軟骨內細胞正常代謝所需的小分子營養物質和細胞生長因子等主要通過分子自由擴散進入軟骨，但目前軟骨內具體傳質規律尚有待研究。該研究以小分子羅丹明B為示蹤劑，分別建立表面、側面和復合路徑下的軟骨傳質模型，通過激光共聚焦顯微鏡對不同傳質時間下軟骨進行切片觀察，分析研究小分子在軟骨不同層區內的運轉規律。結果表明：在表面路徑下，羅丹明B在2 h內可擴散至軟骨全層；隨著傳質時間增加，軟骨全層熒光強度增強；相比于2 h，傳質24 h后軟骨淺表層、中層和深層的平均熒光強度分別增加了1.83倍、1.95倍和3.64倍。在側面路徑下，羅丹明B沿軟骨寬度方向進行傳質，分子傳輸距離隨著傳質時間的增加而增長，在傳質24 h后可轉運至2 mm處。在復合路徑下，無論沿著軟骨厚度方向還是寬度方向，其傳質效果都優于表面路徑和側面路徑，尤其是可以改善軟骨深層的傳質效果。本研究可為軟骨損傷的治療和修復提供參考。
引用本文： 全洲, 譚沿松, 高麗蘭, 史艷萍, 李瑞欣, 張春秋. 小分子羅丹明B在軟骨不同層區內的運轉研究. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(6): 1149-1157. doi: 10.7507/1001-5515.202205083 復制
引言
營養物質和代謝產物的運轉、傳質是生物體新陳代謝的基本條件。對于無血管、無神經、無淋巴等組織的膝關節軟骨而言，運轉、傳質過程不僅能維持營養物質的供給與廢物的代謝，而且能提供對其新陳代謝有調節作用的酶類、抑制因子、細胞活性素和生長因子等具有生物活性的分子。膝關節中正常軟骨組織營養物質的代謝主要來自軟骨與關節囊中滑液的傳輸，小部分來自軟骨下骨[1]。當軟骨缺損后，人們嘗試通過植入支架修復體對軟骨進行修復，但由于支架修復體與軟骨間存在連接界面會影響傳質的進行，尤其當缺損面積較大時，缺損中心區域很可能成為傳質盲區，這將導致再生軟骨為纖維軟骨甚至中心區域無再生軟骨[2-3]，所以研究軟骨內的分子轉運、傳質規律對軟骨的治療和缺損修復有重要的意義[4]。
目前國內外學者對于機械載荷[5-11]、溶質濃度[12-13]、分子電荷[14-16]和分子量大小[17-22]對軟骨內分子轉運的影響進行了一些研究。在機械載荷方面，Evans等[5]研究了動態載荷的加載頻率對軟骨中分子轉運的影響，研究表明，當加載頻率為0.1 Hz、應變幅值為10%~20%時軟骨內的分子轉運得到明顯促進；Graham等[6-7]通過研究滑動載荷對軟骨中電中性分子運輸的影響，發現滑動載荷可以有效促進軟骨內分子的運輸距離；Culliton等[8]通過對比靜態、單軸循環加載和滑動加載三種條件下軟骨內分子轉運情況，發現相較于靜態和單軸循環加載，滑動加載對軟骨中的分子轉運促進效果更加明顯。在溶質濃度對軟骨內分子運輸影響的研究中，Pouran等[12]使用計算機斷層掃描技術探究了軟骨外溶液溶質濃度和電荷電性對分子運輸的影響，結果發現溶液濃度對中性分子在軟骨層中的擴散影響較小。另外，Didomenico等[14]和Kokkonen等[15]對比了帶有不同電荷的溶質分子在軟骨中的轉運情況，發現分子所帶電荷種類會對分子在軟骨層中的轉運產生影響，帶負電荷的分子相較于中性分子擴散速度較慢。Didomenico等[17]研究了機械載荷對軟骨內不同抗體分子轉運的影響，結果表明，分子大小會對分子在軟骨內的擴散速度和距離產生影響。這些研究主要探討表面路徑下軟骨內的分子運轉情況，同時實驗過程中伴隨著對軟骨表層或深層進行去除的實驗操作[5,9,14]，這會使得獲得的軟骨內分子轉運規律與結構完整的軟骨內分子轉運規律出現較大偏差[23-24]。
正常狀態下，膝關節的軟骨表面浸潤在關節腔的滑液中，軟骨的物質運輸主要是通過軟骨表面的分子擴散完成。關節軟骨是一種獨特而復雜的結締組織，不同層區的軟骨結構構成和組成成分有著明顯的不同[25-26]。當營養物質和活性分子進入軟骨時必須穿過致密的軟骨基質，這樣的話，各向異性的軟骨基質可能會影響這些溶質分子在軟骨內的運轉，出現不同的傳質路徑。尤其是當人體運動時，膝關節軟骨層會受到擠壓，進而導致進入軟骨層中的溶質分子發生側向擴散，而現有研究也表明，力學加載對軟骨中的溶質分子運輸有促進作用，但其具體促進路徑尚不明確。另外，當膝關節軟骨發生退變或者出現炎癥時，需要定向運輸藥物或活性分子進行治療，但這些藥物或活性分子從關節腔進入軟骨內的運轉路徑也未知。因此，需要構建不同的轉運路徑，分別探究這些路徑條件下軟骨不同層區內的分子運轉規律。
本文以小分子羅丹明B作為示蹤劑，以完整膝關節軟骨為對象，構建不同運轉路徑，探究了不同運轉時間和運轉路徑對軟骨不同層區內分子轉運規律的影響，研究成果對軟骨的炎癥治療、缺損修復具有重要意義。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
實驗材料選用18個月成年豬的膝關節股骨處的關節軟骨。新鮮的豬股骨從成年豬體內取出后，使用手術刀將覆蓋在股骨表面的肌肉組織去除，去除過程中保證關節軟骨表面不受損傷；然后，將關節軟骨及軟骨下骨完整取下，放入磷酸鹽緩沖液中保存備用。
1.2 實驗方法和內容
根據實驗需要，將軟骨分為表面路徑分子轉運組、側面路徑分子轉運組和復合路徑分子轉運組（見圖1）。表面路徑組僅在軟骨表面發生分子擴散，側面路徑組僅在軟骨層一對側面發生分子轉運，復合路徑組為軟骨的表面和軟骨層的一對側面同時發生分子轉運，為保證在進行特定路徑的分子轉運實驗時其他路徑不發生分子擴散行為，實驗中使用改性丙烯酸酯對軟骨不發生轉運的端面進行密封處理。
圖1
分子轉運路徑示意圖
藍色箭頭代表溶質分子運轉方向；藍色表面代表傳質液與軟骨的接觸面。a. 表面路徑；b. 側面路徑；c. 復合路徑
Figure1. Schematic diagram of molecular transport pathwaysthe blue arrow represents the direction of molecular mass transfer; the blue surface represents the contact surface between the mass transfer fluid and the cartilage. a. surface pathway; b. lateral pathway; c. composite pathway
圖2顯示了軟骨內分子運轉模型的構建。首先，將豬股骨的髁骨部位分別切制成10 mm×6 mm×8 mm骨軟骨矩形塊，并放入磷酸鹽緩沖液中靜置平衡2 h。然后，根據傳質路徑的不同，使用改性丙烯酸酯對軟骨不同的端面進行密封，構建三種不同的傳質路徑。最后，將進行密封處理后的軟骨放入配制好的濃度為3.13 nmol/mL的羅丹明B（熒光示蹤劑分子量479 Da，索萊寶，中國）溶液中，在三種傳質路徑下，分別進行時間為2、12、24 h的分子靜態傳質實驗。在分子轉運完成后，將骨軟骨試樣取出，使用徠卡切片機［徠卡顯微系統（上海）有限公司，Leica RM2255，中國］進行切片。首先，沿骨軟骨的z方向將骨軟骨的窄側邊緣去除3 mm，如圖3a所示；然后，調整切片機的切片厚度，將軟骨層切成55 μm厚的軟骨切片；完成切片后，使用激光共聚焦顯微鏡（Nikon A1，Nikon，日本）在激發波長543 nm條件下進行熒光激發觀察，并拍照記錄軟骨中熒光分布情況。
圖2
軟骨分子轉運模型構建
Figure2.
Construction of cartilage molecular transport model
圖3
對軟骨方向的定義和軟骨中平均熒光強度的測量
a. 骨軟骨三維模型及
a. three-dimensional 3D model of bone and cartilage, and definition of
1.3 實驗數據處理及分析
對骨軟骨矩形塊的3個方向分別進行定義，如圖3a所示，將自軟骨表層到軟骨深層的方向定義為厚度方向，用x表示；矩形軟骨的窄側邊為寬度方向，用y表示；矩形軟骨的長側邊為長度方向，用z表示。軟骨切片中厚度方向和寬度方向如圖3b所示。
熒光強度與示蹤劑的濃度線性相關，熒光強度的大小反映了該區域示蹤劑濃度的高低。因此，本文基于激光共聚焦顯微鏡拍攝的軟骨熒光圖片，使用Image J軟件對軟骨層內的平均熒光強度進行測量，進而分析、探究軟骨內的傳質效果。測量時，厚度方向上選擇距離軟骨側面0.5 mm處，對自軟骨表層至深層的不同位置的平均熒光強度進行測量（見圖3c）。軟骨的全層厚度使用l表示，不同位置的點表示為x。同時，為進一步比較軟骨不同層區的分子運轉結果，在軟骨表層、中層和深層[25]各選取一個點（即0.15l、0.5l、0.85l），測量這三個位置點的平均熒光強度。寬度方向上，以距離軟骨表面0.3l的軟骨中間層的平均熒光強度為考察對象，測量從軟骨側面至距離側面2 mm位置處的平均熒光強度（見圖3d）。將測量得到的平均熒光強度使用Origin 2017進行處理，分別獲得在不同路徑和不同時間條件下，軟骨層中厚度方向和寬度方向上平均熒光強度的分布情況。并且，使用SPSS軟件對不同條件下的平均熒光強度進行統計學分析，檢驗水準為0.05。
2 結果與討論
2.1 表面路徑分子轉運結果
在表面路徑條件下，軟骨內的溶質分子主要是沿其厚度方向進行擴散。當通過表面路徑進行2 h的傳質后，軟骨表層和中層的熒光強度較大，且兩層區的熒光強度接近，軟骨深層的熒光強度較小，其平均值為8.60 AU，僅為表層熒光強度的47.71%（見圖4a）。隨著羅丹明B分子在軟骨中轉運時間的增加，軟骨中各個位置的平均熒光強度也在增加。在軟骨厚度方向上，相較于傳質2 h，傳質12 h后軟骨表層平均熒光強度增加了0.85倍，軟骨中層熒光強度增加1.44倍，軟骨深層熒光強度增加3.43倍。傳質24 h后，軟骨表層、中層和深層的熒光強度比2 h時分別增加了1.83倍、1.95倍、3.64倍(見圖4c)。進一步分析靜態傳質12 h和24 h不同層區的傳質情況，發現在軟骨厚度方向上，這兩種傳質時間都是軟骨中層的熒光強度高于軟骨表層和深層的熒光強度。如靜態傳質12 h時，軟骨中層的熒光強度比表層高40.45%，比深層高19.18%（見圖4c）。靜態傳質24 h時，中層熒光強度分別比表層和深層高11.15%和37.07%（見圖4c）。這一現象與Culliton等[8]研究結果一致。以上變化造成的差異均有統計學意義（P < 0.05）。在寬度方向上，同一時間條件下熒光強度沒有隨著距離發生明顯變化，但隨著傳質時間的增加，寬度方向上的平均熒光強度均出現增強（見圖4b）。
圖4
表面路徑條件下軟骨內傳質的平均熒光強度
a. 軟骨厚度方向的平均熒光強度；b. 軟骨寬度方向的平均熒光強度；c. 不同時間軟骨表、中、深層的平均熒光強度
Figure4. Mean fluorescence intensity of intrachondral mass transfer under surface pathway conditionsa. average fluorescence intensity in cartilage thickness direction; b. average fluorescence intensity in cartilage width direction; c. mean fluorescence intensity of cartilage surface, middle and deep layers at different times
2.2 側面路徑分子轉運結果
在側面路徑條件下，軟骨內的溶質分子主要是沿其寬度方向進行擴散。在軟骨寬度方向上，隨著分子轉運時間的增加，小分子羅丹明B的轉運距離也在增加。當傳質24 h時，羅丹明B可以轉運至距離軟骨側面2 mm處（見圖5b）；同時，隨著分子轉運時間的增加，平均熒光強度也隨之增強。相較于傳質2 h，傳質12 h時在0.5 mm處熒光強度增加1.60倍，在1 mm處熒光強度增加4.55倍；傳質24 h后，在0.5 mm處熒光強度增加3.44倍，在1 mm處熒光強度增加14.65倍（見圖5b），差異均有統計學意義（P < 0.05）。在軟骨厚度方向上，在同一時刻下，軟骨各層區間的平均熒光強度沒有顯著差異（見圖5a）；但隨著傳質時間的增加，軟骨各層區的平均熒光強度也隨之增加（見圖5c），軟骨厚度方向的平均熒光強度隨時間變化的差異均有統計學意義（P < 0.05）。
圖5
側面路徑條件下軟骨內傳質的平均熒光強度
a. 軟骨厚度方向的平均熒光強度；b. 軟骨寬度方向的平均熒光強度；c. 不同時間軟骨表、中、深層的平均熒光強度
Figure5. Mean fluorescence intensity of intrachondral mass transfer under lateral pathway conditionsa. average fluorescence intensity in cartilage thickness direction; b. average fluorescence intensity in cartilage width direction; c. mean fluorescence intensity of cartilage surface, middle and deep layers at different times
2.3 復合路徑分子轉運結果
在復合路徑條件下，軟骨內的分子運轉是沿其厚度方向和寬度方向同時進行的。在軟骨厚度方向上，隨著分子轉運時間的增加，軟骨中平均熒光強度隨之增強（見圖6a）。相較于傳質2 h，傳質12 h的軟骨表層熒光強度增加了0.98倍，中層增加了1.38倍，深層增加了2.81倍；傳質24 h的軟骨表層、中層和深層的平均熒光強度分別增加1.89倍、2.50倍、5.49倍（見圖6c），上述差異均有統計學意義（P < 0.05）。在寬度方向上，在距離軟骨側面0.25 mm處熒光強度有增強趨勢；但隨著距離的增加，熒光強度出現降低（見圖6b）。
圖6
復合路徑條件下軟骨內傳質的平均熒光強度
a. 軟骨厚度方向的平均熒光強度；b. 軟骨寬度方向的平均熒光強度；c. 不同時間下軟骨表、中、深層的平均熒光強度
Figure6. Mean fluorescence intensity of intrachondral mass transfer under composite pathway conditionsa. average fluorescence intensity in cartilage thickness direction; b. average fluorescence intensity in cartilage width direction; c. mean fluorescence intensity of cartilage surface, middle and deep layers at different times
同時比較了分子運轉2 h時三種路徑條件下沿軟骨厚度方向和寬度方向上的熒光強度，結果如圖7所示。在表面轉運路徑條件下，軟骨表層、中層和深層的平均熒光強度分別較側面路徑下對應層區的熒光強度增加了2.61倍、1.70倍、0.21倍（差異無統計學意義）；復合路徑條件下軟骨表層、中層和深層的平均熒光強度分別比側面路徑條件下對應層區的熒光強度增加了4.27倍、2.67倍、0.94倍（見圖7c）。在寬度方向0.5 mm位置處，表面路徑比側面路徑熒光強度增加2.58倍，復合路徑比側面路徑增加3.65倍；在寬度方向1 mm位置處，表面路徑比側面路徑熒光強度高14.52倍，復合路徑比側面路徑高16.80倍（見圖7b），以上結果除表面路徑與側面路徑的深層平均熒光強度外，其他組別之間差異均有統計學意義（P < 0.05）。
圖7
三種路徑下傳質2 h軟骨內平均熒光強度的比較
a. 軟骨厚度方向的平均熒光強度；b. 軟骨寬度方向的平均熒光強度；c. 軟骨表、中、深層的平均熒光強度
Figure7. Comparison of the average fluorescence intensity within the cartilage at 2 h of mass transfer under three pathwaysa. average fluorescence intensity in cartilage thickness direction; b. average fluorescence intensity in cartilage width direction; c. average fluorescence intensity of cartilage surface, middle and deep layers
3 討論
本文采用將軟骨層的不同轉運路徑分別進行阻斷的方法，研究小分子羅丹明B在軟骨中的運轉規律。以成年豬膝關節股骨處的軟骨為對象，構建表面路徑、側面路徑和復合路徑三種條件下的分子轉運模型，探討了不同運轉路徑下小分子在軟骨不同層區內的運轉規律。
軟骨的不同層區其結構構成和成分組成有所區別[23]，因此軟骨在不同路徑中的分子轉運行為可能有所不同。軟骨表面路徑的分子轉運結果表明，小分子可以在2 h內擴散至軟骨全層，如果軟骨表面轉運路徑被阻斷，則可能會導致軟骨在極短的時間內出現營養匱乏甚至造成損傷，這與對關節滑液進行營養阻斷會導致軟骨出現損傷[27]結果一致；同時有研究表明[26，28-29]，軟骨中的水、糖胺聚糖等成分會對關節軟骨中的物質擴散產生影響，進而導致軟骨中分子擴散系數發生變化，這可能是在表面路徑傳質條件下不同層區平均熒光強度出現差異的原因之一。在表面路徑傳質24 h的總時長中，相較于傳質前12個小時，后12個小時中軟骨層的平均熒光強度增加較慢，這可能是軟骨層中的分子轉運已經接近靜態平衡，這與Culliton等[8]的研究結果一致。
軟骨層中的分子擴散不僅發生在厚度方向上，還發生在寬度方向上。Evans等[5]和Didomenico等[17]探究了抗體和葡萄糖類似物在軟骨寬度方向上的分子擴散行為。在側面路徑的分子轉運中，分子沿軟骨寬度方向進行自由擴散，在厚度方向上沒有發生分子自由擴散。側面路徑的分子轉運趨勢與表面路徑的分子轉運不同，在寬度方向上傳質時間影響傳質距離，傳質時間增加使得分子轉運的距離增加；同時隨著距離的增加，其平均熒光強度逐漸降低，這與Didomenico等[9]的研究結果一致。在側面路徑傳質條件下，分子沿寬度方向進行擴散時，軟骨表、中、深層的熒光強度沒有明顯差距。研究結果表明，雖然在軟骨進行表面路徑的分子運輸時，各層結構和成分會對軟骨內分子的運轉產生影響，但是在側面進行分子運轉時，不同軟骨層結構和成分對分子運轉的影響并不顯著，這進一步說明分子在軟骨中的自由運轉具有各向異性，本研究結果與Leddy等[30]一致。
當進行復合路徑分子轉運時，在軟骨厚度方向上的結果顯示，運轉24 h時軟骨深層相較于軟骨中層的平均熒光強度減弱的現象有所改善，雖然效果還不夠明顯，但這表明可以嘗試通過軟骨側面進行分子轉運，提升對軟骨深層區域營養和藥物的運輸，該結果對于治療和修復軟骨缺損具有重要意義。將傳質2 h不同路徑下的分子轉運結果進行比較，發現在厚度方向和寬度方向上復合路徑的分子轉運結果均優于表面路徑和側面路徑。因此，在對軟骨的治療和修復過程中，進行關節腔注射的同時，也應考慮分子在軟骨層中的橫向運輸。
以上研究結果表明，只進行表面路徑或側面路徑的分子轉運時，軟骨中心的深層區域對分子的運輸阻力相對較大，可能使得該區域獲得的營養物質較少，甚至一些用于治療軟骨損傷的藥物因子根本無法到達該區域；而復合路徑條件下，軟骨層可以更好地進行分子運輸，這可能是滑動加載條件下的分子運輸優于軸向加載的原因之一[8]。因此，在對軟骨進行治療和修復時，除了考慮通過關節軟骨表面進行分子擴散外，也要對分子在軟骨中的橫向運輸予以關注。
4 結論
（1）在表面路徑傳質中，軟骨厚度方向上小分子羅丹明B可在2 h擴散至軟骨全層；隨著擴散時間的增加，軟骨各層的平均熒光強度均增強，并且在12 h和24 h時羅丹明B在軟骨中層的平均熒光強度顯著增強。
（2）在側面路徑傳質中，隨著傳質時間的增加，羅丹明B的運轉距離增加；當傳質24 h后，羅丹明B分子可轉運至距離軟骨側面2 mm處；但隨著轉運距離的增加，軟骨層中的平均熒光強度逐漸降低。
（3）在同一時間條件下，復合路徑在厚度方向和寬度方向上的傳質效果均優于表面路徑和側面路徑，即復合路徑為最優的傳質路徑。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：高麗蘭、全洲、譚沿松在實驗設計、數據分析和論文寫作中有重要貢獻；數據收集主要由全洲完成；張春秋、高麗蘭、譚沿松、李瑞欣、史艷萍在數據分析和論文的修改中有重要貢獻。
引言
營養物質和代謝產物的運轉、傳質是生物體新陳代謝的基本條件。對于無血管、無神經、無淋巴等組織的膝關節軟骨而言，運轉、傳質過程不僅能維持營養物質的供給與廢物的代謝，而且能提供對其新陳代謝有調節作用的酶類、抑制因子、細胞活性素和生長因子等具有生物活性的分子。膝關節中正常軟骨組織營養物質的代謝主要來自軟骨與關節囊中滑液的傳輸，小部分來自軟骨下骨[1]。當軟骨缺損后，人們嘗試通過植入支架修復體對軟骨進行修復，但由于支架修復體與軟骨間存在連接界面會影響傳質的進行，尤其當缺損面積較大時，缺損中心區域很可能成為傳質盲區，這將導致再生軟骨為纖維軟骨甚至中心區域無再生軟骨[2-3]，所以研究軟骨內的分子轉運、傳質規律對軟骨的治療和缺損修復有重要的意義[4]。
目前國內外學者對于機械載荷[5-11]、溶質濃度[12-13]、分子電荷[14-16]和分子量大小[17-22]對軟骨內分子轉運的影響進行了一些研究。在機械載荷方面，Evans等[5]研究了動態載荷的加載頻率對軟骨中分子轉運的影響，研究表明，當加載頻率為0.1 Hz、應變幅值為10%~20%時軟骨內的分子轉運得到明顯促進；Graham等[6-7]通過研究滑動載荷對軟骨中電中性分子運輸的影響，發現滑動載荷可以有效促進軟骨內分子的運輸距離；Culliton等[8]通過對比靜態、單軸循環加載和滑動加載三種條件下軟骨內分子轉運情況，發現相較于靜態和單軸循環加載，滑動加載對軟骨中的分子轉運促進效果更加明顯。在溶質濃度對軟骨內分子運輸影響的研究中，Pouran等[12]使用計算機斷層掃描技術探究了軟骨外溶液溶質濃度和電荷電性對分子運輸的影響，結果發現溶液濃度對中性分子在軟骨層中的擴散影響較小。另外，Didomenico等[14]和Kokkonen等[15]對比了帶有不同電荷的溶質分子在軟骨中的轉運情況，發現分子所帶電荷種類會對分子在軟骨層中的轉運產生影響，帶負電荷的分子相較于中性分子擴散速度較慢。Didomenico等[17]研究了機械載荷對軟骨內不同抗體分子轉運的影響，結果表明，分子大小會對分子在軟骨內的擴散速度和距離產生影響。這些研究主要探討表面路徑下軟骨內的分子運轉情況，同時實驗過程中伴隨著對軟骨表層或深層進行去除的實驗操作[5,9,14]，這會使得獲得的軟骨內分子轉運規律與結構完整的軟骨內分子轉運規律出現較大偏差[23-24]。
正常狀態下，膝關節的軟骨表面浸潤在關節腔的滑液中，軟骨的物質運輸主要是通過軟骨表面的分子擴散完成。關節軟骨是一種獨特而復雜的結締組織，不同層區的軟骨結構構成和組成成分有著明顯的不同[25-26]。當營養物質和活性分子進入軟骨時必須穿過致密的軟骨基質，這樣的話，各向異性的軟骨基質可能會影響這些溶質分子在軟骨內的運轉，出現不同的傳質路徑。尤其是當人體運動時，膝關節軟骨層會受到擠壓，進而導致進入軟骨層中的溶質分子發生側向擴散，而現有研究也表明，力學加載對軟骨中的溶質分子運輸有促進作用，但其具體促進路徑尚不明確。另外，當膝關節軟骨發生退變或者出現炎癥時，需要定向運輸藥物或活性分子進行治療，但這些藥物或活性分子從關節腔進入軟骨內的運轉路徑也未知。因此，需要構建不同的轉運路徑，分別探究這些路徑條件下軟骨不同層區內的分子運轉規律。
本文以小分子羅丹明B作為示蹤劑，以完整膝關節軟骨為對象，構建不同運轉路徑，探究了不同運轉時間和運轉路徑對軟骨不同層區內分子轉運規律的影響，研究成果對軟骨的炎癥治療、缺損修復具有重要意義。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
實驗材料選用18個月成年豬的膝關節股骨處的關節軟骨。新鮮的豬股骨從成年豬體內取出后，使用手術刀將覆蓋在股骨表面的肌肉組織去除，去除過程中保證關節軟骨表面不受損傷；然后，將關節軟骨及軟骨下骨完整取下，放入磷酸鹽緩沖液中保存備用。
1.2 實驗方法和內容
根據實驗需要，將軟骨分為表面路徑分子轉運組、側面路徑分子轉運組和復合路徑分子轉運組（見圖1）。表面路徑組僅在軟骨表面發生分子擴散，側面路徑組僅在軟骨層一對側面發生分子轉運，復合路徑組為軟骨的表面和軟骨層的一對側面同時發生分子轉運，為保證在進行特定路徑的分子轉運實驗時其他路徑不發生分子擴散行為，實驗中使用改性丙烯酸酯對軟骨不發生轉運的端面進行密封處理。
圖1
分子轉運路徑示意圖
藍色箭頭代表溶質分子運轉方向；藍色表面代表傳質液與軟骨的接觸面。a. 表面路徑；b. 側面路徑；c. 復合路徑
Figure1. Schematic diagram of molecular transport pathwaysthe blue arrow represents the direction of molecular mass transfer; the blue surface represents the contact surface between the mass transfer fluid and the cartilage. a. surface pathway; b. lateral pathway; c. composite pathway
圖2顯示了軟骨內分子運轉模型的構建。首先，將豬股骨的髁骨部位分別切制成10 mm×6 mm×8 mm骨軟骨矩形塊，并放入磷酸鹽緩沖液中靜置平衡2 h。然后，根據傳質路徑的不同，使用改性丙烯酸酯對軟骨不同的端面進行密封，構建三種不同的傳質路徑。最后，將進行密封處理后的軟骨放入配制好的濃度為3.13 nmol/mL的羅丹明B（熒光示蹤劑分子量479 Da，索萊寶，中國）溶液中，在三種傳質路徑下，分別進行時間為2、12、24 h的分子靜態傳質實驗。在分子轉運完成后，將骨軟骨試樣取出，使用徠卡切片機［徠卡顯微系統（上海）有限公司，Leica RM2255，中國］進行切片。首先，沿骨軟骨的z方向將骨軟骨的窄側邊緣去除3 mm，如圖3a所示；然后，調整切片機的切片厚度，將軟骨層切成55 μm厚的軟骨切片；完成切片后，使用激光共聚焦顯微鏡（Nikon A1，Nikon，日本）在激發波長543 nm條件下進行熒光激發觀察，并拍照記錄軟骨中熒光分布情況。
圖2
軟骨分子轉運模型構建
Figure2.
Construction of cartilage molecular transport model
圖3
對軟骨方向的定義和軟骨中平均熒光強度的測量
a. 骨軟骨三維模型及
a. three-dimensional 3D model of bone and cartilage, and definition of
1.3 實驗數據處理及分析
對骨軟骨矩形塊的3個方向分別進行定義，如圖3a所示，將自軟骨表層到軟骨深層的方向定義為厚度方向，用x表示；矩形軟骨的窄側邊為寬度方向，用y表示；矩形軟骨的長側邊為長度方向，用z表示。軟骨切片中厚度方向和寬度方向如圖3b所示。
熒光強度與示蹤劑的濃度線性相關，熒光強度的大小反映了該區域示蹤劑濃度的高低。因此，本文基于激光共聚焦顯微鏡拍攝的軟骨熒光圖片，使用Image J軟件對軟骨層內的平均熒光強度進行測量，進而分析、探究軟骨內的傳質效果。測量時，厚度方向上選擇距離軟骨側面0.5 mm處，對自軟骨表層至深層的不同位置的平均熒光強度進行測量（見圖3c）。軟骨的全層厚度使用l表示，不同位置的點表示為x。同時，為進一步比較軟骨不同層區的分子運轉結果，在軟骨表層、中層和深層[25]各選取一個點（即0.15l、0.5l、0.85l），測量這三個位置點的平均熒光強度。寬度方向上，以距離軟骨表面0.3l的軟骨中間層的平均熒光強度為考察對象，測量從軟骨側面至距離側面2 mm位置處的平均熒光強度（見圖3d）。將測量得到的平均熒光強度使用Origin 2017進行處理，分別獲得在不同路徑和不同時間條件下，軟骨層中厚度方向和寬度方向上平均熒光強度的分布情況。并且，使用SPSS軟件對不同條件下的平均熒光強度進行統計學分析，檢驗水準為0.05。
2 結果與討論
2.1 表面路徑分子轉運結果
在表面路徑條件下，軟骨內的溶質分子主要是沿其厚度方向進行擴散。當通過表面路徑進行2 h的傳質后，軟骨表層和中層的熒光強度較大，且兩層區的熒光強度接近，軟骨深層的熒光強度較小，其平均值為8.60 AU，僅為表層熒光強度的47.71%（見圖4a）。隨著羅丹明B分子在軟骨中轉運時間的增加，軟骨中各個位置的平均熒光強度也在增加。在軟骨厚度方向上，相較于傳質2 h，傳質12 h后軟骨表層平均熒光強度增加了0.85倍，軟骨中層熒光強度增加1.44倍，軟骨深層熒光強度增加3.43倍。傳質24 h后，軟骨表層、中層和深層的熒光強度比2 h時分別增加了1.83倍、1.95倍、3.64倍(見圖4c)。進一步分析靜態傳質12 h和24 h不同層區的傳質情況，發現在軟骨厚度方向上，這兩種傳質時間都是軟骨中層的熒光強度高于軟骨表層和深層的熒光強度。如靜態傳質12 h時，軟骨中層的熒光強度比表層高40.45%，比深層高19.18%（見圖4c）。靜態傳質24 h時，中層熒光強度分別比表層和深層高11.15%和37.07%（見圖4c）。這一現象與Culliton等[8]研究結果一致。以上變化造成的差異均有統計學意義（P < 0.05）。在寬度方向上，同一時間條件下熒光強度沒有隨著距離發生明顯變化，但隨著傳質時間的增加，寬度方向上的平均熒光強度均出現增強（見圖4b）。
圖4
表面路徑條件下軟骨內傳質的平均熒光強度
a. 軟骨厚度方向的平均熒光強度；b. 軟骨寬度方向的平均熒光強度；c. 不同時間軟骨表、中、深層的平均熒光強度
Figure4. Mean fluorescence intensity of intrachondral mass transfer under surface pathway conditionsa. average fluorescence intensity in cartilage thickness direction; b. average fluorescence intensity in cartilage width direction; c. mean fluorescence intensity of cartilage surface, middle and deep layers at different times
2.2 側面路徑分子轉運結果
在側面路徑條件下，軟骨內的溶質分子主要是沿其寬度方向進行擴散。在軟骨寬度方向上，隨著分子轉運時間的增加，小分子羅丹明B的轉運距離也在增加。當傳質24 h時，羅丹明B可以轉運至距離軟骨側面2 mm處（見圖5b）；同時，隨著分子轉運時間的增加，平均熒光強度也隨之增強。相較于傳質2 h，傳質12 h時在0.5 mm處熒光強度增加1.60倍，在1 mm處熒光強度增加4.55倍；傳質24 h后，在0.5 mm處熒光強度增加3.44倍，在1 mm處熒光強度增加14.65倍（見圖5b），差異均有統計學意義（P < 0.05）。在軟骨厚度方向上，在同一時刻下，軟骨各層區間的平均熒光強度沒有顯著差異（見圖5a）；但隨著傳質時間的增加，軟骨各層區的平均熒光強度也隨之增加（見圖5c），軟骨厚度方向的平均熒光強度隨時間變化的差異均有統計學意義（P < 0.05）。
圖5
側面路徑條件下軟骨內傳質的平均熒光強度
a. 軟骨厚度方向的平均熒光強度；b. 軟骨寬度方向的平均熒光強度；c. 不同時間軟骨表、中、深層的平均熒光強度
Figure5. Mean fluorescence intensity of intrachondral mass transfer under lateral pathway conditionsa. average fluorescence intensity in cartilage thickness direction; b. average fluorescence intensity in cartilage width direction; c. mean fluorescence intensity of cartilage surface, middle and deep layers at different times
2.3 復合路徑分子轉運結果
在復合路徑條件下，軟骨內的分子運轉是沿其厚度方向和寬度方向同時進行的。在軟骨厚度方向上，隨著分子轉運時間的增加，軟骨中平均熒光強度隨之增強（見圖6a）。相較于傳質2 h，傳質12 h的軟骨表層熒光強度增加了0.98倍，中層增加了1.38倍，深層增加了2.81倍；傳質24 h的軟骨表層、中層和深層的平均熒光強度分別增加1.89倍、2.50倍、5.49倍（見圖6c），上述差異均有統計學意義（P < 0.05）。在寬度方向上，在距離軟骨側面0.25 mm處熒光強度有增強趨勢；但隨著距離的增加，熒光強度出現降低（見圖6b）。
圖6
復合路徑條件下軟骨內傳質的平均熒光強度
a. 軟骨厚度方向的平均熒光強度；b. 軟骨寬度方向的平均熒光強度；c. 不同時間下軟骨表、中、深層的平均熒光強度
Figure6. Mean fluorescence intensity of intrachondral mass transfer under composite pathway conditionsa. average fluorescence intensity in cartilage thickness direction; b. average fluorescence intensity in cartilage width direction; c. mean fluorescence intensity of cartilage surface, middle and deep layers at different times
同時比較了分子運轉2 h時三種路徑條件下沿軟骨厚度方向和寬度方向上的熒光強度，結果如圖7所示。在表面轉運路徑條件下，軟骨表層、中層和深層的平均熒光強度分別較側面路徑下對應層區的熒光強度增加了2.61倍、1.70倍、0.21倍（差異無統計學意義）；復合路徑條件下軟骨表層、中層和深層的平均熒光強度分別比側面路徑條件下對應層區的熒光強度增加了4.27倍、2.67倍、0.94倍（見圖7c）。在寬度方向0.5 mm位置處，表面路徑比側面路徑熒光強度增加2.58倍，復合路徑比側面路徑增加3.65倍；在寬度方向1 mm位置處，表面路徑比側面路徑熒光強度高14.52倍，復合路徑比側面路徑高16.80倍（見圖7b），以上結果除表面路徑與側面路徑的深層平均熒光強度外，其他組別之間差異均有統計學意義（P < 0.05）。
圖7
三種路徑下傳質2 h軟骨內平均熒光強度的比較
a. 軟骨厚度方向的平均熒光強度；b. 軟骨寬度方向的平均熒光強度；c. 軟骨表、中、深層的平均熒光強度
Figure7. Comparison of the average fluorescence intensity within the cartilage at 2 h of mass transfer under three pathwaysa. average fluorescence intensity in cartilage thickness direction; b. average fluorescence intensity in cartilage width direction; c. average fluorescence intensity of cartilage surface, middle and deep layers
3 討論
本文采用將軟骨層的不同轉運路徑分別進行阻斷的方法，研究小分子羅丹明B在軟骨中的運轉規律。以成年豬膝關節股骨處的軟骨為對象，構建表面路徑、側面路徑和復合路徑三種條件下的分子轉運模型，探討了不同運轉路徑下小分子在軟骨不同層區內的運轉規律。
軟骨的不同層區其結構構成和成分組成有所區別[23]，因此軟骨在不同路徑中的分子轉運行為可能有所不同。軟骨表面路徑的分子轉運結果表明，小分子可以在2 h內擴散至軟骨全層，如果軟骨表面轉運路徑被阻斷，則可能會導致軟骨在極短的時間內出現營養匱乏甚至造成損傷，這與對關節滑液進行營養阻斷會導致軟骨出現損傷[27]結果一致；同時有研究表明[26，28-29]，軟骨中的水、糖胺聚糖等成分會對關節軟骨中的物質擴散產生影響，進而導致軟骨中分子擴散系數發生變化，這可能是在表面路徑傳質條件下不同層區平均熒光強度出現差異的原因之一。在表面路徑傳質24 h的總時長中，相較于傳質前12個小時，后12個小時中軟骨層的平均熒光強度增加較慢，這可能是軟骨層中的分子轉運已經接近靜態平衡，這與Culliton等[8]的研究結果一致。
軟骨層中的分子擴散不僅發生在厚度方向上，還發生在寬度方向上。Evans等[5]和Didomenico等[17]探究了抗體和葡萄糖類似物在軟骨寬度方向上的分子擴散行為。在側面路徑的分子轉運中，分子沿軟骨寬度方向進行自由擴散，在厚度方向上沒有發生分子自由擴散。側面路徑的分子轉運趨勢與表面路徑的分子轉運不同，在寬度方向上傳質時間影響傳質距離，傳質時間增加使得分子轉運的距離增加；同時隨著距離的增加，其平均熒光強度逐漸降低，這與Didomenico等[9]的研究結果一致。在側面路徑傳質條件下，分子沿寬度方向進行擴散時，軟骨表、中、深層的熒光強度沒有明顯差距。研究結果表明，雖然在軟骨進行表面路徑的分子運輸時，各層結構和成分會對軟骨內分子的運轉產生影響，但是在側面進行分子運轉時，不同軟骨層結構和成分對分子運轉的影響并不顯著，這進一步說明分子在軟骨中的自由運轉具有各向異性，本研究結果與Leddy等[30]一致。
當進行復合路徑分子轉運時，在軟骨厚度方向上的結果顯示，運轉24 h時軟骨深層相較于軟骨中層的平均熒光強度減弱的現象有所改善，雖然效果還不夠明顯，但這表明可以嘗試通過軟骨側面進行分子轉運，提升對軟骨深層區域營養和藥物的運輸，該結果對于治療和修復軟骨缺損具有重要意義。將傳質2 h不同路徑下的分子轉運結果進行比較，發現在厚度方向和寬度方向上復合路徑的分子轉運結果均優于表面路徑和側面路徑。因此，在對軟骨的治療和修復過程中，進行關節腔注射的同時，也應考慮分子在軟骨層中的橫向運輸。
以上研究結果表明，只進行表面路徑或側面路徑的分子轉運時，軟骨中心的深層區域對分子的運輸阻力相對較大，可能使得該區域獲得的營養物質較少，甚至一些用于治療軟骨損傷的藥物因子根本無法到達該區域；而復合路徑條件下，軟骨層可以更好地進行分子運輸，這可能是滑動加載條件下的分子運輸優于軸向加載的原因之一[8]。因此，在對軟骨進行治療和修復時，除了考慮通過關節軟骨表面進行分子擴散外，也要對分子在軟骨中的橫向運輸予以關注。
4 結論
（1）在表面路徑傳質中，軟骨厚度方向上小分子羅丹明B可在2 h擴散至軟骨全層；隨著擴散時間的增加，軟骨各層的平均熒光強度均增強，并且在12 h和24 h時羅丹明B在軟骨中層的平均熒光強度顯著增強。
（2）在側面路徑傳質中，隨著傳質時間的增加，羅丹明B的運轉距離增加；當傳質24 h后，羅丹明B分子可轉運至距離軟骨側面2 mm處；但隨著轉運距離的增加，軟骨層中的平均熒光強度逐漸降低。
（3）在同一時間條件下，復合路徑在厚度方向和寬度方向上的傳質效果均優于表面路徑和側面路徑，即復合路徑為最優的傳質路徑。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：高麗蘭、全洲、譚沿松在實驗設計、數據分析和論文寫作中有重要貢獻；數據收集主要由全洲完成；張春秋、高麗蘭、譚沿松、李瑞欣、史艷萍在數據分析和論文的修改中有重要貢獻。
