本研究旨在評價聚乳酸-己內酯（PLCL）/纖維蛋白原納米纖維膜（P/F-Ns）的安全性和功能性，為臨床應用提供理論支撐。通過掃描電鏡、材料測試機、接觸角測量儀和酶標儀分別研究P/F-Ns的表面形態、力學性能、親水性和纖維蛋白原含量。通過CCK-8法和實時熒光定量PCR評價Hig-82細胞在P/F-Ns上的黏附、增殖及韌帶修復相關基因表達。結果顯示，隨著纖維蛋白原含量增加，P/F-Ns表面纖維孔隙增大，力學性能下降，親水性增強，其中P/F-N-2最有利于細胞黏附和增殖。以不含纖維蛋白原的P/F-N-0為對照，含纖維蛋白原的P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3上細胞韌帶修復相關基因在第3天和第7天表達均上調。與P/F-N-0相比，含纖維蛋白原的P/F-Ns具有更好的生物相容性，能夠有效應用于前交叉韌帶重建。
引用本文： 郭佳花, 張羽, 陳麗媛, 徐麗明, 莫秀梅, 陳亮. 靜電紡納米纖維PLCL/纖維蛋白原人工韌帶的生物相容性評價. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(3): 544-550, 560. doi: 10.7507/1001-5515.202107011 復制
引言
前交叉韌帶是膝關節內一種致密的結締組織，主要由膠原（Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和Ⅴ型膠原）、彈性蛋白、糖基質蛋白及蛋白聚糖組成，在維持膝關節穩定性和功能運動中起重要的作用[1]。然而，在頻繁的膝關節運動中，前交叉韌帶的生物力學性能極易受損。文獻研究表明，前交叉韌帶損傷發生率為35/100 000人，其中女性運動員的發生率是男性運動員的2～8倍[2-3]。僅僅在美國，每年將發生100 000～200 000韌帶損傷案例[4-5]。大部分韌帶損傷患者還伴隨患有關節炎和滑膜炎等，這將嚴重影響其正常生活，降低其生活質量。
由于韌帶的有限自我再生能力，前交叉韌帶修復在臨床醫療上面臨巨大的挑戰。目前韌帶修復的手術治療方法為前交叉韌帶重建術，使用自體移植物[6]、同種異體移植物、異種移植物或人工韌帶移植物等。自體韌帶移植物是目前臨床療效理想的替代物，但是存在增加供體部位發病率、損壞自身健康組織的風險。同種異體和異種移植物也會帶來一系列的免疫排斥反應，加劇患者的損傷情況和增加患者康復周期[7-8]。因此，人工韌帶移植物在臨床醫療應用中受到關注。
人工韌帶移植物材料包括合成聚合物高分子、天然高分子以及復合材料等。合成聚合物高分子一般認為具有良好的力學性能，但生物相容性不足，可能產生骨關節炎和滑膜炎等[9-14]，目前上市的產品包括Gore-Tex十字交叉韌帶、Stryker Dacrone韌帶和3M Kennedy LADTM韌帶增強器[15-20]。天然高分子材料包括膠原、蠶絲蛋白、纖維蛋白原、明膠及殼聚糖等，生物相容性優于合成聚合物，但通常不能提供足夠的力學支撐。由兩者構成的復合材料被認為將具有合適的力學性能和生物相容性，因此在韌帶修復的研究中獲得了越來越多的應用。
本研究中人工韌帶是由聚乳酸-己內酯［poly（lactic-acid-co-ε-caprolactone），PLCL］和豬源的纖維蛋白原按照不同比例混合經靜電紡絲技術制成的前交叉韌帶修復材料，其中的纖維蛋白原被認為具有改善材料親水性、賦予修復材料良好細胞相容性的作用，因此本課題主要對韌帶修復材料的理化性能（包括表面形貌、力學性能、親水性和纖維蛋白原含量）和細胞相容性（細胞黏附增殖、基因表達）進行研究，為開展動物體內韌帶修復實驗提供依據。
1 材料與儀器
Hig-82滑膜細胞（ATCC? CRL-1832TM）購買于美國ATCC公司，人工韌帶是由上海松力生物技術有限公司按課題組要求以不同比例的PLCL和纖維蛋白原為原料通過靜電紡絲技術制成的PLCL/纖維蛋白原納米纖維膜（PLCL/fibrinogen nanofibers，P/F-Ns），其中纖維蛋白原含量分別為0 mg/g（P/F-N-0）、70 mg/g（P/F-N-1）、140 mg/g（P/F-N-2）和180 mg/g（P/F-N-3）。
主要試劑有：硫酸銅、酒石酸鉀鈉、碘化鉀、氫氧化鈉（阿拉丁公司，中國），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、青鏈霉素混合液、CCK-8（Solarbio公司，中國），胎牛血清、Ham's F-12培養液（Gibco公司，美國），PBS（Hyclone公司，美國），RNeasy Plus Mini Kit、QuantiTect Reverse Transcription Kit（Qiagen，德國），TB Green Premix Ex Taq II（TAKARA，日本），ddH2O（生工生物工程公司，中國）。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
主要儀器有：SU8010 Scanning Electron Microscope（HITACHI公司，日本），OCA40接觸角測量儀（Dataphysics公司，德國），XPE205電子天平（梅特勒公司，美國），JXFSTRRP-CL冷凍研磨機（上海凈信公司，中國），H5K-S材料測試機（Hounsfield公司，英國），Spectramax M5酶標儀（Molecular Devices公司，美國），MJ-54A高壓滅菌鍋（上海施都凱公司，中國），BAO-80A干燥箱（上海施都凱公司，中國），MQT-60R恒溫搖床（上海旻泉公司，中國），BB150 CO2細胞培養箱（Thermo公司，美國），倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯公司，日本），TD5臺式低速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司，中國），Veriti基因擴增儀（Life Techonology公司，美國），Lightcycler480Ⅱ實時定量PCR儀（Roche公司，瑞士）。
2 實驗方法
2.1 表面形貌觀察
將P/F-Ns剪成0.5 cm×0.5 cm的大小，用雙面膠固定到載物臺上，在真空狀態下噴金2 min，然后在5 kV電壓下進行表面形貌的拍攝。每種樣品隨機選取四張3 000倍掃描電鏡圖，并根據式(1)通過圖像分析軟件Image J（National Institutes of Health，美國）計算孔隙率。每種樣品再隨機選取100根纖維并通過Image J測量纖維直徑。
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2.2 力學性能測試
人工合成韌帶必須具備一定的拉伸強度和應力-應變行為，在植入人體后才能發揮較好的替代作用，滿足患者日常生活的需求。因此本實驗擬借助H5K-S材料測試機研究不同P/F-Ns的力學性能。具體操作為：將4種P/F-Ns剪成1 cm × 5 cm的大小，用雙面膠分別將材料的兩端1 cm處固定在兩塊載玻片上，然后將兩端的載玻片固定到H5K-S材料測試機的夾具上，在室溫為20 ℃、相對濕度為60%的環境下，以10 mm/min的速度進行拉伸測試。應力、應變計算如下式：
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2.3 親疏水性測試
在測試樣品上滴加3 μL水滴，通過接觸角測量儀測量50 s內水滴在P/F-Ns上的角度變化并記錄。每種樣品測試三個平行樣。
2.4 纖維蛋白原含量測試
雙縮脲試劑的制備：取硫酸銅1.5 g、酒石酸鉀鈉6.0 g和碘化鉀5.0 g，加純化水500 mL使其溶解，邊攪拌邊加10%的氫氧化鈉溶液300 mL，純水稀釋至1 000 mL，混勻。以雙縮脲試劑為溶劑，配制1 mL濃度分別為2、4、6、8、10 mg/mL的BSA標準品溶液，以雙縮脲溶液為空白對照，每種濃度設置三個平行樣。
分別稱取質量約為50 mg的四種P/F-Ns樣品并剪碎。向剪碎的P/F-Ns中加入1 mL雙縮脲試劑，以65 Hz的頻率冷凍研磨勻漿60 s后置于–20 ℃冰箱降溫5 min。重復勻漿過程5次后，以4 000 r·min?1的速度離心10 min。取500 μL上清液，加入500 μL雙縮脲試劑并混勻作為測試樣品溶液，每種P/F-Ns設置三個平行樣。
以上各管均加入4 mL雙縮脲試劑，混勻，室溫放置30 min，在波長540 nm處測量吸光度。以BSA標準品的濃度為橫坐標，以其相應的吸光度值為縱坐標求得線性回歸方程。將測試樣品吸光度值代入標準曲線方程得到相應的纖維蛋白原濃度，然后計算樣品的纖維蛋白原含量。
2.5 細胞黏附實驗
使用熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（5，6-carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl ester，CFSE）標記Hig-82細胞，在不透光的P/F-Ns材料表面進行熒光標記細胞的觀察，具體步驟為：在細胞懸液中加入50 μmol·L?1的CFSE染液，混勻后置于37 ℃、含5% CO2細胞培養箱中孵育15 min后，加入預冷的PBS終止反應。隨后以1 000 r·min?1的速度離心5 min，棄上清，用PBS反復沖洗3次，離心（條件同上），棄去上清，加入含10%胎牛血清的完全培養液制備成CFSE標記的細胞懸液。將P/F-Ns剪成直徑為11 mm的圓片置于48孔板中，每種P/F-Ns分別設置三個平行樣。每孔加入1 mL完全培養液潤濕2 h，棄去培養液備用。P/F-Ns上每孔播種1×105個細胞，37 ℃培養箱分別培養4、24 h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞數量及形態。
同時，另取未用CFSE標記的Hig-82細胞同法接種P/F-Ns膜，在放入37 ℃、含5% CO2培養箱孵育4、24 h后，棄去細胞培養液，每孔加入500 μL完全培養液以及20 μL CCK-8溶液后，放入37 ℃、含5% CO2培養箱孵育4 h。孵育完成后，每孔分別吸取100 μL培養液于450 nm下測量吸光度。
2.6 細胞增殖實驗
P/F-Ns處理同2.5。每種P/F-Ns分別設置三個平行樣，P/F-Ns上每孔分別播種1×104、4×104個細胞，37 ℃培養箱分別培養1、3、5、7 d后，棄去細胞培養液，每孔加入500 μL完全培養液以及20 μL CCK-8，放入37 ℃、含5% CO2培養箱孵育4 h。孵育完成后，每孔吸取100 μL培養液在450 nm下測量吸光度。
2.7 韌帶組織相關蛋白基因表達測試
P/F-Ns處理同2.5。每種P/F-Ns分別設置三個平行樣，P/F-Ns上每孔播種4×104個Hig-82滑膜細胞，分別培養3 d和7 d。在P/F-Ns上用0.25%的Trypsin-EDTA消化細胞，用RNeasy Plus Mini Kit提取RNA，并使用QuantiTect Reverse Transcription Kit逆轉錄成為cDNA。20 μL實時定量熒光PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）反應體系為：10 μL的TB Green Premix Ex Taq II，上游引物和下游引物（濃度為10 μmol·L?1）各0.8 μL，2 μL的cDNA，6.4 μL的ddH2O。RT-qPCR擴增程序為：95 ℃預變性30 s，40個循環的擴增：95 ℃變性10 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s。每組三個復孔。以GAPDH為內參引物，以P/F-N-0為對照，進行相對定量。相關基因引物如表1所示。
表1
韌帶修復相關基因引物
Table1.
Genes primers related to ligament repair
2.8 統計學分析
所有數據均用SPSS 26.0軟件進行統計分析，數據形式為均值±標準差。本文各實驗組分別與對照組比較，采用t檢驗。所有的統計分析中，檢驗水準均為0.05。
3 結果
3.1 表面形貌觀察
如圖1所示，P/F-N-0表面致密，幾乎未見孔隙。P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3表面呈網狀結構，P/F-Ns的孔隙率隨纖維蛋白原含量增加而逐漸增大。其中P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3的孔隙率分別為：（15.42 ± 1.31）%、（28.53 ± 1.70）%、（33.85 ± 1.12）%。P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3纖維直徑分別為（603.92 ± 158.61）、（413.96 ± 187.02）、（244.54 ± 42.81）nm，表明隨著纖維蛋白原含量的增加，P/F-Ns的纖維直徑逐漸減小。
圖1
P/F-Ns的表觀形貌圖（3 000 ×）
Figure1.
The surface morphology of P/F-Ns (3 000 ×)
3.2 力學性能分析
如圖2所示，P/F-N-0、P/F-N-1、P/F-N-2與P/F-N-3斷裂時的應變分別為：（122.58 ± 0.18）%、（140.36 ± 0.21）%、（75.11 ± 3.13）%、（68.74 ± 0.11）%，斷裂時的拉伸強度分別為（35.66 ± 0.32）、（12.24 ± 0.12）、（8.02 ± 0.54）、（7.25 ± 0.22）MPa。因此，P/F-N-0、P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3的斷裂強度依次降低。上述實驗現象表明未添加纖維蛋白原的P/F-N-0具有較好的力學性能，而纖維蛋白原的增加會降低P/F-Ns的力學性能。這是因為由無規則的納米纖維堆積而成的靜電紡納米纖維膜的力學性能不僅與材料本身性能有關，還與纖維膜的結構（如纖維孔隙、纖維直徑、纖維的長度和纖維直徑的粘連程度）有關。由前文掃描電鏡結果可知，P/F-N-0表面致密，幾乎無孔隙，并且納米纖維抱團纏繞在一起，不容易產生滑脫。隨著纖維蛋白原含量增加，纖維直徑逐漸減小，孔隙逐漸增大，膜變得較為松散，纖維之間的連接和纏繞較少，摩擦力也變小，在拉力的作用下極易從納米纖維膜中抽離出來，最終斷裂。
圖2
P/F-Ns的力學性能結果
Figure2.
The mechanical properties results of P/F-Ns
3.3 親疏水性分析
在50 s內，P/F-N-0的接觸角大小基本不變（74.32～71.51°），而P/F-N-1的接觸角從75.21°減小到63.33°，P/F-N-2的接觸角從72.53°減小到41.21°，P/F-N-3的接觸角從70.65°減小到33.23°。如圖3所示，當水滴接觸30 s后，P/F-N-0、P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3的接觸角分別為：（72.75 ± 1.26）°、（64.67 ± 1.16）°、（60.35 ± 4.24）°、（49.33 ± 3.51）°。與P/F-N-0相比，含有纖維蛋白原的P/F-Ns的接觸角明顯減小，且隨著纖維蛋白原的增加接觸角逐漸減小。
圖3
P/F-Ns接觸角
**：與P/F-N-0相比，
**: compared with P/F-N-0,
3.4 纖維蛋白原含量
BSA定量標準曲線為Y = 0.048 03 X + 0.003 52，其中R2 = 0.999 34。通過計算得出P/F-N-1纖維蛋白原含量為（67.81 ± 1.88）mg/g，P/F-N-2纖維蛋白原含量為（140.23 ± 3.25）mg/g，P/F-N-3纖維蛋白原含量為（151.33 ± 13.46）mg/g。
3.5 黏附和增殖結果
如圖4左圖所示，當Hig-82細胞與P/F-Ns共培養4 h時，在P/F-Ns上的細胞數量較少，前三組幾乎無差別，P/F-N-3上的細胞數最多。當Hig-82細胞與P/F-Ns共培養24 h時，各組熒光強度均增強，表明黏附在P/F-Ns上的細胞數量增多。其中黏附在P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3上的細胞數量較多，且在P/F-N-2上的部分細胞形態呈梭形。如圖4右圖所示，當Hig-82細胞與P/F-Ns共培養4 h時，細胞吸光度值較低。當Hig-82細胞與P/F-Ns共培養24 h時，P/F-Ns上的細胞吸光度值均有所增高，P/F-N-0與其他三組的吸光度值具有顯著差異（P < 0.01）。其中P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3上的細胞吸光度值較高，表明添加纖維蛋白原的P/F-Ns更有利于細胞的黏附。
圖4
CFSE染色的Hig-82細胞在P/F-Ns上的黏附
**：與P/F-N-0相比，
**: Compared with P/F-N-0,
如圖5a所示，當Hig-82細胞接種量為1 × 104個時，在7天的培養過程中P/F-N-0的細胞吸光度值均未表現出明顯的增加，表明細胞未明顯增殖；而在含有纖維蛋白原的材料上，雖然在3天時細胞吸光度值未明顯變化，但從第5天開始，P/F-N-2和P/F-N-3的細胞吸光度值均明顯增加；在第7天時，P/F-N-1的細胞吸光度值也開始明顯增加，P/F-N-2和P/F-N-3的細胞吸光度值進一步增加，表明P/F-Ns中含有的纖維蛋白原有促進細胞增殖的作用。
圖5
Hig-82滑膜細胞在P/F-Ns上的增殖
a. 接種密度為1×104個；b. 接種密度為4×104個。*：與P/F-N-0相比，
a. inoculation densities: 1×104; b. inoculation densities: 4×104. *: compared with P/F-N-0,
當Hig-82細胞接種量增加為4×104個時，如圖5b所示，雖然P/F-N-0的細胞吸光度值在7天的培養過程中逐漸升高，表明細胞有增殖，但是在每一檢測時間點，P/F-N-0的細胞吸光度值均明顯低于含有纖維蛋白原的P/F-Ns，表明細胞在含有纖維蛋白原的材料上增殖更為明顯。且隨著細胞接種數量的增加，細胞在含有纖維蛋白原的P/F-Ns上接種后迅速出現明顯增殖，第1天時，P/F-N-2和P/F-N-3的細胞吸光度值就明顯增加，在第3天時，P/F-N-1的細胞吸光度值開始升高。7天的增殖實驗結果顯示，在含有纖維蛋白原的材料中， P/F-N-2上的細胞數量增加更為明顯，表明該濃度的纖維蛋白原更有利于細胞在納米纖維膜上的增殖。
3.6 韌帶組織相關蛋白基因表達結果
COAL1和COAL3是構成韌帶組織的主要細胞外基質，其DECORIN和BIGLYCAN能夠影響膠原纖維組裝[21]。如圖6所示，3天和7天時，除個別組外，在含有纖維蛋白原的P/F-Ns上細胞的COAL1、COAL3、BIGLYCAN、DECORIN基因表達均明顯高于P/F-N-0組。
圖6
Hig-82細胞在P/F-Ns上培養3 d和7 d時，各基因在P/F-Ns的表達情況
a. P/F-N-0；b. P/F-N-1；c. P/F-N-2；d. P/F-N-3。*：與P/F-N-0相比，
a. P/F-N-0; b. P/F-N-1; c. P/F-N-2; d. P/F-N-3. *: compared with P/F-N-0,
4 討論
前交叉韌帶連接著股骨下端和脛骨上端，在骨與骨之間傳遞能量以促進運動，對于維持膝關節內部的穩定性和正常的生命運動起著重要的作用。由于韌帶不可再生，一旦損傷，只能通過前交叉韌帶重建進行治療。傳統的用于韌帶修復的材料各有缺點，如材料獲取難、生物相容性差，因此在臨床應用中十分受限。而人工合成韌帶因材料來源簡單得到了廣泛的研究與應用。為了避免單一合成高分子材料生物相容性差以及天然高分子力學性能有限的缺點，本實驗中的人工韌帶是以PLCL和不同含量的纖維蛋白原為原料，通過靜電紡絲技術制備的納米纖維膜。
之前的研究表明親水性對于細胞在材料表面的黏附是相當重要的，材料的接觸角越小表明親水性越強，更有利于細胞在材料表面的黏附[22]。本研究中接觸角測試結果表明，P/F-Ns中纖維蛋白原的添加可顯著改變材料的親水性，并且隨著纖維蛋白原的增加，親水性逐漸增強。同時，細胞黏附實驗中纖維蛋白原的增加確實更利于細胞在材料上的黏附。
納米纖維的孔徑和孔隙率在支架的細胞培養過程中起著至關重要的作用，較大的孔徑和較高的孔隙率可以為細胞提供營養物質和代謝物質輸送的通道[23]。在本研究中，掃描電鏡測試結果顯示，添加了纖維蛋白原的P/F-Ns具有較高的孔隙率，并且隨著纖維蛋白原含量的增加，孔隙率逐漸增大，更有利于細胞在P/F-Ns上的生長和增殖。纖維蛋白原是一種天然高分子材料，具有良好的生物相容性，因此含纖維蛋白原材料中細胞的吸光度值高于未添加纖維蛋白原的材料；但隨著P/F-Ns中纖維蛋白原含量的增加，其力學性能逐漸下降，孔隙率逐漸增加，且纖維直徑逐漸降低，可能影響細胞的黏附與增殖[23]。因此，增殖實驗結果顯示細胞吸光度值隨纖維蛋白原含量增加呈先增加后降低的趨勢，P/F-N-2的細胞吸光度值最高。
Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原是構成韌帶組織的主要組分，DECORIN和BIGLYCAN可以調控纖維的形成和組裝[24]。因此，在人工韌帶修復過程中，細胞在P/F-Ns上的韌帶組織相關基因的表達會反映韌帶組織修復情況。韌帶修復相關基因表達結果顯示，3天和7天時，以P/F-N-0為對照，除個別組外，在P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3上細胞的COL1A1、COL1A3、BIGLYCAN和DECORIN的表達量整體均發生上調，表明含有纖維蛋白原的P/F-Ns能促進細胞韌帶組織相關基因的表達，有利于韌帶組織修復。
5 結論
與P/F-N-0相比，P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3具有更好的生物相容性，更有利于細胞在組織支架上的黏附、生長和增殖，更有利于韌帶修復，因此為其臨床應用[25-32]提供了安全性和功能性的理論依據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：郭佳花進行了實驗設計和論文撰寫，張羽和陳麗媛進行了數據分析和圖片潤色，徐麗明、莫秀梅和陳亮提出研究思路、指導實驗并修訂論文初稿。
引言
前交叉韌帶是膝關節內一種致密的結締組織，主要由膠原（Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和Ⅴ型膠原）、彈性蛋白、糖基質蛋白及蛋白聚糖組成，在維持膝關節穩定性和功能運動中起重要的作用[1]。然而，在頻繁的膝關節運動中，前交叉韌帶的生物力學性能極易受損。文獻研究表明，前交叉韌帶損傷發生率為35/100 000人，其中女性運動員的發生率是男性運動員的2～8倍[2-3]。僅僅在美國，每年將發生100 000～200 000韌帶損傷案例[4-5]。大部分韌帶損傷患者還伴隨患有關節炎和滑膜炎等，這將嚴重影響其正常生活，降低其生活質量。
由于韌帶的有限自我再生能力，前交叉韌帶修復在臨床醫療上面臨巨大的挑戰。目前韌帶修復的手術治療方法為前交叉韌帶重建術，使用自體移植物[6]、同種異體移植物、異種移植物或人工韌帶移植物等。自體韌帶移植物是目前臨床療效理想的替代物，但是存在增加供體部位發病率、損壞自身健康組織的風險。同種異體和異種移植物也會帶來一系列的免疫排斥反應，加劇患者的損傷情況和增加患者康復周期[7-8]。因此，人工韌帶移植物在臨床醫療應用中受到關注。
人工韌帶移植物材料包括合成聚合物高分子、天然高分子以及復合材料等。合成聚合物高分子一般認為具有良好的力學性能，但生物相容性不足，可能產生骨關節炎和滑膜炎等[9-14]，目前上市的產品包括Gore-Tex十字交叉韌帶、Stryker Dacrone韌帶和3M Kennedy LADTM韌帶增強器[15-20]。天然高分子材料包括膠原、蠶絲蛋白、纖維蛋白原、明膠及殼聚糖等，生物相容性優于合成聚合物，但通常不能提供足夠的力學支撐。由兩者構成的復合材料被認為將具有合適的力學性能和生物相容性，因此在韌帶修復的研究中獲得了越來越多的應用。
本研究中人工韌帶是由聚乳酸-己內酯［poly（lactic-acid-co-ε-caprolactone），PLCL］和豬源的纖維蛋白原按照不同比例混合經靜電紡絲技術制成的前交叉韌帶修復材料，其中的纖維蛋白原被認為具有改善材料親水性、賦予修復材料良好細胞相容性的作用，因此本課題主要對韌帶修復材料的理化性能（包括表面形貌、力學性能、親水性和纖維蛋白原含量）和細胞相容性（細胞黏附增殖、基因表達）進行研究，為開展動物體內韌帶修復實驗提供依據。
1 材料與儀器
Hig-82滑膜細胞（ATCC? CRL-1832TM）購買于美國ATCC公司，人工韌帶是由上海松力生物技術有限公司按課題組要求以不同比例的PLCL和纖維蛋白原為原料通過靜電紡絲技術制成的PLCL/纖維蛋白原納米纖維膜（PLCL/fibrinogen nanofibers，P/F-Ns），其中纖維蛋白原含量分別為0 mg/g（P/F-N-0）、70 mg/g（P/F-N-1）、140 mg/g（P/F-N-2）和180 mg/g（P/F-N-3）。
主要試劑有：硫酸銅、酒石酸鉀鈉、碘化鉀、氫氧化鈉（阿拉丁公司，中國），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、青鏈霉素混合液、CCK-8（Solarbio公司，中國），胎牛血清、Ham's F-12培養液（Gibco公司，美國），PBS（Hyclone公司，美國），RNeasy Plus Mini Kit、QuantiTect Reverse Transcription Kit（Qiagen，德國），TB Green Premix Ex Taq II（TAKARA，日本），ddH2O（生工生物工程公司，中國）。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
主要儀器有：SU8010 Scanning Electron Microscope（HITACHI公司，日本），OCA40接觸角測量儀（Dataphysics公司，德國），XPE205電子天平（梅特勒公司，美國），JXFSTRRP-CL冷凍研磨機（上海凈信公司，中國），H5K-S材料測試機（Hounsfield公司，英國），Spectramax M5酶標儀（Molecular Devices公司，美國），MJ-54A高壓滅菌鍋（上海施都凱公司，中國），BAO-80A干燥箱（上海施都凱公司，中國），MQT-60R恒溫搖床（上海旻泉公司，中國），BB150 CO2細胞培養箱（Thermo公司，美國），倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯公司，日本），TD5臺式低速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司，中國），Veriti基因擴增儀（Life Techonology公司，美國），Lightcycler480Ⅱ實時定量PCR儀（Roche公司，瑞士）。
2 實驗方法
2.1 表面形貌觀察
將P/F-Ns剪成0.5 cm×0.5 cm的大小，用雙面膠固定到載物臺上，在真空狀態下噴金2 min，然后在5 kV電壓下進行表面形貌的拍攝。每種樣品隨機選取四張3 000倍掃描電鏡圖，并根據式(1)通過圖像分析軟件Image J（National Institutes of Health，美國）計算孔隙率。每種樣品再隨機選取100根纖維并通過Image J測量纖維直徑。
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2.2 力學性能測試
人工合成韌帶必須具備一定的拉伸強度和應力-應變行為，在植入人體后才能發揮較好的替代作用，滿足患者日常生活的需求。因此本實驗擬借助H5K-S材料測試機研究不同P/F-Ns的力學性能。具體操作為：將4種P/F-Ns剪成1 cm × 5 cm的大小，用雙面膠分別將材料的兩端1 cm處固定在兩塊載玻片上，然后將兩端的載玻片固定到H5K-S材料測試機的夾具上，在室溫為20 ℃、相對濕度為60%的環境下，以10 mm/min的速度進行拉伸測試。應力、應變計算如下式：
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2.3 親疏水性測試
在測試樣品上滴加3 μL水滴，通過接觸角測量儀測量50 s內水滴在P/F-Ns上的角度變化并記錄。每種樣品測試三個平行樣。
2.4 纖維蛋白原含量測試
雙縮脲試劑的制備：取硫酸銅1.5 g、酒石酸鉀鈉6.0 g和碘化鉀5.0 g，加純化水500 mL使其溶解，邊攪拌邊加10%的氫氧化鈉溶液300 mL，純水稀釋至1 000 mL，混勻。以雙縮脲試劑為溶劑，配制1 mL濃度分別為2、4、6、8、10 mg/mL的BSA標準品溶液，以雙縮脲溶液為空白對照，每種濃度設置三個平行樣。
分別稱取質量約為50 mg的四種P/F-Ns樣品并剪碎。向剪碎的P/F-Ns中加入1 mL雙縮脲試劑，以65 Hz的頻率冷凍研磨勻漿60 s后置于–20 ℃冰箱降溫5 min。重復勻漿過程5次后，以4 000 r·min?1的速度離心10 min。取500 μL上清液，加入500 μL雙縮脲試劑并混勻作為測試樣品溶液，每種P/F-Ns設置三個平行樣。
以上各管均加入4 mL雙縮脲試劑，混勻，室溫放置30 min，在波長540 nm處測量吸光度。以BSA標準品的濃度為橫坐標，以其相應的吸光度值為縱坐標求得線性回歸方程。將測試樣品吸光度值代入標準曲線方程得到相應的纖維蛋白原濃度，然后計算樣品的纖維蛋白原含量。
2.5 細胞黏附實驗
使用熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（5，6-carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl ester，CFSE）標記Hig-82細胞，在不透光的P/F-Ns材料表面進行熒光標記細胞的觀察，具體步驟為：在細胞懸液中加入50 μmol·L?1的CFSE染液，混勻后置于37 ℃、含5% CO2細胞培養箱中孵育15 min后，加入預冷的PBS終止反應。隨后以1 000 r·min?1的速度離心5 min，棄上清，用PBS反復沖洗3次，離心（條件同上），棄去上清，加入含10%胎牛血清的完全培養液制備成CFSE標記的細胞懸液。將P/F-Ns剪成直徑為11 mm的圓片置于48孔板中，每種P/F-Ns分別設置三個平行樣。每孔加入1 mL完全培養液潤濕2 h，棄去培養液備用。P/F-Ns上每孔播種1×105個細胞，37 ℃培養箱分別培養4、24 h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞數量及形態。
同時，另取未用CFSE標記的Hig-82細胞同法接種P/F-Ns膜，在放入37 ℃、含5% CO2培養箱孵育4、24 h后，棄去細胞培養液，每孔加入500 μL完全培養液以及20 μL CCK-8溶液后，放入37 ℃、含5% CO2培養箱孵育4 h。孵育完成后，每孔分別吸取100 μL培養液于450 nm下測量吸光度。
2.6 細胞增殖實驗
P/F-Ns處理同2.5。每種P/F-Ns分別設置三個平行樣，P/F-Ns上每孔分別播種1×104、4×104個細胞，37 ℃培養箱分別培養1、3、5、7 d后，棄去細胞培養液，每孔加入500 μL完全培養液以及20 μL CCK-8，放入37 ℃、含5% CO2培養箱孵育4 h。孵育完成后，每孔吸取100 μL培養液在450 nm下測量吸光度。
2.7 韌帶組織相關蛋白基因表達測試
P/F-Ns處理同2.5。每種P/F-Ns分別設置三個平行樣，P/F-Ns上每孔播種4×104個Hig-82滑膜細胞，分別培養3 d和7 d。在P/F-Ns上用0.25%的Trypsin-EDTA消化細胞，用RNeasy Plus Mini Kit提取RNA，并使用QuantiTect Reverse Transcription Kit逆轉錄成為cDNA。20 μL實時定量熒光PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）反應體系為：10 μL的TB Green Premix Ex Taq II，上游引物和下游引物（濃度為10 μmol·L?1）各0.8 μL，2 μL的cDNA，6.4 μL的ddH2O。RT-qPCR擴增程序為：95 ℃預變性30 s，40個循環的擴增：95 ℃變性10 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s。每組三個復孔。以GAPDH為內參引物，以P/F-N-0為對照，進行相對定量。相關基因引物如表1所示。
表1
韌帶修復相關基因引物
Table1.
Genes primers related to ligament repair
2.8 統計學分析
所有數據均用SPSS 26.0軟件進行統計分析，數據形式為均值±標準差。本文各實驗組分別與對照組比較，采用t檢驗。所有的統計分析中，檢驗水準均為0.05。
3 結果
3.1 表面形貌觀察
如圖1所示，P/F-N-0表面致密，幾乎未見孔隙。P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3表面呈網狀結構，P/F-Ns的孔隙率隨纖維蛋白原含量增加而逐漸增大。其中P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3的孔隙率分別為：（15.42 ± 1.31）%、（28.53 ± 1.70）%、（33.85 ± 1.12）%。P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3纖維直徑分別為（603.92 ± 158.61）、（413.96 ± 187.02）、（244.54 ± 42.81）nm，表明隨著纖維蛋白原含量的增加，P/F-Ns的纖維直徑逐漸減小。
圖1
P/F-Ns的表觀形貌圖（3 000 ×）
Figure1.
The surface morphology of P/F-Ns (3 000 ×)
3.2 力學性能分析
如圖2所示，P/F-N-0、P/F-N-1、P/F-N-2與P/F-N-3斷裂時的應變分別為：（122.58 ± 0.18）%、（140.36 ± 0.21）%、（75.11 ± 3.13）%、（68.74 ± 0.11）%，斷裂時的拉伸強度分別為（35.66 ± 0.32）、（12.24 ± 0.12）、（8.02 ± 0.54）、（7.25 ± 0.22）MPa。因此，P/F-N-0、P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3的斷裂強度依次降低。上述實驗現象表明未添加纖維蛋白原的P/F-N-0具有較好的力學性能，而纖維蛋白原的增加會降低P/F-Ns的力學性能。這是因為由無規則的納米纖維堆積而成的靜電紡納米纖維膜的力學性能不僅與材料本身性能有關，還與纖維膜的結構（如纖維孔隙、纖維直徑、纖維的長度和纖維直徑的粘連程度）有關。由前文掃描電鏡結果可知，P/F-N-0表面致密，幾乎無孔隙，并且納米纖維抱團纏繞在一起，不容易產生滑脫。隨著纖維蛋白原含量增加，纖維直徑逐漸減小，孔隙逐漸增大，膜變得較為松散，纖維之間的連接和纏繞較少，摩擦力也變小，在拉力的作用下極易從納米纖維膜中抽離出來，最終斷裂。
圖2
P/F-Ns的力學性能結果
Figure2.
The mechanical properties results of P/F-Ns
3.3 親疏水性分析
在50 s內，P/F-N-0的接觸角大小基本不變（74.32～71.51°），而P/F-N-1的接觸角從75.21°減小到63.33°，P/F-N-2的接觸角從72.53°減小到41.21°，P/F-N-3的接觸角從70.65°減小到33.23°。如圖3所示，當水滴接觸30 s后，P/F-N-0、P/F-N-1、P/F-N-2、P/F-N-3的接觸角分別為：（72.75 ± 1.26）°、（64.67 ± 1.16）°、（60.35 ± 4.24）°、（49.33 ± 3.51）°。與P/F-N-0相比，含有纖維蛋白原的P/F-Ns的接觸角明顯減小，且隨著纖維蛋白原的增加接觸角逐漸減小。
圖3
P/F-Ns接觸角
**：與P/F-N-0相比，
**: compared with P/F-N-0,
3.4 纖維蛋白原含量
BSA定量標準曲線為Y = 0.048 03 X + 0.003 52，其中R2 = 0.999 34。通過計算得出P/F-N-1纖維蛋白原含量為（67.81 ± 1.88）mg/g，P/F-N-2纖維蛋白原含量為（140.23 ± 3.25）mg/g，P/F-N-3纖維蛋白原含量為（151.33 ± 13.46）mg/g。
3.5 黏附和增殖結果
如圖4左圖所示，當Hig-82細胞與P/F-Ns共培養4 h時，在P/F-Ns上的細胞數量較少，前三組幾乎無差別，P/F-N-3上的細胞數最多。當Hig-82細胞與P/F-Ns共培養24 h時，各組熒光強度均增強，表明黏附在P/F-Ns上的細胞數量增多。其中黏附在P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3上的細胞數量較多，且在P/F-N-2上的部分細胞形態呈梭形。如圖4右圖所示，當Hig-82細胞與P/F-Ns共培養4 h時，細胞吸光度值較低。當Hig-82細胞與P/F-Ns共培養24 h時，P/F-Ns上的細胞吸光度值均有所增高，P/F-N-0與其他三組的吸光度值具有顯著差異（P < 0.01）。其中P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3上的細胞吸光度值較高，表明添加纖維蛋白原的P/F-Ns更有利于細胞的黏附。
圖4
CFSE染色的Hig-82細胞在P/F-Ns上的黏附
**：與P/F-N-0相比，
**: Compared with P/F-N-0,
如圖5a所示，當Hig-82細胞接種量為1 × 104個時，在7天的培養過程中P/F-N-0的細胞吸光度值均未表現出明顯的增加，表明細胞未明顯增殖；而在含有纖維蛋白原的材料上，雖然在3天時細胞吸光度值未明顯變化，但從第5天開始，P/F-N-2和P/F-N-3的細胞吸光度值均明顯增加；在第7天時，P/F-N-1的細胞吸光度值也開始明顯增加，P/F-N-2和P/F-N-3的細胞吸光度值進一步增加，表明P/F-Ns中含有的纖維蛋白原有促進細胞增殖的作用。
圖5
Hig-82滑膜細胞在P/F-Ns上的增殖
a. 接種密度為1×104個；b. 接種密度為4×104個。*：與P/F-N-0相比，
a. inoculation densities: 1×104; b. inoculation densities: 4×104. *: compared with P/F-N-0,
當Hig-82細胞接種量增加為4×104個時，如圖5b所示，雖然P/F-N-0的細胞吸光度值在7天的培養過程中逐漸升高，表明細胞有增殖，但是在每一檢測時間點，P/F-N-0的細胞吸光度值均明顯低于含有纖維蛋白原的P/F-Ns，表明細胞在含有纖維蛋白原的材料上增殖更為明顯。且隨著細胞接種數量的增加，細胞在含有纖維蛋白原的P/F-Ns上接種后迅速出現明顯增殖，第1天時，P/F-N-2和P/F-N-3的細胞吸光度值就明顯增加，在第3天時，P/F-N-1的細胞吸光度值開始升高。7天的增殖實驗結果顯示，在含有纖維蛋白原的材料中， P/F-N-2上的細胞數量增加更為明顯，表明該濃度的纖維蛋白原更有利于細胞在納米纖維膜上的增殖。
3.6 韌帶組織相關蛋白基因表達結果
COAL1和COAL3是構成韌帶組織的主要細胞外基質，其DECORIN和BIGLYCAN能夠影響膠原纖維組裝[21]。如圖6所示，3天和7天時，除個別組外，在含有纖維蛋白原的P/F-Ns上細胞的COAL1、COAL3、BIGLYCAN、DECORIN基因表達均明顯高于P/F-N-0組。
圖6
Hig-82細胞在P/F-Ns上培養3 d和7 d時，各基因在P/F-Ns的表達情況
a. P/F-N-0；b. P/F-N-1；c. P/F-N-2；d. P/F-N-3。*：與P/F-N-0相比，
a. P/F-N-0; b. P/F-N-1; c. P/F-N-2; d. P/F-N-3. *: compared with P/F-N-0,
4 討論
前交叉韌帶連接著股骨下端和脛骨上端，在骨與骨之間傳遞能量以促進運動，對于維持膝關節內部的穩定性和正常的生命運動起著重要的作用。由于韌帶不可再生，一旦損傷，只能通過前交叉韌帶重建進行治療。傳統的用于韌帶修復的材料各有缺點，如材料獲取難、生物相容性差，因此在臨床應用中十分受限。而人工合成韌帶因材料來源簡單得到了廣泛的研究與應用。為了避免單一合成高分子材料生物相容性差以及天然高分子力學性能有限的缺點，本實驗中的人工韌帶是以PLCL和不同含量的纖維蛋白原為原料，通過靜電紡絲技術制備的納米纖維膜。
之前的研究表明親水性對于細胞在材料表面的黏附是相當重要的，材料的接觸角越小表明親水性越強，更有利于細胞在材料表面的黏附[22]。本研究中接觸角測試結果表明，P/F-Ns中纖維蛋白原的添加可顯著改變材料的親水性，并且隨著纖維蛋白原的增加，親水性逐漸增強。同時，細胞黏附實驗中纖維蛋白原的增加確實更利于細胞在材料上的黏附。
納米纖維的孔徑和孔隙率在支架的細胞培養過程中起著至關重要的作用，較大的孔徑和較高的孔隙率可以為細胞提供營養物質和代謝物質輸送的通道[23]。在本研究中，掃描電鏡測試結果顯示，添加了纖維蛋白原的P/F-Ns具有較高的孔隙率，并且隨著纖維蛋白原含量的增加，孔隙率逐漸增大，更有利于細胞在P/F-Ns上的生長和增殖。纖維蛋白原是一種天然高分子材料，具有良好的生物相容性，因此含纖維蛋白原材料中細胞的吸光度值高于未添加纖維蛋白原的材料；但隨著P/F-Ns中纖維蛋白原含量的增加，其力學性能逐漸下降，孔隙率逐漸增加，且纖維直徑逐漸降低，可能影響細胞的黏附與增殖[23]。因此，增殖實驗結果顯示細胞吸光度值隨纖維蛋白原含量增加呈先增加后降低的趨勢，P/F-N-2的細胞吸光度值最高。
Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原是構成韌帶組織的主要組分，DECORIN和BIGLYCAN可以調控纖維的形成和組裝[24]。因此，在人工韌帶修復過程中，細胞在P/F-Ns上的韌帶組織相關基因的表達會反映韌帶組織修復情況。韌帶修復相關基因表達結果顯示，3天和7天時，以P/F-N-0為對照，除個別組外，在P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3上細胞的COL1A1、COL1A3、BIGLYCAN和DECORIN的表達量整體均發生上調，表明含有纖維蛋白原的P/F-Ns能促進細胞韌帶組織相關基因的表達，有利于韌帶組織修復。
5 結論
與P/F-N-0相比，P/F-N-1、P/F-N-2和P/F-N-3具有更好的生物相容性，更有利于細胞在組織支架上的黏附、生長和增殖，更有利于韌帶修復，因此為其臨床應用[25-32]提供了安全性和功能性的理論依據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：郭佳花進行了實驗設計和論文撰寫，張羽和陳麗媛進行了數據分析和圖片潤色，徐麗明、莫秀梅和陳亮提出研究思路、指導實驗并修訂論文初稿。
