本文系統綜述了活細胞超分辨熒光顯微成像技術相關研究進展，探討了領域內研究現狀及熱點問題，并歸納總結了超分辨技術在活細胞成像中的應用。本文具體概括了該技術在相關領域取得的多方面研究進展，其中結構光照明顯微術、受激發射損耗顯微術以及最低光子通量顯微術是當前研究的熱點和前沿。根據當前領域內的發展態勢，本文預計未來基于人工智能和熒光探針及其標記方法的創新將是該領域未來一段時間的重點發展方向。
引用本文： 程雨飛, 李薇, 金婷婷, 吳思思, 張龍浩. 活細胞超分辨熒光顯微成像技術前沿與進展. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(1): 180-184. doi: 10.7507/1001-5515.202210060 復制
0 引言
熒光顯微成像技術是探索生命科學和生物醫學問題的重要工具，具有其它研究手段不可替代的優勢。目前有多類適用于人體疾病模型的可用于熒光顯微成像的細胞系，而相較于其他觀察方法，細胞成像具有不可比擬的高通量、重復性、可操縱性，是激光共聚焦等主流熒光顯微成像方法的核心模型。超分辨熒光顯微成像技術可以繞過光學衍射極限對傳統光學顯微成像分辨率的限制（約200 nm），讓激光共聚焦等常規成像模式下觀察不到的納米級結構可視化，從而實現活細胞超微結構的動態超高分辨率追蹤，例如對神經細胞突起及樹突棘[1]、線粒體分裂及融合[2]，以及對內質網[3]等的觀察是其重要的應用場景。活細胞超分辨熒光顯微成像是較為新興的領域，相關研究及應用技術于2 000年之后開始出現，并隨著時間呈波動上升趨勢，這些研究主要由美國、德國、英國、中國主導。該技術歷經20年的發展，至今受到了越來越多的關注和重視，相關領域的研究與應用也越來越廣泛。本文旨在全面梳理這一領域的研究現狀，并總結相關前沿進展，為讀者在該領域的探索提供參考。
1 活細胞超分辨熒光顯微成像技術研究前沿與熱點
活細胞超分辨熒光顯微成像技術目前的研究熱點主要集中于結構光照明顯微術（structured illumination microscopy，SIM）、受激發射損耗顯微術（stimulated emission depletion microscopy，STED）、最低光子通量顯微術（minimal photon fluxes，MINFLUX）這三大方向。
1.1 結構光照明顯微術
SIM是Gustafsson[4]提出的一種基于頻域調制的超分辨技術，基本原理是通過對樣品的高頻信息和已知的高頻光柵進行調制編碼后得到低頻的摩爾條紋，經相機接收后通過傅里葉變換調整空間域和頻域，從而解碼出樣品細節。相較于能將分辨率提升至20 nm的單分子定位等顯微成像技術，SIM受限于成像原理，其橫向分辨率普遍最多只能提升至100 nm左右，因而遠不及其他超分辨技術。但SIM所具備的快速和大視野寬場成像能力、對熒光標記物的非特異性需求，以及較低的激發光強所帶來的低光毒性，使其成為活細胞成像方面最適合、應用最多的超分辨技術[5-6]。
相較于常規高分辨共聚焦成像，SIM依賴更強的激發光，并且需要捕獲多幅原始圖以組建最終圖像。自該技術普及以來，相繼產生了很多致力于縮減捕獲原始圖像的數量以控制曝光程度并提升時間分辨率的新算法。但總的來說，相較于常規SIM算法，經處理后的圖像質量存在偏差并且需要額外調整參數[7]。隨著技術不斷進步，深度學習的應用對圖像質量的保持起到了較大的改善，在實現高通量成像的同時維持了分辨率等指標[7-8]。Jin等[8]將卷積神經網絡架構的U型網絡（U-Net）用于SIM，經訓練后將所需的原始圖像數量縮減了5倍，并在低光照（光子數<100×）條件下產出了分辨率接近于常規SIM重構算法的圖像，該方法在不同細胞結構下均經過了驗證。這項研究首次實現了深度學習方法在低光照條件下對SIM超分辨成像速率的有效提升。后來另一卷積神經網絡架構—循環一致性生成對抗網絡（cycle-consistent generative adversarial networks，CycleGAN）也被應用于SIM超分辨重構，該方法無需自定義參數，能較簡便地在任何SIM數據集中執行，并且不依賴樣品結構信息的先驗知識[7]。相較而言，U-Net的訓練由于需耗費大量計算資源，其訓練效率遠不及CycleGAN方法。
超分辨成像中的偽影部分源自于活細胞中移動速率偏快的熒光標記對象。基于此F?rster等[9]提出了一種具備定位活體運動偽影的SIM重構算法，首次在超分辨結果圖像中精準定位并標記了運動偽影。該方法讓用戶能夠有機會判斷產出的SIM圖像是否被活體的運動所影響。該檢測程序經修正和完善后增強了穩定性，對偏暗對象的檢測靈敏度大幅提升，能夠對定位到的運動偽影進行分類[10]。此外，針對SIM重構算法的固有缺陷導致的重構偽影，Wen等[11]開發出了基于點擴散函數（point spread function，PSF）工程優化的高保真SIM（high-fidelity SIM，HiFi-SIM）重構算法用于有效去除常規SIM算法產生的重構偽影。通過兩部頻譜優化流程，Hifi-SIM可在識別活細胞精細結構和偏暗結構的基礎上更有效地抑制殘留背景熒光信號等常見偽影，并且高背景下常規SIM的光學層切能力也獲得了提升。同時，該方法對一些常用的重構相關參數的不敏感性降低了成像后對PSF等參數修正的復雜要求，提升了易用性。
為有效提升活細胞超分辨顯微鏡的時間分辨率和成像時間，陳良怡團隊開發了基于海森矩陣（Hessian matrix）的SIM反卷積算法（Hessian-SIM），利用連續性的多維度生物樣品結構作為先驗知識指導圖像重構[12]。Hessian-SIM能夠以88 nm空間分辨率和188 Hz的速度對活細胞內質網中移動的囊泡和網環進行快速成像并有效屏蔽噪音，首次捕捉到了線粒體嵴與內質網之間的動態相互作用與變化，其特有的高靈敏度及相應的高采集速率大大降低了光漂白，進而顯著增強了對活細胞的超分辨連續成像。該方法在低光照下對時間分辨率和成像時間的提升相對于其他算法有極其顯著的優勢，同時適用于各類SIM模塊，但是其空間分辨率仍普遍維持于90～100 nm。基于此，該團隊進一步在新計算原理的基礎上開發了兩部迭代解卷積算法，即稀疏反卷積（sparse deconvolution）方法，將活細胞成像的最高空間分辨率拓展至了60 nm，幀率達到了564 Hz[13]。相較于常規深度學習超分辨顯微重構，sparse deconvolution不依賴于樣本形態與熒光顯微鏡種類，而是基于信號的時空連續性和熒光超分辨圖像的相對稀疏性這兩個先驗知識，因此是可通用的熒光超分辨成像算法，可處理不同熒光顯微成像平臺產出的各類樣品。例如，該方法可用于增進搭載于轉盤式激光共聚焦的SIM的分辨率，即便在低信噪比條件下也可獲得90 nm空間分辨率的四通道三維活細胞成像。
1.2 受激發射損耗顯微術
STED是由Hell等[14]的研究團隊研發出的遠場超分辨顯微成像技術，其基本工作原理是在常規點掃描激光共聚焦顯微成像系統的基礎上添加一束與共聚焦激發光共線的受激發射損耗激光同時照射樣品，在熒光團被激發后處于高能態階段時，STED損耗光以環狀的形式重疊在激發光斑中邊沿區域，使得這部分的熒光團迅速返回基態而不再發出熒光，從而起到了壓縮有效PSF尺寸、提高分辨率的效果。目前商用STED系統的細胞成像經優化可普遍達到50～60 nm的橫向分辨率[15]。STED是僅有的成像過程無需算法處理的純光學超分辨技術，因而完全規避了引入數學計算所導致的不確定性，同時其工作方式及成像速率類似于常規點掃描共聚焦顯微鏡，總體而言在活細胞成像領域的應用具有很大的優勢。用戶可實時調節STED損耗光的功率來調整分辨率，持續增強的損耗光會進一步壓縮中央有效激發區域從而解析出更好的分辨率。但分辨率同等程度的提升需要損耗光功率非線性的增強，由此將大幅增加光漂白和光毒性，例如將分辨率提升至30～50 nm需要約10～100 MW/cm2的高功率STED激光[15]。近年來相繼產生了基于時間門控(clock-gating)的STED（gated-STED）以及基于全脈沖匹配的STED（pulsed-STED）等各類改進型成像方法，可在維持分辨率的同時將損耗光功率有效降低[16-20]。其中比較重要的一項進展是基于人工智能的自適應照明方式的最小動態強度STED (dynamic intensity minimum STED，DyMIN-STED) 的推出，即在掃描中通過樣品的標記密度實時調節STED損耗光強，例如僅當熒光團位于掃描區域的中心位置時提供最高功率的損耗光[21-22]。相較于儀器本身的更新，新型熒光探針的開發與改進在STED的活細胞超分辨成像應用中有著更為直接和重要的影響，因而是該方向目前主要的研究熱點[6]。
D’Este等[23]在初期基于耐漂白性、高滲透性且細胞膜滲透性強的硅基羅丹明構建了硅基羅丹明-肌動蛋白（silicon rhodamine actin，SiR-Actin）標簽，對活海馬神經元進行標記并用STED成功表征了先前始終無法清楚判定的肌動蛋白在神經元和軸突始段的分布狀態。該實驗通過觀測活神經元樹突與軸突中廣泛存在的周期性細胞骨架相關結構，闡明了肌動蛋白對神經元極性的維護作用，同時表明了細胞骨架蛋白在控制和調配神經元功能、發育及可塑性方面存在新的作用。該方法在活神經元中的有效應用，推進了神經生物學的研究，強調了開發合適的特異性熒光探針應用于前沿超分辨成像的重要性，很大程度地刺激了STED活細胞成像應用的需求和發展。后續研究中，Lukinavicius等[24] 使用新型熒光染料連接紫杉醇以標記微管蛋白，合成了適用于活體和活細胞成像的熒光探針。探針經優化后用STED系統以29 nm空間分辨率對標記的活體人成纖維細胞的微管蛋白進行超分辨成像，超出了先前所有STED活細胞成像所達到的分辨度，而針對熒光基團和配體的進一步優化則可使之標記其他細胞結構。這些工作幫助構建了發展相應結構探針的平臺，并有效推進了后續STED超分辨在這些活體結構成像的應用。
活細胞成像很重要的一方面是可對動力學過程進行較長時程的有效觀測，但高功率STED利用受激損耗激光對熒光團的快速光漂白以及對細胞的光損傷很大程度限制了這方面的應用。基于此，Wang等[25]開發出了一種新型黃色高效線粒體靶向（MitoPB Yellow）熒光探針，能夠在gated-STED成像下觀測活細胞線粒體內膜的動態變化，該探針具備光穩定性強、熒光壽命長、能對活細胞線粒體內膜進行特異性標記等特點。該實驗還對活細胞線粒體內膜進行了1.54 幀/s的超過1 000幀的動力學成像，并成功捕捉到了單個線粒體內嵴的快速合并以及線粒體之間的相互融合過程。另外，Yang等[26]研發出了一種適用于活細胞的低飽和強度和高光穩定性的新型芳酸變體染料，相較于其他同類標記物，其主要優勢在于能夠在偏低功率的STED光下產生受激輻射，進而讓細胞在更加原生狀態下進行成像。經完善后的標記方法在實驗中以35 nm的分辨率實現了對線粒體內膜長達50 min的延時成像，并清晰地觀測到了線粒體融合與裂變過程中線粒體嵴的狀態演變。該染料的高特異性以及在低功率STED中的突出表現顯示其可作為活細胞線粒體動態超高分辨成像的下一代標準，并能被廣泛應用于線粒體相關的細胞行為的研究以及線粒體進化之謎的探索[26]。
1.3 最低光子通量顯微術
近年來，Balzarotti等[27]研發出一種新型的單分子定位成像（single molecule localization microscopy，SMLM）方法——最低光子通量顯微術（minimal photon fluxes，MINFLUX），并將其用于超分辨成像。該方法利用中心光強為0而往外逐漸增強的環形激發光對同一熒光分子4個特定位置的采集，并依據獲得的光子數之前的比例關系來確立熒光分子的空間位置。傳統SMLM需要相機持續采集盡量多的衍射極限像點，然后通過算法估算單個熒光分子的中心位置進而重建出結果圖像，其定位精度依賴于捕獲的光子數而需要較長的采集時間。采集時，如果耗時過長，一方面很大程度限制了成像的時間分辨率，另一方面生物樣品（尤其是活體）不可避免的微移也會影響定位精度；再加上長時間成像所導致的光漂白、相機背景、發射態分子未知的極性方向及湍動等因素對相機上光點精度的影響，導致其在生物樣品上實際產生的最好分辨率僅約為20 nm。而MINFLUX方法則以盡可能小的激發強度和最少信號光子數（僅為傳統質心定位法的1/22），即時標定熒光分子的位置，從而顯著提升了定位精度和時間分辨率。
Balzarotti等[27]的研究顯示，MINFLUX技術高達1 nm左右的定位精度可很好地分辨出間距僅6 nm的DNA折紙結構。相較于傳統SMLM方法，對活大腸桿菌中單個30 S核糖體蛋白亞單位的動態監測可使時間分辨率提升100倍。隨后的實驗中，Eilers等[28]以納米級別的分辨率將采集時間間隔縮短至1 ms以內。應用MINFLUX技術，后續還實現了對活細胞的三維多通道超分辨成像，以接近單個熒光標記物的分辨率（約2 nm）觀察到了人骨肉瘤細胞（U2OS）活細胞中的核孔復合物Nup96蛋白[29]。該技術同樣以納米級別的分辨率和分子水平的定位精度對線粒體接觸位點和嵴組織系統復合物進行了解析[30]。需要指出的是，MINFLUX偏小的成像視野使其應用相對局限于單分子追蹤，難以達到基于相機寬場成像的SIM技術對生物樣品大范圍特征的把控程度，其實際通量相較于其他超分辨方法尚存較大差距，因而很大程度限制了從中挖掘出具有統計學意義的生物信息的能力[31]。
目前商用的MINFLUX系統局限于其開創團隊德國Abberior公司，相關研發和應用依賴于其自身特殊的定制化顯微鏡。為擴展應用范圍，很重要的一環是抗振系統相關的設計。近期，該團隊成功地將MINFLUX在一套標準顯微鏡上以普通實驗流程實現了1～3 nm分辨率等一系列指標，促進了該技術在其他熒光顯微成像平臺的拓展[32]。在顯微成像的分辨度達到分子級別（1～5 nm）的情況下，對波動和漂移的控制便成為了分辨率進一步提升的重要因素[32]。另外，熒光探針的標記是超分辨技術發展中的一大關鍵制約因素，當前光學超分辨成像僅能從所標記的抗原表位的位置信息解析出整體結構，受限于標記物的大小和標記密度，所能達到的分辨率極限在1 nm左右[31]，突破此限制需要全新的標記策略。
2 總結與展望
本文全面回顧了近階段以活細胞超分辨熒光顯微成像技術為主題的研究，該領域的研究整體呈現逐年上升趨勢，在國內外已形成一定規模的研究群體。該技術的主要發文期刊涵蓋了生物物理、生物化學、細胞生物學、分子生物學、信息技術以及材料等各類專業領域，指向該技術多學科交叉的特征。結合近年來各大研究機構的研發動向與活躍度，針對該領域的研究大致是美國與德國處于主導地位，尤其是Hell等[14]團隊開創了STED與MINFLUX兩大方向并且主導了其后續的重要進展。總體而言，超分辨技術作為生物成像的一項新興工具極大推動了生物學的進步，今后也將發揮越來越重要的作用。
SIM是活細胞成像中應用得最早、最廣泛、最成熟的超分辨技術，目前主要的工作和研究熱點集中于對重構算法的更新，但受其成像原理的制約最多僅能將橫向分辨率提升至傳統光學顯微鏡的2倍多。STED和單分子定位術等其他超分辨方法理論上可以將分辨率提升至單分子級別，但實際活體成像中受限于各種因素，難以達到預期的水平。STED這幾年研究的主要熱點在于各類熒光探針的更新和優化，并且側重于降低成像方式對活細胞的光毒性。MINFLUX則是目前唯一的三維分辨率可達到2～3 nm的光學成像系統，但其應用范圍局限于單分子追蹤，后續各方面的推廣和發展有待觀察。值得關注的是，新型熒光探針及標記方法的開發可能在未來技術突破中起到關鍵性的作用。另外，人工智能算法對超分辨技術各方面的拓展和更新也起到了很大的作用，一直是醫學成像領域中的熱門課題，預計未來基于這方面的新興應用和探索會逐漸增多，并產出能進一步助力生物醫學科研的成果。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：程雨飛撰寫論文初稿，李薇、金婷婷、吳思思參與修改論文，張龍浩指導、修改及審校論文。
0 引言
熒光顯微成像技術是探索生命科學和生物醫學問題的重要工具，具有其它研究手段不可替代的優勢。目前有多類適用于人體疾病模型的可用于熒光顯微成像的細胞系，而相較于其他觀察方法，細胞成像具有不可比擬的高通量、重復性、可操縱性，是激光共聚焦等主流熒光顯微成像方法的核心模型。超分辨熒光顯微成像技術可以繞過光學衍射極限對傳統光學顯微成像分辨率的限制（約200 nm），讓激光共聚焦等常規成像模式下觀察不到的納米級結構可視化，從而實現活細胞超微結構的動態超高分辨率追蹤，例如對神經細胞突起及樹突棘[1]、線粒體分裂及融合[2]，以及對內質網[3]等的觀察是其重要的應用場景。活細胞超分辨熒光顯微成像是較為新興的領域，相關研究及應用技術于2 000年之后開始出現，并隨著時間呈波動上升趨勢，這些研究主要由美國、德國、英國、中國主導。該技術歷經20年的發展，至今受到了越來越多的關注和重視，相關領域的研究與應用也越來越廣泛。本文旨在全面梳理這一領域的研究現狀，并總結相關前沿進展，為讀者在該領域的探索提供參考。
1 活細胞超分辨熒光顯微成像技術研究前沿與熱點
活細胞超分辨熒光顯微成像技術目前的研究熱點主要集中于結構光照明顯微術（structured illumination microscopy，SIM）、受激發射損耗顯微術（stimulated emission depletion microscopy，STED）、最低光子通量顯微術（minimal photon fluxes，MINFLUX）這三大方向。
1.1 結構光照明顯微術
SIM是Gustafsson[4]提出的一種基于頻域調制的超分辨技術，基本原理是通過對樣品的高頻信息和已知的高頻光柵進行調制編碼后得到低頻的摩爾條紋，經相機接收后通過傅里葉變換調整空間域和頻域，從而解碼出樣品細節。相較于能將分辨率提升至20 nm的單分子定位等顯微成像技術，SIM受限于成像原理，其橫向分辨率普遍最多只能提升至100 nm左右，因而遠不及其他超分辨技術。但SIM所具備的快速和大視野寬場成像能力、對熒光標記物的非特異性需求，以及較低的激發光強所帶來的低光毒性，使其成為活細胞成像方面最適合、應用最多的超分辨技術[5-6]。
相較于常規高分辨共聚焦成像，SIM依賴更強的激發光，并且需要捕獲多幅原始圖以組建最終圖像。自該技術普及以來，相繼產生了很多致力于縮減捕獲原始圖像的數量以控制曝光程度并提升時間分辨率的新算法。但總的來說，相較于常規SIM算法，經處理后的圖像質量存在偏差并且需要額外調整參數[7]。隨著技術不斷進步，深度學習的應用對圖像質量的保持起到了較大的改善，在實現高通量成像的同時維持了分辨率等指標[7-8]。Jin等[8]將卷積神經網絡架構的U型網絡（U-Net）用于SIM，經訓練后將所需的原始圖像數量縮減了5倍，并在低光照（光子數<100×）條件下產出了分辨率接近于常規SIM重構算法的圖像，該方法在不同細胞結構下均經過了驗證。這項研究首次實現了深度學習方法在低光照條件下對SIM超分辨成像速率的有效提升。后來另一卷積神經網絡架構—循環一致性生成對抗網絡（cycle-consistent generative adversarial networks，CycleGAN）也被應用于SIM超分辨重構，該方法無需自定義參數，能較簡便地在任何SIM數據集中執行，并且不依賴樣品結構信息的先驗知識[7]。相較而言，U-Net的訓練由于需耗費大量計算資源，其訓練效率遠不及CycleGAN方法。
超分辨成像中的偽影部分源自于活細胞中移動速率偏快的熒光標記對象。基于此F?rster等[9]提出了一種具備定位活體運動偽影的SIM重構算法，首次在超分辨結果圖像中精準定位并標記了運動偽影。該方法讓用戶能夠有機會判斷產出的SIM圖像是否被活體的運動所影響。該檢測程序經修正和完善后增強了穩定性，對偏暗對象的檢測靈敏度大幅提升，能夠對定位到的運動偽影進行分類[10]。此外，針對SIM重構算法的固有缺陷導致的重構偽影，Wen等[11]開發出了基于點擴散函數（point spread function，PSF）工程優化的高保真SIM（high-fidelity SIM，HiFi-SIM）重構算法用于有效去除常規SIM算法產生的重構偽影。通過兩部頻譜優化流程，Hifi-SIM可在識別活細胞精細結構和偏暗結構的基礎上更有效地抑制殘留背景熒光信號等常見偽影，并且高背景下常規SIM的光學層切能力也獲得了提升。同時，該方法對一些常用的重構相關參數的不敏感性降低了成像后對PSF等參數修正的復雜要求，提升了易用性。
為有效提升活細胞超分辨顯微鏡的時間分辨率和成像時間，陳良怡團隊開發了基于海森矩陣（Hessian matrix）的SIM反卷積算法（Hessian-SIM），利用連續性的多維度生物樣品結構作為先驗知識指導圖像重構[12]。Hessian-SIM能夠以88 nm空間分辨率和188 Hz的速度對活細胞內質網中移動的囊泡和網環進行快速成像并有效屏蔽噪音，首次捕捉到了線粒體嵴與內質網之間的動態相互作用與變化，其特有的高靈敏度及相應的高采集速率大大降低了光漂白，進而顯著增強了對活細胞的超分辨連續成像。該方法在低光照下對時間分辨率和成像時間的提升相對于其他算法有極其顯著的優勢，同時適用于各類SIM模塊，但是其空間分辨率仍普遍維持于90～100 nm。基于此，該團隊進一步在新計算原理的基礎上開發了兩部迭代解卷積算法，即稀疏反卷積（sparse deconvolution）方法，將活細胞成像的最高空間分辨率拓展至了60 nm，幀率達到了564 Hz[13]。相較于常規深度學習超分辨顯微重構，sparse deconvolution不依賴于樣本形態與熒光顯微鏡種類，而是基于信號的時空連續性和熒光超分辨圖像的相對稀疏性這兩個先驗知識，因此是可通用的熒光超分辨成像算法，可處理不同熒光顯微成像平臺產出的各類樣品。例如，該方法可用于增進搭載于轉盤式激光共聚焦的SIM的分辨率，即便在低信噪比條件下也可獲得90 nm空間分辨率的四通道三維活細胞成像。
1.2 受激發射損耗顯微術
STED是由Hell等[14]的研究團隊研發出的遠場超分辨顯微成像技術，其基本工作原理是在常規點掃描激光共聚焦顯微成像系統的基礎上添加一束與共聚焦激發光共線的受激發射損耗激光同時照射樣品，在熒光團被激發后處于高能態階段時，STED損耗光以環狀的形式重疊在激發光斑中邊沿區域，使得這部分的熒光團迅速返回基態而不再發出熒光，從而起到了壓縮有效PSF尺寸、提高分辨率的效果。目前商用STED系統的細胞成像經優化可普遍達到50～60 nm的橫向分辨率[15]。STED是僅有的成像過程無需算法處理的純光學超分辨技術，因而完全規避了引入數學計算所導致的不確定性，同時其工作方式及成像速率類似于常規點掃描共聚焦顯微鏡，總體而言在活細胞成像領域的應用具有很大的優勢。用戶可實時調節STED損耗光的功率來調整分辨率，持續增強的損耗光會進一步壓縮中央有效激發區域從而解析出更好的分辨率。但分辨率同等程度的提升需要損耗光功率非線性的增強，由此將大幅增加光漂白和光毒性，例如將分辨率提升至30～50 nm需要約10～100 MW/cm2的高功率STED激光[15]。近年來相繼產生了基于時間門控(clock-gating)的STED（gated-STED）以及基于全脈沖匹配的STED（pulsed-STED）等各類改進型成像方法，可在維持分辨率的同時將損耗光功率有效降低[16-20]。其中比較重要的一項進展是基于人工智能的自適應照明方式的最小動態強度STED (dynamic intensity minimum STED，DyMIN-STED) 的推出，即在掃描中通過樣品的標記密度實時調節STED損耗光強，例如僅當熒光團位于掃描區域的中心位置時提供最高功率的損耗光[21-22]。相較于儀器本身的更新，新型熒光探針的開發與改進在STED的活細胞超分辨成像應用中有著更為直接和重要的影響，因而是該方向目前主要的研究熱點[6]。
D’Este等[23]在初期基于耐漂白性、高滲透性且細胞膜滲透性強的硅基羅丹明構建了硅基羅丹明-肌動蛋白（silicon rhodamine actin，SiR-Actin）標簽，對活海馬神經元進行標記并用STED成功表征了先前始終無法清楚判定的肌動蛋白在神經元和軸突始段的分布狀態。該實驗通過觀測活神經元樹突與軸突中廣泛存在的周期性細胞骨架相關結構，闡明了肌動蛋白對神經元極性的維護作用，同時表明了細胞骨架蛋白在控制和調配神經元功能、發育及可塑性方面存在新的作用。該方法在活神經元中的有效應用，推進了神經生物學的研究，強調了開發合適的特異性熒光探針應用于前沿超分辨成像的重要性，很大程度地刺激了STED活細胞成像應用的需求和發展。后續研究中，Lukinavicius等[24] 使用新型熒光染料連接紫杉醇以標記微管蛋白，合成了適用于活體和活細胞成像的熒光探針。探針經優化后用STED系統以29 nm空間分辨率對標記的活體人成纖維細胞的微管蛋白進行超分辨成像，超出了先前所有STED活細胞成像所達到的分辨度，而針對熒光基團和配體的進一步優化則可使之標記其他細胞結構。這些工作幫助構建了發展相應結構探針的平臺，并有效推進了后續STED超分辨在這些活體結構成像的應用。
活細胞成像很重要的一方面是可對動力學過程進行較長時程的有效觀測，但高功率STED利用受激損耗激光對熒光團的快速光漂白以及對細胞的光損傷很大程度限制了這方面的應用。基于此，Wang等[25]開發出了一種新型黃色高效線粒體靶向（MitoPB Yellow）熒光探針，能夠在gated-STED成像下觀測活細胞線粒體內膜的動態變化，該探針具備光穩定性強、熒光壽命長、能對活細胞線粒體內膜進行特異性標記等特點。該實驗還對活細胞線粒體內膜進行了1.54 幀/s的超過1 000幀的動力學成像，并成功捕捉到了單個線粒體內嵴的快速合并以及線粒體之間的相互融合過程。另外，Yang等[26]研發出了一種適用于活細胞的低飽和強度和高光穩定性的新型芳酸變體染料，相較于其他同類標記物，其主要優勢在于能夠在偏低功率的STED光下產生受激輻射，進而讓細胞在更加原生狀態下進行成像。經完善后的標記方法在實驗中以35 nm的分辨率實現了對線粒體內膜長達50 min的延時成像，并清晰地觀測到了線粒體融合與裂變過程中線粒體嵴的狀態演變。該染料的高特異性以及在低功率STED中的突出表現顯示其可作為活細胞線粒體動態超高分辨成像的下一代標準，并能被廣泛應用于線粒體相關的細胞行為的研究以及線粒體進化之謎的探索[26]。
1.3 最低光子通量顯微術
近年來，Balzarotti等[27]研發出一種新型的單分子定位成像（single molecule localization microscopy，SMLM）方法——最低光子通量顯微術（minimal photon fluxes，MINFLUX），并將其用于超分辨成像。該方法利用中心光強為0而往外逐漸增強的環形激發光對同一熒光分子4個特定位置的采集，并依據獲得的光子數之前的比例關系來確立熒光分子的空間位置。傳統SMLM需要相機持續采集盡量多的衍射極限像點，然后通過算法估算單個熒光分子的中心位置進而重建出結果圖像，其定位精度依賴于捕獲的光子數而需要較長的采集時間。采集時，如果耗時過長，一方面很大程度限制了成像的時間分辨率，另一方面生物樣品（尤其是活體）不可避免的微移也會影響定位精度；再加上長時間成像所導致的光漂白、相機背景、發射態分子未知的極性方向及湍動等因素對相機上光點精度的影響，導致其在生物樣品上實際產生的最好分辨率僅約為20 nm。而MINFLUX方法則以盡可能小的激發強度和最少信號光子數（僅為傳統質心定位法的1/22），即時標定熒光分子的位置，從而顯著提升了定位精度和時間分辨率。
Balzarotti等[27]的研究顯示，MINFLUX技術高達1 nm左右的定位精度可很好地分辨出間距僅6 nm的DNA折紙結構。相較于傳統SMLM方法，對活大腸桿菌中單個30 S核糖體蛋白亞單位的動態監測可使時間分辨率提升100倍。隨后的實驗中，Eilers等[28]以納米級別的分辨率將采集時間間隔縮短至1 ms以內。應用MINFLUX技術，后續還實現了對活細胞的三維多通道超分辨成像，以接近單個熒光標記物的分辨率（約2 nm）觀察到了人骨肉瘤細胞（U2OS）活細胞中的核孔復合物Nup96蛋白[29]。該技術同樣以納米級別的分辨率和分子水平的定位精度對線粒體接觸位點和嵴組織系統復合物進行了解析[30]。需要指出的是，MINFLUX偏小的成像視野使其應用相對局限于單分子追蹤，難以達到基于相機寬場成像的SIM技術對生物樣品大范圍特征的把控程度，其實際通量相較于其他超分辨方法尚存較大差距，因而很大程度限制了從中挖掘出具有統計學意義的生物信息的能力[31]。
目前商用的MINFLUX系統局限于其開創團隊德國Abberior公司，相關研發和應用依賴于其自身特殊的定制化顯微鏡。為擴展應用范圍，很重要的一環是抗振系統相關的設計。近期，該團隊成功地將MINFLUX在一套標準顯微鏡上以普通實驗流程實現了1～3 nm分辨率等一系列指標，促進了該技術在其他熒光顯微成像平臺的拓展[32]。在顯微成像的分辨度達到分子級別（1～5 nm）的情況下，對波動和漂移的控制便成為了分辨率進一步提升的重要因素[32]。另外，熒光探針的標記是超分辨技術發展中的一大關鍵制約因素，當前光學超分辨成像僅能從所標記的抗原表位的位置信息解析出整體結構，受限于標記物的大小和標記密度，所能達到的分辨率極限在1 nm左右[31]，突破此限制需要全新的標記策略。
2 總結與展望
本文全面回顧了近階段以活細胞超分辨熒光顯微成像技術為主題的研究，該領域的研究整體呈現逐年上升趨勢，在國內外已形成一定規模的研究群體。該技術的主要發文期刊涵蓋了生物物理、生物化學、細胞生物學、分子生物學、信息技術以及材料等各類專業領域，指向該技術多學科交叉的特征。結合近年來各大研究機構的研發動向與活躍度，針對該領域的研究大致是美國與德國處于主導地位，尤其是Hell等[14]團隊開創了STED與MINFLUX兩大方向并且主導了其后續的重要進展。總體而言，超分辨技術作為生物成像的一項新興工具極大推動了生物學的進步，今后也將發揮越來越重要的作用。
SIM是活細胞成像中應用得最早、最廣泛、最成熟的超分辨技術，目前主要的工作和研究熱點集中于對重構算法的更新，但受其成像原理的制約最多僅能將橫向分辨率提升至傳統光學顯微鏡的2倍多。STED和單分子定位術等其他超分辨方法理論上可以將分辨率提升至單分子級別，但實際活體成像中受限于各種因素，難以達到預期的水平。STED這幾年研究的主要熱點在于各類熒光探針的更新和優化，并且側重于降低成像方式對活細胞的光毒性。MINFLUX則是目前唯一的三維分辨率可達到2～3 nm的光學成像系統，但其應用范圍局限于單分子追蹤，后續各方面的推廣和發展有待觀察。值得關注的是，新型熒光探針及標記方法的開發可能在未來技術突破中起到關鍵性的作用。另外，人工智能算法對超分辨技術各方面的拓展和更新也起到了很大的作用，一直是醫學成像領域中的熱門課題，預計未來基于這方面的新興應用和探索會逐漸增多，并產出能進一步助力生物醫學科研的成果。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：程雨飛撰寫論文初稿，李薇、金婷婷、吳思思參與修改論文，張龍浩指導、修改及審校論文。