牛心包作為人工心臟生物瓣關鍵原材料目前基本依靠進口，已然成為“卡脖子”難題，嚴重限制了國產生物瓣研發效率，因此牛心包國產化迫在眉睫。本文以四川牦牛心包為樣本，在基礎性能及抗鈣化性能方面與澳洲黃牛心包進行了對比研究，結果表明牦牛心包在外觀及厚度方面更優，熱皺縮性能、力學性能及抗鈣化性能不弱于澳洲心包。本研究初步驗證了四川牦牛心包替代澳洲黃牛心包的可行性，為牛心包國產化的推進提供了有力的數據支撐。
引用本文： 左一聰, 康珂, 尚大鵬, 楊夏燕, 吳堯, 虞奇峰, 溫賢濤. 四川牦牛心包與澳洲黃牛心包對比研究. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(3): 537-543. doi: 10.7507/1001-5515.202202044 復制
引言
心臟瓣膜病是一種常見心臟病，指人體心臟四個瓣膜發生病變，影響血流的正常流動，從而造成心臟功能異常，最終導致心力衰竭[1-2]。人工心臟瓣膜置換是根治心臟瓣膜病的方法之一，目前介入生物瓣憑借著手術切口小、復原過程較快且出血少等優點開始取代外科瓣[3-7]。
生物瓣主要由瓣葉、支架和瓣裙三大部分組成，其中瓣葉作為閥門控制著血流流動，其功能性直接影響著生物瓣的壽命。早期生物瓣的瓣葉材料使用的是豬心包或者豬心瓣，但在并發癥發生率、死亡率、功能狀態和血流動力學功能等對比中，研究者發現牛心包的綜合性能更優，因此牛心包已經成為當今瓣葉材料的主要來源選擇[8-11]。
目前國內的生物瓣研發公司使用的牛心包均是從國外進口，主要源自澳大利亞和新西蘭，這種進口供應鏈存在諸多問題，如價格昂貴、運輸時效不可控、受環境及政策影響大等，極大地降低了國內企業的產品研發效率，因此牛心包原材料已然成為“卡脖子”難題。國內牛源豐富，牛心包國產化能降低研發成本、提高研發效率，是促進國產生物瓣產業高速發展的突破點，因此牛心包國產化已迫在眉睫。
實現牛心包國產化的任務之一是評價國產牛心包替代進口牛心包的可行性。目前關于國產牛心包的研究主要來自樂以倫教授團隊，其團隊以四川西部紅原大草原養殖的牦牛為樣本，對其心包進行了生化組成[12-13]、免疫原性及免疫反應性[14]、基礎力學性能[15-16]、纖維組織形態[17]、組織結構[18]、超微結構[19]、酶成分[20]等基礎分析，并初步進行了應用研究，評價了牦牛心包經工藝處理后的力學性能及抗鈣化性能[21-25]，測試了基于牦牛心包制備的心臟瓣膜的流體動力學性能[26]。雖然該團隊的研究工作初步證明了牦牛心包具備作為生物瓣瓣葉的潛力，但與進口心包的對比研究較少，國產心包是否可以完全替代進口心包尚需更深入及全面的對比分析。
鑒于此，本文以四川牦牛心包為樣本，與澳洲黃牛心包在多個重要指標上進行對比研究，重要指標包括了外觀、微觀結構、厚度、熱皺縮性能、力學性能及抗鈣化性能，這些指標常用于心包的基礎及應用研究[27-31]，本文期望通過對比研究進一步評價國產心包替代進口心包的可行性。
1 材料與方法
1.1 主要材料及儀器
新鮮四川牦牛心包（采集自四川西部紅原大草原3 ~ 5歲牦牛），新鮮澳洲黃牛心包（來源于澳洲供應商Maverick公司2 ~ 3歲黃牛），戊二醛溶液（國藥集團化學試劑有限公司，中國），D-Hanks溶液（內部自行配置），生理鹽水（0.9% NaCl溶液，內部自行配置），無水乙醇（成都科隆化學品有限公司，中國）；膠原熱形變分析儀（陜西科技大學陽光電子研究所，TMA-YD4，中國），場發射掃描電鏡（Hitachi，S-4800，日本），單軸拉伸機（Instron，34SC-2，美國），三豐測厚儀（三豐量具，C112EXBS，日本）。
1.2 新鮮心包處理
獲取新鮮心包之后，去除表面多余的脂肪及結締組織，隨后依次進行裁剪、精洗、脫細胞、固定（0.6%的戊二醛溶液中固定7天）、抗鈣化處理，每個測試項目根據需求在不同處理階段獲取樣本。
1.3 外觀觀察
隨機取10片新鮮心包（原始心包，未經過任何處理），展開后觀察心包顏色、表面脂肪殘留、增生、血管等，并對心包外觀進行拍照記錄。
1.4 厚度檢測
隨機取10片新鮮心包（脫細胞處理后，固定前），對心包進行定點測厚，測厚儀壓桿下壓后開始計時，讀取10 s后的數據為厚度值，每個心包測量9個點，9個點的平均值為心包厚度值；心包固定處理后，用同樣方法再次測厚并做記錄，測厚點位與固定前測厚點位保持一致。
1.5 微觀結構觀察
隨機從新鮮心包片（脫細胞處理后）和固定心包片上裁剪出尺寸為1 cm × 1 cm的樣品，每片樣品依次經過30%、50%、70%、87%、95%、100%的乙醇脫水處理，其中30%、50%濃度各處理30 min，其余濃度處理1 h，處理完后保存在100%乙醇中。對脫水后的心包進行冷凍干燥，在10 mA電流下噴金90 s鍍膜，隨后利用場發射掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）拍攝心包表面形貌。
1.6 力學性能測試
隨機選取多片新鮮心包片（脫細胞處理后）及固定心包片進行力學測試，其中，斷裂伸長率、拉伸強度、彈性模量按照QBT 2710-2018進行測試，樣品尺寸為2 cm × 9 cm，設置平行樣10個；撕裂強度按照QBT 4198-2011中試樣尺寸（小號）進行制樣并測試，設置平行樣10個。
1.7 熱皺縮溫度測試
隨機挑選10片新鮮心包片（脫細胞處理后）及10片固定心包片，使用熱皺縮制樣工裝對每片心包片進行取樣（每條樣條尺寸為3 mm × 50 mm），隨后進行熱皺縮測試，記錄收縮溫度。
1.8 抗鈣化性能評價
利用大鼠背部皮下植入方式進行抗鈣化性能評價。大鼠選用3周齡的雄性Wistar，于四川醫療器械生物材料和制品檢驗中心內飼養和實驗，許可證號：SYXK（川）2018-017。隨機裁剪出固定心包片10片為對照組、抗鈣化處理心包片10片為實驗組，每片樣品尺寸為1 cm × 1 cm。植入大鼠背部30天后對大鼠進行無痛處死，取出樣品，去除表面多余的結締組織之后進行鈣含量測試。
1.9 數據統計
本研究中所有數據表現形式為均值±標準差。顯著性檢驗采用t檢驗或者雙因素方差分析進行檢驗，檢驗水準為0.05。
2 結果與討論
2.1 外觀
新鮮心包外觀照片如圖1所示。圖1a為新鮮四川牦牛心包外觀照片，新鮮心包呈淺黃色，表面有少量脂肪殘留，肉眼觀察無明顯血管和增生（見圖1e）。圖1b為新鮮澳洲黃牛心包外觀照片，新鮮心包呈淺黃色，表面有脂肪殘留。該類心包表面存在肉眼可見的血管及明顯增生，且出現比例較高。如圖1f所示，在10個心包中，有8個觀察到了血管、5個觀察到了增生，血管和增生示意圖如圖1c ~ d所示。
圖1
新鮮心包照片及血管和增生情況
a. 新鮮四川牦牛心包外觀照片；b. 新鮮澳洲黃牛心包外觀照片；c. 典型的新鮮澳洲黃牛心包的血管（紅色箭頭標注）；d. 典型的新鮮澳洲黃牛心包的增生（紅色虛線圓圈內）；e. 新鮮四川牦牛心包血管和增生統計；f. 新鮮澳洲黃牛心包血管和增生統計
Figure1. Images of fresh pericardium with vascular and hyperplasiaa. image of fresh pericardium from Sichuan yak; b. image of fresh pericardium from Australian cattle; c. typical vessel (marked by red arrows) in fresh pericardium of Australian cattle; d. typical hyperplasia (marked by red circles) in fresh pericardium of Australian cattle; e. statistics of vascular and hyperplasia in fresh pericardium of Sichuan yak; f. statistics of vascular and hyperplasia in fresh pericardium of Australian cattle
瓣葉挑選要求極高，若表面有血管和增生會影響瓣膜產品血流動力學等性能，因此心包上的血管和增生部位需要在處理階段裁剪掉。血管和增生的存在會降低心包可用面積，大大降低最終成品率，提高產品成本，從上述數據可以得出四川牦牛心包較澳洲黃牛心包更有優勢，利用率更高。
2.2 厚度
如圖2所示，新鮮和固定后的四川牦牛心包厚度值分別為（0.282 ± 0.048）mm和（0.289 ± 0.061）mm，經過固定處理后的心包厚度略微增加，但差異無統計學意義；新鮮和固定后的澳洲黃牛心包厚度值分別為（0.374 ± 0.050）mm和（0.447 ± 0.059）mm，固定后心包厚度顯著增大（P < 0.05）。
圖2
四川牦牛心包（n = 10）和澳洲黃牛心包（n = 10）的厚 度數據（*表示P < 0.05）
Figure2.
Thickness of pericardium from Sichuan yak (n = 10) and Australian cattle (n = 10) (* stands for P < 0.05)
在進行瓣葉挑選和匹配時，厚度是關鍵篩選條件之一，因此牛心包的厚度及處理過程中厚度的變化會影響最終成品率。從上述數據可以看出，四川牦牛心包較澳洲黃牛心包薄，同時固定前后厚度變化小，因此在厚度上牦牛心包更具優勢，利用率更高。
2.3 微觀結構
心包的SEM照片如圖3所示。圖3a為新鮮四川牦牛心包表面照片，可以看出心包為致密型纖維結構，電鏡拍照區域內纖維走向比較統一，并可以明顯地觀察到纖維束結構，纖維束之間有一定的空間。對固定后牦牛心包表面結構進行觀察發現，其纖維走向也比較統一，但未觀察到明顯纖維束結構（見圖3b）。出現這種現象可能是膠原纖維之間的彈性纖維、糖胺聚糖等成分在固定過程中的流失造成的，同時這些成分的流失也可能會使心包力學性能下降。
圖3
心包的掃描電鏡圖
a. 新鮮四川牦牛心包；b. 固定四川牦牛心包；c. 新鮮澳洲黃牛心包；d. 固定澳洲黃牛心包
Figure3. SEM images of pericardiuma. fresh pericardium rom Sichuan yak; b. fixed pericardium from Sichuan yak; c. fresh pericardium from Australian cattle; d. fixed pericardium from Australian cattle
圖3c為新鮮澳洲黃牛心包表面SEM照片，與牦牛心包相比，澳洲黃牛的心包纖維結構較為松散，經戊二醛固定后，纖維走向比較統一，可觀察到明顯的纖維束結構（見圖3d），表明膠原纖維之間發生明顯交聯作用。
2.4 力學性能
如圖4所示，新鮮四川牦牛心包斷裂伸長率、拉伸強度、彈性模量、撕裂強度分別為（65.83 ± 23.26）%、（18.91 ± 6.71）MPa、（110.99 ± 35.92）MPa、（46.41 ± 10.13）N/mm。固定后的四川牦牛心包斷裂伸長率、拉伸強度、彈性模量、撕裂強度則分別為（58.15 ± 25.84）%、（15.64 ± 4.62）MPa、（106.45 ± 43.54）MPa、（44.82 ± 11.96）N/mm。心包固定后各項力學性能均值有下降趨勢，但差異均無統計學意義。
圖4
四川牦牛心包（n = 10）和澳洲黃牛心包（n = 10）力學性能
Figure4.
Mechanical properties of pericardium from yak (n = 10) and Australian cattle (n = 10)
新鮮澳洲黃牛心包斷裂伸長率、拉伸強度、彈性模量、撕裂強度分別為（48.69 ± 10.47）%、（16.90 ± 5.59）MPa、（84.93 ± 25.30）MPa、（52.42 ± 25.22）N/mm。固定澳洲黃牛心包斷裂伸長率、拉伸強度、彈性模量、撕裂強度分別為（40.43 ± 4.89）%、（20.43 ± 2.71）MPa、（98.78 ± 14.58）MPa、（54.65 ± 17.62）N/mm。澳洲黃牛心包固定后，除斷裂伸長率以外，其余力學性能均值有上升趨勢，但差異也沒有統計學意義。
四川牦牛心包在固定后力學性能參數平均值有所降低的原因可能是因牦牛生長緩慢，3 ~ 5周歲的成熟牦牛心包纖維結構本身較為致密，固定后彈性纖維、糖胺聚糖等成分的流失對心包結構產生了影響，使得心包在力學參數上發生一定變化。澳洲黃牛生長速度較快，來源于2 ~ 3周歲黃牛的心包纖維結構與牦牛心包相比較為松散（如圖3所示），經戊二醛固定后，與彈性纖維、糖胺聚糖等成分的流失相比，膠原纖維之間的交聯對心包力學性能影響更大，因此部分力學性能參數呈現出上升的趨勢。值得注意的是，固定過程雖然交聯了膠原纖維，但并沒有顯著改變其相關力學強度。
2.5 熱皺縮溫度
如圖5所示，新鮮四川牦牛心包的熱皺縮溫度為（66.64 ± 0.23）℃，固定后牦牛心包的熱皺縮溫度為（85.06 ± 0.16）℃，固定心包相對于新鮮心包熱皺縮溫度提高了約18.4 ℃（P < 0.05），表明戊二醛交聯處理提高了心包的熱穩定性。同樣，固定后澳洲黃牛心包的熱皺縮溫度也從（66.96 ± 0.37）℃ 提升至（84.77 ± 0.11）℃，固定心包相對于新鮮心包熱皺縮溫度提高了約17.8 ℃（P < 0.05）。
圖5
四川牦牛心包（n = 10）和澳洲黃牛心包（n = 10）熱 皺縮溫度（*表示P < 0.05）
Figure5.
Shrinkage temperature of pericardium from Sichuan yak (n = 10) and Australian cattle (n = 10) (* stands for P < 0.05)
熱皺縮溫度是心包處理過程的重要評價指標之一，代表其主要成分膠原蛋白的熱穩定性。新鮮心包在經過交聯固定等處理之后，其內部膠原蛋白之間或者膠原蛋白與交聯劑之間發生鍵合，因此交聯固定后的心包熱皺縮溫度會升高，熱穩定性顯著增強。對于四川牦牛心包與澳洲黃牛心包，無論是新鮮心包之間還是固定心包之間，熱皺縮溫度均值都非常接近，差異沒有統計學意義。
2.6 抗鈣化性能
鈣化是影響生物瓣使用壽命的主要原因之一，因此抗鈣化性能是評價牛心包材料功能性的重要指標。圖6為抗鈣化工藝處理后心包片（實驗組）及固定后心包片（對照組）在大鼠皮下植入30天后的鈣含量數據。固定四川牦牛心包鈣含量為（34.196 ± 39.719）μg/mg，均值低于固定澳洲黃牛心包鈣含量即（74.580 ± 50.311）μg/mg，但差異無統計學意義。經抗鈣化工藝處理后，兩種心包鈣含量均顯著降低，其中四川牦牛心包鈣含量為（1.01 ± 0.47）μg/mg（與處理前比較，P < 0.05），澳洲黃牛心包鈣含量為（0.90 ± 0.37）μg/mg（與處理前比較，P < 0.05），但兩種心包之間的差異無統計學意義。從數據中可以初步看出，在相同處理工藝下，四川牦牛心包抗鈣化性能不弱于澳洲黃牛心包。
圖6
四川牦牛心包（n = 10）和澳洲黃牛心包（n = 10）大 鼠皮下植入30天后鈣含量（*表示P < 0.05）
Figure6.
Calcium content of pericardium (Sichuan yak, n = 10; Australian cattle, n = 10) after 30 days’ subcutaneous implantation in rat (* stands for P < 0.05)
3 總結與展望
本文通過對比研究發現，四川牦牛心包在外觀和厚度方面有顯著優勢，同時抗鈣化能力也不弱于澳洲黃牛心包，初步驗證了國產替代可行性。當然，要實現對進口心包的完全替代，還需要進一步對國產心包展開更加全面和系統的評價研究，并完善相關溯源體系。相信隨著國內法律法規逐步完善和生物材料學科的發展，國產牛心包的供應鏈體系會被進一步地規范，相應風險管理措施及評價體系亦將愈發完善，臨床應用的可行性及安全性將會得到更強有力的保障。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：左一聰負責實驗設計以及文章撰寫，康珂負責數據收集、整理分析以及文章修改，尚大鵬協助了實驗設計和數據整理工作，楊夏燕指導了課題的設計，吳堯指導了數據處理和文章修改工作，虞奇峰和溫賢濤一起指導了研究設計、文章撰寫和修改工作。
倫理聲明：本研究動物實驗通過了四川醫療器械生物材料和制品檢驗中心動物實驗倫理審查。
引言
心臟瓣膜病是一種常見心臟病，指人體心臟四個瓣膜發生病變，影響血流的正常流動，從而造成心臟功能異常，最終導致心力衰竭[1-2]。人工心臟瓣膜置換是根治心臟瓣膜病的方法之一，目前介入生物瓣憑借著手術切口小、復原過程較快且出血少等優點開始取代外科瓣[3-7]。
生物瓣主要由瓣葉、支架和瓣裙三大部分組成，其中瓣葉作為閥門控制著血流流動，其功能性直接影響著生物瓣的壽命。早期生物瓣的瓣葉材料使用的是豬心包或者豬心瓣，但在并發癥發生率、死亡率、功能狀態和血流動力學功能等對比中，研究者發現牛心包的綜合性能更優，因此牛心包已經成為當今瓣葉材料的主要來源選擇[8-11]。
目前國內的生物瓣研發公司使用的牛心包均是從國外進口，主要源自澳大利亞和新西蘭，這種進口供應鏈存在諸多問題，如價格昂貴、運輸時效不可控、受環境及政策影響大等，極大地降低了國內企業的產品研發效率，因此牛心包原材料已然成為“卡脖子”難題。國內牛源豐富，牛心包國產化能降低研發成本、提高研發效率，是促進國產生物瓣產業高速發展的突破點，因此牛心包國產化已迫在眉睫。
實現牛心包國產化的任務之一是評價國產牛心包替代進口牛心包的可行性。目前關于國產牛心包的研究主要來自樂以倫教授團隊，其團隊以四川西部紅原大草原養殖的牦牛為樣本，對其心包進行了生化組成[12-13]、免疫原性及免疫反應性[14]、基礎力學性能[15-16]、纖維組織形態[17]、組織結構[18]、超微結構[19]、酶成分[20]等基礎分析，并初步進行了應用研究，評價了牦牛心包經工藝處理后的力學性能及抗鈣化性能[21-25]，測試了基于牦牛心包制備的心臟瓣膜的流體動力學性能[26]。雖然該團隊的研究工作初步證明了牦牛心包具備作為生物瓣瓣葉的潛力，但與進口心包的對比研究較少，國產心包是否可以完全替代進口心包尚需更深入及全面的對比分析。
鑒于此，本文以四川牦牛心包為樣本，與澳洲黃牛心包在多個重要指標上進行對比研究，重要指標包括了外觀、微觀結構、厚度、熱皺縮性能、力學性能及抗鈣化性能，這些指標常用于心包的基礎及應用研究[27-31]，本文期望通過對比研究進一步評價國產心包替代進口心包的可行性。
1 材料與方法
1.1 主要材料及儀器
新鮮四川牦牛心包（采集自四川西部紅原大草原3 ~ 5歲牦牛），新鮮澳洲黃牛心包（來源于澳洲供應商Maverick公司2 ~ 3歲黃牛），戊二醛溶液（國藥集團化學試劑有限公司，中國），D-Hanks溶液（內部自行配置），生理鹽水（0.9% NaCl溶液，內部自行配置），無水乙醇（成都科隆化學品有限公司，中國）；膠原熱形變分析儀（陜西科技大學陽光電子研究所，TMA-YD4，中國），場發射掃描電鏡（Hitachi，S-4800，日本），單軸拉伸機（Instron，34SC-2，美國），三豐測厚儀（三豐量具，C112EXBS，日本）。
1.2 新鮮心包處理
獲取新鮮心包之后，去除表面多余的脂肪及結締組織，隨后依次進行裁剪、精洗、脫細胞、固定（0.6%的戊二醛溶液中固定7天）、抗鈣化處理，每個測試項目根據需求在不同處理階段獲取樣本。
1.3 外觀觀察
隨機取10片新鮮心包（原始心包，未經過任何處理），展開后觀察心包顏色、表面脂肪殘留、增生、血管等，并對心包外觀進行拍照記錄。
1.4 厚度檢測
隨機取10片新鮮心包（脫細胞處理后，固定前），對心包進行定點測厚，測厚儀壓桿下壓后開始計時，讀取10 s后的數據為厚度值，每個心包測量9個點，9個點的平均值為心包厚度值；心包固定處理后，用同樣方法再次測厚并做記錄，測厚點位與固定前測厚點位保持一致。
1.5 微觀結構觀察
隨機從新鮮心包片（脫細胞處理后）和固定心包片上裁剪出尺寸為1 cm × 1 cm的樣品，每片樣品依次經過30%、50%、70%、87%、95%、100%的乙醇脫水處理，其中30%、50%濃度各處理30 min，其余濃度處理1 h，處理完后保存在100%乙醇中。對脫水后的心包進行冷凍干燥，在10 mA電流下噴金90 s鍍膜，隨后利用場發射掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）拍攝心包表面形貌。
1.6 力學性能測試
隨機選取多片新鮮心包片（脫細胞處理后）及固定心包片進行力學測試，其中，斷裂伸長率、拉伸強度、彈性模量按照QBT 2710-2018進行測試，樣品尺寸為2 cm × 9 cm，設置平行樣10個；撕裂強度按照QBT 4198-2011中試樣尺寸（小號）進行制樣并測試，設置平行樣10個。
1.7 熱皺縮溫度測試
隨機挑選10片新鮮心包片（脫細胞處理后）及10片固定心包片，使用熱皺縮制樣工裝對每片心包片進行取樣（每條樣條尺寸為3 mm × 50 mm），隨后進行熱皺縮測試，記錄收縮溫度。
1.8 抗鈣化性能評價
利用大鼠背部皮下植入方式進行抗鈣化性能評價。大鼠選用3周齡的雄性Wistar，于四川醫療器械生物材料和制品檢驗中心內飼養和實驗，許可證號：SYXK（川）2018-017。隨機裁剪出固定心包片10片為對照組、抗鈣化處理心包片10片為實驗組，每片樣品尺寸為1 cm × 1 cm。植入大鼠背部30天后對大鼠進行無痛處死，取出樣品，去除表面多余的結締組織之后進行鈣含量測試。
1.9 數據統計
本研究中所有數據表現形式為均值±標準差。顯著性檢驗采用t檢驗或者雙因素方差分析進行檢驗，檢驗水準為0.05。
2 結果與討論
2.1 外觀
新鮮心包外觀照片如圖1所示。圖1a為新鮮四川牦牛心包外觀照片，新鮮心包呈淺黃色，表面有少量脂肪殘留，肉眼觀察無明顯血管和增生（見圖1e）。圖1b為新鮮澳洲黃牛心包外觀照片，新鮮心包呈淺黃色，表面有脂肪殘留。該類心包表面存在肉眼可見的血管及明顯增生，且出現比例較高。如圖1f所示，在10個心包中，有8個觀察到了血管、5個觀察到了增生，血管和增生示意圖如圖1c ~ d所示。
圖1
新鮮心包照片及血管和增生情況
a. 新鮮四川牦牛心包外觀照片；b. 新鮮澳洲黃牛心包外觀照片；c. 典型的新鮮澳洲黃牛心包的血管（紅色箭頭標注）；d. 典型的新鮮澳洲黃牛心包的增生（紅色虛線圓圈內）；e. 新鮮四川牦牛心包血管和增生統計；f. 新鮮澳洲黃牛心包血管和增生統計
Figure1. Images of fresh pericardium with vascular and hyperplasiaa. image of fresh pericardium from Sichuan yak; b. image of fresh pericardium from Australian cattle; c. typical vessel (marked by red arrows) in fresh pericardium of Australian cattle; d. typical hyperplasia (marked by red circles) in fresh pericardium of Australian cattle; e. statistics of vascular and hyperplasia in fresh pericardium of Sichuan yak; f. statistics of vascular and hyperplasia in fresh pericardium of Australian cattle
瓣葉挑選要求極高，若表面有血管和增生會影響瓣膜產品血流動力學等性能，因此心包上的血管和增生部位需要在處理階段裁剪掉。血管和增生的存在會降低心包可用面積，大大降低最終成品率，提高產品成本，從上述數據可以得出四川牦牛心包較澳洲黃牛心包更有優勢，利用率更高。
2.2 厚度
如圖2所示，新鮮和固定后的四川牦牛心包厚度值分別為（0.282 ± 0.048）mm和（0.289 ± 0.061）mm，經過固定處理后的心包厚度略微增加，但差異無統計學意義；新鮮和固定后的澳洲黃牛心包厚度值分別為（0.374 ± 0.050）mm和（0.447 ± 0.059）mm，固定后心包厚度顯著增大（P < 0.05）。
圖2
四川牦牛心包（n = 10）和澳洲黃牛心包（n = 10）的厚 度數據（*表示P < 0.05）
Figure2.
Thickness of pericardium from Sichuan yak (n = 10) and Australian cattle (n = 10) (* stands for P < 0.05)
在進行瓣葉挑選和匹配時，厚度是關鍵篩選條件之一，因此牛心包的厚度及處理過程中厚度的變化會影響最終成品率。從上述數據可以看出，四川牦牛心包較澳洲黃牛心包薄，同時固定前后厚度變化小，因此在厚度上牦牛心包更具優勢，利用率更高。
2.3 微觀結構
心包的SEM照片如圖3所示。圖3a為新鮮四川牦牛心包表面照片，可以看出心包為致密型纖維結構，電鏡拍照區域內纖維走向比較統一，并可以明顯地觀察到纖維束結構，纖維束之間有一定的空間。對固定后牦牛心包表面結構進行觀察發現，其纖維走向也比較統一，但未觀察到明顯纖維束結構（見圖3b）。出現這種現象可能是膠原纖維之間的彈性纖維、糖胺聚糖等成分在固定過程中的流失造成的，同時這些成分的流失也可能會使心包力學性能下降。
圖3
心包的掃描電鏡圖
a. 新鮮四川牦牛心包；b. 固定四川牦牛心包；c. 新鮮澳洲黃牛心包；d. 固定澳洲黃牛心包
Figure3. SEM images of pericardiuma. fresh pericardium rom Sichuan yak; b. fixed pericardium from Sichuan yak; c. fresh pericardium from Australian cattle; d. fixed pericardium from Australian cattle
圖3c為新鮮澳洲黃牛心包表面SEM照片，與牦牛心包相比，澳洲黃牛的心包纖維結構較為松散，經戊二醛固定后，纖維走向比較統一，可觀察到明顯的纖維束結構（見圖3d），表明膠原纖維之間發生明顯交聯作用。
2.4 力學性能
如圖4所示，新鮮四川牦牛心包斷裂伸長率、拉伸強度、彈性模量、撕裂強度分別為（65.83 ± 23.26）%、（18.91 ± 6.71）MPa、（110.99 ± 35.92）MPa、（46.41 ± 10.13）N/mm。固定后的四川牦牛心包斷裂伸長率、拉伸強度、彈性模量、撕裂強度則分別為（58.15 ± 25.84）%、（15.64 ± 4.62）MPa、（106.45 ± 43.54）MPa、（44.82 ± 11.96）N/mm。心包固定后各項力學性能均值有下降趨勢，但差異均無統計學意義。
圖4
四川牦牛心包（n = 10）和澳洲黃牛心包（n = 10）力學性能
Figure4.
Mechanical properties of pericardium from yak (n = 10) and Australian cattle (n = 10)
新鮮澳洲黃牛心包斷裂伸長率、拉伸強度、彈性模量、撕裂強度分別為（48.69 ± 10.47）%、（16.90 ± 5.59）MPa、（84.93 ± 25.30）MPa、（52.42 ± 25.22）N/mm。固定澳洲黃牛心包斷裂伸長率、拉伸強度、彈性模量、撕裂強度分別為（40.43 ± 4.89）%、（20.43 ± 2.71）MPa、（98.78 ± 14.58）MPa、（54.65 ± 17.62）N/mm。澳洲黃牛心包固定后，除斷裂伸長率以外，其余力學性能均值有上升趨勢，但差異也沒有統計學意義。
四川牦牛心包在固定后力學性能參數平均值有所降低的原因可能是因牦牛生長緩慢，3 ~ 5周歲的成熟牦牛心包纖維結構本身較為致密，固定后彈性纖維、糖胺聚糖等成分的流失對心包結構產生了影響，使得心包在力學參數上發生一定變化。澳洲黃牛生長速度較快，來源于2 ~ 3周歲黃牛的心包纖維結構與牦牛心包相比較為松散（如圖3所示），經戊二醛固定后，與彈性纖維、糖胺聚糖等成分的流失相比，膠原纖維之間的交聯對心包力學性能影響更大，因此部分力學性能參數呈現出上升的趨勢。值得注意的是，固定過程雖然交聯了膠原纖維，但并沒有顯著改變其相關力學強度。
2.5 熱皺縮溫度
如圖5所示，新鮮四川牦牛心包的熱皺縮溫度為（66.64 ± 0.23）℃，固定后牦牛心包的熱皺縮溫度為（85.06 ± 0.16）℃，固定心包相對于新鮮心包熱皺縮溫度提高了約18.4 ℃（P < 0.05），表明戊二醛交聯處理提高了心包的熱穩定性。同樣，固定后澳洲黃牛心包的熱皺縮溫度也從（66.96 ± 0.37）℃ 提升至（84.77 ± 0.11）℃，固定心包相對于新鮮心包熱皺縮溫度提高了約17.8 ℃（P < 0.05）。
圖5
四川牦牛心包（n = 10）和澳洲黃牛心包（n = 10）熱 皺縮溫度（*表示P < 0.05）
Figure5.
Shrinkage temperature of pericardium from Sichuan yak (n = 10) and Australian cattle (n = 10) (* stands for P < 0.05)
熱皺縮溫度是心包處理過程的重要評價指標之一，代表其主要成分膠原蛋白的熱穩定性。新鮮心包在經過交聯固定等處理之后，其內部膠原蛋白之間或者膠原蛋白與交聯劑之間發生鍵合，因此交聯固定后的心包熱皺縮溫度會升高，熱穩定性顯著增強。對于四川牦牛心包與澳洲黃牛心包，無論是新鮮心包之間還是固定心包之間，熱皺縮溫度均值都非常接近，差異沒有統計學意義。
2.6 抗鈣化性能
鈣化是影響生物瓣使用壽命的主要原因之一，因此抗鈣化性能是評價牛心包材料功能性的重要指標。圖6為抗鈣化工藝處理后心包片（實驗組）及固定后心包片（對照組）在大鼠皮下植入30天后的鈣含量數據。固定四川牦牛心包鈣含量為（34.196 ± 39.719）μg/mg，均值低于固定澳洲黃牛心包鈣含量即（74.580 ± 50.311）μg/mg，但差異無統計學意義。經抗鈣化工藝處理后，兩種心包鈣含量均顯著降低，其中四川牦牛心包鈣含量為（1.01 ± 0.47）μg/mg（與處理前比較，P < 0.05），澳洲黃牛心包鈣含量為（0.90 ± 0.37）μg/mg（與處理前比較，P < 0.05），但兩種心包之間的差異無統計學意義。從數據中可以初步看出，在相同處理工藝下，四川牦牛心包抗鈣化性能不弱于澳洲黃牛心包。
圖6
四川牦牛心包（n = 10）和澳洲黃牛心包（n = 10）大 鼠皮下植入30天后鈣含量（*表示P < 0.05）
Figure6.
Calcium content of pericardium (Sichuan yak, n = 10; Australian cattle, n = 10) after 30 days’ subcutaneous implantation in rat (* stands for P < 0.05)
3 總結與展望
本文通過對比研究發現，四川牦牛心包在外觀和厚度方面有顯著優勢，同時抗鈣化能力也不弱于澳洲黃牛心包，初步驗證了國產替代可行性。當然，要實現對進口心包的完全替代，還需要進一步對國產心包展開更加全面和系統的評價研究，并完善相關溯源體系。相信隨著國內法律法規逐步完善和生物材料學科的發展，國產牛心包的供應鏈體系會被進一步地規范，相應風險管理措施及評價體系亦將愈發完善，臨床應用的可行性及安全性將會得到更強有力的保障。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：左一聰負責實驗設計以及文章撰寫，康珂負責數據收集、整理分析以及文章修改，尚大鵬協助了實驗設計和數據整理工作，楊夏燕指導了課題的設計，吳堯指導了數據處理和文章修改工作，虞奇峰和溫賢濤一起指導了研究設計、文章撰寫和修改工作。
倫理聲明：本研究動物實驗通過了四川醫療器械生物材料和制品檢驗中心動物實驗倫理審查。
