本研究從神經電生理角度探究重復經顱磁刺激對模擬失重小鼠神經元興奮性和離子通道的影響。將青年C57小鼠分成對照組、尾吊組和磁刺激組。對尾吊組和磁刺激組小鼠進行14天的尾吊處理，建立模擬失重模型，同時對磁刺激組小鼠施加14天的重復經顱磁刺激。利用離體腦片膜片鉗實驗，檢測動作電位的相關指標和電壓門控型鈉、鉀離子通道的動力學特性變化，分析神經元的興奮性及其離子通道機制。結果顯示，小鼠的行為認知能力和神經元興奮性隨著尾吊而顯著下降，重復經顱磁刺激可以顯著改善后肢去負荷小鼠海馬齒狀回顆粒細胞的認知損傷和神經電生理相關指標；重復經顱磁刺激可能是通過促進鈉離子外流和抑制鉀離子，來改變鈉、鉀離子通道的激活、失活和失活后再復活過程，影響離子通道的動力學特性，從而增強單個神經元的興奮性，改善后肢去負荷小鼠的認知損傷和空間記憶能力。
引用本文： 侯文濤, 付蕊, 朱明強, 朱海軍, 丁沖. 重復經顱磁刺激對后肢去負荷小鼠神經元興奮性及離子通道影響的研究. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(1): 8-19. doi: 10.7507/1001-5515.202205008 復制
0 引言
太空環境中，失重是影響航天員認知功能和學習記憶的重要因素，直接影響航天任務的完成。研究人員對一名德國航天員進行為期8天的認知和精神運動功能測試，檢測結果發現失重環境影響航天員的邏輯推理和決策功能、記憶檢索功能，以及精細的手動控制等認知能力[1-3]。此外，失重對太空飛行前后航天員的警覺度和認知節律均產生影響[4]。開展失重環境對航天員認知功能影響潛在機制的研究多采用后肢去負荷（hindlimb unloading，HU）模型[5]。對大鼠進行不同天數的尾吊，隨著尾吊天數的增加，小鼠的空間認知和學習記憶能力出現顯著的障礙[6-7]。模擬失重導致的認知功能障礙可能與神經元變化有關。小鼠經過尾吊14天后，海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）環路的神經節律與能量代謝均發生改變，這些變化對模擬失重小鼠谷氨酸系統和情緒行為產生了顯著的影響[8-9]。
重復經顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）作為一種非侵入式的刺激腦區的新型神經治療技術，具有臨床應用和實驗研究價值[10-11]。它是基于法拉第電磁感應定律，通過作用于大腦皮質層產生的感應電流來影響神經元興奮性[12-13]。2015年，美國FDA已批準rTMS用于治療單向抑郁癥。有學者發現5 Hz高頻rTMS能顯著改善帕金森病患者的執行能力和空間規劃任務能力[14-15]。也有研究表明高頻rTMS能通過提高DG區顆粒細胞的神經元興奮性來改善老年鼠的相關認知障礙[16-19]。但是關于rTMS對HU小鼠認知功能影響的相關機制還不明確。
神經元興奮性是神經元在受到刺激后膜電位變化的重要動力學機制[20-21]。帶電粒子的跨膜運動產生膜電位，其變化規律與膜上鈉、鉀通道的開放與關閉密切相關。其中電壓門控型離子通道主要存在于可興奮細胞上，對膜電位的變化產生重要的影響[22]。電壓門控型鈉通道主要作用于動作電位的上升支，電壓門控型鉀通道主要作用于動作電位的下降支。瞬時外向鉀通道（transient outward potassium，IA）主要參與膜電位的復極化過程，影響細胞膜電位的產生[23]。延遲整流鉀通道（delayed rectifer potassium，IK）的幅值影響動作電位峰值和頻率，對神經元的興奮性起關鍵作用[24]。本文通過研究rTMS對HU小鼠神經元興奮性的影響，以及對電壓門控鈉、鉀離子通道的調控作用，探究rTMS改善HU小鼠神經元興奮性的內在作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗設備
見表1。
表1
實驗設備
Table1.
The experimental facilities
1.2 實驗設計
實驗所用動物為8周齡雄性C57小鼠，從北京華阜康生物科技有限公司購買。動物實驗遵守河北工業大學倫理委員會的準則，完全符合實驗動物使用標準。C57小鼠在恒溫（25 ± 1）℃的籠子里適應性喂養1周，保證充足的水與食物。光照/黑暗周期為12 h。適應性喂養結束后。將18只小鼠隨機分成3組：對照組（sham，n = 6），尾吊組（HU，n = 6），尾吊+磁刺激組（HU+rTMS，n = 6）。HU組和HU + rTMS組小鼠尾吊14天，建立尾吊模型，模擬失重環境下實驗小鼠的狀態。HU模型建立的同時，HU + rTMS組小鼠進行rTMS刺激，連續刺激14天。而對照組和尾吊組小鼠進行假刺激，只能聽到磁刺激的聲音，但是不進行磁刺激。實驗模型建立后立即進行電生理實驗。具體實驗流程及時間安排如圖1所示。
圖1
實驗設計流程圖
Figure1.
Experimental design
1.3 重復經顱磁刺激
實驗采用依瑞德公司生產的CCY-IA型高性能磁場刺激儀，線圈采用型號Y064動物標準圓型線圈，外型尺寸為64 mm×30 mm，內線圈外徑56 mm，內徑14 mm，高23 mm。最大磁場輸出強度為3.6 T。刺激方案采用高頻15 Hz，刺激強度約為0.3 T，每天刺激1 000個脈沖，連續刺激14天。線圈平行于小鼠頂骨，放置于頭皮表面之上2～3 mm處。刺激時間為每天上午8:00―10:00。Sham組和HU組小鼠接受假刺激，將線圈垂直于小鼠頭頂放置，不接受刺激。
1.4 后肢去負荷模型
HU模型是在參考前人研究[5]的基礎上建立的。采用有機玻璃定制25 cm × 25 cm × 30 cm大小的尾吊鼠籠，用醫用膠帶固定小鼠的尾部。具體方法如下：用溫水或75%酒精清洗小鼠尾部，這樣可以讓后續的膠帶粘得更牢；用兩條醫用膠帶垂直粘貼小鼠尾巴的兩邊，兩端之間留一段距離；將兩條醫用膠帶水平粘貼在小鼠尾部的根部和末端，固定垂直膠帶；靠近尾部膠帶的一端與鼠籠細線連接，另一端固定在專業鼠籠的滾輪上；調整細線的長度，使小鼠后肢處于懸空狀態，軀干與水平面之間大約成30°角。需要注意的是，允許小鼠自由活動，獲得足夠的食物和水。
1.5 全細胞膜片鉗實驗
1.5.1 切片準備
用2%的異氟烷氣體麻醉小鼠，小鼠在深度麻醉狀態下被迅速斷頭，剪開頭皮和顱骨，完整取出大腦，用刀片修切大腦前后端，保證大腦的平整，把大腦浸入提前準備好的冰水混合狀態且氧飽和的切片液中，整個過程不超過3 min；設置震動切片機的切片程序，將大腦切成300 μm厚度的腦片，取其中有完整海馬的腦片并將其移入30 ℃恒溫的人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中孵育1 h。在實驗記錄中，ACSF中充入含95% O2和5% CO2的混合氣體維持氧飽和狀態。相關溶液配方如表2所示。
表2
溶液配方
Table2.
Solution formulation
1.5.2 電生理實驗操作
腦片孵育完成后，選擇海馬完整的腦片移入培養記錄槽中，用蓋網進行固定；培養記錄槽中加入氧飽和的相關電生理外液，使用正置顯微鏡下低倍鏡觀察腦片狀態，將海馬移入視野中央；切換鏡頭，高倍鏡下找到海馬DG區位置，觀察DG區顆粒細胞狀態，從中挑選一個狀態飽滿的顆粒細胞作為目標細胞，將細胞移到視野中央并做好標記；將電極內液注射到拉制好的玻璃微電極中，使用微操裝置將電極入液，觀察Patchmaster軟件界面上的入液電阻值，確保電阻在4～10 MΩ之間；將電極尖端與目標細胞膜接觸并處于輕壓狀態，釋放正壓，直至軟件上的電阻達到GΩ完成高阻封接；對電極施加快電容補償，通過短而迅速的抽吸三通，給予電極負壓，直至目標細胞膜破裂，阻值驟降到200～300 MΩ左右達到穩定。相關溶液配方如表2所示。
1.5.3 信號記錄
動作電位的記錄：全細胞膜片鉗實驗以DG區顆粒細胞為實驗對象，采用全細胞電流鉗記錄模式，通過刺激器給目標細胞施加電流刺激產生動作電位，按照設定好的程序，采集細胞膜的靜息膜電位和動作電位相關信號變化，記錄靜息膜電位的幅值、動作電位的放電頻數以及單個動作電位的相關指標，如動作電位的峰值、動作電位達峰時間、動作電位閾值、動作電位半波寬，以及動作電位最大上升斜率和最大下降斜率。
鈉、鉀離子通道的記錄：采用電壓鉗模式，記錄電壓門控型鈉、鉀離子通道電流，繪制I-V曲線、激活曲線、失活曲線和復活曲線。通過觀察I-V曲線的電流峰值的變化，分析激活、失活和復活過程中相關動力學特征的變化。
1.5.4 離子通道電流I-V、激活、失活及復活程序的設定
INa的I-V曲線的刺激程序：采用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定膜電位為?70 mV，刺激器對目標細胞施加–80 ～ +50 mV的脈沖電壓，以10 mV為增量依次增加，每個脈沖的刺激時間為20 ms，在PatchMaster軟件上記錄到全細胞電流峰值的變化情況。
INa的激活曲線的刺激程序：采用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定膜電位為–70 mV，對目標細胞施加–120 mV條件脈沖電壓，每個脈沖的刺激時間為100 ms，再次施加–90 ～ +10 mV的刺激脈沖電壓，以10 mV為增量依次增加，每個脈沖的刺激時間為20 ms，通過先條件脈沖刺激、后測試脈沖刺激的方式記錄到INa的激活過程。
INa的失活曲線的刺激程序：用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定膜電位為–70 mV，對目標細胞施加–100 ～ +10 mV的條件脈沖刺激，以10 mV為增量依次增加，每個脈沖的刺激時間為100 ms，再次施加–30 mV的刺激脈沖電壓，每個脈沖的刺激時間為20 ms，通過這種先條件脈沖刺激、后測試脈沖刺激的方式記錄到INa的失活過程。
INa的復活曲線的刺激程序：采用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定膜電位為–70 mV，對目標細胞施加–30 mV條件脈沖電壓，每個脈沖的刺激時間為25 ms，再次施加同樣條件的刺激脈沖電壓，兩個脈沖電壓之間保持膜電位為–70 mV，刺激間隔為2 ～ 26 ms，以2 ms為增量依次增加，通過雙脈沖刺激記錄得到INa復活過程。
IA和IK的I-V刺激參數為：采用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，IA設定膜電位為–100 mV，IK設定膜電位為–50 mV，刺激器對目標細胞施加–50 ～ +90 mV的脈沖電壓，以10 mV為增量依次增加，IA每個脈沖的刺激時間為150 ms，IK每個脈沖的刺激時間為300 ms。在PatchMaster軟件上記錄到全細胞電流峰值的變化情況。
IA和IK的激活刺激參數：采用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定IA膜電位為–100 mV，IK膜電位為–50 mV，對目標細胞施加–110 mV條件脈沖電壓，每個脈沖的刺激時間為400 ms，IA再次施加–40 ～ +70 mV的刺激脈沖電壓，IK再次施加–50 ～ +90 mV的刺激脈沖電壓，以10 mV為增量依次增加，每個脈沖的刺激時間為150 ms，通過這種先條件脈沖刺激、后測試脈沖刺激的方式記錄到IA和IK的激活過程。
IA的失活刺激參數為雙脈沖刺激：用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定膜電位為–100 mV，對目標細胞施加–100 ～ +10 mV的條件脈沖刺激，以10 mV為增量依次增加，每個脈沖的刺激時間為80 ms，再次施加+50 mV的刺激脈沖電壓，每個脈沖的刺激時間為80 ms，通過這種先條件脈沖刺激、后測試脈沖刺激的方式記錄到INa的失活過程。
IA的復活刺激參數：采用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定膜電位為–100 mV，對目標細胞施加+50 mV條件脈沖電壓，每個脈沖的刺激時間為80 ms，再次施加同樣條件的刺激脈沖電壓，兩個脈沖電壓之間保持膜電位為–100 mV，刺激間隔為2 ～ 256 ms，以2 ms為增量依次增加，通過雙脈沖刺激記錄得到IA復活過程。
1.5.5 離子通道電流I-V、激活、失活及復活曲線的繪制
① I-V曲線：以脈沖電位為橫軸，電流峰值為縱軸繪制離子通道的I-V曲線。
② 激活曲線：刺激器通過給目前細胞施加遞增的脈沖電壓，記錄的離子通道電流的變化情況。利用式(1)將記錄到的電流值變化轉為電導值，以施加的脈沖電壓（Vm）為橫軸，G/Gmax為縱軸，繪制離子通道的激活曲線。
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式中，G為脈沖電壓下離子通道的電導值，Vm為不同的脈沖電壓，Vr為反轉電位。
之后利用式(2) Boltzmann方程進行擬合：
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式中，Gmax為所有脈沖電壓下離子通道的最大電導值，V1/2為離子通道激活一半的膜電位，叫做半數激活電壓。k為斜率因子。
③ 失活曲線：刺激器通過對目標細胞施加條件脈沖和測試脈沖，記錄離子通道失活過程。以施加的脈沖電壓（Vm）為橫軸，以I/Imax為縱軸，繪制離子通道的失活曲線。用式(3) Boltzmann方程I/Imax進行擬合。
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式中，I和Imax分別是每條測試脈沖下離子通道電流的峰值和最大電流峰值。Vm為不同的脈沖電壓，V1/2為離子通道失活一半的膜電位，叫做半數失活電壓。k為斜率因子。
④ 復活曲線：刺激器通過對目標細胞施加相同的條件脈沖和測試脈沖，記錄離子通道復活過程。以恢復間隔時間t為橫軸，I2/I1為縱軸，利用公式(4)單指數方程進行擬合。
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式中，I2為不同恢復時間的電流峰值，I1為條件脈沖誘發的電流峰值，t為恢復間隔時間，τ為恢復時間常數。
1.5.6 數據及統計分析
膜片鉗實驗所有信號數據均由德國HEKA公司的PatchMaster軟件采集記錄。Origin軟件和GraphPad Prism軟件對信號進一步處理和統計學分析，采用單因素方差分析方法統計比較各組之間的差異，事后分析（即組間的多重比較）使用由Bonferroni檢驗修正的配對t檢驗進行。統計結果以mean ± SEM表示，檢驗標準為0.05。
2 數據分析結果
2.1 rTMS對HU小鼠海馬DG區神經元興奮性的影響
rTMS對靜息膜電位和動作電位放電頻數的影響如圖2所示。三組小鼠的靜息膜電位存在顯著差異。HU組的靜息膜電位顯著低于sham組（P < 0.001），HU + rTMS組的靜息膜電位顯著高于HU組（P < 0.001）。三組小鼠動作電位放電頻數也表現出顯著差異，HU組動作電位放電頻數顯著低于sham組（P < 0.001），HU + rTMS組動作電位放電頻數顯著高于HU組（P < 0.001）。
圖2
靜息膜電位和動作電位頻數變化（*** P < 0.001）
Figure2.
The change in resting membrane potential and frequency of the AP (*** P < 0.001)
對于單個誘發動作電位，分析動作電位的峰值、達峰時間、閾值、半波寬度、最大上升斜率和最大下降斜率。rTMS對單個動作電位的影響如圖3所示。
圖3
單個動作電位各項指標變化（* P < 0.05，*** P < 0.001）
Figure3.
The individual AP changes in each indicator (* P < 0.05, *** P < 0.001)
三組小鼠的動作電位峰值無顯著差異。三組小鼠的達峰時間存在顯著差異，HU組小鼠的動作電位達峰值時間顯著高于sham組和HU + rTMS組（P < 0.001）。三組小鼠的動作電位的閾值存在顯著差異，HU組閾值顯著高于sham組（P < 0.001），HU + rTMS組閾值顯著低于HU組（P < 0.001）。三組小鼠的動作電位的半波寬存在顯著差異，HU組的半波寬顯著高于sham組（P < 0.001），HU + rTMS組的半波寬顯著低于HU組（P < 0.001）。三組小鼠動作電位最大上升斜率存在顯著差異，HU組動作電位的最大上升斜率顯著低于sham組（P < 0.001），HU + rTMS組最大上升斜率顯著高于HU組（P < 0.05），但低于sham組。三組小鼠動作電位最大下降斜率存在顯著差異，HU組的最大下降斜率顯著低于sham組和HU + rTMS組（P < 0.001）。
通過對靜息膜電位以及動作電位的分析，實驗發現單個動作電位相關指標在HU模型中大都表現出顯著的下降，而在rTMS的作用下，這些下降指數都表現出顯著的改善。AP相關電生理指標分析，在刺激電流的作用下，HU小鼠的動作電位放電頻數更少，表明在靜息狀態下HU小鼠神經元的幅值更低，更難以興奮，受到外界刺激時，產生相同誘發電位所需要的刺激更大。AP達峰時間的變化與最大上升斜率的變化趨勢基本相同，達峰時間越短，表明膜電位變化的速度越快，斜率也越大。而這些HU引起的神經元興奮性的減弱在rTMS的作用下有顯著的改善，表明rTMS改善HU引起的認知障礙與神經元興奮性的增強有關。
2.2 rTMS對海馬DG區電壓門控鈉離子通道的影響
2.2.1 rTMS對INa電壓和電流（I-V）曲線的影響
鈉離子通道的電流示意圖和I-V曲線如圖4所示，分析同一脈沖電壓下三組小鼠的電流峰值，研究發現HU組小鼠的鈉離子通道電流顯著低于sham組，而HU + rTMS組的鈉通道電流峰值顯著高于HU組。并當膜電位等于–20 mV時，三組小鼠的鈉離子電流峰值差異達到最大。研究表明，rTMS可以顯著地提高HU小鼠鈉離子通道的電流，但不能恢復到正常水平。
圖4
三組小鼠INa的I-V變化（* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs. HU；### P < 0.001vs. sham）
Figure4.
The I-V curve of INa (* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 vs. HU; ### P < 0.001 vs. sham)
2.2.2 rTMS對INa激活過程的影響
INa的激活過程的電流示意圖和激活曲線如圖5所示。與HU組相比，sham組和HU+rTMS組的激活曲線在–40 mV處顯著左移。經過統計學分析發現，sham組的V1/2與HU組相比有所減小（P < 0.05），HU + rTMS組與HU組的V1/2之間無顯著差異。三組的斜率因子k無顯著差異，表明rTMS對鈉離子通道的激活過程無顯著影響。鈉離子通道激活過程的動力學參數變化見表3。
圖5
INa激活動力學變化曲線
Figure5.
The activation curve of INa
表3
INa激活曲線的動力學參數（n = 6）
Table3.
The activation parameters of INa (n = 6)
2.2.3 rTMS對INa失活過程的影響
INa的失活過程的電流示意圖和失活曲線如圖6所示。觀察發現與HU組相比，sham組和HU + rTMS組的失活曲線顯著右移，sham組的失活曲線與HU + rTMS組相比，右移更顯著。經過統計學分析發現，與HU組相比，sham組和HU + rTMS組的V1/2發生顯著變化，sham組的V1/2為（–44.61 ± 1.08）mV（P < 0.01），HU + rTMS組的V1/2為（–53.81 ± 0.86）mV（P < 0.05）。斜率因子k的差異沒有統計學意義。INa的穩態失活過程的動力學參數見表4。
圖6
INa失活動力學變化曲線
Figure6.
The inactivation curve of INa
表4
INa失活和復活曲線的動力學參數
Table4.
The inactivation and recovery parameters of INa
2.2.4 rTMS對INa復活過程的影響
INa的復活過程的電流示意圖和復活曲線如圖7所示。觀察發現與HU組相比，sham組和HU + rTMS組的復活曲線顯著左移，sham組與HU + rTMS組相比無顯著差異。經過統計學分析發現，與HU組相比，sham組和HU + rTMS組的恢復時間常數τ發生顯著變化，sham組的τ為（9.63 ± 1.10）ms（P < 0.01），HU+rTMS組的τ為（8.48 ± 0.63） ms（P < 0.01）。INa的復活過程的動力學參數見表4。
圖7
INa復活動力學變化曲線
Figure7.
The recovery curve of INa
2.3 rTMS對海馬DG區電壓門控型鉀離子通道的影響
2.3.1 rTMS對IA和IK的電壓-電流（I-V）曲線的影響
IA和IK的電流示意圖和I-V擬合曲線圖如圖8所示。統計學分析表明，rTMS對HU小鼠IA和IK的電流峰值有顯著影響。觀察IA和IK的I-V曲線，發現HU組的峰值電流顯著高于rTMS組和sham組。實驗結果表明rTMS對峰值電流有一定的抑制作用，但rTMS組并沒有回到sham組的水平。具體來說，電流峰值表現出明顯的電壓依賴性，不同的電壓刺激下，電流峰值以不同的方式下降。
圖8
IA和IK的I-V變化曲線（* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs. HU；# P < 0.05，### P < 0.001 vs. sham）
Figure8.
I-V curve of IA and IK (* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 vs. HU; # P < 0.05, ###P < 0.001 vs. sham)
2.3.2 rTMS對IA和IK的激活曲線的影響
IA和IK的激活過程的電流示意圖和激活曲線如圖9所示。與HU組相比，sham組和HU + rTMS組的激活曲線顯著向右偏移。分析IA的激活動力學參數發現，與HU組相比，sham組的V1/2顯著增大為（–9.84 ± 2.03）mV（P < 0.001），HU + rTMS組的V1/2也顯著增大為（–12.34 ± 1.58）mV（P < 0.01）。分析IK的激活動力學參數發現，與HU組相比，sham組的V1/2顯著增大為（8.46 ± 0.58）mV（P < 0.001），HU + rTMS組的V1/2也顯著增大為（–4.76 ± 1.47）mV（P < 0.05）。sham組的斜率因子k與HU組相比略微增大，HU組和HU + rTMS組之間斜率因子k的差異無統計學意義。結果表明rTMS影響了IA激活過程。IA激活過程的動力學參數變化見表5，IK激活過程的動力學參數變化見表6。
圖9
IA和IK的激活動力學變化曲線（* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs. HU）
Figure9.
The activation dynamics curve of IA and IK (* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 vs. HU)
表5
IA激活曲線的動力學參數（n = 6）
Table5.
The activation parameters of IA (n = 6)
表6
IK激活曲線的動力學參數（n = 6）
Table6.
The activation parameters of IK (n = 6)
2.3.3 rTMS對IA的失活曲線的影響
IA的失活過程的電流示意圖和失活曲線如圖10所示。觀察發現與HU組相比，sham組和HU+rTMS組的失活曲線顯著左移，sham組的失活曲線與HU + rTMS組相比，左移更顯著。經過統計學分析發現，與HU組相比，sham組和HU + rTMS組V1/2發生顯著變化，sham組的V1/2為（–54.26 ± 40.32）mV（P < 0.01），HU + rTMS組的V1/2為（–45.45 ± 0.39）mV（P < 0.05）；sham組的斜率因子k增大為7.64 ± 0.25（P < 0.05）。IA的失活過程的動力學參數見表7。
圖10
IA的失活動力學變化曲線（* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs. HU）
Figure10.
The inactivation dynamics curve of IA (* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 vs. HU)
表7
IA失活和復活曲線的動力學參數
Table7.
The inactivation and recovery parameters of IA
2.3.4 rTMS對IA的復活曲線的影響
IA的復活過程的電流示意圖和復活曲線如圖11所示。三組之間無顯著變化。經過統計學分析發現，與HU組相比，sham組和HU + rTMS組的恢復時間常數τ明顯增大，sham組的τ為（10.32 ± 1.75）ms（P < 0.05），HU + rTMS組的τ為（8.44 ± 1.05）ms（P < 0.05）。IA的復活過程的動力學參數見表7。
圖11
IA的復活動力學變化曲線
Figure11.
The recovery dynamics curve of IA
3 討論
DG區顆粒神經元細胞在海馬學習記憶和神經傳遞中起著十分關鍵的作用。當DG區產生新的神經元時，被試者的認知功能和情緒能力都會發生顯著的變化[25]；當DG區受損時，大部分海馬依賴的記憶功能也會降低[26]。因此，提高DG顆粒細胞的神經元興奮性可能成為改善認知功能障礙的潛在研究機制。本文將rTMS作為神經調控手段，以海馬為目標區域，神經細胞為目的神經元，研究rTMS對HU引起的認知損傷的改善作用。實驗從神經電生理角度進行研究，探究rTMS對認知功能改善的電生理機制。
我們通過離體腦片膜電位實驗，研究rTMS對HU小鼠的神經元興奮性的影響。通過分析發現，在刺激電流的作用下，HU小鼠的動作電位放電頻數更少，靜息膜電位向去極化方向移動，整體動作電位水平下降，在靜息狀態下HU小鼠神經元的幅值更低，更難以興奮，當受到外界刺激時，產生相同誘發電位所需要的刺激更大，表明HU小鼠的神經元興奮性降低。單個動作電位的相關指標在HU模型中大都表現出顯著的變化，AP達峰時間、半波寬和閾值等指標明顯上升，而達峰時間越長，半波寬越大，膜電位變化的速度越慢，最大上升斜率也越小，均提示神經元興奮性的減弱。而這些HU引起的神經元興奮性的減弱在rTMS的作用下有顯著的改善，表明rTMS改善HU引起的認知障礙與神經元興奮性的增強有關。
膜電位是帶電粒子的跨膜運動產生的，在哺乳動物中樞神經系統中，細胞膜上動作電位的變化與離子通道的打開和關閉有關[27]。AP的達峰時間越短，半波寬越小，代表離子通道開放和關閉的速度越快[28]，最大上升斜率越大，代表膜電位水平變化的最大速度越大。rTMS明顯改善了HU引起的神經元動作電位的相關電生理指標，表明離子通道發生了相應的變化。離子通道具有選擇透過性，可以幫助生物體細胞與外界環境進行能量傳遞和物質交換。其中鈉通道主要作用于AP的上升支，鉀通道主要作用于AP的下降支。IA主要參與膜電位的復極化過程，影響細胞膜電位的產生[23]。IK的幅值則對動作電位峰值和頻率產生重要的作用，從而影響神經元的興奮性[24,29]。
我們的研究結果證實了rTMS對HU小鼠神經元細胞鈉、鉀離子通道的調節作用。實驗通過全細胞膜片鉗技術研究rTMS對HU小鼠相關離子通道的影響。rTMS增加了IA和IK的峰值電流和激活曲線的斜率因子，說明激活的電壓靈敏度降低，激活曲線右移，半數激活電壓V1/2增大，說明鉀離子通道較難激活。對于IA失活動力學曲線，在rTMS作用下，失活曲線左移，半數失活電壓V1/2減小。這說明rTMS后的失活過程顯著縮短。這些鉀離子通道的動態特性表明，rTMS通過抑制IA和IK，降低了鉀離子流出量。INa的激活、IA和IK的抑制共同提高了神經元的興奮性。已有類似的研究揭示了調控離子通道可影響神經元興奮性的變化。研究人員發現通過減少IA和IK通道的開放數量可以抑制鉀離子通道電流，從而增加神經元的興奮性[30]。另一項研究發現，對老年小鼠施加連續14天的高頻rTMS，膜片鉗記錄顯示，經過rTMS刺激后，老化小鼠的海馬角1區（CA1）錐體神經元放電顯著增加，后極化現象減少，動作電位個數顯著增加，這些指標的變化與本研究中的結果變化一致，而這些動作電位指標的變化可能與電壓依賴型Ca+通道的電生理變化有關，表明神經元興奮性的變化與離子通道的開放和關閉密切相關，可能是rTMS改善認知功能的潛在機制之一[31-33]。
本研究表明rTMS在刺激小鼠腦部過程中，產生的磁場可能會影響鈉、鉀離子通道蛋白，導致帶電離子的跨膜運動從而改變細胞膜內外的電位水平，從而改變神經元興奮性，為治療失重導致的認知損傷提供了一定的理論基礎。目前，關于rTMS改善太空失重導致的認知功能損傷的作用機制尚無定論。因此，深入研究磁刺激對神經調控的電生理機制仍是未來神經電磁調控的研究重點。
4 結論
rTMS通過影響鈉離子和鉀離子通道的激活、失活和失活后再復活過程的動力學特性，改變了離子通道活性，激活了INa，抑制了IA和IK，從而提高神經元的興奮性，改善后肢去負荷小鼠的認知功能。本文結果表明rTMS通過改變電壓門控鈉離子和鉀離子通道的動力學特性，改善了后肢去負荷小鼠的認知功能損傷與海馬DG區的神經元相關電特性，為改善太空失重導致的認知損傷提供了一定的理論基礎。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：丁沖負責實驗的整體安排和最終論文的修改，侯文濤是實驗的主要完成者和論文的主要撰稿人。朱海軍、付蕊、朱明強在實驗過程中提供了幫助。所有作者都閱讀并通過了最終草案。
倫理聲明：本研究通過了河北工業大學動物倫理委員會的審批（批文編號：HEBUTacuc2022028）。
0 引言
太空環境中，失重是影響航天員認知功能和學習記憶的重要因素，直接影響航天任務的完成。研究人員對一名德國航天員進行為期8天的認知和精神運動功能測試，檢測結果發現失重環境影響航天員的邏輯推理和決策功能、記憶檢索功能，以及精細的手動控制等認知能力[1-3]。此外，失重對太空飛行前后航天員的警覺度和認知節律均產生影響[4]。開展失重環境對航天員認知功能影響潛在機制的研究多采用后肢去負荷（hindlimb unloading，HU）模型[5]。對大鼠進行不同天數的尾吊，隨著尾吊天數的增加，小鼠的空間認知和學習記憶能力出現顯著的障礙[6-7]。模擬失重導致的認知功能障礙可能與神經元變化有關。小鼠經過尾吊14天后，海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）環路的神經節律與能量代謝均發生改變，這些變化對模擬失重小鼠谷氨酸系統和情緒行為產生了顯著的影響[8-9]。
重復經顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）作為一種非侵入式的刺激腦區的新型神經治療技術，具有臨床應用和實驗研究價值[10-11]。它是基于法拉第電磁感應定律，通過作用于大腦皮質層產生的感應電流來影響神經元興奮性[12-13]。2015年，美國FDA已批準rTMS用于治療單向抑郁癥。有學者發現5 Hz高頻rTMS能顯著改善帕金森病患者的執行能力和空間規劃任務能力[14-15]。也有研究表明高頻rTMS能通過提高DG區顆粒細胞的神經元興奮性來改善老年鼠的相關認知障礙[16-19]。但是關于rTMS對HU小鼠認知功能影響的相關機制還不明確。
神經元興奮性是神經元在受到刺激后膜電位變化的重要動力學機制[20-21]。帶電粒子的跨膜運動產生膜電位，其變化規律與膜上鈉、鉀通道的開放與關閉密切相關。其中電壓門控型離子通道主要存在于可興奮細胞上，對膜電位的變化產生重要的影響[22]。電壓門控型鈉通道主要作用于動作電位的上升支，電壓門控型鉀通道主要作用于動作電位的下降支。瞬時外向鉀通道（transient outward potassium，IA）主要參與膜電位的復極化過程，影響細胞膜電位的產生[23]。延遲整流鉀通道（delayed rectifer potassium，IK）的幅值影響動作電位峰值和頻率，對神經元的興奮性起關鍵作用[24]。本文通過研究rTMS對HU小鼠神經元興奮性的影響，以及對電壓門控鈉、鉀離子通道的調控作用，探究rTMS改善HU小鼠神經元興奮性的內在作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗設備
見表1。
表1
實驗設備
Table1.
The experimental facilities
1.2 實驗設計
實驗所用動物為8周齡雄性C57小鼠，從北京華阜康生物科技有限公司購買。動物實驗遵守河北工業大學倫理委員會的準則，完全符合實驗動物使用標準。C57小鼠在恒溫（25 ± 1）℃的籠子里適應性喂養1周，保證充足的水與食物。光照/黑暗周期為12 h。適應性喂養結束后。將18只小鼠隨機分成3組：對照組（sham，n = 6），尾吊組（HU，n = 6），尾吊+磁刺激組（HU+rTMS，n = 6）。HU組和HU + rTMS組小鼠尾吊14天，建立尾吊模型，模擬失重環境下實驗小鼠的狀態。HU模型建立的同時，HU + rTMS組小鼠進行rTMS刺激，連續刺激14天。而對照組和尾吊組小鼠進行假刺激，只能聽到磁刺激的聲音，但是不進行磁刺激。實驗模型建立后立即進行電生理實驗。具體實驗流程及時間安排如圖1所示。
圖1
實驗設計流程圖
Figure1.
Experimental design
1.3 重復經顱磁刺激
實驗采用依瑞德公司生產的CCY-IA型高性能磁場刺激儀，線圈采用型號Y064動物標準圓型線圈，外型尺寸為64 mm×30 mm，內線圈外徑56 mm，內徑14 mm，高23 mm。最大磁場輸出強度為3.6 T。刺激方案采用高頻15 Hz，刺激強度約為0.3 T，每天刺激1 000個脈沖，連續刺激14天。線圈平行于小鼠頂骨，放置于頭皮表面之上2～3 mm處。刺激時間為每天上午8:00―10:00。Sham組和HU組小鼠接受假刺激，將線圈垂直于小鼠頭頂放置，不接受刺激。
1.4 后肢去負荷模型
HU模型是在參考前人研究[5]的基礎上建立的。采用有機玻璃定制25 cm × 25 cm × 30 cm大小的尾吊鼠籠，用醫用膠帶固定小鼠的尾部。具體方法如下：用溫水或75%酒精清洗小鼠尾部，這樣可以讓后續的膠帶粘得更牢；用兩條醫用膠帶垂直粘貼小鼠尾巴的兩邊，兩端之間留一段距離；將兩條醫用膠帶水平粘貼在小鼠尾部的根部和末端，固定垂直膠帶；靠近尾部膠帶的一端與鼠籠細線連接，另一端固定在專業鼠籠的滾輪上；調整細線的長度，使小鼠后肢處于懸空狀態，軀干與水平面之間大約成30°角。需要注意的是，允許小鼠自由活動，獲得足夠的食物和水。
1.5 全細胞膜片鉗實驗
1.5.1 切片準備
用2%的異氟烷氣體麻醉小鼠，小鼠在深度麻醉狀態下被迅速斷頭，剪開頭皮和顱骨，完整取出大腦，用刀片修切大腦前后端，保證大腦的平整，把大腦浸入提前準備好的冰水混合狀態且氧飽和的切片液中，整個過程不超過3 min；設置震動切片機的切片程序，將大腦切成300 μm厚度的腦片，取其中有完整海馬的腦片并將其移入30 ℃恒溫的人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中孵育1 h。在實驗記錄中，ACSF中充入含95% O2和5% CO2的混合氣體維持氧飽和狀態。相關溶液配方如表2所示。
表2
溶液配方
Table2.
Solution formulation
1.5.2 電生理實驗操作
腦片孵育完成后，選擇海馬完整的腦片移入培養記錄槽中，用蓋網進行固定；培養記錄槽中加入氧飽和的相關電生理外液，使用正置顯微鏡下低倍鏡觀察腦片狀態，將海馬移入視野中央；切換鏡頭，高倍鏡下找到海馬DG區位置，觀察DG區顆粒細胞狀態，從中挑選一個狀態飽滿的顆粒細胞作為目標細胞，將細胞移到視野中央并做好標記；將電極內液注射到拉制好的玻璃微電極中，使用微操裝置將電極入液，觀察Patchmaster軟件界面上的入液電阻值，確保電阻在4～10 MΩ之間；將電極尖端與目標細胞膜接觸并處于輕壓狀態，釋放正壓，直至軟件上的電阻達到GΩ完成高阻封接；對電極施加快電容補償，通過短而迅速的抽吸三通，給予電極負壓，直至目標細胞膜破裂，阻值驟降到200～300 MΩ左右達到穩定。相關溶液配方如表2所示。
1.5.3 信號記錄
動作電位的記錄：全細胞膜片鉗實驗以DG區顆粒細胞為實驗對象，采用全細胞電流鉗記錄模式，通過刺激器給目標細胞施加電流刺激產生動作電位，按照設定好的程序，采集細胞膜的靜息膜電位和動作電位相關信號變化，記錄靜息膜電位的幅值、動作電位的放電頻數以及單個動作電位的相關指標，如動作電位的峰值、動作電位達峰時間、動作電位閾值、動作電位半波寬，以及動作電位最大上升斜率和最大下降斜率。
鈉、鉀離子通道的記錄：采用電壓鉗模式，記錄電壓門控型鈉、鉀離子通道電流，繪制I-V曲線、激活曲線、失活曲線和復活曲線。通過觀察I-V曲線的電流峰值的變化，分析激活、失活和復活過程中相關動力學特征的變化。
1.5.4 離子通道電流I-V、激活、失活及復活程序的設定
INa的I-V曲線的刺激程序：采用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定膜電位為?70 mV，刺激器對目標細胞施加–80 ～ +50 mV的脈沖電壓，以10 mV為增量依次增加，每個脈沖的刺激時間為20 ms，在PatchMaster軟件上記錄到全細胞電流峰值的變化情況。
INa的激活曲線的刺激程序：采用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定膜電位為–70 mV，對目標細胞施加–120 mV條件脈沖電壓，每個脈沖的刺激時間為100 ms，再次施加–90 ～ +10 mV的刺激脈沖電壓，以10 mV為增量依次增加，每個脈沖的刺激時間為20 ms，通過先條件脈沖刺激、后測試脈沖刺激的方式記錄到INa的激活過程。
INa的失活曲線的刺激程序：用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定膜電位為–70 mV，對目標細胞施加–100 ～ +10 mV的條件脈沖刺激，以10 mV為增量依次增加，每個脈沖的刺激時間為100 ms，再次施加–30 mV的刺激脈沖電壓，每個脈沖的刺激時間為20 ms，通過這種先條件脈沖刺激、后測試脈沖刺激的方式記錄到INa的失活過程。
INa的復活曲線的刺激程序：采用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定膜電位為–70 mV，對目標細胞施加–30 mV條件脈沖電壓，每個脈沖的刺激時間為25 ms，再次施加同樣條件的刺激脈沖電壓，兩個脈沖電壓之間保持膜電位為–70 mV，刺激間隔為2 ～ 26 ms，以2 ms為增量依次增加，通過雙脈沖刺激記錄得到INa復活過程。
IA和IK的I-V刺激參數為：采用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，IA設定膜電位為–100 mV，IK設定膜電位為–50 mV，刺激器對目標細胞施加–50 ～ +90 mV的脈沖電壓，以10 mV為增量依次增加，IA每個脈沖的刺激時間為150 ms，IK每個脈沖的刺激時間為300 ms。在PatchMaster軟件上記錄到全細胞電流峰值的變化情況。
IA和IK的激活刺激參數：采用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定IA膜電位為–100 mV，IK膜電位為–50 mV，對目標細胞施加–110 mV條件脈沖電壓，每個脈沖的刺激時間為400 ms，IA再次施加–40 ～ +70 mV的刺激脈沖電壓，IK再次施加–50 ～ +90 mV的刺激脈沖電壓，以10 mV為增量依次增加，每個脈沖的刺激時間為150 ms，通過這種先條件脈沖刺激、后測試脈沖刺激的方式記錄到IA和IK的激活過程。
IA的失活刺激參數為雙脈沖刺激：用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定膜電位為–100 mV，對目標細胞施加–100 ～ +10 mV的條件脈沖刺激，以10 mV為增量依次增加，每個脈沖的刺激時間為80 ms，再次施加+50 mV的刺激脈沖電壓，每個脈沖的刺激時間為80 ms，通過這種先條件脈沖刺激、后測試脈沖刺激的方式記錄到INa的失活過程。
IA的復活刺激參數：采用Whole-cell膜片鉗技術，利用電壓鉗模式，設定膜電位為–100 mV，對目標細胞施加+50 mV條件脈沖電壓，每個脈沖的刺激時間為80 ms，再次施加同樣條件的刺激脈沖電壓，兩個脈沖電壓之間保持膜電位為–100 mV，刺激間隔為2 ～ 256 ms，以2 ms為增量依次增加，通過雙脈沖刺激記錄得到IA復活過程。
1.5.5 離子通道電流I-V、激活、失活及復活曲線的繪制
① I-V曲線：以脈沖電位為橫軸，電流峰值為縱軸繪制離子通道的I-V曲線。
② 激活曲線：刺激器通過給目前細胞施加遞增的脈沖電壓，記錄的離子通道電流的變化情況。利用式(1)將記錄到的電流值變化轉為電導值，以施加的脈沖電壓（Vm）為橫軸，G/Gmax為縱軸，繪制離子通道的激活曲線。
|
式中，G為脈沖電壓下離子通道的電導值，Vm為不同的脈沖電壓，Vr為反轉電位。
之后利用式(2) Boltzmann方程進行擬合：
|
式中，Gmax為所有脈沖電壓下離子通道的最大電導值，V1/2為離子通道激活一半的膜電位，叫做半數激活電壓。k為斜率因子。
③ 失活曲線：刺激器通過對目標細胞施加條件脈沖和測試脈沖，記錄離子通道失活過程。以施加的脈沖電壓（Vm）為橫軸，以I/Imax為縱軸，繪制離子通道的失活曲線。用式(3) Boltzmann方程I/Imax進行擬合。
|
式中，I和Imax分別是每條測試脈沖下離子通道電流的峰值和最大電流峰值。Vm為不同的脈沖電壓，V1/2為離子通道失活一半的膜電位，叫做半數失活電壓。k為斜率因子。
④ 復活曲線：刺激器通過對目標細胞施加相同的條件脈沖和測試脈沖，記錄離子通道復活過程。以恢復間隔時間t為橫軸，I2/I1為縱軸，利用公式(4)單指數方程進行擬合。
|
式中，I2為不同恢復時間的電流峰值，I1為條件脈沖誘發的電流峰值，t為恢復間隔時間，τ為恢復時間常數。
1.5.6 數據及統計分析
膜片鉗實驗所有信號數據均由德國HEKA公司的PatchMaster軟件采集記錄。Origin軟件和GraphPad Prism軟件對信號進一步處理和統計學分析，采用單因素方差分析方法統計比較各組之間的差異，事后分析（即組間的多重比較）使用由Bonferroni檢驗修正的配對t檢驗進行。統計結果以mean ± SEM表示，檢驗標準為0.05。
2 數據分析結果
2.1 rTMS對HU小鼠海馬DG區神經元興奮性的影響
rTMS對靜息膜電位和動作電位放電頻數的影響如圖2所示。三組小鼠的靜息膜電位存在顯著差異。HU組的靜息膜電位顯著低于sham組（P < 0.001），HU + rTMS組的靜息膜電位顯著高于HU組（P < 0.001）。三組小鼠動作電位放電頻數也表現出顯著差異，HU組動作電位放電頻數顯著低于sham組（P < 0.001），HU + rTMS組動作電位放電頻數顯著高于HU組（P < 0.001）。
圖2
靜息膜電位和動作電位頻數變化（*** P < 0.001）
Figure2.
The change in resting membrane potential and frequency of the AP (*** P < 0.001)
對于單個誘發動作電位，分析動作電位的峰值、達峰時間、閾值、半波寬度、最大上升斜率和最大下降斜率。rTMS對單個動作電位的影響如圖3所示。
圖3
單個動作電位各項指標變化（* P < 0.05，*** P < 0.001）
Figure3.
The individual AP changes in each indicator (* P < 0.05, *** P < 0.001)
三組小鼠的動作電位峰值無顯著差異。三組小鼠的達峰時間存在顯著差異，HU組小鼠的動作電位達峰值時間顯著高于sham組和HU + rTMS組（P < 0.001）。三組小鼠的動作電位的閾值存在顯著差異，HU組閾值顯著高于sham組（P < 0.001），HU + rTMS組閾值顯著低于HU組（P < 0.001）。三組小鼠的動作電位的半波寬存在顯著差異，HU組的半波寬顯著高于sham組（P < 0.001），HU + rTMS組的半波寬顯著低于HU組（P < 0.001）。三組小鼠動作電位最大上升斜率存在顯著差異，HU組動作電位的最大上升斜率顯著低于sham組（P < 0.001），HU + rTMS組最大上升斜率顯著高于HU組（P < 0.05），但低于sham組。三組小鼠動作電位最大下降斜率存在顯著差異，HU組的最大下降斜率顯著低于sham組和HU + rTMS組（P < 0.001）。
通過對靜息膜電位以及動作電位的分析，實驗發現單個動作電位相關指標在HU模型中大都表現出顯著的下降，而在rTMS的作用下，這些下降指數都表現出顯著的改善。AP相關電生理指標分析，在刺激電流的作用下，HU小鼠的動作電位放電頻數更少，表明在靜息狀態下HU小鼠神經元的幅值更低，更難以興奮，受到外界刺激時，產生相同誘發電位所需要的刺激更大。AP達峰時間的變化與最大上升斜率的變化趨勢基本相同，達峰時間越短，表明膜電位變化的速度越快，斜率也越大。而這些HU引起的神經元興奮性的減弱在rTMS的作用下有顯著的改善，表明rTMS改善HU引起的認知障礙與神經元興奮性的增強有關。
2.2 rTMS對海馬DG區電壓門控鈉離子通道的影響
2.2.1 rTMS對INa電壓和電流（I-V）曲線的影響
鈉離子通道的電流示意圖和I-V曲線如圖4所示，分析同一脈沖電壓下三組小鼠的電流峰值，研究發現HU組小鼠的鈉離子通道電流顯著低于sham組，而HU + rTMS組的鈉通道電流峰值顯著高于HU組。并當膜電位等于–20 mV時，三組小鼠的鈉離子電流峰值差異達到最大。研究表明，rTMS可以顯著地提高HU小鼠鈉離子通道的電流，但不能恢復到正常水平。
圖4
三組小鼠INa的I-V變化（* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs. HU；### P < 0.001vs. sham）
Figure4.
The I-V curve of INa (* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 vs. HU; ### P < 0.001 vs. sham)
2.2.2 rTMS對INa激活過程的影響
INa的激活過程的電流示意圖和激活曲線如圖5所示。與HU組相比，sham組和HU+rTMS組的激活曲線在–40 mV處顯著左移。經過統計學分析發現，sham組的V1/2與HU組相比有所減小（P < 0.05），HU + rTMS組與HU組的V1/2之間無顯著差異。三組的斜率因子k無顯著差異，表明rTMS對鈉離子通道的激活過程無顯著影響。鈉離子通道激活過程的動力學參數變化見表3。
圖5
INa激活動力學變化曲線
Figure5.
The activation curve of INa
表3
INa激活曲線的動力學參數（n = 6）
Table3.
The activation parameters of INa (n = 6)
2.2.3 rTMS對INa失活過程的影響
INa的失活過程的電流示意圖和失活曲線如圖6所示。觀察發現與HU組相比，sham組和HU + rTMS組的失活曲線顯著右移，sham組的失活曲線與HU + rTMS組相比，右移更顯著。經過統計學分析發現，與HU組相比，sham組和HU + rTMS組的V1/2發生顯著變化，sham組的V1/2為（–44.61 ± 1.08）mV（P < 0.01），HU + rTMS組的V1/2為（–53.81 ± 0.86）mV（P < 0.05）。斜率因子k的差異沒有統計學意義。INa的穩態失活過程的動力學參數見表4。
圖6
INa失活動力學變化曲線
Figure6.
The inactivation curve of INa
表4
INa失活和復活曲線的動力學參數
Table4.
The inactivation and recovery parameters of INa
2.2.4 rTMS對INa復活過程的影響
INa的復活過程的電流示意圖和復活曲線如圖7所示。觀察發現與HU組相比，sham組和HU + rTMS組的復活曲線顯著左移，sham組與HU + rTMS組相比無顯著差異。經過統計學分析發現，與HU組相比，sham組和HU + rTMS組的恢復時間常數τ發生顯著變化，sham組的τ為（9.63 ± 1.10）ms（P < 0.01），HU+rTMS組的τ為（8.48 ± 0.63） ms（P < 0.01）。INa的復活過程的動力學參數見表4。
圖7
INa復活動力學變化曲線
Figure7.
The recovery curve of INa
2.3 rTMS對海馬DG區電壓門控型鉀離子通道的影響
2.3.1 rTMS對IA和IK的電壓-電流（I-V）曲線的影響
IA和IK的電流示意圖和I-V擬合曲線圖如圖8所示。統計學分析表明，rTMS對HU小鼠IA和IK的電流峰值有顯著影響。觀察IA和IK的I-V曲線，發現HU組的峰值電流顯著高于rTMS組和sham組。實驗結果表明rTMS對峰值電流有一定的抑制作用，但rTMS組并沒有回到sham組的水平。具體來說，電流峰值表現出明顯的電壓依賴性，不同的電壓刺激下，電流峰值以不同的方式下降。
圖8
IA和IK的I-V變化曲線（* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs. HU；# P < 0.05，### P < 0.001 vs. sham）
Figure8.
I-V curve of IA and IK (* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 vs. HU; # P < 0.05, ###P < 0.001 vs. sham)
2.3.2 rTMS對IA和IK的激活曲線的影響
IA和IK的激活過程的電流示意圖和激活曲線如圖9所示。與HU組相比，sham組和HU + rTMS組的激活曲線顯著向右偏移。分析IA的激活動力學參數發現，與HU組相比，sham組的V1/2顯著增大為（–9.84 ± 2.03）mV（P < 0.001），HU + rTMS組的V1/2也顯著增大為（–12.34 ± 1.58）mV（P < 0.01）。分析IK的激活動力學參數發現，與HU組相比，sham組的V1/2顯著增大為（8.46 ± 0.58）mV（P < 0.001），HU + rTMS組的V1/2也顯著增大為（–4.76 ± 1.47）mV（P < 0.05）。sham組的斜率因子k與HU組相比略微增大，HU組和HU + rTMS組之間斜率因子k的差異無統計學意義。結果表明rTMS影響了IA激活過程。IA激活過程的動力學參數變化見表5，IK激活過程的動力學參數變化見表6。
圖9
IA和IK的激活動力學變化曲線（* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs. HU）
Figure9.
The activation dynamics curve of IA and IK (* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 vs. HU)
表5
IA激活曲線的動力學參數（n = 6）
Table5.
The activation parameters of IA (n = 6)
表6
IK激活曲線的動力學參數（n = 6）
Table6.
The activation parameters of IK (n = 6)
2.3.3 rTMS對IA的失活曲線的影響
IA的失活過程的電流示意圖和失活曲線如圖10所示。觀察發現與HU組相比，sham組和HU+rTMS組的失活曲線顯著左移，sham組的失活曲線與HU + rTMS組相比，左移更顯著。經過統計學分析發現，與HU組相比，sham組和HU + rTMS組V1/2發生顯著變化，sham組的V1/2為（–54.26 ± 40.32）mV（P < 0.01），HU + rTMS組的V1/2為（–45.45 ± 0.39）mV（P < 0.05）；sham組的斜率因子k增大為7.64 ± 0.25（P < 0.05）。IA的失活過程的動力學參數見表7。
圖10
IA的失活動力學變化曲線（* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs. HU）
Figure10.
The inactivation dynamics curve of IA (* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 vs. HU)
表7
IA失活和復活曲線的動力學參數
Table7.
The inactivation and recovery parameters of IA
2.3.4 rTMS對IA的復活曲線的影響
IA的復活過程的電流示意圖和復活曲線如圖11所示。三組之間無顯著變化。經過統計學分析發現，與HU組相比，sham組和HU + rTMS組的恢復時間常數τ明顯增大，sham組的τ為（10.32 ± 1.75）ms（P < 0.05），HU + rTMS組的τ為（8.44 ± 1.05）ms（P < 0.05）。IA的復活過程的動力學參數見表7。
圖11
IA的復活動力學變化曲線
Figure11.
The recovery dynamics curve of IA
3 討論
DG區顆粒神經元細胞在海馬學習記憶和神經傳遞中起著十分關鍵的作用。當DG區產生新的神經元時，被試者的認知功能和情緒能力都會發生顯著的變化[25]；當DG區受損時，大部分海馬依賴的記憶功能也會降低[26]。因此，提高DG顆粒細胞的神經元興奮性可能成為改善認知功能障礙的潛在研究機制。本文將rTMS作為神經調控手段，以海馬為目標區域，神經細胞為目的神經元，研究rTMS對HU引起的認知損傷的改善作用。實驗從神經電生理角度進行研究，探究rTMS對認知功能改善的電生理機制。
我們通過離體腦片膜電位實驗，研究rTMS對HU小鼠的神經元興奮性的影響。通過分析發現，在刺激電流的作用下，HU小鼠的動作電位放電頻數更少，靜息膜電位向去極化方向移動，整體動作電位水平下降，在靜息狀態下HU小鼠神經元的幅值更低，更難以興奮，當受到外界刺激時，產生相同誘發電位所需要的刺激更大，表明HU小鼠的神經元興奮性降低。單個動作電位的相關指標在HU模型中大都表現出顯著的變化，AP達峰時間、半波寬和閾值等指標明顯上升，而達峰時間越長，半波寬越大，膜電位變化的速度越慢，最大上升斜率也越小，均提示神經元興奮性的減弱。而這些HU引起的神經元興奮性的減弱在rTMS的作用下有顯著的改善，表明rTMS改善HU引起的認知障礙與神經元興奮性的增強有關。
膜電位是帶電粒子的跨膜運動產生的，在哺乳動物中樞神經系統中，細胞膜上動作電位的變化與離子通道的打開和關閉有關[27]。AP的達峰時間越短，半波寬越小，代表離子通道開放和關閉的速度越快[28]，最大上升斜率越大，代表膜電位水平變化的最大速度越大。rTMS明顯改善了HU引起的神經元動作電位的相關電生理指標，表明離子通道發生了相應的變化。離子通道具有選擇透過性，可以幫助生物體細胞與外界環境進行能量傳遞和物質交換。其中鈉通道主要作用于AP的上升支，鉀通道主要作用于AP的下降支。IA主要參與膜電位的復極化過程，影響細胞膜電位的產生[23]。IK的幅值則對動作電位峰值和頻率產生重要的作用，從而影響神經元的興奮性[24,29]。
我們的研究結果證實了rTMS對HU小鼠神經元細胞鈉、鉀離子通道的調節作用。實驗通過全細胞膜片鉗技術研究rTMS對HU小鼠相關離子通道的影響。rTMS增加了IA和IK的峰值電流和激活曲線的斜率因子，說明激活的電壓靈敏度降低，激活曲線右移，半數激活電壓V1/2增大，說明鉀離子通道較難激活。對于IA失活動力學曲線，在rTMS作用下，失活曲線左移，半數失活電壓V1/2減小。這說明rTMS后的失活過程顯著縮短。這些鉀離子通道的動態特性表明，rTMS通過抑制IA和IK，降低了鉀離子流出量。INa的激活、IA和IK的抑制共同提高了神經元的興奮性。已有類似的研究揭示了調控離子通道可影響神經元興奮性的變化。研究人員發現通過減少IA和IK通道的開放數量可以抑制鉀離子通道電流，從而增加神經元的興奮性[30]。另一項研究發現，對老年小鼠施加連續14天的高頻rTMS，膜片鉗記錄顯示，經過rTMS刺激后，老化小鼠的海馬角1區（CA1）錐體神經元放電顯著增加，后極化現象減少，動作電位個數顯著增加，這些指標的變化與本研究中的結果變化一致，而這些動作電位指標的變化可能與電壓依賴型Ca+通道的電生理變化有關，表明神經元興奮性的變化與離子通道的開放和關閉密切相關，可能是rTMS改善認知功能的潛在機制之一[31-33]。
本研究表明rTMS在刺激小鼠腦部過程中，產生的磁場可能會影響鈉、鉀離子通道蛋白，導致帶電離子的跨膜運動從而改變細胞膜內外的電位水平，從而改變神經元興奮性，為治療失重導致的認知損傷提供了一定的理論基礎。目前，關于rTMS改善太空失重導致的認知功能損傷的作用機制尚無定論。因此，深入研究磁刺激對神經調控的電生理機制仍是未來神經電磁調控的研究重點。
4 結論
rTMS通過影響鈉離子和鉀離子通道的激活、失活和失活后再復活過程的動力學特性，改變了離子通道活性，激活了INa，抑制了IA和IK，從而提高神經元的興奮性，改善后肢去負荷小鼠的認知功能。本文結果表明rTMS通過改變電壓門控鈉離子和鉀離子通道的動力學特性，改善了后肢去負荷小鼠的認知功能損傷與海馬DG區的神經元相關電特性，為改善太空失重導致的認知損傷提供了一定的理論基礎。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：丁沖負責實驗的整體安排和最終論文的修改，侯文濤是實驗的主要完成者和論文的主要撰稿人。朱海軍、付蕊、朱明強在實驗過程中提供了幫助。所有作者都閱讀并通過了最終草案。
倫理聲明：本研究通過了河北工業大學動物倫理委員會的審批（批文編號：HEBUTacuc2022028）。
