采用可視化分子模擬程序（visual molecular dynamics，VMD）[21]搭建體系，將蛋白浸入在邊長為復合物各方向上最遠處再延伸1.5 nm的TIP3P立方水體中，水框大小約為7.9 nm × 8.1 nm × 9.0 nm，并添加0.154 mol/L的NaCl使體系呈電中性，體系原子總數為54 289。
1.2 體系優化
為保證體系構象的穩定性和數據的可靠性，需要通過能量最小化對構象進一步優化，采用NAMD軟件[22]對體系進行3次1.5×104步能量最小化，力場文件選用CHARMM27[23]，過程采用周期性邊界條件，積分步長為2 fs。以最小化的最后一幀作為初始構象，在恒溫恒壓系綜下對體系進行三次40 ns平衡模擬。平衡時采用Langevin動力學控制溫度在310 K，壓強用Langevin活塞方法維持在1 atm，采用埃瓦爾德粒子網格算法（particle mesh Ewald，PME）處理靜電相互作用，范德華相互作用（van der Waals interaction）的截止點（cut off）設為1.2 nm[24-26]。
1.3 拉伸模擬
為模擬力對Talin-F0/Rap1b相互作用的影響，對達到平衡的復合物體系進行受控分子動力學模擬（steered molecular dynamics，SMD），SMD過程中采用先恒速度拉伸再恒力拉伸的方法。恒速拉伸方案為：以平衡后期穩定構象為起點，拉伸速度為0.2 nm/ns，彈簧系數為139 pN/nm，時長為30 ns。為模擬生理環境下Rap1b的C端與細胞膜的相互作用，固定點選取Rap1b C端Arg167的Cα原子；為模擬傳遞到Talin的骨架力，拉伸點選取F0結構域C端Arg86的Cα原子，拉伸方向為兩點連線方向。恒力拉伸方案為：分別選取恒速度拉伸過程中拉力加載到10、20、30和40 pN時的構象作為起點。去除虛擬彈簧，將力直接作用到拉伸原子上，維持力的大小不變，采用不同起始構象進行三次實驗，時長為40 ns。
1.4 數據分析
所有數據和蛋白結構可視化均采用VMD軟件。在恒速拉伸過程中，分別采用解離力、解離時間和應力累積來評價復合物的機械強度。其中，解離力定義為：力譜曲線的最大值；解離時間定義為：當拉力首次達到解離力所需的時間；應力累積，即力譜曲線下的積分面積，其區間為零時刻到解離時刻。為定量估計受配體蛋白的結合情況，分析了溶劑不可達表面積（buried solvent accessible surface area，Buried SASA）。采用相互作用能和結合自由能作為復合物熱力學指標，相互作用能包括靜電能和范德華能，相互作用能和Buried SASA都通過VMD腳本計算獲得。結合自由能包括真空的結合自由能、溶劑化自由能和熵變貢獻，由于在恒力下體系變化不大，故本研究忽略了熵變貢獻。采用分子力學泊松-波爾茲曼表面積（molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area，MM-PBSA）方法計算結合自由能。
為了更好地描述殘基—殘基的相互作用，本研究引入了殘基間相互作用指數Pij，即第i個配體殘基與第j個受體殘基結合的概率，定義為：
 |
其中，本研究將結合位點上每個氫鍵的形成與斷裂均視為獨立事件，用ωij,l表示第i個配體殘基和第j個受體殘基之間第l個氫鍵的生存率，ML（≥ 1）和MR（≥ 1）分別為參與結合的配體和受體殘基總數，Mij（≥ 0）表示第i個配體殘基與第j個受體殘基之間的氫鍵數。同樣地，本研究定義了Pj,L與Pj,R，分別為配體上第j個殘基與受體結合的概率和受體上第j個殘基與配體結合的概率：
 |
由此，本研究通過基于殘基相互作用的Pij估計配體與受體的解離概率PD為：
 |
此外，為了克服模擬計算與真實生理條件之間存在的時間尺度效應，得到與細胞水平實驗數據可比的結果，本研究引入了機械調節因子
（相對解離概率），其定義為：
 |
其中，f代表施加在復合物上的恒力，
的取值分別為0、10、20、30、40 pN。
1.5 統計分析
所有模擬進行三次獨立實驗，以平均值±標準差表示。兩組間的差異采用非配對雙尾學生t檢驗。采用Pearson相關性分析檢驗兩個變量的相關性。
2 結果與分析
2.1 平衡過程中Talin-F0/Rap1b的相互作用
為保證后續模擬初始構象的合理性并研究恒溫恒壓條件下Talin-F0/Rap1b的動態平衡相互作用，對系統進行了三次40 ns的平衡。結果表明，RMSD-Cα值在平衡20 ns后基本穩定，上下波動不超過0.1 nm（見圖1a）；回轉半徑也呈現相同趨勢（見圖1b）。這提示，通過40 ns的系統平衡之后，復合物處于平衡狀態。同時，三次平衡中，復合物結合面內氫鍵數目的均值都大于6個（見圖1c）。這意味著結合面內穩定的氫鍵相互作用維持了復合物的穩定性。另外，結合面氫鍵數目的頻數分布及其高斯擬合曲線表明氫鍵數目基本呈正態分布（見圖1d），三次擬合得出的擬合度R2都大于0.98，提示通過40 ns的系統平衡所獲得的構象樣本空間是準完備的，可作為后續拉伸分子動力學模擬的初始構象。
圖1
平衡過程中Talin-F0/Rap1b的穩定性分析
a. 復合物重原子RMSD值；b. 回轉半徑；c. 結合面氫鍵數目；d. 氫鍵數目頻數分布
Figure1. The stability analysis of the talin-F0/Rap1b complex during the equilibrium simulationa. Cα-RMSD of the complex; b. the radius of gyration; c. the H-bond number (
為揭示結合面上的關鍵殘基，我們計算了每個結合面氫鍵的生存率。表1展示了平衡過程中維持復合物穩定的關鍵殘基對的氫鍵生存率（選取均值>15%的殘基對）。其中F0結構域上LYS15和ARG35是經突變實驗驗證的參與Talin-F0/Rap1b相互作用的關鍵殘基[8]，而在三次模擬中LYS15和ARG35都能與Rap1b上兩個殘基形成生存率較高的氫鍵，得到了與實驗一致的結果，這證明了LYS15與ARG35對于Talin-F0/Rap1b穩定結合的重要貢獻；此外，F0結構域的β2片層上ASN12、VAL14和THR16也能與配體產生較強的相互作用，表明F0結構域的β2片層是維持復合物穩定的關鍵結構。
表1
平衡過程中復合物結合面上的重要氫鍵
Table1.
The hydrogen bonds with occupancy >15% of the equilibrated complex
2.2 Talin-F0/Rap1b的受力解離路徑與機械強度
為研究機械力作用下復合物的構象變化和解離過程，選取平衡后期的穩定構象進行恒速拉伸。通過分析拉伸過程中的力譜曲線，發現復合物的受力解離過程有兩種路徑，分別命名為Type 1和 Type 2，且兩者的解離力、解離時間和應力累積有顯著差異（見圖2）。一方面，兩種路徑的力譜曲線趨勢不同：在Type 1中，曲線在達到最大峰值之前，存在多個小峰，而Type 2中只存在一個明顯力峰（見圖2a-b）。另一方面，從力學性質來看，Type 1與Type 2的解離力分別為（237 ± 3）、（162 ± 4）pN，解離時間分別為（16.7 ± 1.4）、（8.0 ± 1.7）ns（見圖2c-d）。此外，我們引入了應力累積以更好地評估復合物的機械穩定性。兩種路徑的應力累積分別為（1 772 ± 237）、（652 ± 198）pN·ns（見圖2e）。以上結果表明，當復合物沿路徑1解離時，其機械強度能顯著提高。
圖2
Talin-F0/Rap1b存在兩條不同機械強度的解離路徑
a-b. 復合物沿解離路徑1或解離路徑2的力譜曲線；c. 解離力，
a-b. the time courses of loading force on the complex in type 1 or type 2, respectively; c. the rupture forces,
2.3 力誘導的變構提高了復合物的機械強度
為進一步研究兩種路徑中復合物機械強度存在差異的原因，觀察了復合物構象的動態演化，特別是重點關注直接受到拉力作用的F0結構域，拉伸過程中的快照如圖3所示（其中Rap1b為青色；F0結構域為紅色）。結果發現，在不同的解離路徑下，機械力誘導復合物的異構。在Type 1中，當拉伸3.2 ns時，F0結構域上拉伸點（綠色）所在的β4片層在力的作用下從β1-β4的平行結構中被拉出，這與力譜曲線中首次降至0左右的時間一致（見圖2a），該現象在Type 2中卻不存在。蛋白質的功能與構象密切相關，在3.2 ns之后，由于外力減小了β1片層對β4片層的約束，β4片層的柔性會明顯增加，這意味著，作用在β4片層的拉力很可能不會快速傳遞到結合面上，從而導致機械強度提高。因此，我們推斷影響復合物機械強度的關鍵事件很可能是Type 1中拉伸前期出現的力誘導的F0結構域構象改變。
圖3
拉力誘導的Talin-F0/Rap1b復合物解離快照
Figure3.
Pull-induced dissociation pathways snapshots of talin-F0/Rap1b complex
為明確力誘導的構象變化差異是否有統計學意義，分析兩種路徑下F0結構域上β1片層（LEU4和SER9的Cα原子連線方向）與β4片層（ASP77和TYR81的Cα原子連線方向）的夾角φ（見圖4a）。時間歷程曲線表明：當復合物受力沿著路徑1解離時，夾角φ不斷減小；而在路徑2中，夾角φ基本保持穩定（見圖4b）。觀察快照可得，復合物沿著解離路徑1拉伸10 ns后其F0結構域與初始構象有顯著區別（見圖4c）。通過比較夾角φ的均值，發現Type 1組的φ（125.8 ± 5.2）°顯著低于Type 2組（135.3 ± 1.4）°，表明兩者F0結構域的構象差異明顯（見圖4d）。進一步地，為揭示影響夾角φ變化的分子基礎，分析F0結構域的β1-β4片層上殘基對的氫鍵情況，發現在Type 2中LYS7-ASP77的生存率（86.4 ± 3.1）%顯著高于Type 1（44.7 ± 22.2）%（見圖4e）。同時，對夾角φ和LYS7-ASP77的氫鍵生存率進行Pearson相關性分析，發現兩者相關程度極強（見圖4f）。以上結果表明，當沿著路徑1解離時，力能通過進一步破壞LYS7-ASP77誘導出特定的構象，從而顯著提高機械強度。
圖4
力誘導復合物在解離路徑1下的變構
a. β1-β4片層夾角
a. diagram of the angle
2.4 雙相力依賴的Talin-F0/Rap1b相互作用
接著，用10、20、30、40 pN的恒力拉伸復合物40 ns并與平衡過程（0 pN）比較，以探究力對Talin-F0/Rap1b親和力的調控。隨著力的增大，氫鍵數目從7.4個增加到9.4個又隨之減少，呈現出對力的雙相依賴性，其最佳閾值點出現在20 pN（見圖5a）。為更好地衡量復合物解離情況，我們引入機械調節因子fD，fD值越低說明該條件下復合物越難解離。由圖5b可知，fD同樣受到力的雙相調控，0 pN比20 pN的解離概率高約33倍，充分說明20 pN的力能顯著增強Talin-F0/Rap1b的相互作用。采用Buried SASA表征結合面面積，發現在20 pN下，復合物結合面從約5.4 nm2增加到約7.2 nm2（見圖5c）。另外，當拉力不超過20 pN時，力能降低復合物的結合自由能與相互作用能，呈現力增強Talin-F0/Rap1b結合的效應（見圖5d-e）。這些結果表明，Talin-F0/Rap1b的相互作用服從“逆鎖-滑移鍵”機制。
圖5
力對Talin-F0與Rap1b相互作用的雙相調控
a. 氫鍵數目；b. 機械調節因子；c. 溶劑不可達表面積；d. 結合自由能；e. 相互作用能。當0 ≤
a. the
2.5 不同拉力下復合物結合面上殘基作用網絡的動態演化
為探究力改變復合物親和力的分子機制，分析了不同力對結合面上殘基作用指數的影響，選取指數超過0.2的11對殘基并繪制成熱圖（見圖6）。與平衡相比，恒力過程中新增了三對作用強度適中的殘基，其中，ASP54-ARG41和GLN18-THR65的作用指數都呈現出“逆鎖-滑移鍵”機制。此外，結合強度最高的三對殘基ASN12-ARG41、VAL14-SER39、ARG35-ASP33受力波動不大。最后，對剩下的六對殘基而言，盡管增強效果最好的力不是20 pN，但總體上，有力條件更能增強它們的作用指數。綜上，我們推斷力調控Talin-F0/Rap1b結合親和力變化的機制為：低力條件（不超過20 pN）可以增強ASP54-ARG41和GLN18-THR65等力敏感殘基對的作用能力；而ASN12-ARG41、VAL14-SER39、ARG35-ASP33這些維持結合面的關鍵殘基，則具有一定的機械穩定性從而抵抗力的破壞。兩種類型殘基互相配合，實現了不同大小的力對Talin-F0/Rap1b的結合親和力的動態調控。
圖6
力依賴的殘基相互作用網絡的演變
Figure6.
Evolution of force-dependent residue interaction networks
3 討論
Talin-F0結構域與錨定在膜上的Rap1b的相互作用是幫助Talin解除自抑制構象并將其從細胞質招募到細胞膜的初始步驟，對生理或病理條件下血栓的形成至關重要。Liao等[27]發現，如果破壞了Talin/Rap1b的相互作用，即使事先讓Talin募集到膜上也不足以誘導整合素的激活，這表明保持Talin/Rap1b通路穩定對激活整合素的重要性。然而目前關于Talin-F0/Rap1b的力學性質的相關研究尚未報道。本文通過研究機械環境下Talin-F0/Rap1b的相互作用，試圖深入認識生理條件下Talin-F0/Rap1b介導的整合素持續激活的動態過程，從原子水平揭示Talin-F0/Rap1b相互作用的力調控機制以及結合面殘基作用的關鍵信息。
結果表明，Talin-F0/Rap1b在平衡過程中具有較好的穩定性（見圖1），而F0結構域的β2片層是維持復合物穩定的關鍵結構。在恒速拉伸過程中，復合物存在兩種解離路徑且機械強度有顯著差異（見圖2）。通過復合物解離快照和構象定量分析（見圖3-4），發現在Type 1中，F0結構域上的β1-β4片層的夾角φ發生明顯變化，這與β1-β4片層上殘基對LYS7-ASP77的相互作用密切相關。恒力結果表明，Talin-F0/Rap1b具有較好的機械穩定性，當力達到40 pN時，復合物構象還能保持平衡態。同時，Talin-F0/Rap1b的相互作用具有雙相力依賴機制，20 pN下復合物的相對解離概率降低至0.03（見圖5）。殘基對ASP54-ARG41和GLN18-THR65在力對復合物親和力的調控中發揮著重要作用（見圖6）。
值得注意的是，相關研究報道Talin-F0在溶液中與Rap1b的結合親和力很弱[28]。雖然Talin-F0和膜錨定的Rap1b相互作用可以使其結合能力比在溶液中提高兩個數量級，但具體機制尚未闡明。本文發現的20 pN下復合物的結合親和力顯著提升，或許能夠回答前述問題，當Rap1b錨定在膜上時，細胞膜能對復合物施加一個支點，使機械力增強兩者的結合親和力。這種黏附分子間的逆鎖鍵現象在許多研究中都能觀測到，如β2整合素與ICAM-1[29]、β3整合素與Kindlin-2[30]。本文發現的Talin-F0/Rap1b相互作用的雙相力依賴性或許能夠解釋生理過程中Talin-F0/Rap1b的相互作用：在力還沒加載到復合物時，Talin-F0/Rap1b的解離過程較為快速，只有部分保持信號連通，使機械信號傳導成為可能；當力不斷加強時，Talin-F0/Rap1b的信號連通也不斷加強，這將穩定力信號的傳導，從而形成相對穩定的動態平衡；若力進一步加強，由于此時力對復合物的調控表現為抑制，信號不斷減弱，最終細胞回歸于靜息態。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：吳建華和方穎設計實驗；黃文華參與研究計劃修訂；余哲和姬彥儒分別負責全部和部分研究以及分析數據；余哲、吳建華和方穎撰寫論文。
0 引言
整合素αIIbβ3是跨膜受體整合素家族的一員，在止血和病理性血栓形成過程中扮演著重要角色。血小板表面的αIIbβ3在被激活后與纖維蛋白原結合，介導血小板聚集，最終形成血小板栓塞[1]。踝蛋白（Talin）是激活αIIbβ3的關鍵適配蛋白，充當著橋梁連接整合素與肌動蛋白[2]，它能感受配體施加的機械力并將之轉變成生化信號，因此，Talin在胞內信號傳導過程中是不可或缺的。Talin在哺乳動物中有兩種表達亞型，分別為Talin-1和Talin-2，在血小板中表達的是Talin-1[3]。既往研究表明，Talin-1通過其F3結構域上的整合素結合位點與整合素β亞基胞質尾部保守的近膜端NPxY基序相互作用并誘導整合素構象改變，從而激活αIIbβ3[4]。然而，靜息狀態下的Talin-1自身構象處于自抑制狀態，此時F3結構域的整合素結合位點被遮蔽[5]。近幾年研究發現，錨定在膜上的Ras相關蛋白1b（ras-associated protein 1，Rap1b）通過與Talin-1的F0結構域相互作用，幫助Talin-1被招募到細胞膜上并解除自抑制，進而介導整合素活化[6-10]。
除了以生化“激活劑”的形式發揮作用外，Talin作為分子離合器的關鍵成分之一，還具有十分重要的機械特性[11-13]。Talin能感受到外基質施加的張力和肌球蛋白產生的收縮力[14]。研究表明，Talin在這些力的影響下會發生構象轉變，暴露出關鍵結合位點；而且，在一定范圍內，力以逆鎖鍵機制調控Talin與其配體的相互作用[15-17]。由于Talin構象對力的敏感性，猜測力同樣能調控Talin-F0/Rap1b的相互作用。此外，Zhu等[8]發現，在溶液中Talin-F0/Rap1b的結合親和力較弱，而膜錨定的Rap1b對Talin-F0的結合能力提高了兩個數量級，但相關機制至今尚未明晰。類似地，Talin-F3與整合素、Talin的C端與肌動蛋白在溶液中的結合親和力同樣很弱[18-20]，而對Talin施加與骨架力相當的力時，它們的相互作用會大幅增強。因此，有理由相信，膜錨定的Rap1b與Talin結合親和力的提高與機械力有一定關聯性。本研究以Talin-F0/Rap1b的復合物作為研究對象，采用分子動力學模擬技術，研究力調節Talin-F0/Rap1b結合親和力的動力學機制及分子基礎，以期深化對胞內機械信號傳導的認知，為針對Talin-F0/Rap1b相互作用的新型抗血栓藥物靶標的設計提供方向。
1 材料與方法
1.1 搭建體系
分子體系選自蛋白質數據庫（protein data bank，PDB）中Talin-F0/Rap1b復合物結構，代碼為6BA6[8]。該結構包含鼠源Talin-F0結構域的1～86號殘基，以及人源Rap1b的1～167號殘基。采用可視化分子模擬程序（visual molecular dynamics，VMD）[21]搭建體系，將蛋白浸入在邊長為復合物各方向上最遠處再延伸1.5 nm的TIP3P立方水體中，水框大小約為7.9 nm × 8.1 nm × 9.0 nm，并添加0.154 mol/L的NaCl使體系呈電中性，體系原子總數為54 289。
1.2 體系優化
為保證體系構象的穩定性和數據的可靠性，需要通過能量最小化對構象進一步優化，采用NAMD軟件[22]對體系進行3次1.5×104步能量最小化，力場文件選用CHARMM27[23]，過程采用周期性邊界條件，積分步長為2 fs。以最小化的最后一幀作為初始構象，在恒溫恒壓系綜下對體系進行三次40 ns平衡模擬。平衡時采用Langevin動力學控制溫度在310 K，壓強用Langevin活塞方法維持在1 atm，采用埃瓦爾德粒子網格算法（particle mesh Ewald，PME）處理靜電相互作用，范德華相互作用（van der Waals interaction）的截止點（cut off）設為1.2 nm[24-26]。
1.3 拉伸模擬
為模擬力對Talin-F0/Rap1b相互作用的影響，對達到平衡的復合物體系進行受控分子動力學模擬（steered molecular dynamics，SMD），SMD過程中采用先恒速度拉伸再恒力拉伸的方法。恒速拉伸方案為：以平衡后期穩定構象為起點，拉伸速度為0.2 nm/ns，彈簧系數為139 pN/nm，時長為30 ns。為模擬生理環境下Rap1b的C端與細胞膜的相互作用，固定點選取Rap1b C端Arg167的Cα原子；為模擬傳遞到Talin的骨架力，拉伸點選取F0結構域C端Arg86的Cα原子，拉伸方向為兩點連線方向。恒力拉伸方案為：分別選取恒速度拉伸過程中拉力加載到10、20、30和40 pN時的構象作為起點。去除虛擬彈簧，將力直接作用到拉伸原子上，維持力的大小不變，采用不同起始構象進行三次實驗，時長為40 ns。
1.4 數據分析
所有數據和蛋白結構可視化均采用VMD軟件。在恒速拉伸過程中，分別采用解離力、解離時間和應力累積來評價復合物的機械強度。其中，解離力定義為：力譜曲線的最大值；解離時間定義為：當拉力首次達到解離力所需的時間；應力累積，即力譜曲線下的積分面積，其區間為零時刻到解離時刻。為定量估計受配體蛋白的結合情況，分析了溶劑不可達表面積（buried solvent accessible surface area，Buried SASA）。采用相互作用能和結合自由能作為復合物熱力學指標，相互作用能包括靜電能和范德華能，相互作用能和Buried SASA都通過VMD腳本計算獲得。結合自由能包括真空的結合自由能、溶劑化自由能和熵變貢獻，由于在恒力下體系變化不大，故本研究忽略了熵變貢獻。采用分子力學泊松-波爾茲曼表面積（molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area，MM-PBSA）方法計算結合自由能。
為了更好地描述殘基—殘基的相互作用，本研究引入了殘基間相互作用指數Pij，即第i個配體殘基與第j個受體殘基結合的概率，定義為：
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其中，本研究將結合位點上每個氫鍵的形成與斷裂均視為獨立事件，用ωij,l表示第i個配體殘基和第j個受體殘基之間第l個氫鍵的生存率，ML（≥ 1）和MR（≥ 1）分別為參與結合的配體和受體殘基總數，Mij（≥ 0）表示第i個配體殘基與第j個受體殘基之間的氫鍵數。同樣地，本研究定義了Pj,L與Pj,R，分別為配體上第j個殘基與受體結合的概率和受體上第j個殘基與配體結合的概率：
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由此，本研究通過基于殘基相互作用的Pij估計配體與受體的解離概率PD為：
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此外，為了克服模擬計算與真實生理條件之間存在的時間尺度效應，得到與細胞水平實驗數據可比的結果，本研究引入了機械調節因子（相對解離概率），其定義為：
|
其中，f代表施加在復合物上的恒力， 的取值分別為0、10、20、30、40 pN。
1.5 統計分析
所有模擬進行三次獨立實驗，以平均值±標準差表示。兩組間的差異采用非配對雙尾學生t檢驗。采用Pearson相關性分析檢驗兩個變量的相關性。
2 結果與分析
2.1 平衡過程中Talin-F0/Rap1b的相互作用
為保證后續模擬初始構象的合理性并研究恒溫恒壓條件下Talin-F0/Rap1b的動態平衡相互作用，對系統進行了三次40 ns的平衡。結果表明，RMSD-Cα值在平衡20 ns后基本穩定，上下波動不超過0.1 nm（見圖1a）；回轉半徑也呈現相同趨勢（見圖1b）。這提示，通過40 ns的系統平衡之后，復合物處于平衡狀態。同時，三次平衡中，復合物結合面內氫鍵數目的均值都大于6個（見圖1c）。這意味著結合面內穩定的氫鍵相互作用維持了復合物的穩定性。另外，結合面氫鍵數目的頻數分布及其高斯擬合曲線表明氫鍵數目基本呈正態分布（見圖1d），三次擬合得出的擬合度R2都大于0.98，提示通過40 ns的系統平衡所獲得的構象樣本空間是準完備的，可作為后續拉伸分子動力學模擬的初始構象。
圖1
平衡過程中Talin-F0/Rap1b的穩定性分析
a. 復合物重原子RMSD值；b. 回轉半徑；c. 結合面氫鍵數目；d. 氫鍵數目頻數分布
Figure1. The stability analysis of the talin-F0/Rap1b complex during the equilibrium simulationa. Cα-RMSD of the complex; b. the radius of gyration; c. the H-bond number (
為揭示結合面上的關鍵殘基，我們計算了每個結合面氫鍵的生存率。表1展示了平衡過程中維持復合物穩定的關鍵殘基對的氫鍵生存率（選取均值>15%的殘基對）。其中F0結構域上LYS15和ARG35是經突變實驗驗證的參與Talin-F0/Rap1b相互作用的關鍵殘基[8]，而在三次模擬中LYS15和ARG35都能與Rap1b上兩個殘基形成生存率較高的氫鍵，得到了與實驗一致的結果，這證明了LYS15與ARG35對于Talin-F0/Rap1b穩定結合的重要貢獻；此外，F0結構域的β2片層上ASN12、VAL14和THR16也能與配體產生較強的相互作用，表明F0結構域的β2片層是維持復合物穩定的關鍵結構。
表1
平衡過程中復合物結合面上的重要氫鍵
Table1.
The hydrogen bonds with occupancy >15% of the equilibrated complex
2.2 Talin-F0/Rap1b的受力解離路徑與機械強度
為研究機械力作用下復合物的構象變化和解離過程，選取平衡后期的穩定構象進行恒速拉伸。通過分析拉伸過程中的力譜曲線，發現復合物的受力解離過程有兩種路徑，分別命名為Type 1和 Type 2，且兩者的解離力、解離時間和應力累積有顯著差異（見圖2）。一方面，兩種路徑的力譜曲線趨勢不同：在Type 1中，曲線在達到最大峰值之前，存在多個小峰，而Type 2中只存在一個明顯力峰（見圖2a-b）。另一方面，從力學性質來看，Type 1與Type 2的解離力分別為（237 ± 3）、（162 ± 4）pN，解離時間分別為（16.7 ± 1.4）、（8.0 ± 1.7）ns（見圖2c-d）。此外，我們引入了應力累積以更好地評估復合物的機械穩定性。兩種路徑的應力累積分別為（1 772 ± 237）、（652 ± 198）pN·ns（見圖2e）。以上結果表明，當復合物沿路徑1解離時，其機械強度能顯著提高。
圖2
Talin-F0/Rap1b存在兩條不同機械強度的解離路徑
a-b. 復合物沿解離路徑1或解離路徑2的力譜曲線；c. 解離力，
a-b. the time courses of loading force on the complex in type 1 or type 2, respectively; c. the rupture forces,
2.3 力誘導的變構提高了復合物的機械強度
為進一步研究兩種路徑中復合物機械強度存在差異的原因，觀察了復合物構象的動態演化，特別是重點關注直接受到拉力作用的F0結構域，拉伸過程中的快照如圖3所示（其中Rap1b為青色；F0結構域為紅色）。結果發現，在不同的解離路徑下，機械力誘導復合物的異構。在Type 1中，當拉伸3.2 ns時，F0結構域上拉伸點（綠色）所在的β4片層在力的作用下從β1-β4的平行結構中被拉出，這與力譜曲線中首次降至0左右的時間一致（見圖2a），該現象在Type 2中卻不存在。蛋白質的功能與構象密切相關，在3.2 ns之后，由于外力減小了β1片層對β4片層的約束，β4片層的柔性會明顯增加，這意味著，作用在β4片層的拉力很可能不會快速傳遞到結合面上，從而導致機械強度提高。因此，我們推斷影響復合物機械強度的關鍵事件很可能是Type 1中拉伸前期出現的力誘導的F0結構域構象改變。
圖3
拉力誘導的Talin-F0/Rap1b復合物解離快照
Figure3.
Pull-induced dissociation pathways snapshots of talin-F0/Rap1b complex
為明確力誘導的構象變化差異是否有統計學意義，分析兩種路徑下F0結構域上β1片層（LEU4和SER9的Cα原子連線方向）與β4片層（ASP77和TYR81的Cα原子連線方向）的夾角φ（見圖4a）。時間歷程曲線表明：當復合物受力沿著路徑1解離時，夾角φ不斷減小；而在路徑2中，夾角φ基本保持穩定（見圖4b）。觀察快照可得，復合物沿著解離路徑1拉伸10 ns后其F0結構域與初始構象有顯著區別（見圖4c）。通過比較夾角φ的均值，發現Type 1組的φ（125.8 ± 5.2）°顯著低于Type 2組（135.3 ± 1.4）°，表明兩者F0結構域的構象差異明顯（見圖4d）。進一步地，為揭示影響夾角φ變化的分子基礎，分析F0結構域的β1-β4片層上殘基對的氫鍵情況，發現在Type 2中LYS7-ASP77的生存率（86.4 ± 3.1）%顯著高于Type 1（44.7 ± 22.2）%（見圖4e）。同時，對夾角φ和LYS7-ASP77的氫鍵生存率進行Pearson相關性分析，發現兩者相關程度極強（見圖4f）。以上結果表明，當沿著路徑1解離時，力能通過進一步破壞LYS7-ASP77誘導出特定的構象，從而顯著提高機械強度。
圖4
力誘導復合物在解離路徑1下的變構
a. β1-β4片層夾角
a. diagram of the angle
2.4 雙相力依賴的Talin-F0/Rap1b相互作用
接著，用10、20、30、40 pN的恒力拉伸復合物40 ns并與平衡過程（0 pN）比較，以探究力對Talin-F0/Rap1b親和力的調控。隨著力的增大，氫鍵數目從7.4個增加到9.4個又隨之減少，呈現出對力的雙相依賴性，其最佳閾值點出現在20 pN（見圖5a）。為更好地衡量復合物解離情況，我們引入機械調節因子fD，fD值越低說明該條件下復合物越難解離。由圖5b可知，fD同樣受到力的雙相調控，0 pN比20 pN的解離概率高約33倍，充分說明20 pN的力能顯著增強Talin-F0/Rap1b的相互作用。采用Buried SASA表征結合面面積，發現在20 pN下，復合物結合面從約5.4 nm2增加到約7.2 nm2（見圖5c）。另外，當拉力不超過20 pN時，力能降低復合物的結合自由能與相互作用能，呈現力增強Talin-F0/Rap1b結合的效應（見圖5d-e）。這些結果表明，Talin-F0/Rap1b的相互作用服從“逆鎖-滑移鍵”機制。
圖5
力對Talin-F0與Rap1b相互作用的雙相調控
a. 氫鍵數目；b. 機械調節因子；c. 溶劑不可達表面積；d. 結合自由能；e. 相互作用能。當0 ≤
a. the
2.5 不同拉力下復合物結合面上殘基作用網絡的動態演化
為探究力改變復合物親和力的分子機制，分析了不同力對結合面上殘基作用指數的影響，選取指數超過0.2的11對殘基并繪制成熱圖（見圖6）。與平衡相比，恒力過程中新增了三對作用強度適中的殘基，其中，ASP54-ARG41和GLN18-THR65的作用指數都呈現出“逆鎖-滑移鍵”機制。此外，結合強度最高的三對殘基ASN12-ARG41、VAL14-SER39、ARG35-ASP33受力波動不大。最后，對剩下的六對殘基而言，盡管增強效果最好的力不是20 pN，但總體上，有力條件更能增強它們的作用指數。綜上，我們推斷力調控Talin-F0/Rap1b結合親和力變化的機制為：低力條件（不超過20 pN）可以增強ASP54-ARG41和GLN18-THR65等力敏感殘基對的作用能力；而ASN12-ARG41、VAL14-SER39、ARG35-ASP33這些維持結合面的關鍵殘基，則具有一定的機械穩定性從而抵抗力的破壞。兩種類型殘基互相配合，實現了不同大小的力對Talin-F0/Rap1b的結合親和力的動態調控。
圖6
力依賴的殘基相互作用網絡的演變
Figure6.
Evolution of force-dependent residue interaction networks
3 討論
Talin-F0結構域與錨定在膜上的Rap1b的相互作用是幫助Talin解除自抑制構象并將其從細胞質招募到細胞膜的初始步驟，對生理或病理條件下血栓的形成至關重要。Liao等[27]發現，如果破壞了Talin/Rap1b的相互作用，即使事先讓Talin募集到膜上也不足以誘導整合素的激活，這表明保持Talin/Rap1b通路穩定對激活整合素的重要性。然而目前關于Talin-F0/Rap1b的力學性質的相關研究尚未報道。本文通過研究機械環境下Talin-F0/Rap1b的相互作用，試圖深入認識生理條件下Talin-F0/Rap1b介導的整合素持續激活的動態過程，從原子水平揭示Talin-F0/Rap1b相互作用的力調控機制以及結合面殘基作用的關鍵信息。
結果表明，Talin-F0/Rap1b在平衡過程中具有較好的穩定性（見圖1），而F0結構域的β2片層是維持復合物穩定的關鍵結構。在恒速拉伸過程中，復合物存在兩種解離路徑且機械強度有顯著差異（見圖2）。通過復合物解離快照和構象定量分析（見圖3-4），發現在Type 1中，F0結構域上的β1-β4片層的夾角φ發生明顯變化，這與β1-β4片層上殘基對LYS7-ASP77的相互作用密切相關。恒力結果表明，Talin-F0/Rap1b具有較好的機械穩定性，當力達到40 pN時，復合物構象還能保持平衡態。同時，Talin-F0/Rap1b的相互作用具有雙相力依賴機制，20 pN下復合物的相對解離概率降低至0.03（見圖5）。殘基對ASP54-ARG41和GLN18-THR65在力對復合物親和力的調控中發揮著重要作用（見圖6）。
值得注意的是，相關研究報道Talin-F0在溶液中與Rap1b的結合親和力很弱[28]。雖然Talin-F0和膜錨定的Rap1b相互作用可以使其結合能力比在溶液中提高兩個數量級，但具體機制尚未闡明。本文發現的20 pN下復合物的結合親和力顯著提升，或許能夠回答前述問題，當Rap1b錨定在膜上時，細胞膜能對復合物施加一個支點，使機械力增強兩者的結合親和力。這種黏附分子間的逆鎖鍵現象在許多研究中都能觀測到，如β2整合素與ICAM-1[29]、β3整合素與Kindlin-2[30]。本文發現的Talin-F0/Rap1b相互作用的雙相力依賴性或許能夠解釋生理過程中Talin-F0/Rap1b的相互作用：在力還沒加載到復合物時，Talin-F0/Rap1b的解離過程較為快速，只有部分保持信號連通，使機械信號傳導成為可能；當力不斷加強時，Talin-F0/Rap1b的信號連通也不斷加強，這將穩定力信號的傳導，從而形成相對穩定的動態平衡；若力進一步加強，由于此時力對復合物的調控表現為抑制，信號不斷減弱，最終細胞回歸于靜息態。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：吳建華和方穎設計實驗；黃文華參與研究計劃修訂；余哲和姬彥儒分別負責全部和部分研究以及分析數據；余哲、吳建華和方穎撰寫論文。
