本文旨在探討姜黃素（Cur）體外抗人巨細胞病毒（HCMV）的作用。通過體外培養人胚肺成纖維細胞，采用四唑鹽（MTS）方法檢測Cur對細胞活力的影響。本研究分為對照組、HCMV組、HCMV+膦甲酸鈉（PFA）組和HCMV+Cur組，通過蝕斑實驗觀察各組細胞病變效應（CPE），采用定量聚合酶鏈式反應（qPCR）檢測各組HCMV的DNA拷貝數，蛋白免疫印跡檢測 HCMV 不同時序蛋白的表達情況。結果發現，在細胞毒性實驗中，與對照孔相比，當Cur濃度小于等于15 μmol/L時，Cur對細胞生長和活力沒有明顯影響（P＞0.05）。HCMV感染細胞5 d后，細胞開始出現CPE，隨著時間延長，蝕斑數量增加。Cur可以減少CPE的產生，且呈劑量依賴性。HCMV感染細胞后，其DNA拷貝數和蛋白表達量逐漸增多，呈時間依賴性；Cur能夠顯著抑制HCMV的DNA復制，并下調HCMV蛋白表達水平，呈濃度依賴性，差異具有統計學意義（P＜0.05）。綜上，Cur通過抑制HCMV的DNA的復制和下調HCMV不同時序蛋白表達水平從而發揮抗HCMV活性。本研究為抗HCMV感染藥物的研發提供新的實驗依據。
引用本文： 丁香, 岳冀蓉, 董碧蓉, 冷曉. 姜黃素抗人巨細胞病毒感染的體外實驗研究. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(6): 1158-1164. doi: 10.7507/1001-5515.202108035 復制
引言
人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一種機會病原體，在人群中具有較高的感染率，可達40%～100%[1-2]。隨著年齡的增加，其感染率逐漸增加。研究表明，30～39歲的成年人其HCMV的感染率為54%，而80歲以上的老年人感染率則達到91%[3]。一旦該病毒侵入機體，自身免疫系統難以將其完全清除，將長期或終身存在于體內，呈持續性隱性感染或潛伏感染[4-5]。在機體免疫功能低下時（如感染人類免疫缺陷病毒），或經受過器官骨髓移植以及長期使用免疫抑制劑等特殊人群中，潛伏在體內的HCMV往往容易被激活，繼而引起嚴重的臨床癥狀甚至罹患致死性疾病[6-8]。而在免疫功能正常的機體中，HCMV感染往往缺乏明顯的臨床癥狀，因此通常認為HCMV感染對免疫功能正常的人群沒有影響。但是，最近越來越多的研究發現，慢性HCMV感染能夠誘導宿主促炎性細胞因子的分泌，同時還可以導致T細胞免疫衰老[9]，其在健康人群的各種慢性疾病的發病機制中起著重要作用，如動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓以及炎癥性腸病等[10-13]。此外，HCMV感染還與認知能力下降、功能受損、衰弱的發生密切相關[14-15]，并導致死亡率增加[16-17]。因此，慢性HCMV感染在免疫功能正常的人群，尤其是老年人群中的臨床意義越來越受到關注和重視。目前美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）批準用于HCMV治療的藥物有5種，即更昔洛韋、纈更昔洛韋、膦甲酸鈉（phosphonoformic acid，PFA）、西多福韋和福米韋生[18]，這些藥物具有耐藥性、腎毒性以及生物利用度低等副作用，而老年人常常伴有腎功能不全，因此尋找新的抗HCMV藥物迫在眉睫。來源于植物的化合物由于毒副作用較低，目前已成為抗HCMV藥物研究中的熱點。姜黃素（curcumin，Cur）是從姜黃的塊莖中提取出來的一種疏水性的多酚化合物，為姜黃最主要的活性成分。既往研究發現Cur具有抗炎、抗氧化、抗微生物、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、抗動脈粥樣硬化以及免疫調節等多種藥理活性和生物學作用[19]，由于其毒副作用小，現已成為研發新藥的熱點并具有良好的臨床應用潛力。研究證實，Cur可以抑制 T 淋巴細胞、B 淋巴細胞和巨噬細胞的活化和增生，以及抗體的產生及淋巴因子的分泌。同時，Cur對急性、亞急性和慢性炎癥都有抗炎作用，可以減輕炎性組織中性粒細胞浸潤，抑制促炎性細胞因子的產生，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）[20]。目前已嘗試將Cur用于炎癥性腸病、類風濕關節炎、 哮喘、冠心病、阿爾茨海默病等疾病。Lv等[21-22]在體內和體外實驗均發現Cur能夠抑制HCMV的復制，但其具體的實驗機制尚不明確。因此，本研究通過體外培養人胚肺成纖維細胞，進一步證實Cur抗HCMV感染活性并探索其相關的分子機制，為尋找新的抗HCMV藥物提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞與病毒
本實驗采用人胚肺成纖維細胞（MRC-5），該細胞為28～32代細胞；HCMV采用Towne病毒株，該細胞和病毒均購自美國國立細胞庫公司。
按常規方法將病毒增殖至實驗需求量，本實驗使用的病毒感染復數（multiply of infection，MOI）為0.02，MOI = 感染性病毒量/細胞數。
1.1.2 藥物
Cur購自Sigma公司。根據說明書配制，配制方法：先用1.357 mL的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解10 mg的Cur粉末配成20 mmol/L的儲存液。使用前加入等量體積的無水乙醇配成10 mmol/L的Cur溶液，根據實驗需要，再進一步配制成所需濃度，現配現用。PFA購自Sigma公司，本研究使用的濃度為5 μmol/L。
1.1.3 主要試劑
杜爾貝科改良培養基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、濾紙膜購自美國Millipore公司；增強型化學發光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影劑、辣根過氧化物酶購自美國細胞信號技術（Cell Signaling Technology，CST）公司； DMSO購自美國Sigma公司；3-（4, 5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑內鹽[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium, inner salt, MTS]細胞增殖與細胞毒性檢測試劑盒購自美國Promega公司；DNA提取試劑盒、定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）超混合液與試劑盒購自美國QIAGEN公司；即刻早期（immediate early，IE）基因編碼蛋白2（IE2）、長獨特序列（unique long，UL） 44（UL44）、UL99抗體購自美國Abcam公司等。
1.1.4 主要儀器
倒置相差顯微鏡（TS2，尼康公司，日本）、二氧化碳培養箱（Forma Steri-Cycle 371，賽默飛世爾公司，美國）、高速冷凍離心機（ST16R，賽默飛世爾公司，德國）、臺式離心機（Legend Micro 17R，賽默飛世爾公司，美國)、熒光細胞分析儀（Countstar Rigel S2，上海睿鈺公司，中國），蛋白垂直電泳儀（165-8033，伯樂公司，美國）、超微量分光光度計（Nanodrop 2000，賽默飛世爾公司，美國）、熒光qPCR儀（Quantistudio 3，賽默飛世爾公司，美國）、酶標儀（epoch 2，伯騰公司，美國）等。
1.2 方法
1.2.1 MTS法檢測Cur對 MRC-5細胞活力的影響
取對數生長期的MRC-5細胞，按每孔5×103個細胞（體積100 μL）接種于96孔培養板中進行培養。培養24 h后去除培養基，更換含不同濃度Cur（5、8、10、12、15、18、20 μmol/L）的培養基，每個濃度設置3個平行孔，同時設置空白孔（無細胞，只加培養基）和對照孔（有細胞，不加Cur）；培養48 h后，每孔加入20 μL的MTS溶液（5 mg/mL），繼續于培養箱中培養4 h；在490 nm處測定各孔的光密度（optical density，OD）值。重復3次實驗，取各孔OD值的平均數，計算細胞活力。細胞活力 = ［（加藥細胞OD值 ? 空白孔OD值）/（對照孔OD值 ? 空白孔OD值）］ × 100%。
1.2.2 蝕斑實驗
取對數生長期的MRC-5細胞，培養24 h后，向各孔中分別加入不同濃度的Cur（8、10、12、15 μmol/L），作用2 h后，接種HCMV，同時設有對照組（只有細胞，不加Cur和HCMV）、HCMV組（不加Cur，只加HCMV）和陽性對照組即HCMV+PFA組（加入PFA和HCMV），培養7 d后，去除培養基，PBS清洗1次，加入2%的多聚甲醛固定1 h，然后PBS清洗1次，加入亞甲基藍溶液染色5 min，用PBS清洗2次，在顯微鏡下觀察各組蝕斑形成單位（plaque forming unit, PFU）的個數。
1.2.3 qPCR檢測各組HCMV DNA的復制數
本實驗分為以下幾個組：① HCMV組：不進行Cur預處理，直接接種HCMV；② HCMV+Cur（8 μmol/L）組：濃度為8 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV；③ HCMV+Cur（10 μmol/L）組：濃度為10 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV；④ HCMV+Cur（12 μmol/L）組：濃度為12 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV；⑤ HCMV+Cur（15 μmol/L）組：濃度為15 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV；⑥ HCMV+PFA組：濃度為5 μmol/L的PFA預處理2 h后接種HCMV。上述各組細胞培養至72 h和96 h，收集細胞。采用DNA提取試劑盒提取各組DNA；然后測定各組DNA濃度，將不同的DNA樣品稀釋成相同濃度；最后進行qPCR。
本文以HCMV UL123基因為模板設計并合成引物，上游引物：5′-TCTGCCAGGACATCTTTCTC-3′，下游引物：5′-GTGACCAAGGCCACGACGTT-3′。在此基礎上進行qPCR擴增，反應體系包括：qPCR超混合液10 μL、上游引物+下游引物各0.5 μL、不含DNA酶/RNA酶的蒸餾水4 μL以及DNA 5 μL，總體積為20 μL。反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；一共40個循環。擴增結束后，導出結果，分析不同組別HCMV的DNA拷貝數。
1.2.4 蛋白免疫印跡檢測各組HCMV蛋白的表達
本實驗分為以下幾個組：① 對照組：不進行Cur預處理，不接種HCMV；② HCMV組：不進行Cur預處理，直接接種HCMV；③ HCMV+Cur（10 μmol/L）組：濃度為10 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV；④ HCMV+Cur（12 μmol/L）組：濃度為12 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV；⑤ HCMV+Cur（15 μmol/L）組：濃度為15 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV。培養72 h后，收集細胞。常規提取各組細胞的總蛋白，測定蛋白濃度，蛋白免疫印跡檢測HCMV各期蛋白（IE2、UL44、UL99）的表達情況，ECL發光試劑進行熒光顯色。將膠片掃描后，計算出條帶灰度值，并以β-actin為內參進行校正。
1.3 統計學方法
本研究采用統計產品與服務解決方案軟件SPSS（19.0, SPSS Inc., 美國）進行統計學處理。計量資料采用均數±標準差表示；組間比較采用學生t檢驗；P<0.05表示差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 Cur對MRC-5細胞活力的影響
如圖1所示，當Cur的濃度為18 μmol/L和20 μmol/L時，MRC-5細胞的活力與對照孔相比，受到明顯的抑制，差異具有統計學意義（P<0.05）。當Cur的濃度小于等于15 μmol/L時，與對照孔相比，細胞活力及增殖沒有明顯變化，且與時間的長短沒有明顯相關性，差異不具有統計學意義（P>0.05）。因此，在本研究的后續實驗中，所使用的Cur的最大濃度均為15 μmol/L。
圖1
Cur對MRC-5細胞活力的影響 *P < 0.05
Figure1.
Effect of Cur on viability of MRC-5 cells *P < 0.05
2.2 Cur對HCMV感染細胞形態學的影響
如圖2所示，與對照組相比，HCMV組細胞在感染病毒8 d后細胞幾乎全部裂解。HCMV+PFA組的細胞幾乎沒有裂解。用不同濃度的Cur預處理2 h后，發現在一定濃度范圍內，隨著Cur濃度的增加，蝕斑數量明顯減少，HCMV+Cur（15 μmol/L）組細胞形態基本正常，無明顯蝕斑和細胞溶解，與HCMV+PFA組的細胞形態類似。
圖2
Cur對HCMV感染引起的細胞病變的影響(8 d)
Figure2.
Effect of Cur on cytopathic effect caused by HCMV infection（8 d）
2.3 Cur對HCMV的DNA復制數的影響
采用qPCR方法測定HCMV的DNA拷貝數。本文以HCMV的UL123基因為模板，設計并合成引物。MRC-5細胞接種HCMV 72 h和96 h后收集細胞。如圖3所示，隨著時間的增加，各組HCMV的DNA拷貝數均增加。經PFA預處理后，HCMV的DNA拷貝數顯著減少，差異具有統計學意義（P<0.05）。經Cur預處理后，病毒DNA拷貝數雖然高于HCMV+PFA組，但低于HCMV組，且呈濃度依賴性，差異具有統計學意義（P<0.05）。
圖3
Cur對HCMV DNA載量的影響 *P < 0.05
Figure3.
Effect of Cur on DNA copies of HCMV *P < 0.05
2.4 Cur對HCMV蛋白表達的影響
HCMV基因組的轉錄和表達具有明顯的時序性，依次為IE、早期（Early，E）和晚期（Late，L）基因，參與病毒復制、轉錄、翻譯及調控等作用。IE基因代表感染早期，是原發或再次感染后最先表達的基因，主要調節宿主細胞基因復制與表達。E基因主要編碼HCMV的非結構蛋白，L基因主要合成病毒的結構蛋白，如衣殼、被膜和包膜蛋白。IE2、UL44和UL99分別屬于IE、E和L基因所編碼的蛋白。本研究發現MRC-5細胞感染HCMV 72 h后，三種HCMV蛋白（IE2、UL44、UL99）均已表達，且最先表達的IE2蛋白含量最多，最晚表達的UL99蛋白含量最少。如圖4所示，經Cur預處理后，三種蛋白的表達量均顯著降低，且呈濃度依賴性，差異具有統計學意義（P<0.05）。
圖4
Cur對HCMV蛋白表達的影響
*
*
3 討論
既往研究發現Cur具有抗腫瘤、抗氧化、抗微生物、抗腫瘤、降血脂以及抗動脈粥樣硬化等多種藥理活性和生物學作用[19]。大量研究證實，Cur直接與多種信號生物分子相互作用，具有治療多種炎癥和感染性疾病的潛能。現已發現其可在癌癥、關節炎、心血管疾病、神經退行性疾病、炎癥性腸病、口腔扁平苔癬、白癜風、牛皮癬、腎臟疾病、動脈粥樣硬化及糖尿病等疾病中起作用[23]。此外，研究還發現，Cur具有抑制某些人類病毒的感染活性，如丙型肝炎病毒 （hepatitis C virus，HCV）、柯薩奇病毒、人乳頭瘤病毒 （human papilloma viruses，HPV）、流感病毒等，其共同的抗病毒機制主要包括：減少病毒DNA/RNA表達、蛋白質合成，以及降低病毒滴度；誘導細胞凋亡和細胞病變；抑制磷脂酰肌醇-3激酶/蘇氨酸激酶/核因子-κB信號通路、降低局部炎性細胞因子的表達等[24-28]。
近年來，研究發現HCMV除了在免疫功能低下患者中引起嚴重的臨床癥狀和導致新生兒畸形與生長阻滯以外，也是引起老年人群發生衰老疾病的主要原因。2012年，Lv等[21]通過體外實驗首次發現Cur能夠顯著降低HCMV DNA的病毒載量，從而達到抗HCMV活性。Cur抗HCMV活性的機制很復雜，一方面Cur通過直接抑制HCMV的復制減輕細胞組織的損傷；另一方面，它通過抑制感染HCMV細胞凋亡而發揮保護作用。研究人員進一步發現Cur抗HCMV活性可能是改變宿主細胞微環境，如減少IL-6、TNF-α的分泌，抑制HCMV抗原（IE和UL83抗原）的表達[29]。動物實驗表明，Cur能夠減少HCMV免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）水平和DNA載量，在受感染的小鼠中，降低血清天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶、肌酸激酶、乳酸脫氫酶、TNF-α和IL-6水平，同時也抑制丙二醛含量和上調超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平。此外，還可以預防感染小鼠的心、肺、肝、腎組織發生病變[22]。
本研究通過MRC-5細胞的體外培養，建立HCMV感染模型，觀察Cur對感染HCMV細胞的保護作用。首先，采用MTS方法檢測Cur對MRC-5細胞活力和細胞毒性的影響。按照Cur（10、20、30、40、50 μmol/L）的藥物濃度梯度進行檢測，發現當Cur在20 μmol/L及以上濃度時，對細胞生長產生嚴重抑制作用。因此，本研究縮小濃度范圍，選擇不同濃度的Cur（5、8、10、12、15、18、20 μmol/L）繼續檢測其對細胞活力的影響。結果發現Cur濃度小于等于15 μmol/L時，與對照孔相比，細胞增殖沒有受到影響。因此本實驗使用Cur的最大濃度為15 μmol/L。接著，本研究采用蝕斑實驗直觀地觀察Cur對HCMV的影響，并且采用FDA批準用于抗HCMV的PFA作為陽性對照組，結果發現MRC-5細胞感染HCMV的5 d后，開始出現蝕斑，隨著時間的延長，蝕斑數量逐漸增多；感染8 d后，細胞全部裂解。用不同濃度的Cur預處理2 h后，各組蝕斑數量有所減少，且呈濃度依賴性。HCMV+Cur（15 μmol/L）組與HCMV+PFA組的細胞形態類似，從形態學上表明Cur能夠抑制HCMV的侵襲，有效減少蝕斑個數和細胞病變效應。然后，本研究進一步采用qPCR和蛋白免疫印跡方法分別檢測Cur對HCMV的DNA拷貝數和HCMV蛋白表達的影響。HCMV進入宿主細胞后，病毒基因的表達分為IE、E和L三個階段。IE基因編碼調控蛋白，主要包括由UL122和UL123基因編碼的IE2和IE1兩種磷酸化蛋白。IE2蛋白在反饋抑制HCMV的IE基因啟動子和激活早期基因啟動子方面起主要作用，而IE1能激活IE基因啟動子并協助IE2的反式激活。若阻斷IE基因的表達，HCMV基因組將無法進行復制，因此可將IE基因作為抗病毒藥物的一個重要作用靶點。本研究以UL123基因作為模板，設計并合成相關引物序列檢測HCMV的DNA拷貝數。研究發現，隨著時間的延長，病毒DNA拷貝數逐漸增多，經過PFA和不同濃度Cur預處理后，病毒DNA拷貝數明顯低于HCMV組，雖然PFA抑制HCMV的DNA比Cur更加顯著，但Cur也能夠抑制病毒DNA的復制，且呈濃度依賴性。E基因的表達是在HCMV基因組合成之前，依賴于IE基因表達產物的存在，主要合成一些促使進入宿主細胞有利于病毒DNA復制。而L基因的表達需要病毒基因組的復制，并依賴于IE或E基因表達產物的激活，主要編碼病毒結構蛋白、包膜糖蛋白以及皮層蛋白等[30-31]。本研究檢測了細胞在感染HCMV的72 h后，三種不同時期基因所編碼的蛋白表達情況，發現細胞在感染72 h后，HCMV不同時期（IE期、E期和L期）的蛋白（IE2、UL44、UL99）均已表達，且最先表達的IE2的量最高，最晚表達的UL99的量最低，進一步表明HCMV的基因表達具有時序性。經過Cur干預后，三種蛋白的表達水平均顯著下降，且呈濃度依賴性，表明Cur能夠抑制HCMV不同時序蛋白的表達。盡管既往有研究表明，Cur具有抗HCMV的活性，但都只是從單一角度進行描述。本研究從細胞形態學變化、病毒DNA拷貝數以及HCMV各時序蛋白表達等多方面進一步證實Cur可以通過抑制病毒復制和下調各個時序蛋白的表達發揮抗HCMV活性。
綜上所述，本研究利用MRC-5細胞作為HCMV感染的體外模型，證實了Cur作為一種潛在抗病毒藥物對抑制HCMV感染具有良好的應用前景，其抗HCMV感染可能是通過抑制HCMV的DNA的復制和下調HCMV不同時序蛋白的表達水平而實現的。該結果為臨床使用Cur治療HCMV感染性疾病提供了實驗依據。此外，Cur是否還通過其他作用靶點或分子機制抗HCMV仍不清楚，因此Cur抗HCMV活性還需要進一步研究明確。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：冷曉主要負責平臺搭建、實驗指導與安排、論文審閱修訂；丁香主要負責實驗操作、數據記錄與分析、論文撰寫；岳冀蓉主要負責數據管理與分析指導；董碧容主要負責實驗協調溝通、論文審閱修訂。
引言
人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一種機會病原體，在人群中具有較高的感染率，可達40%～100%[1-2]。隨著年齡的增加，其感染率逐漸增加。研究表明，30～39歲的成年人其HCMV的感染率為54%，而80歲以上的老年人感染率則達到91%[3]。一旦該病毒侵入機體，自身免疫系統難以將其完全清除，將長期或終身存在于體內，呈持續性隱性感染或潛伏感染[4-5]。在機體免疫功能低下時（如感染人類免疫缺陷病毒），或經受過器官骨髓移植以及長期使用免疫抑制劑等特殊人群中，潛伏在體內的HCMV往往容易被激活，繼而引起嚴重的臨床癥狀甚至罹患致死性疾病[6-8]。而在免疫功能正常的機體中，HCMV感染往往缺乏明顯的臨床癥狀，因此通常認為HCMV感染對免疫功能正常的人群沒有影響。但是，最近越來越多的研究發現，慢性HCMV感染能夠誘導宿主促炎性細胞因子的分泌，同時還可以導致T細胞免疫衰老[9]，其在健康人群的各種慢性疾病的發病機制中起著重要作用，如動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓以及炎癥性腸病等[10-13]。此外，HCMV感染還與認知能力下降、功能受損、衰弱的發生密切相關[14-15]，并導致死亡率增加[16-17]。因此，慢性HCMV感染在免疫功能正常的人群，尤其是老年人群中的臨床意義越來越受到關注和重視。目前美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）批準用于HCMV治療的藥物有5種，即更昔洛韋、纈更昔洛韋、膦甲酸鈉（phosphonoformic acid，PFA）、西多福韋和福米韋生[18]，這些藥物具有耐藥性、腎毒性以及生物利用度低等副作用，而老年人常常伴有腎功能不全，因此尋找新的抗HCMV藥物迫在眉睫。來源于植物的化合物由于毒副作用較低，目前已成為抗HCMV藥物研究中的熱點。姜黃素（curcumin，Cur）是從姜黃的塊莖中提取出來的一種疏水性的多酚化合物，為姜黃最主要的活性成分。既往研究發現Cur具有抗炎、抗氧化、抗微生物、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、抗動脈粥樣硬化以及免疫調節等多種藥理活性和生物學作用[19]，由于其毒副作用小，現已成為研發新藥的熱點并具有良好的臨床應用潛力。研究證實，Cur可以抑制 T 淋巴細胞、B 淋巴細胞和巨噬細胞的活化和增生，以及抗體的產生及淋巴因子的分泌。同時，Cur對急性、亞急性和慢性炎癥都有抗炎作用，可以減輕炎性組織中性粒細胞浸潤，抑制促炎性細胞因子的產生，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）[20]。目前已嘗試將Cur用于炎癥性腸病、類風濕關節炎、 哮喘、冠心病、阿爾茨海默病等疾病。Lv等[21-22]在體內和體外實驗均發現Cur能夠抑制HCMV的復制，但其具體的實驗機制尚不明確。因此，本研究通過體外培養人胚肺成纖維細胞，進一步證實Cur抗HCMV感染活性并探索其相關的分子機制，為尋找新的抗HCMV藥物提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞與病毒
本實驗采用人胚肺成纖維細胞（MRC-5），該細胞為28～32代細胞；HCMV采用Towne病毒株，該細胞和病毒均購自美國國立細胞庫公司。
按常規方法將病毒增殖至實驗需求量，本實驗使用的病毒感染復數（multiply of infection，MOI）為0.02，MOI = 感染性病毒量/細胞數。
1.1.2 藥物
Cur購自Sigma公司。根據說明書配制，配制方法：先用1.357 mL的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解10 mg的Cur粉末配成20 mmol/L的儲存液。使用前加入等量體積的無水乙醇配成10 mmol/L的Cur溶液，根據實驗需要，再進一步配制成所需濃度，現配現用。PFA購自Sigma公司，本研究使用的濃度為5 μmol/L。
1.1.3 主要試劑
杜爾貝科改良培養基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、濾紙膜購自美國Millipore公司；增強型化學發光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影劑、辣根過氧化物酶購自美國細胞信號技術（Cell Signaling Technology，CST）公司； DMSO購自美國Sigma公司；3-（4, 5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑內鹽[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium, inner salt, MTS]細胞增殖與細胞毒性檢測試劑盒購自美國Promega公司；DNA提取試劑盒、定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）超混合液與試劑盒購自美國QIAGEN公司；即刻早期（immediate early，IE）基因編碼蛋白2（IE2）、長獨特序列（unique long，UL） 44（UL44）、UL99抗體購自美國Abcam公司等。
1.1.4 主要儀器
倒置相差顯微鏡（TS2，尼康公司，日本）、二氧化碳培養箱（Forma Steri-Cycle 371，賽默飛世爾公司，美國）、高速冷凍離心機（ST16R，賽默飛世爾公司，德國）、臺式離心機（Legend Micro 17R，賽默飛世爾公司，美國)、熒光細胞分析儀（Countstar Rigel S2，上海睿鈺公司，中國），蛋白垂直電泳儀（165-8033，伯樂公司，美國）、超微量分光光度計（Nanodrop 2000，賽默飛世爾公司，美國）、熒光qPCR儀（Quantistudio 3，賽默飛世爾公司，美國）、酶標儀（epoch 2，伯騰公司，美國）等。
1.2 方法
1.2.1 MTS法檢測Cur對 MRC-5細胞活力的影響
取對數生長期的MRC-5細胞，按每孔5×103個細胞（體積100 μL）接種于96孔培養板中進行培養。培養24 h后去除培養基，更換含不同濃度Cur（5、8、10、12、15、18、20 μmol/L）的培養基，每個濃度設置3個平行孔，同時設置空白孔（無細胞，只加培養基）和對照孔（有細胞，不加Cur）；培養48 h后，每孔加入20 μL的MTS溶液（5 mg/mL），繼續于培養箱中培養4 h；在490 nm處測定各孔的光密度（optical density，OD）值。重復3次實驗，取各孔OD值的平均數，計算細胞活力。細胞活力 = ［（加藥細胞OD值 ? 空白孔OD值）/（對照孔OD值 ? 空白孔OD值）］ × 100%。
1.2.2 蝕斑實驗
取對數生長期的MRC-5細胞，培養24 h后，向各孔中分別加入不同濃度的Cur（8、10、12、15 μmol/L），作用2 h后，接種HCMV，同時設有對照組（只有細胞，不加Cur和HCMV）、HCMV組（不加Cur，只加HCMV）和陽性對照組即HCMV+PFA組（加入PFA和HCMV），培養7 d后，去除培養基，PBS清洗1次，加入2%的多聚甲醛固定1 h，然后PBS清洗1次，加入亞甲基藍溶液染色5 min，用PBS清洗2次，在顯微鏡下觀察各組蝕斑形成單位（plaque forming unit, PFU）的個數。
1.2.3 qPCR檢測各組HCMV DNA的復制數
本實驗分為以下幾個組：① HCMV組：不進行Cur預處理，直接接種HCMV；② HCMV+Cur（8 μmol/L）組：濃度為8 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV；③ HCMV+Cur（10 μmol/L）組：濃度為10 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV；④ HCMV+Cur（12 μmol/L）組：濃度為12 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV；⑤ HCMV+Cur（15 μmol/L）組：濃度為15 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV；⑥ HCMV+PFA組：濃度為5 μmol/L的PFA預處理2 h后接種HCMV。上述各組細胞培養至72 h和96 h，收集細胞。采用DNA提取試劑盒提取各組DNA；然后測定各組DNA濃度，將不同的DNA樣品稀釋成相同濃度；最后進行qPCR。
本文以HCMV UL123基因為模板設計并合成引物，上游引物：5′-TCTGCCAGGACATCTTTCTC-3′，下游引物：5′-GTGACCAAGGCCACGACGTT-3′。在此基礎上進行qPCR擴增，反應體系包括：qPCR超混合液10 μL、上游引物+下游引物各0.5 μL、不含DNA酶/RNA酶的蒸餾水4 μL以及DNA 5 μL，總體積為20 μL。反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；一共40個循環。擴增結束后，導出結果，分析不同組別HCMV的DNA拷貝數。
1.2.4 蛋白免疫印跡檢測各組HCMV蛋白的表達
本實驗分為以下幾個組：① 對照組：不進行Cur預處理，不接種HCMV；② HCMV組：不進行Cur預處理，直接接種HCMV；③ HCMV+Cur（10 μmol/L）組：濃度為10 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV；④ HCMV+Cur（12 μmol/L）組：濃度為12 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV；⑤ HCMV+Cur（15 μmol/L）組：濃度為15 μmol/L的Cur預處理2 h后接種HCMV。培養72 h后，收集細胞。常規提取各組細胞的總蛋白，測定蛋白濃度，蛋白免疫印跡檢測HCMV各期蛋白（IE2、UL44、UL99）的表達情況，ECL發光試劑進行熒光顯色。將膠片掃描后，計算出條帶灰度值，并以β-actin為內參進行校正。
1.3 統計學方法
本研究采用統計產品與服務解決方案軟件SPSS（19.0, SPSS Inc., 美國）進行統計學處理。計量資料采用均數±標準差表示；組間比較采用學生t檢驗；P<0.05表示差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 Cur對MRC-5細胞活力的影響
如圖1所示，當Cur的濃度為18 μmol/L和20 μmol/L時，MRC-5細胞的活力與對照孔相比，受到明顯的抑制，差異具有統計學意義（P<0.05）。當Cur的濃度小于等于15 μmol/L時，與對照孔相比，細胞活力及增殖沒有明顯變化，且與時間的長短沒有明顯相關性，差異不具有統計學意義（P>0.05）。因此，在本研究的后續實驗中，所使用的Cur的最大濃度均為15 μmol/L。
圖1
Cur對MRC-5細胞活力的影響 *P < 0.05
Figure1.
Effect of Cur on viability of MRC-5 cells *P < 0.05
2.2 Cur對HCMV感染細胞形態學的影響
如圖2所示，與對照組相比，HCMV組細胞在感染病毒8 d后細胞幾乎全部裂解。HCMV+PFA組的細胞幾乎沒有裂解。用不同濃度的Cur預處理2 h后，發現在一定濃度范圍內，隨著Cur濃度的增加，蝕斑數量明顯減少，HCMV+Cur（15 μmol/L）組細胞形態基本正常，無明顯蝕斑和細胞溶解，與HCMV+PFA組的細胞形態類似。
圖2
Cur對HCMV感染引起的細胞病變的影響(8 d)
Figure2.
Effect of Cur on cytopathic effect caused by HCMV infection（8 d）
2.3 Cur對HCMV的DNA復制數的影響
采用qPCR方法測定HCMV的DNA拷貝數。本文以HCMV的UL123基因為模板，設計并合成引物。MRC-5細胞接種HCMV 72 h和96 h后收集細胞。如圖3所示，隨著時間的增加，各組HCMV的DNA拷貝數均增加。經PFA預處理后，HCMV的DNA拷貝數顯著減少，差異具有統計學意義（P<0.05）。經Cur預處理后，病毒DNA拷貝數雖然高于HCMV+PFA組，但低于HCMV組，且呈濃度依賴性，差異具有統計學意義（P<0.05）。
圖3
Cur對HCMV DNA載量的影響 *P < 0.05
Figure3.
Effect of Cur on DNA copies of HCMV *P < 0.05
2.4 Cur對HCMV蛋白表達的影響
HCMV基因組的轉錄和表達具有明顯的時序性，依次為IE、早期（Early，E）和晚期（Late，L）基因，參與病毒復制、轉錄、翻譯及調控等作用。IE基因代表感染早期，是原發或再次感染后最先表達的基因，主要調節宿主細胞基因復制與表達。E基因主要編碼HCMV的非結構蛋白，L基因主要合成病毒的結構蛋白，如衣殼、被膜和包膜蛋白。IE2、UL44和UL99分別屬于IE、E和L基因所編碼的蛋白。本研究發現MRC-5細胞感染HCMV 72 h后，三種HCMV蛋白（IE2、UL44、UL99）均已表達，且最先表達的IE2蛋白含量最多，最晚表達的UL99蛋白含量最少。如圖4所示，經Cur預處理后，三種蛋白的表達量均顯著降低，且呈濃度依賴性，差異具有統計學意義（P<0.05）。
圖4
Cur對HCMV蛋白表達的影響
*
*
3 討論
既往研究發現Cur具有抗腫瘤、抗氧化、抗微生物、抗腫瘤、降血脂以及抗動脈粥樣硬化等多種藥理活性和生物學作用[19]。大量研究證實，Cur直接與多種信號生物分子相互作用，具有治療多種炎癥和感染性疾病的潛能。現已發現其可在癌癥、關節炎、心血管疾病、神經退行性疾病、炎癥性腸病、口腔扁平苔癬、白癜風、牛皮癬、腎臟疾病、動脈粥樣硬化及糖尿病等疾病中起作用[23]。此外，研究還發現，Cur具有抑制某些人類病毒的感染活性，如丙型肝炎病毒 （hepatitis C virus，HCV）、柯薩奇病毒、人乳頭瘤病毒 （human papilloma viruses，HPV）、流感病毒等，其共同的抗病毒機制主要包括：減少病毒DNA/RNA表達、蛋白質合成，以及降低病毒滴度；誘導細胞凋亡和細胞病變；抑制磷脂酰肌醇-3激酶/蘇氨酸激酶/核因子-κB信號通路、降低局部炎性細胞因子的表達等[24-28]。
近年來，研究發現HCMV除了在免疫功能低下患者中引起嚴重的臨床癥狀和導致新生兒畸形與生長阻滯以外，也是引起老年人群發生衰老疾病的主要原因。2012年，Lv等[21]通過體外實驗首次發現Cur能夠顯著降低HCMV DNA的病毒載量，從而達到抗HCMV活性。Cur抗HCMV活性的機制很復雜，一方面Cur通過直接抑制HCMV的復制減輕細胞組織的損傷；另一方面，它通過抑制感染HCMV細胞凋亡而發揮保護作用。研究人員進一步發現Cur抗HCMV活性可能是改變宿主細胞微環境，如減少IL-6、TNF-α的分泌，抑制HCMV抗原（IE和UL83抗原）的表達[29]。動物實驗表明，Cur能夠減少HCMV免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）水平和DNA載量，在受感染的小鼠中，降低血清天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶、肌酸激酶、乳酸脫氫酶、TNF-α和IL-6水平，同時也抑制丙二醛含量和上調超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平。此外，還可以預防感染小鼠的心、肺、肝、腎組織發生病變[22]。
本研究通過MRC-5細胞的體外培養，建立HCMV感染模型，觀察Cur對感染HCMV細胞的保護作用。首先，采用MTS方法檢測Cur對MRC-5細胞活力和細胞毒性的影響。按照Cur（10、20、30、40、50 μmol/L）的藥物濃度梯度進行檢測，發現當Cur在20 μmol/L及以上濃度時，對細胞生長產生嚴重抑制作用。因此，本研究縮小濃度范圍，選擇不同濃度的Cur（5、8、10、12、15、18、20 μmol/L）繼續檢測其對細胞活力的影響。結果發現Cur濃度小于等于15 μmol/L時，與對照孔相比，細胞增殖沒有受到影響。因此本實驗使用Cur的最大濃度為15 μmol/L。接著，本研究采用蝕斑實驗直觀地觀察Cur對HCMV的影響，并且采用FDA批準用于抗HCMV的PFA作為陽性對照組，結果發現MRC-5細胞感染HCMV的5 d后，開始出現蝕斑，隨著時間的延長，蝕斑數量逐漸增多；感染8 d后，細胞全部裂解。用不同濃度的Cur預處理2 h后，各組蝕斑數量有所減少，且呈濃度依賴性。HCMV+Cur（15 μmol/L）組與HCMV+PFA組的細胞形態類似，從形態學上表明Cur能夠抑制HCMV的侵襲，有效減少蝕斑個數和細胞病變效應。然后，本研究進一步采用qPCR和蛋白免疫印跡方法分別檢測Cur對HCMV的DNA拷貝數和HCMV蛋白表達的影響。HCMV進入宿主細胞后，病毒基因的表達分為IE、E和L三個階段。IE基因編碼調控蛋白，主要包括由UL122和UL123基因編碼的IE2和IE1兩種磷酸化蛋白。IE2蛋白在反饋抑制HCMV的IE基因啟動子和激活早期基因啟動子方面起主要作用，而IE1能激活IE基因啟動子并協助IE2的反式激活。若阻斷IE基因的表達，HCMV基因組將無法進行復制，因此可將IE基因作為抗病毒藥物的一個重要作用靶點。本研究以UL123基因作為模板，設計并合成相關引物序列檢測HCMV的DNA拷貝數。研究發現，隨著時間的延長，病毒DNA拷貝數逐漸增多，經過PFA和不同濃度Cur預處理后，病毒DNA拷貝數明顯低于HCMV組，雖然PFA抑制HCMV的DNA比Cur更加顯著，但Cur也能夠抑制病毒DNA的復制，且呈濃度依賴性。E基因的表達是在HCMV基因組合成之前，依賴于IE基因表達產物的存在，主要合成一些促使進入宿主細胞有利于病毒DNA復制。而L基因的表達需要病毒基因組的復制，并依賴于IE或E基因表達產物的激活，主要編碼病毒結構蛋白、包膜糖蛋白以及皮層蛋白等[30-31]。本研究檢測了細胞在感染HCMV的72 h后，三種不同時期基因所編碼的蛋白表達情況，發現細胞在感染72 h后，HCMV不同時期（IE期、E期和L期）的蛋白（IE2、UL44、UL99）均已表達，且最先表達的IE2的量最高，最晚表達的UL99的量最低，進一步表明HCMV的基因表達具有時序性。經過Cur干預后，三種蛋白的表達水平均顯著下降，且呈濃度依賴性，表明Cur能夠抑制HCMV不同時序蛋白的表達。盡管既往有研究表明，Cur具有抗HCMV的活性，但都只是從單一角度進行描述。本研究從細胞形態學變化、病毒DNA拷貝數以及HCMV各時序蛋白表達等多方面進一步證實Cur可以通過抑制病毒復制和下調各個時序蛋白的表達發揮抗HCMV活性。
綜上所述，本研究利用MRC-5細胞作為HCMV感染的體外模型，證實了Cur作為一種潛在抗病毒藥物對抑制HCMV感染具有良好的應用前景，其抗HCMV感染可能是通過抑制HCMV的DNA的復制和下調HCMV不同時序蛋白的表達水平而實現的。該結果為臨床使用Cur治療HCMV感染性疾病提供了實驗依據。此外，Cur是否還通過其他作用靶點或分子機制抗HCMV仍不清楚，因此Cur抗HCMV活性還需要進一步研究明確。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：冷曉主要負責平臺搭建、實驗指導與安排、論文審閱修訂；丁香主要負責實驗操作、數據記錄與分析、論文撰寫；岳冀蓉主要負責數據管理與分析指導；董碧容主要負責實驗協調溝通、論文審閱修訂。
