細胞外基質（ECM）對癌癥進展和化療敏感性至關重要。卵巢癌死亡率高、預后差，嚴重威脅著女性生命健康。但目前ECM硬度對卵巢癌長鏈非編碼RNA(lncRNAs)表達譜和化療抗性的調控作用尚不清楚。因此，本研究通過分析不同基質硬度卵巢癌細胞轉錄組數據，發現基質硬化導致大量lncRNAs表達上調，但SNHG8表達顯著下調，并利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）水凝膠培養的卵巢癌細胞進行驗證。研究發現敲低SNHG8降低了同源重組修復效率以及卵巢癌細胞對依托泊苷和順鉑的敏感性。GEPIA數據分析顯示，SNHG8在卵巢癌組織中顯著下調，其表達水平與卵巢癌患者預后呈負相關。本研究顯示基質硬化相關lncRNA SNHG8與卵巢癌化療敏感性和預后密切相關，可望作為指導卵巢癌化療用藥和預測預后的分子標志物。
引用本文： 程子娜, 馬曉璐, 張全有, 陳維毅. 基質硬化相關lncRNA SNHG8調控卵巢癌化療敏感性. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(1): 87-94. doi: 10.7507/1001-5515.202205038 復制
0 引言
卵巢癌（ovarian cancer，OC）是最常見且死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1]。由于缺乏可靠靈敏的早期診斷方法，超過75%的患者確診時已經處于晚期[2]。盡管手術切除、放化療和分子靶向藥物等治療在一定程度上能夠緩解患者病情，卵巢癌的5年生存率仍然較差[3]。以往對卵巢癌的研究和治療方案主要靶向癌細胞[4]，很大程度上忽略了卵巢微環境的影響。研究表明，人類卵巢排卵和傷口愈合的反復炎癥過程中細胞外基質（extracellular matrix，ECM）膠原蛋白會發生過度沉積及構象變化，引起ECM硬度增加，導致卵巢纖維化[5]。纖維化不僅是誘發卵巢癌的關鍵因素，還嚴重影響著卵巢癌的化療耐藥和預后[6]，但臨床上尚沒有用于緩解或者逆轉卵巢纖維化的治療方法，ECM硬度調控卵巢癌發生發展的功能及其內在機制仍知之甚少。
ECM不僅能夠支撐細胞結構，還可以響應多種機械信號如張力、壓力和剪切力的改變，從而調控基因表達[7]。研究表明，ECM硬度的增加會促進上皮-間充質轉化過程（epithelial-mesenchymal transition，EMT），導致癌細胞的浸潤和轉移[6]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指長度大于200個核苷酸、不具有蛋白編碼能力的RNA[8]，它在調控基因表達、細胞分化、細胞周期等多種生命過程中發揮著重要作用[6]。越來越多的研究發現，lncRNA表達失調會影響EMT，進而調控腫瘤的發生發展[6]。例如，HOTAIR、MALALT1、lncROR和H19等多個lncRNA被報道在腫瘤中表達上調并促進EMT，與腫瘤預后呈負相關[9]。因此，聚焦ECM硬度，尋找卵巢癌細胞lncRNA標志物，對防治卵巢癌和保護女性生殖健康具有重要意義。
本研究基于不同基質硬度卵巢癌細胞系SKOV3的轉錄組數據，揭示基質硬化相關的卵巢癌lncRNA表達譜，并對差異lncRNAs共表達的mRNA進行GO功能富集分析，利用RT-PCR、shRNA敲低、CCK8等實驗及GEPIA數據庫進行驗證，探究基質硬化相關lncRNA在化療敏感性及預后方面的價值，從而為指導卵巢癌的化療用藥和預測預后提供新的分子標志物。
1 材料與方法
1.1 實驗試劑
卵巢癌細胞系SKOV3、HO-8910和A2780以及人胚腎細胞HEK293T（來源于ATCC細胞庫），置于含有10%胎牛血清（Biowest，烏拉圭）的RPMI-1640或者DMEM培養基（BI），37 ℃培養箱中培養（5% CO2）。
1.2 數據來源
從Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫中下載GSE178888數據集原始數據。該數據集基于Illumina NovaSeq 6000平臺測序，包括在不同基質硬度（0.5、25、106 kPa）生長的卵巢癌細胞系SKOV3的轉錄組測序結果。
1.3 數據篩選
對于差異表達基因（differentially expressed genes，DEG）的分析，使用R語言中的limma包，以差異倍數2倍（|log2FC|>1，P<0.05）為標準，獲取差異表達基因并利用R包ggplot2作圖。對于GO（gene ontology）富集分析，以P<0.05為標準，用clusterProfiler R packages分析所有差異表達基因，獲得顯著差異的信號通路。對于共表達分析，選取在0.5 kPa組、106 kPa組的所有差異lncRNA和mRNA，納入共表達分析網絡，根據皮爾森相關系數選取|PCC|>0.95和校正后P<0.05的lncRNA和mRNA對。
1.4 不同硬度基質的制備
按照文章報道的方法[6]，我們使用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）（SYLGARD184，道康寧）制備兩種不同硬度基質：按質量比40∶1（Stiff）和60∶1（Moderate）在PDMS前驅物A劑中加入B劑（固化劑），充分混勻，排除氣泡。將制備的PDMS混合液導入60 mm培養皿中，靜置1 h后70 ℃烘烤4~6 h。然后在皿內加入0.2 mg/mL的Ⅰ型膠原溶液（C8062，索萊寶），4 ℃孵育過夜，紫外線照射2 h后用PBS清洗3次用于接種細胞。
1.5 實時熒光定量PCR（RT-PCR）
將細胞接種于不同硬度PDMS基底培養皿72 h后，提取總RNA（TRizol法，全式金），并反轉錄成cDNA（AU341，全式金），–20 ℃保存。按照實時熒光定量試劑盒（AQ601，全式金）說明操作，驗證候選lncRNAs的表達情況。設計RT-PCR引物序列如下：NEAT1-F：AGTGATGTGGAGTTAAGGCGC；NEAT1-R：CGGGCTTACCAGATGACCAG；LINC00894-F：GGGGCTACTTTGTAAACCAC；LINC00894-R：AAATGAAAACTCAGAGAACAGAC；LINC02535-F：AAGGAGCTCTGTTCTCCAGG；LINC02535-R：GCCTCTATGTAGGGCGCTTT；SNHG8-F：ATCCAAGTGGTAATGGGCGAAG；SNHG8-R：AATAGGTGTCCTGATAACTTCC；GAPDH-F：TGTGGGCATCAATGGATTTGG；GAPDH-R：ACACCATGTATTCCGGGTCAAT。
1.6 同源重組修復效率分析
DR-U2OS細胞是一種含有GFP報告基因的同源重組（homologous recombination，HR）修復報告系統[10]。I-SceI酶切導致SceGFP內部產生DNA雙鏈斷裂，若利用iGFP進行HR修復，則細胞表達GFP綠色熒光。針對候選lncRNA，分別設計一對shRNA寡核苷酸（上海捷瑞生物工程有限公司，中國），然后退火克隆到pLKO.1空載體上，構建shRNA-NEAT1、shRNA-LINC00894、shRNA-LINC02535、shRNA-SNHG8和shRNA-NC病毒載體。利用HEK293T細胞包裝上述shRNA病毒，并感染DR-U2OS細胞。24 h后，用I-SceI限制性內切酶的病毒感染敲低候選lncRNA的DR-U2OS細胞，48 h后用流式細胞術分析表達GFP的陽性細胞比例。shRNA引物序列如下：
shNEAT1-F：TAGAGAAAAGTCCAAAAGGAGCTCGAGCTCCTTTTGGACTTTTCTCTA；shNEAT1-R：TAGAGAAAAGTCCAAAAGGAGCTCGAGCTCCTTTTGGACTTTTCTCTA；shLINC00894-F：GAAGTGTGTGTGGCTGGAAGCTCGAGCTTCCAGCCACACACACTTCC；shLINC00894-R：GAAGTGTGTGTGGCTGGAAGCTCGAGCTTCCAGCCACACACACTTC；shLINC02535-F：GCCGATTGTCACAAAGATCTCGAGATCTTTGTGACAATCGGC；shLINC02535-R：GCCGATTGTCACAAAGATCTCGAGATCTTTGTGACAATCGGC；shSNHG8-F：AGGTGGTCCGTGATAATTAAACTCGAGTTTAATTATCACGGACCACCT；shSNHG8-R：AGGTGGTCCGTGATAATTAAACTCGAGTTTAATTATCACGGACCACCT。
1.7 藥物敏感性
用shRNA病毒感染細胞，敲低候選lncRNA 24 h后將細胞種到96孔板（5 000個/孔）。敲低48 h后，用化療藥物依托泊苷（etoposide，ETO）或者順鉑（cisplatin，CDDP）處理細胞24 h，然后加入CCK8試劑，2~4 h后用酶標儀檢測吸光值（OD450）。
1.8 統計學分析
采用PRISM軟件（Graphpad Software Inc.）進行雙尾t檢驗。P值保留小數點后4位，檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 基質硬度調控卵巢癌細胞lncRNAs表達
為了探究不同基質硬度卵巢癌細胞中的lncRNA表達情況及其相關功能，首先對不同基質硬度（Soft組：0.5 kPa；Moderate組：25 kPa；Stiff組：106 kPa）卵巢癌細胞系SKOV3轉錄組數據（RNA-Seq）進行基因表達主成分分析（principal component analysis，PCA）。結果顯示，三種不同基質硬度培養的SKOV3細胞有較好的區分度，重復性較好（見圖1a）。利用R軟件的limma包篩選不同基質硬度SKOV3細胞的差異表達lncRNAs發現，基質變軟或者變硬均會導致細胞內lncRNAs表達發生明顯變化。Soft組與Moderate組的lncRNAs表達更為相似，而Stiff組lncRNA的表達譜與Soft組和Moderate組顯著不同（見圖1b）。以Moderate組為對照，Soft組有35個差異表達lncRNAs（包括28個上調lncRNAs，7個下調lncRNAs）（見圖1c），Stiff組有174個差異表達lncRNAs（包括165個上調lncRNAs，9個下調lncRNAs）（見圖1d）。進一步地，我們對Soft和Stiff組的所有差異表達lncRNAs進行差異表達基因的共表達分析和GO功能注釋。結果顯示，基質硬度變化顯著影響了卵巢癌細胞的二價無機陽離子平衡、內質網、膠原合成與代謝、平滑肌細胞增殖、內質網細胞分化、質膜黏附分子介導的親和性細胞黏附、細胞外結構重塑和ECM重塑等生命過程（見圖1e）。以上結果表明，基質硬化導致大量lncRNAs的表達上調，基質硬度的確參與了調控卵巢癌細胞lncRNAs的表達并影響卵巢癌細胞的多種生物學過程。
圖1
基質硬度對卵巢癌lncRNA表達的調控
a. PCA分析；b. 差異lncRNA熱圖；Soft組 (c) 和Stiff組 (d) 差異表達lncRNAs火山圖；e. 差異表達lncRNAs共表達的DEG GO功能富集
Figure1. Regulation of matrix stiffness on lncRNA expression in ovarian cancera. PCA analysis; b. heat map of differentially expressed lncRNAs; volcanic plots of differentially expressed lncRNAs in Soft group (c) and Stiff group (d) respectively; e. GO enrichment analysis of the DEGs correlated with differentially expressed lncRNAs
2.2 基質硬化相關lncRNAs驗證
如圖2a所示，與Moderate組相比，Stiff組差異表達lncRNA（174個）的數量明顯高于Soft組（35個），而兩組共有差異表達lncRNA僅有8個。已知腫瘤的發生發展常常伴隨著ECM硬化，為了篩選可能參與應答卵巢癌ECM硬度增加的lncRNAs，我們首先比較了Stiff組174個差異表達lncRNAs的reads數目，從中篩選出28個表達量較高（raw count>100）的lncRNAs（包括26個上調lncRNAs，2個下調lncRNAs）。通過分析26個上調lncRNAs的差異表達倍數（|log2FC|），從Top 10表達上調lncRNAs中挑選出了2個上調lncRNAs（NEAT1和LINC00894），與上述2個下調lncRNAs（LINC02535和SNHG8）作為4個候選lncRNAs用于后續研究（見圖2b）。我們利用PDMS制備Moderate（60∶1）和Stiff（40∶1）兩種不同硬度的水凝膠，培養卵巢癌細胞SKOV3 72 h后，收集總RNA并采用RT-PCR技術進一步驗證基質硬化對候選lncRNAs（NEAT1、LINC00894、LINC02535和SNHG8）表達的調控作用。如圖2c所示，SKOV3細胞在兩種硬度PDMS基底上形態良好、增殖正常。與Moderate組相比，Stiff組中NEAT1和LINC00984顯著上調，LINC02535和SNHG8明顯下調（見圖2d），該結果與RNA-Seq結果一致，驗證了RNA-Seq測序和分析的重復性和準確性。此外，我們將卵巢癌細胞A2780和HO8910在上述兩種硬度的PDMS基底培養72 h后，發現4個候選lncRNAs的表達變化與SKOV3細胞的結果一致（見圖2e~f）。
圖2
基質硬化相關lncRNAs的驗證
a. Stiff組和Soft組差異表達lncRNAs韋恩圖；b. 基質硬化相關的候選lncRNAs；c. 不同硬度PDMS基底培養的SKOV3細胞；候選lncRNAs在不同硬度PDMS基底培養的SKOV3（d）、A2780（e）和HO-8910（f）中的表達水平
Figure2. Validation of matrix stiffness related lncRNAsa. Venn diagrams of differentially expressed lncRNAs in Stiff and Soft groups; b. candidate lncRNAs related to matrix stiffness; c. SKOV3 cells cultured in PDMS substrates with different stiffness; gene expression levels of candidate lncRNAs in SKOV3 (d), A2780 (e) and HO8910 (f) cells cultured in PDMS substrates with different stiffness
2.3 lncRNA SNHG8調控卵巢癌化療敏感性
目前治療癌癥的化療藥物多為DNA損傷試劑，可以損傷腫瘤細胞DNA，例如造成DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB），進而誘發癌細胞凋亡。已知HR修復是細胞內修復DSB損傷的主要通路，我們首先構建了候選lncRNAs的shRNA病毒載體，利用shRNA在HR報告系統中分別敲低候選lncRNAs（見圖3a~b）。結果顯示，敲低LINC00894、LINC02535和SNHG8均導致細胞內GFP陽性細胞比例顯著降低，而敲低NEAT1則沒有明顯變化（見圖3c~d），暗示LINC00894、LINC02535和SNHG8促進HR通路，很有可能調控DSB修復進程進而影響化療藥物的治療效果。
圖3
LINC00894、LINC02535和SNHG8參與HR修復
a. 候選lncRNAs的shRNA敲低效果；b. HR報告系統示意圖；c. GFP陽性細胞的流式細胞術代表圖；d. HR修復效率
Figure3. LINC00894, LINC02535 and SNHG8 participate in HR repaira. gene expression levels of candidate lncRNAs after shRNA transfection; b. schematic diagram of HR reporter; c. representative images of GFP-positive cells analyzed by flow cytometry; d. LINC00894, LINC02535 and SNHG8 knockdown impairs HR repair
依托泊苷作為臨床上治療卵巢癌的有效藥物，它主要通過與DNA拓撲異構酶II結合，導致細胞內產生DSB達到抗腫瘤的效果。為了進一步探究基質硬化相關lncRNAs是否影響卵巢癌化療敏感性，我們在SKOV3細胞中分別敲低候選lncRNAs，48 h后用ETO處理，發現敲低SNHG8顯著降低了SKOV3對ETO藥物的敏感性，而NEAT1、LINC00894和LINC02535敲低的SKOV3細胞對ETO敏感性沒有明顯改變（見圖4a）。此外，我們還發現SNHG8下調導致SKOV3細胞對順鉑的敏感性也顯著降低（見圖4b）。與SKOV3細胞結果一致，在卵巢癌細胞系A2780和HO-8910中敲低SNHG8同樣導致細胞對ETO和CDDP的敏感性顯著降低（見圖4c~d）。以上結果說明，基質硬化相關lncRNA SNHG8表達下調嚴重降低了化療藥物ETO和CDDP對卵巢癌的抗腫瘤效果，暗示lncRNA SNHG8可能與卵巢癌化療耐藥的產生相關。
圖4
SNHG8調控卵巢癌對依托泊苷（ETO）和順鉑（CDDP）的化療敏感性
敲低SNHG8降低SKOV3細胞對ETO (a)和CDDP (b)的敏感性；c. 敲低SNHG8降低A2780細胞對ETO和CDDP的藥物敏感性；d. 敲低SNHG8降低HO-8910細胞對ETO和CDDP的藥物敏感性
Figure4. SNHG8 regulates chemotherapy sensitivity of ovarian cancer to etoposide (ETO) and cisplatin (CDDP)SNHG8 knockdown impairs the cellular sensitivity of SKOV3 to ETO (a) and CDDP (b); c. SNHG8 knockdown impairs the cellular sensitivity of A2780 to ETO and CDDP; d. SNHG8 knockdown impairs the cellular sensitivity of HO-8910 to ETO and CDDP
2.4 lncRNA SNHG8與卵巢癌預后呈負相關
通過GEPIA數據庫分析，我們發現相比于正常組織，SNHG8在卵巢癌中的表達確實顯著下降（見圖5a），與基質硬度的增加導致SNHG8表達下調一致（見圖2d~f）。此外，如圖5b所示，與SNHG8低表達卵巢癌患者相比，SNHG8高表達卵巢癌患者的生存期明顯縮短（P=0.011），暗示基質硬化相關lncRNA SNHG8很有可能作為一個新的卵巢癌預后分子標志物。
圖5
GEPIA分析
a. 正常組織和腫瘤組織中的SNHG8表達水平；b. SNHG8與卵巢癌生存期呈負相關
Figure5. GEPIA analysisa. expression levels of SNHG8 in normal and tumor tissues; b. SNHG8 is negatively correlated with the overall survival of ovarian cancer
3 討論
卵巢纖維化是誘發卵巢癌的關鍵因素[11]，其特點是ECM硬化[12]。ECM硬化引起的EMT還會導致腫瘤細胞化療耐藥性的產生[13]。研究報道，ECM硬度可以通過Hippo通路不依賴的方式調控YAP蛋白入核進而促進癌細胞增殖[14-15]。基質變軟會引起鉑類化療藥物耐藥相關基因ERBB2、BCL-2、MAP3K5、PIK3R1和BIRC3的表達顯著升高，導致卵巢癌細胞SKOV3對順鉑的敏感性降低[16]。另外，越來越多lncRNAs被報道調控腫瘤增殖和轉移等過程[17-19]。例如，MALAT1是目前研究最清楚的腫瘤相關lncRNA[20]，它通過激活Wnt/β-catenin、EMT、PI3K/AKT和ERK/MAPK多種通路同時促進腫瘤的發生發展[21]。雖然ECM硬度已經成為直接影響卵巢癌進展和化療敏感性的重要因素[22]，但是目前ECM硬度對卵巢癌lncRNA表達譜的影響尚不清楚，基質硬化相關lncRNAs對卵巢癌化療抗性的具體影響也仍未可知。
以Moderate（25 kPa）組為對照，基質變軟對整體lncRNA的表達影響不大，僅有少量lncRNAs表達發生變化。而基質硬度的增加則引起了大量lncRNAs表達上調和少量lncRNAs下調，這與腫瘤發生過程中常常伴隨著基質硬度的增加和大量基因的表達上調相一致[13]。同時，基質硬度調控的差異表達lncRNA主要參與膠原合成代謝、平滑肌細胞增殖、ECM重塑等生物過程。
lncRNA SNHG8是一種小的核仁RNA[23]，不僅參與轉錄、翻譯、RNA剪切等多種生物學過程[24]，還與多種惡性腫瘤的發生密切相關，包括非小細胞肺癌[25]、胃癌[26]、胰腺癌[27]、乳腺癌[28]等。最近，SNHG8被報道能夠激活Wnt/β-catenin信號通路[29]促進卵巢癌進展，沉默SNHG8能顯著抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和EMT等過程[30]。我們發現SNHG8參與應答卵巢癌基質硬度的變化，基質硬化導致其表達顯著下調，說明SNHG8與卵巢纖維化和卵巢癌的發生密切相關，有可能作為卵巢癌早期診斷的分子標志物，對防治卵巢癌和保護女性生殖健康具有重要意義。敲低SNHG8不僅降低了卵巢癌細胞HR的修復效率，還導致卵巢癌細胞對化療藥物ETO和CDDP的敏感性明顯降低，暗示SNHG8參與HR修復，并與卵巢癌化療耐藥呈負相關，但其在DSB損傷修復中的具體功能和分子機制值得進一步深入研究。
4 結論
本研究成功分析出基質硬化相關的卵巢癌lncRNAs表達譜，篩選出基質硬化相關的關鍵lncRNA SNHG8。SNHG8在基質硬化過程和卵巢癌組織中的表達均顯著下降。SNHG8敲低顯著降低了細胞HR修復效率以及對化療藥物ETO和CDDP的敏感性。同時，SNHG8的表達水平與卵巢癌患者的生存期呈負相關。
重要聲明
利益沖突說明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：程子娜是本研究的實驗設計者及實驗研究的執行人，負責數據收集、數據分析、論文寫作；馬曉璐參與本研究的實驗設計，數據分析，論文寫作；張全有參與本研究的實驗設計；陳維毅是本研究的構思者及負責人，指導實驗設計、數據分析、論文寫作與修改。
0 引言
卵巢癌（ovarian cancer，OC）是最常見且死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1]。由于缺乏可靠靈敏的早期診斷方法，超過75%的患者確診時已經處于晚期[2]。盡管手術切除、放化療和分子靶向藥物等治療在一定程度上能夠緩解患者病情，卵巢癌的5年生存率仍然較差[3]。以往對卵巢癌的研究和治療方案主要靶向癌細胞[4]，很大程度上忽略了卵巢微環境的影響。研究表明，人類卵巢排卵和傷口愈合的反復炎癥過程中細胞外基質（extracellular matrix，ECM）膠原蛋白會發生過度沉積及構象變化，引起ECM硬度增加，導致卵巢纖維化[5]。纖維化不僅是誘發卵巢癌的關鍵因素，還嚴重影響著卵巢癌的化療耐藥和預后[6]，但臨床上尚沒有用于緩解或者逆轉卵巢纖維化的治療方法，ECM硬度調控卵巢癌發生發展的功能及其內在機制仍知之甚少。
ECM不僅能夠支撐細胞結構，還可以響應多種機械信號如張力、壓力和剪切力的改變，從而調控基因表達[7]。研究表明，ECM硬度的增加會促進上皮-間充質轉化過程（epithelial-mesenchymal transition，EMT），導致癌細胞的浸潤和轉移[6]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指長度大于200個核苷酸、不具有蛋白編碼能力的RNA[8]，它在調控基因表達、細胞分化、細胞周期等多種生命過程中發揮著重要作用[6]。越來越多的研究發現，lncRNA表達失調會影響EMT，進而調控腫瘤的發生發展[6]。例如，HOTAIR、MALALT1、lncROR和H19等多個lncRNA被報道在腫瘤中表達上調并促進EMT，與腫瘤預后呈負相關[9]。因此，聚焦ECM硬度，尋找卵巢癌細胞lncRNA標志物，對防治卵巢癌和保護女性生殖健康具有重要意義。
本研究基于不同基質硬度卵巢癌細胞系SKOV3的轉錄組數據，揭示基質硬化相關的卵巢癌lncRNA表達譜，并對差異lncRNAs共表達的mRNA進行GO功能富集分析，利用RT-PCR、shRNA敲低、CCK8等實驗及GEPIA數據庫進行驗證，探究基質硬化相關lncRNA在化療敏感性及預后方面的價值，從而為指導卵巢癌的化療用藥和預測預后提供新的分子標志物。
1 材料與方法
1.1 實驗試劑
卵巢癌細胞系SKOV3、HO-8910和A2780以及人胚腎細胞HEK293T（來源于ATCC細胞庫），置于含有10%胎牛血清（Biowest，烏拉圭）的RPMI-1640或者DMEM培養基（BI），37 ℃培養箱中培養（5% CO2）。
1.2 數據來源
從Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫中下載GSE178888數據集原始數據。該數據集基于Illumina NovaSeq 6000平臺測序，包括在不同基質硬度（0.5、25、106 kPa）生長的卵巢癌細胞系SKOV3的轉錄組測序結果。
1.3 數據篩選
對于差異表達基因（differentially expressed genes，DEG）的分析，使用R語言中的limma包，以差異倍數2倍（|log2FC|>1，P<0.05）為標準，獲取差異表達基因并利用R包ggplot2作圖。對于GO（gene ontology）富集分析，以P<0.05為標準，用clusterProfiler R packages分析所有差異表達基因，獲得顯著差異的信號通路。對于共表達分析，選取在0.5 kPa組、106 kPa組的所有差異lncRNA和mRNA，納入共表達分析網絡，根據皮爾森相關系數選取|PCC|>0.95和校正后P<0.05的lncRNA和mRNA對。
1.4 不同硬度基質的制備
按照文章報道的方法[6]，我們使用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）（SYLGARD184，道康寧）制備兩種不同硬度基質：按質量比40∶1（Stiff）和60∶1（Moderate）在PDMS前驅物A劑中加入B劑（固化劑），充分混勻，排除氣泡。將制備的PDMS混合液導入60 mm培養皿中，靜置1 h后70 ℃烘烤4~6 h。然后在皿內加入0.2 mg/mL的Ⅰ型膠原溶液（C8062，索萊寶），4 ℃孵育過夜，紫外線照射2 h后用PBS清洗3次用于接種細胞。
1.5 實時熒光定量PCR（RT-PCR）
將細胞接種于不同硬度PDMS基底培養皿72 h后，提取總RNA（TRizol法，全式金），并反轉錄成cDNA（AU341，全式金），–20 ℃保存。按照實時熒光定量試劑盒（AQ601，全式金）說明操作，驗證候選lncRNAs的表達情況。設計RT-PCR引物序列如下：NEAT1-F：AGTGATGTGGAGTTAAGGCGC；NEAT1-R：CGGGCTTACCAGATGACCAG；LINC00894-F：GGGGCTACTTTGTAAACCAC；LINC00894-R：AAATGAAAACTCAGAGAACAGAC；LINC02535-F：AAGGAGCTCTGTTCTCCAGG；LINC02535-R：GCCTCTATGTAGGGCGCTTT；SNHG8-F：ATCCAAGTGGTAATGGGCGAAG；SNHG8-R：AATAGGTGTCCTGATAACTTCC；GAPDH-F：TGTGGGCATCAATGGATTTGG；GAPDH-R：ACACCATGTATTCCGGGTCAAT。
1.6 同源重組修復效率分析
DR-U2OS細胞是一種含有GFP報告基因的同源重組（homologous recombination，HR）修復報告系統[10]。I-SceI酶切導致SceGFP內部產生DNA雙鏈斷裂，若利用iGFP進行HR修復，則細胞表達GFP綠色熒光。針對候選lncRNA，分別設計一對shRNA寡核苷酸（上海捷瑞生物工程有限公司，中國），然后退火克隆到pLKO.1空載體上，構建shRNA-NEAT1、shRNA-LINC00894、shRNA-LINC02535、shRNA-SNHG8和shRNA-NC病毒載體。利用HEK293T細胞包裝上述shRNA病毒，并感染DR-U2OS細胞。24 h后，用I-SceI限制性內切酶的病毒感染敲低候選lncRNA的DR-U2OS細胞，48 h后用流式細胞術分析表達GFP的陽性細胞比例。shRNA引物序列如下：
shNEAT1-F：TAGAGAAAAGTCCAAAAGGAGCTCGAGCTCCTTTTGGACTTTTCTCTA；shNEAT1-R：TAGAGAAAAGTCCAAAAGGAGCTCGAGCTCCTTTTGGACTTTTCTCTA；shLINC00894-F：GAAGTGTGTGTGGCTGGAAGCTCGAGCTTCCAGCCACACACACTTCC；shLINC00894-R：GAAGTGTGTGTGGCTGGAAGCTCGAGCTTCCAGCCACACACACTTC；shLINC02535-F：GCCGATTGTCACAAAGATCTCGAGATCTTTGTGACAATCGGC；shLINC02535-R：GCCGATTGTCACAAAGATCTCGAGATCTTTGTGACAATCGGC；shSNHG8-F：AGGTGGTCCGTGATAATTAAACTCGAGTTTAATTATCACGGACCACCT；shSNHG8-R：AGGTGGTCCGTGATAATTAAACTCGAGTTTAATTATCACGGACCACCT。
1.7 藥物敏感性
用shRNA病毒感染細胞，敲低候選lncRNA 24 h后將細胞種到96孔板（5 000個/孔）。敲低48 h后，用化療藥物依托泊苷（etoposide，ETO）或者順鉑（cisplatin，CDDP）處理細胞24 h，然后加入CCK8試劑，2~4 h后用酶標儀檢測吸光值（OD450）。
1.8 統計學分析
采用PRISM軟件（Graphpad Software Inc.）進行雙尾t檢驗。P值保留小數點后4位，檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 基質硬度調控卵巢癌細胞lncRNAs表達
為了探究不同基質硬度卵巢癌細胞中的lncRNA表達情況及其相關功能，首先對不同基質硬度（Soft組：0.5 kPa；Moderate組：25 kPa；Stiff組：106 kPa）卵巢癌細胞系SKOV3轉錄組數據（RNA-Seq）進行基因表達主成分分析（principal component analysis，PCA）。結果顯示，三種不同基質硬度培養的SKOV3細胞有較好的區分度，重復性較好（見圖1a）。利用R軟件的limma包篩選不同基質硬度SKOV3細胞的差異表達lncRNAs發現，基質變軟或者變硬均會導致細胞內lncRNAs表達發生明顯變化。Soft組與Moderate組的lncRNAs表達更為相似，而Stiff組lncRNA的表達譜與Soft組和Moderate組顯著不同（見圖1b）。以Moderate組為對照，Soft組有35個差異表達lncRNAs（包括28個上調lncRNAs，7個下調lncRNAs）（見圖1c），Stiff組有174個差異表達lncRNAs（包括165個上調lncRNAs，9個下調lncRNAs）（見圖1d）。進一步地，我們對Soft和Stiff組的所有差異表達lncRNAs進行差異表達基因的共表達分析和GO功能注釋。結果顯示，基質硬度變化顯著影響了卵巢癌細胞的二價無機陽離子平衡、內質網、膠原合成與代謝、平滑肌細胞增殖、內質網細胞分化、質膜黏附分子介導的親和性細胞黏附、細胞外結構重塑和ECM重塑等生命過程（見圖1e）。以上結果表明，基質硬化導致大量lncRNAs的表達上調，基質硬度的確參與了調控卵巢癌細胞lncRNAs的表達并影響卵巢癌細胞的多種生物學過程。
圖1
基質硬度對卵巢癌lncRNA表達的調控
a. PCA分析；b. 差異lncRNA熱圖；Soft組 (c) 和Stiff組 (d) 差異表達lncRNAs火山圖；e. 差異表達lncRNAs共表達的DEG GO功能富集
Figure1. Regulation of matrix stiffness on lncRNA expression in ovarian cancera. PCA analysis; b. heat map of differentially expressed lncRNAs; volcanic plots of differentially expressed lncRNAs in Soft group (c) and Stiff group (d) respectively; e. GO enrichment analysis of the DEGs correlated with differentially expressed lncRNAs
2.2 基質硬化相關lncRNAs驗證
如圖2a所示，與Moderate組相比，Stiff組差異表達lncRNA（174個）的數量明顯高于Soft組（35個），而兩組共有差異表達lncRNA僅有8個。已知腫瘤的發生發展常常伴隨著ECM硬化，為了篩選可能參與應答卵巢癌ECM硬度增加的lncRNAs，我們首先比較了Stiff組174個差異表達lncRNAs的reads數目，從中篩選出28個表達量較高（raw count>100）的lncRNAs（包括26個上調lncRNAs，2個下調lncRNAs）。通過分析26個上調lncRNAs的差異表達倍數（|log2FC|），從Top 10表達上調lncRNAs中挑選出了2個上調lncRNAs（NEAT1和LINC00894），與上述2個下調lncRNAs（LINC02535和SNHG8）作為4個候選lncRNAs用于后續研究（見圖2b）。我們利用PDMS制備Moderate（60∶1）和Stiff（40∶1）兩種不同硬度的水凝膠，培養卵巢癌細胞SKOV3 72 h后，收集總RNA并采用RT-PCR技術進一步驗證基質硬化對候選lncRNAs（NEAT1、LINC00894、LINC02535和SNHG8）表達的調控作用。如圖2c所示，SKOV3細胞在兩種硬度PDMS基底上形態良好、增殖正常。與Moderate組相比，Stiff組中NEAT1和LINC00984顯著上調，LINC02535和SNHG8明顯下調（見圖2d），該結果與RNA-Seq結果一致，驗證了RNA-Seq測序和分析的重復性和準確性。此外，我們將卵巢癌細胞A2780和HO8910在上述兩種硬度的PDMS基底培養72 h后，發現4個候選lncRNAs的表達變化與SKOV3細胞的結果一致（見圖2e~f）。
圖2
基質硬化相關lncRNAs的驗證
a. Stiff組和Soft組差異表達lncRNAs韋恩圖；b. 基質硬化相關的候選lncRNAs；c. 不同硬度PDMS基底培養的SKOV3細胞；候選lncRNAs在不同硬度PDMS基底培養的SKOV3（d）、A2780（e）和HO-8910（f）中的表達水平
Figure2. Validation of matrix stiffness related lncRNAsa. Venn diagrams of differentially expressed lncRNAs in Stiff and Soft groups; b. candidate lncRNAs related to matrix stiffness; c. SKOV3 cells cultured in PDMS substrates with different stiffness; gene expression levels of candidate lncRNAs in SKOV3 (d), A2780 (e) and HO8910 (f) cells cultured in PDMS substrates with different stiffness
2.3 lncRNA SNHG8調控卵巢癌化療敏感性
目前治療癌癥的化療藥物多為DNA損傷試劑，可以損傷腫瘤細胞DNA，例如造成DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB），進而誘發癌細胞凋亡。已知HR修復是細胞內修復DSB損傷的主要通路，我們首先構建了候選lncRNAs的shRNA病毒載體，利用shRNA在HR報告系統中分別敲低候選lncRNAs（見圖3a~b）。結果顯示，敲低LINC00894、LINC02535和SNHG8均導致細胞內GFP陽性細胞比例顯著降低，而敲低NEAT1則沒有明顯變化（見圖3c~d），暗示LINC00894、LINC02535和SNHG8促進HR通路，很有可能調控DSB修復進程進而影響化療藥物的治療效果。
圖3
LINC00894、LINC02535和SNHG8參與HR修復
a. 候選lncRNAs的shRNA敲低效果；b. HR報告系統示意圖；c. GFP陽性細胞的流式細胞術代表圖；d. HR修復效率
Figure3. LINC00894, LINC02535 and SNHG8 participate in HR repaira. gene expression levels of candidate lncRNAs after shRNA transfection; b. schematic diagram of HR reporter; c. representative images of GFP-positive cells analyzed by flow cytometry; d. LINC00894, LINC02535 and SNHG8 knockdown impairs HR repair
依托泊苷作為臨床上治療卵巢癌的有效藥物，它主要通過與DNA拓撲異構酶II結合，導致細胞內產生DSB達到抗腫瘤的效果。為了進一步探究基質硬化相關lncRNAs是否影響卵巢癌化療敏感性，我們在SKOV3細胞中分別敲低候選lncRNAs，48 h后用ETO處理，發現敲低SNHG8顯著降低了SKOV3對ETO藥物的敏感性，而NEAT1、LINC00894和LINC02535敲低的SKOV3細胞對ETO敏感性沒有明顯改變（見圖4a）。此外，我們還發現SNHG8下調導致SKOV3細胞對順鉑的敏感性也顯著降低（見圖4b）。與SKOV3細胞結果一致，在卵巢癌細胞系A2780和HO-8910中敲低SNHG8同樣導致細胞對ETO和CDDP的敏感性顯著降低（見圖4c~d）。以上結果說明，基質硬化相關lncRNA SNHG8表達下調嚴重降低了化療藥物ETO和CDDP對卵巢癌的抗腫瘤效果，暗示lncRNA SNHG8可能與卵巢癌化療耐藥的產生相關。
圖4
SNHG8調控卵巢癌對依托泊苷（ETO）和順鉑（CDDP）的化療敏感性
敲低SNHG8降低SKOV3細胞對ETO (a)和CDDP (b)的敏感性；c. 敲低SNHG8降低A2780細胞對ETO和CDDP的藥物敏感性；d. 敲低SNHG8降低HO-8910細胞對ETO和CDDP的藥物敏感性
Figure4. SNHG8 regulates chemotherapy sensitivity of ovarian cancer to etoposide (ETO) and cisplatin (CDDP)SNHG8 knockdown impairs the cellular sensitivity of SKOV3 to ETO (a) and CDDP (b); c. SNHG8 knockdown impairs the cellular sensitivity of A2780 to ETO and CDDP; d. SNHG8 knockdown impairs the cellular sensitivity of HO-8910 to ETO and CDDP
2.4 lncRNA SNHG8與卵巢癌預后呈負相關
通過GEPIA數據庫分析，我們發現相比于正常組織，SNHG8在卵巢癌中的表達確實顯著下降（見圖5a），與基質硬度的增加導致SNHG8表達下調一致（見圖2d~f）。此外，如圖5b所示，與SNHG8低表達卵巢癌患者相比，SNHG8高表達卵巢癌患者的生存期明顯縮短（P=0.011），暗示基質硬化相關lncRNA SNHG8很有可能作為一個新的卵巢癌預后分子標志物。
圖5
GEPIA分析
a. 正常組織和腫瘤組織中的SNHG8表達水平；b. SNHG8與卵巢癌生存期呈負相關
Figure5. GEPIA analysisa. expression levels of SNHG8 in normal and tumor tissues; b. SNHG8 is negatively correlated with the overall survival of ovarian cancer
3 討論
卵巢纖維化是誘發卵巢癌的關鍵因素[11]，其特點是ECM硬化[12]。ECM硬化引起的EMT還會導致腫瘤細胞化療耐藥性的產生[13]。研究報道，ECM硬度可以通過Hippo通路不依賴的方式調控YAP蛋白入核進而促進癌細胞增殖[14-15]。基質變軟會引起鉑類化療藥物耐藥相關基因ERBB2、BCL-2、MAP3K5、PIK3R1和BIRC3的表達顯著升高，導致卵巢癌細胞SKOV3對順鉑的敏感性降低[16]。另外，越來越多lncRNAs被報道調控腫瘤增殖和轉移等過程[17-19]。例如，MALAT1是目前研究最清楚的腫瘤相關lncRNA[20]，它通過激活Wnt/β-catenin、EMT、PI3K/AKT和ERK/MAPK多種通路同時促進腫瘤的發生發展[21]。雖然ECM硬度已經成為直接影響卵巢癌進展和化療敏感性的重要因素[22]，但是目前ECM硬度對卵巢癌lncRNA表達譜的影響尚不清楚，基質硬化相關lncRNAs對卵巢癌化療抗性的具體影響也仍未可知。
以Moderate（25 kPa）組為對照，基質變軟對整體lncRNA的表達影響不大，僅有少量lncRNAs表達發生變化。而基質硬度的增加則引起了大量lncRNAs表達上調和少量lncRNAs下調，這與腫瘤發生過程中常常伴隨著基質硬度的增加和大量基因的表達上調相一致[13]。同時，基質硬度調控的差異表達lncRNA主要參與膠原合成代謝、平滑肌細胞增殖、ECM重塑等生物過程。
lncRNA SNHG8是一種小的核仁RNA[23]，不僅參與轉錄、翻譯、RNA剪切等多種生物學過程[24]，還與多種惡性腫瘤的發生密切相關，包括非小細胞肺癌[25]、胃癌[26]、胰腺癌[27]、乳腺癌[28]等。最近，SNHG8被報道能夠激活Wnt/β-catenin信號通路[29]促進卵巢癌進展，沉默SNHG8能顯著抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和EMT等過程[30]。我們發現SNHG8參與應答卵巢癌基質硬度的變化，基質硬化導致其表達顯著下調，說明SNHG8與卵巢纖維化和卵巢癌的發生密切相關，有可能作為卵巢癌早期診斷的分子標志物，對防治卵巢癌和保護女性生殖健康具有重要意義。敲低SNHG8不僅降低了卵巢癌細胞HR的修復效率，還導致卵巢癌細胞對化療藥物ETO和CDDP的敏感性明顯降低，暗示SNHG8參與HR修復，并與卵巢癌化療耐藥呈負相關，但其在DSB損傷修復中的具體功能和分子機制值得進一步深入研究。
4 結論
本研究成功分析出基質硬化相關的卵巢癌lncRNAs表達譜，篩選出基質硬化相關的關鍵lncRNA SNHG8。SNHG8在基質硬化過程和卵巢癌組織中的表達均顯著下降。SNHG8敲低顯著降低了細胞HR修復效率以及對化療藥物ETO和CDDP的敏感性。同時，SNHG8的表達水平與卵巢癌患者的生存期呈負相關。
重要聲明
利益沖突說明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：程子娜是本研究的實驗設計者及實驗研究的執行人，負責數據收集、數據分析、論文寫作；馬曉璐參與本研究的實驗設計，數據分析，論文寫作；張全有參與本研究的實驗設計；陳維毅是本研究的構思者及負責人，指導實驗設計、數據分析、論文寫作與修改。
