為探究聚天冬氨酸－多巴胺接枝聚合物（PAsp-g-DA）螯合三價鐵離子（Fe3+）用于磁共振可視化光熱治療的潛力，本實驗通過聚琥珀酰亞胺（PSI）氨解反應獲得共價接枝多巴胺和聚乙二醇的聚天冬氨酸接枝共聚物（PAsp-g-DA/PEG），然后將其與Fe3+在水溶液中螯合，通過808 nm波長光熱轉換、體外弛豫效率和體內磁共振成像檢測其光熱轉換和磁共振對比增強效果。結果顯示，聚合物鐵配合物具有較好的近紅外光吸收及光熱轉換能力，同時具有良好的磁共振增強效果，在不同場強下具有良好的縱向弛豫效能。綜上所述，本研究提供了一種新型的磁共振可視化光熱治療劑，為相關領域的研究提供了新的研究思路。
引用本文： 杜亮, 盧福麟, 吳昌強. 聚天冬氨酸－多巴胺接枝聚合物－鐵（Ⅲ）配合物用于磁共振可視化光熱治療劑. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(2): 398-404. doi: 10.7507/1001-5515.202109033 復制
引言
癌癥是人類普遍關注的一種疾病，其治療方法主要是手術、放療和化療，但因副作用大導致總體治療效果并不理想[1-2]。光熱療法是一種新興的癌癥治療方法，腫瘤組織攝取光熱轉換劑將激光能量轉換為熱能，從而殺死癌細胞，實現癌癥微創治療[3]。但是，光熱轉換劑是否被腫瘤組織有效攝取及其在腫瘤組織中的富集時間和代謝情況都是影響光熱治療效果和制定治療計劃的關鍵參數。因此，急需一種無創的醫學影像手段實時觀察治療劑在腫瘤組織的分布與代謝。磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）因其無電離輻射以及軟組織對比度和圖像分辨率高而廣泛應用于臨床醫學影像診斷領域。磁共振成像造影劑可改變局部組織磁共振成像信號，被廣泛用于細胞、基因或藥物載體的磁共振成像標記和生物體內可視化研究[4-7]。本文旨在設計和制備一種具有磁共振對比增強效果的光熱轉換劑——磁共振可視化的光熱治療劑。大量文獻報道[8-10]，聚多巴胺具有較好的光熱轉換效率，被廣泛用于光熱治療研究，同時聚多巴胺可與順磁性金屬離子螯合用于磁共振造影劑。但是多巴胺（dopamine，DA）的聚合物機制較復雜，較難實現可控聚合，且多巴胺聚合物成分復雜，很難實現轉化應用，通常獲得粒徑較大的聚多巴胺微球。聚天冬氨酸是一種類似多肽（具有良好生物相容性）的高分子材料，在體內具有可降解、毒副作用小等特點。將多巴胺接枝修飾到聚天冬氨酸上可獲得類似聚多巴胺的結構和功能。另外，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）具有良好生物相容性，可在生物體內形成水合保護層，阻止蛋白吸附，在材料表面修飾PEG可提高其在體內的穩定性。因此，本文以聚天冬氨酸為骨架，部分接枝多巴胺和聚乙二醇，并螯合順磁性三價鐵離子獲得聚天冬氨酸－多巴胺接枝聚合物－鐵（Ⅲ）配合物，通過研究其弛豫效能、近紅外光吸收、光熱轉換及動物體內磁共振成像效果等性能，探討其在磁共振可視化光熱治療中的應用潛力。
1 材料與方法
1.1 聚天冬氨酸－多巴胺/聚乙二醇接枝聚合物的合成
稱取0.5 g聚琥珀酰亞胺（poly succinimide，PSI，分子量7 000 Da）和0.5 g端氨基聚乙二醇（amine-terminated polyethylene glycol，PEG-NH2，分子量550 Da）置于反應瓶中，加入二甲基亞砜充分溶解。再稱取0.25 g多巴胺鹽酸鹽，用1 mL二甲基亞砜和0.2 mL三乙胺溶解后，在氬氣保護下一并加入到反應瓶中。在80 ℃下攪拌反應24 h，加入0.2 g氫氧化鈉和3 mL水，60 ℃下繼續反應24 h。用0.1 mol/L鹽酸調節pH至6.0，將反應溶液置于透析袋（截留分子量：3 500 Da）中，透析 24 h。收集透析袋中溶液，凍干得到聚天冬氨酸－多巴胺/聚乙二醇接枝聚合物（polyaspartic acid grafted dopamine and polyethylene glycol，PAsp-g-DA/PEG）。
1.2 聚天冬氨酸－多巴胺/聚乙二醇接枝聚合物－鐵（Ⅲ）配合物制備
將100 mg PAsp-g-DA/PEG溶解在100 mL超純水中，將0.507 mL的FeCl3溶液（Fe：85.5 mmol/L）加入到PAsp-g-DA/PEG溶液中，用0.5 mmol/L的NaOH調節pH至7.0，凍干后用少量水溶解，透析48 h，得到聚天冬氨酸－多巴胺/聚乙二醇接枝聚合物－鐵（Ⅲ）配合物（polyaspartic acid grafted dopamine，Fe3+ and polyethylene glycol，PAsp-DAFe/PEG）溶液。取一定量的PAsp-DAFe/PEG溶液，經濃硝酸分解后用超純水稀釋至標樣濃度范圍，通過原子吸收光譜檢測溶液中鐵濃度。
1.3 主要儀器和設備
0.5 T核磁共振造影劑弛豫率分析儀（PQ001-20-015V，上海紐邁電子科技有限公司，中國），1.41 T小核磁分析儀（minispec mq60，布魯克（北京）科技有限公司，中國），3.0 T磁共振成像系統（Discovery MR750，GE公司，美國），大鼠專用線圈（Animalcoil WK601，Magtron，美國)，400 MHz高分辨魔角旋轉探頭（BRUKER 4 mm DUI，布魯克拜厄斯賓有限公司，瑞士），紫外可見分光光度計（UV-1900i，日本島津儀器有限公司），光纖耦合激光系統（VCLHLGD0024991，北京宏藍光電科技有限公司，中國），紅外熱像儀（Fotric226s，青島科創貿易有限公司，中國），呼吸麻醉機（MatrxVME2，Midmark，美國)，皖儀原子吸收光譜儀（WYS2000，安徽皖儀科技股份有限公司，中國）。
1.4 實驗動物
實驗動物為健康SD大鼠3只，無疾病史，年齡4～8周，體重110～150 g，均購于川北醫學院實驗動物中心。動物實驗許可證編號：SYXK（川）2018-076。用呼吸麻醉機對大鼠進行異氟烷吸入性麻醉，將大鼠尾巴清洗干凈，置于大鼠專用線圈中，經尾靜脈注射PAsp-DAFe/PEG，在GE3.0 T磁共振成像系統中對大鼠進行核磁共振掃描。本項目實驗研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。
1.5 弛豫效能測試
檸檬酸鐵溶液經HEPES緩沖溶液（100 mmol/L，pH=7.4）稀釋至鐵濃度0.10、0.19、0.30、0.40、0.51 mmol/L，PAsp-DAFe/PEG溶液經磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液，10 mmol/L，pH=7.4）稀釋至鐵濃度0.12、0.24、0.48、0.97、1.94 mmol/L，置于測試瓶中，室溫下(25 ℃)分別采用0.5 T弛豫率分析儀、1.41 T小核磁分析儀、臨床3.0 T磁共振成像系統測定T1弛豫效能（r1）和T2弛豫效能（r2）。
1.6 紫外－可見光吸收光譜
分別取少量PAsp-g-DA/PEG、PAsp-DAFe/PEG溶液于比色皿中，加入PBS緩沖液，稀釋到0.5 mg/mL（聚合物濃度），以PBS溶液為對照，進行紫外吸收光譜測定，平行測定兩次取其一。
1.7 光熱轉換
分別取PBS、PAsp-g-DA/PEG溶液及不同多巴胺濃度的PAsp-DAFe/PEG溶液各1 mL于EP管中，用808 nm近紅外激光（光功率密度：5 W/cm2）照射每個EP管中的溶液，持續10 min，并用紅外熱像儀記錄每1 min溶液溫度變化。選取多巴胺濃度1.3 mmol/L的PAsp-DAFe/PEG溶液予以近紅外光照射10 min，然后停止照射15 min，持續循環4次，并在該過程中記錄每1 min溫度變化。
1.8 大鼠體內磁共振增強成像
整個掃描過程均使用呼吸麻醉機給予大鼠異氟烷持續吸入性麻醉（麻醉濃度1%～2%，氧流量800～1 500 mL/min）。將麻醉下的大鼠放入GE3.0 T磁共振大鼠專用線圈中，俯臥位，頭先進，行平掃和增強掃描。平掃和增強掃描均采用如下序列和參數：T1加權成像（T1-weighted imaging，T1WI），重復時間 = 6 ms，回波時間 = 3 ms，層厚 = 0.8 mm，視野 = 120 mm × 120 mm，激勵次數 = 2～3。在完成冠狀位平掃后尾靜脈注射PAsp-DAFe/PEG（Fe：2.5 mg/kg劑量）以0.1 mL/s的速率推入，進行增強掃描，序列同平掃，于不同時間點對大鼠體部行磁共振掃描。在此基礎上測量在不同時間點肝臟、腎臟同一層面的信號強度變化，分析該造影劑在大鼠體內的增強效果及代謝情況。
2 結 果
2.1 PAsp-g-DA/PEG合成與表征
本文以PSI為原料，通過其氨解反應獲得了共價接枝多巴胺和聚乙二醇的聚天冬氨酸接枝聚合物PAsp-g-DA/PEG。實驗中對原料和產物進行了1H核磁譜表征，結果如圖1所示。PAsp-g-DA/PEG譜圖中增加了多巴胺苯環特征峰（峰3、4、5）和聚乙二醇特征峰（峰6、7），證明多巴胺和聚乙二醇成功共價接枝到聚天冬氨酸側鏈上。通過對聚天冬氨酸、多巴胺和聚乙二醇特征峰進行積分，計算得本批次產物的多巴胺接枝率約為30%，聚乙二醇接枝率約為15%。多巴胺和聚乙二醇的接枝率可通過調節反應投料比以及反應溫度進行有效控制。
圖1
PSI（DMSO）和PAsp-g-DA/PEG（D2O）的1H核磁譜圖及特征峰標注
Figure1.
1H NMR spectra and characteristic peak labeling of PSI (DMSO) and PAsp-g-DA/PEG (D2O)
2.2 PAsp-DAFe/PEG弛豫效能的表征
實驗首先測試了不同濃度樣品的縱向和橫向弛豫時間（Ti，i = 1或2），再將其倒數（1/Ti）與鐵離子濃度（CFe）做曲線，曲線的斜率即是造影劑的縱向和橫向弛豫效能（ri，i = 1或2）。實驗中分別在0.5 T弛豫率分析儀、1.41 T小核磁分析儀和3.0 T磁共振成像系統下測試了PAsp-DAFe/PEG的r1和r2，并以檸檬酸鐵作為對照（見表1）。結果顯示，檸檬酸鐵溶液在0.5～3.0 T下弛豫效能較低。根據文獻推測檸檬酸鐵可能難以應用于臨床磁共振增強成像[11]。相同磁場強度下PAsp-DAFe/PEG的r1明顯高于檸檬酸鐵，并且r2/r1更低，是一種良好的T1磁共振造影劑。
表1
樣品的T1、T2弛豫效能（r1、r2單位：Fe mmol?1·L· s?1）
Table1.
T1 and T2 relaxation efficiency of samples (r1 and r2 units: Fe mmol?1·L· s?1)
2.3 紫外－可見光吸收光譜
分別將少量PAsp-g-DA/PEG和PAsp-DAFe/PEG均勻分散在PBS溶液中，進行吸光度測試，研究其紫外－可見光吸收性能。結果如圖2所示。圖2中很明顯地觀察到兩種物質在波長220～900 nm間有典型的吸收帶，其中300～900 nm間PAsp-DAFe/PEG的吸收值始終高于PAsp-g-DA/PEG，而PAsp-g-DA/PEG在300 nm左右表現出較好的吸收峰，并且展示了兩者在近紅外光波長區域中的吸收性能，結果顯示，PAsp-DAFe/PEG具有更加明顯的近紅外光吸收。
圖2
紫外－可見光吸收光譜圖
Figure2.
Ultraviolet -visible absorption spectra
2.4 光熱轉換
與同類研究[12]相似，本文以波長808 nm、光功率密度為5 W/cm2的近紅外激光作為光源，考察不同濃度PAsp-DAFe/PEG水溶液在近紅外激光照射下溫度隨時間的變化。溫度變化曲線如圖3a所示，DA濃度為0.26 mmol/L的PAsp-DAFe/PEG溶液10 min內溫度從26 ℃升至38.5 ℃。隨著樣品濃度增加，溶液的溫度也隨之提高，當DA濃度達到1.30 mmol/L時溶液10 min內溫度上升至57.6 ℃，超過了癌細胞的耐受溫度（50 ℃）[13]。在相同條件下對照組PAsp-g-DA/PEG溫度僅升高至32 ℃，PBS水溶液溫度僅升高至29.8 ℃，說明PAsp-g-DA/PEG與Fe3+螯合后大大增加了聚合物的光熱轉換能力。圖3b為PAsp-DAFe/PEG（DA：1.30 mmol/L）水溶液反復經過近紅外光照射（10 min）然后停止照射（15 min）持續循環4次的溫度隨時間變化的曲線，結果顯示每次循環曲線基本一致且溫度均能達到第一次照射時所達到的最高溫度，說明PAsp-DAFe/PEG具有良好的光熱穩定性。圖3c為808 nm近紅外激光照射10 min的熱成像圖，直觀地顯示了樣品在808 nm近紅外激光照射下溫度的變化和分布。
圖3
PAsp-DAFe/PEG光熱轉換及穩定性
a. 光熱轉換示意圖；b. 光熱穩定性示意圖；c. 熱成像圖。不同濃度的PAsp-DAFe/PEG：① DA：0.26 mmol/L；② DA：0.65 mmol/L；③ DA：1.30 mmol/L
Figure3. Photothermal conversion and stability of PAsp-DAFe/PEGa. schematic diagram of photothermal conversion; b. schematic diagram of photothermal stability; c. diagram of thermal image. Different concentrations of PAsp-DAFe/PEG: ① DA: 0.26 mmol/L; ② DA: 0.65 mmol/L; ③ DA: 1.30 mmol/L
2.5 大鼠體內磁共振增強成像
圖4為尾靜脈注射PAsp-DAFe/PEG前和注射后1、10、20、30、1 440、2 880 min行磁共振掃描采集的腎臟和肝臟動態增強圖像。PAsp-DAFe/PEG可通過血液循環分散在大鼠體內，并可能富集于某些器官，本研究經過信號強度對比分析，檢測了組織富集及信號改變情況。圖4a中可觀察到大鼠在增強前肝臟和腎臟呈低信號，在造影劑注射完成后直接行磁共振掃描，肝腎的亮度均高于增強前的水平。圖4b可觀察到肝臟信號值在1 min達到最高，在1 min到24 h的信號強度逐漸降低，但始終高于增強前腎臟信號強度，直到48 h后信號強度恢復到增強前水平；腎臟信號值在1 min達到最高，然后信號強度逐漸降低，在48 h其信號強度降至增強前水平。結果說明PAsp-DAFe/PEG具有較好的體內增強成像效果，可通過腎臟較快排泄，少量殘留體內經過48 h逐漸代謝完全。
圖4
大鼠肝、腎磁共振成像和信號強度變化
a. 3.0 T磁共振T1WI掃描大鼠肝、腎圖像；b. 大鼠肝、腎信號強度變化
Figure4. Liver and kidney magnetic resonance imaging and signal intensity changes in ratsa. T1 weighted magnetic resonance imaging of liver and kidney in rats at 3.0 T; b. changes of signal intensity of liver and kidney in rats
3 討論
本文設計和制備了一種以聚天冬氨酸為骨架，接枝修飾多巴胺和聚乙二醇的接枝聚合物配體PAsp-g-DA/PEG，并螯合順磁性Fe3+，研究其作為磁共振可視化光熱轉換劑的潛力[14]。磁共振可視化的光熱治療劑應同時具有良好的磁共振成像增強效果和較高的光熱轉換效率。藥物通過靜脈注射進入體內后，一方面，具有良好的磁共振成像增強效果才能有效示蹤藥物體內分布，通過磁共振信號變化有效觀察在病變組織的聚集與代謝情況；另一方面，具有較高的光熱轉換效率，才能保證將近紅外激光轉換為足夠的熱量殺死腫瘤細胞。磁共振成像中，弛豫效能是評價造影劑產生對比增強效果的重要指標[15-16]，本文選擇臨床常用磁場（0.5 T、1.5 T和3.0 T）測試了PAsp-DAFe/PEG的T1和T2弛豫效能（r1和r2）。結果顯示PAsp-DAFe/PEG的r1在2~3 mmol-1·L·s?1，明顯高于Fe3+（實驗中以檸檬酸鐵溶液為對照），接近于臨床用釓劑[17]，具有良好的磁共振T1造影增強效果。在臨床3.0 T磁共振的大鼠成像實驗中，通過尾靜脈注射PAsp-DAFe/PEG，大鼠肝臟和腎臟T1加權圖像呈現出良好的對比增強效果，磁共振信號明顯增高，隨后逐漸降低，48 h后肝腎器官的信號值恢復到正常水平，造影劑基本被代謝掉。光熱轉換方面，實驗測試了PAsp-DAFe/PEG紫外－可見光吸收波譜和808 nm近紅外激光下的光熱效應。紫外－可見光吸收波譜顯示，PAsp-DAFe/PEG在280 nm和600 nm波長處出現兩個較大吸收峰。在近紅外光區域PAsp-DAFe/PEG比PAsp-g-DA/PEG表現出更強的吸收。從電子轉移角度分析，Fe3+是一種高氧化態的過渡金屬離子，具有未充滿的d軌道，可以作為電子接受體；聚合物中含有多巴胺分子，多巴胺分子結構中含有很多鄰苯二酚結構（可氧化性配體），可以作為電子給予體。因此，Fe3+與鄰苯二酚結構發生氧化還原，隨Fe3+還原能力增強，電荷轉移吸收帶向長波長移動。Fe3+具強氧化能力，顏色加深，螯合鐵離子后的共聚物在近紅外光區域的吸光度更高[18]。近紅外激光具有一定的生物組織穿透效果[19]，近紅外光熱治療劑更具發展優勢。從808 nm近紅外激光下的光熱曲線可以看出，當DA濃度為1.3 mmol/L時PAsp-DAFe/PEG溶液在10 min內溫度可升至57.6 ℃，產生較好的加熱效果。在腫瘤熱療過程中，腫瘤組織溫度達到41～46 ℃即會刺激機體產生免疫應答，對腫瘤細胞發揮非特異性的殺傷作用[20-22]。因此，PAsp-DAFe/PEG既是一種良好的磁共振造影劑，也是具有很大潛力的近紅外光熱治療劑，有望在磁共振可視化的光熱治療中發揮巨大作用。
Fe3+為一種順磁性金屬離子，是生物體內的一種必需元素，生物安全性高于臨床中常用的釓造影劑，但弛豫效率較低[23]，提高其在磁共振增強成像中的組織對比度是一項重大的挑戰。多巴胺上的鄰苯二酚結構對Fe3+具有較高的螯合能力，該特性已在生物體和仿生系統中得到了廣泛應用[24-25]。聚多巴胺與生物體內黑色素相似，具有較好的光熱轉換效果，近年來廣泛用于光熱轉換劑研究。聚天冬氨酸是一種生物降解性好、安全無毒的氨基酸聚合物，被廣泛用于環境、衛生、農業、日化等領域，是一種較理想的藥物載體。將多巴胺接枝到聚天冬氨酸上同樣可以獲得類似聚多巴胺結構，聚合物上的多價鄰苯二酚基團可有效螯合Fe3+同時獲得磁共振造影和光熱轉換效果。聚天冬氨酸側鏈上含有大量羧基，未接枝多巴胺的游離羧基可進一步修飾活性分子，實現聚合物的多功能化。本文修飾了具有良好生物相容性的聚乙二醇，以增加其在血液循環中的穩定性[26]。聚天冬氨酸側鏈的羧基可與帶氨基的分子通過縮合方式化合鏈接，但往往反應活性較低，不能獲得較高的接枝率。本文選擇了聚天冬氨酸的前體聚琥珀酰亞胺為原料，與多巴胺、端氨基聚乙二醇氨解，一步獲得接枝多巴胺和聚乙二醇的聚天冬氨酸接枝聚合物。實驗結果顯示該制備方法接枝效率高且接枝率可通過投料比調節。
本研究證實了該配合物在磁共振可視化的條件下進行光熱治療的潛力，但808 nm波長的近紅外激光能穿透的組織深度有限，可以考慮應用于較淺部位的癌細胞或腫瘤組織的光熱治療。例如食管癌，可以考慮制作近紅外激光－內鏡裝置，找到食管癌所在的位置后經近紅外激光照射治療或者通過微創手術對處于較深部位的腫瘤組織實施近紅外激光照射治療。
綜上所述，本研究設計制備的PAsp-DAFe/PEG具有較好的磁共振增強成像效果和良好的近紅外光熱轉換能力。該聚合物各成分均為生物相容性材料，具有較大的臨床轉化潛力，可為磁共振可視化光熱治療腫瘤提供新的方法及思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：杜亮參與實驗設計、數據收集與分析及論文寫作，盧福麟參與數據收集和論文修改，吳昌強參與實驗設計與指導工作。
倫理聲明：本研究通過了川北醫學院倫理委員會的審批（批文編號：[2021]79號）。
引言
癌癥是人類普遍關注的一種疾病，其治療方法主要是手術、放療和化療，但因副作用大導致總體治療效果并不理想[1-2]。光熱療法是一種新興的癌癥治療方法，腫瘤組織攝取光熱轉換劑將激光能量轉換為熱能，從而殺死癌細胞，實現癌癥微創治療[3]。但是，光熱轉換劑是否被腫瘤組織有效攝取及其在腫瘤組織中的富集時間和代謝情況都是影響光熱治療效果和制定治療計劃的關鍵參數。因此，急需一種無創的醫學影像手段實時觀察治療劑在腫瘤組織的分布與代謝。磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）因其無電離輻射以及軟組織對比度和圖像分辨率高而廣泛應用于臨床醫學影像診斷領域。磁共振成像造影劑可改變局部組織磁共振成像信號，被廣泛用于細胞、基因或藥物載體的磁共振成像標記和生物體內可視化研究[4-7]。本文旨在設計和制備一種具有磁共振對比增強效果的光熱轉換劑——磁共振可視化的光熱治療劑。大量文獻報道[8-10]，聚多巴胺具有較好的光熱轉換效率，被廣泛用于光熱治療研究，同時聚多巴胺可與順磁性金屬離子螯合用于磁共振造影劑。但是多巴胺（dopamine，DA）的聚合物機制較復雜，較難實現可控聚合，且多巴胺聚合物成分復雜，很難實現轉化應用，通常獲得粒徑較大的聚多巴胺微球。聚天冬氨酸是一種類似多肽（具有良好生物相容性）的高分子材料，在體內具有可降解、毒副作用小等特點。將多巴胺接枝修飾到聚天冬氨酸上可獲得類似聚多巴胺的結構和功能。另外，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）具有良好生物相容性，可在生物體內形成水合保護層，阻止蛋白吸附，在材料表面修飾PEG可提高其在體內的穩定性。因此，本文以聚天冬氨酸為骨架，部分接枝多巴胺和聚乙二醇，并螯合順磁性三價鐵離子獲得聚天冬氨酸－多巴胺接枝聚合物－鐵（Ⅲ）配合物，通過研究其弛豫效能、近紅外光吸收、光熱轉換及動物體內磁共振成像效果等性能，探討其在磁共振可視化光熱治療中的應用潛力。
1 材料與方法
1.1 聚天冬氨酸－多巴胺/聚乙二醇接枝聚合物的合成
稱取0.5 g聚琥珀酰亞胺（poly succinimide，PSI，分子量7 000 Da）和0.5 g端氨基聚乙二醇（amine-terminated polyethylene glycol，PEG-NH2，分子量550 Da）置于反應瓶中，加入二甲基亞砜充分溶解。再稱取0.25 g多巴胺鹽酸鹽，用1 mL二甲基亞砜和0.2 mL三乙胺溶解后，在氬氣保護下一并加入到反應瓶中。在80 ℃下攪拌反應24 h，加入0.2 g氫氧化鈉和3 mL水，60 ℃下繼續反應24 h。用0.1 mol/L鹽酸調節pH至6.0，將反應溶液置于透析袋（截留分子量：3 500 Da）中，透析 24 h。收集透析袋中溶液，凍干得到聚天冬氨酸－多巴胺/聚乙二醇接枝聚合物（polyaspartic acid grafted dopamine and polyethylene glycol，PAsp-g-DA/PEG）。
1.2 聚天冬氨酸－多巴胺/聚乙二醇接枝聚合物－鐵（Ⅲ）配合物制備
將100 mg PAsp-g-DA/PEG溶解在100 mL超純水中，將0.507 mL的FeCl3溶液（Fe：85.5 mmol/L）加入到PAsp-g-DA/PEG溶液中，用0.5 mmol/L的NaOH調節pH至7.0，凍干后用少量水溶解，透析48 h，得到聚天冬氨酸－多巴胺/聚乙二醇接枝聚合物－鐵（Ⅲ）配合物（polyaspartic acid grafted dopamine，Fe3+ and polyethylene glycol，PAsp-DAFe/PEG）溶液。取一定量的PAsp-DAFe/PEG溶液，經濃硝酸分解后用超純水稀釋至標樣濃度范圍，通過原子吸收光譜檢測溶液中鐵濃度。
1.3 主要儀器和設備
0.5 T核磁共振造影劑弛豫率分析儀（PQ001-20-015V，上海紐邁電子科技有限公司，中國），1.41 T小核磁分析儀（minispec mq60，布魯克（北京）科技有限公司，中國），3.0 T磁共振成像系統（Discovery MR750，GE公司，美國），大鼠專用線圈（Animalcoil WK601，Magtron，美國)，400 MHz高分辨魔角旋轉探頭（BRUKER 4 mm DUI，布魯克拜厄斯賓有限公司，瑞士），紫外可見分光光度計（UV-1900i，日本島津儀器有限公司），光纖耦合激光系統（VCLHLGD0024991，北京宏藍光電科技有限公司，中國），紅外熱像儀（Fotric226s，青島科創貿易有限公司，中國），呼吸麻醉機（MatrxVME2，Midmark，美國)，皖儀原子吸收光譜儀（WYS2000，安徽皖儀科技股份有限公司，中國）。
1.4 實驗動物
實驗動物為健康SD大鼠3只，無疾病史，年齡4～8周，體重110～150 g，均購于川北醫學院實驗動物中心。動物實驗許可證編號：SYXK（川）2018-076。用呼吸麻醉機對大鼠進行異氟烷吸入性麻醉，將大鼠尾巴清洗干凈，置于大鼠專用線圈中，經尾靜脈注射PAsp-DAFe/PEG，在GE3.0 T磁共振成像系統中對大鼠進行核磁共振掃描。本項目實驗研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。
1.5 弛豫效能測試
檸檬酸鐵溶液經HEPES緩沖溶液（100 mmol/L，pH=7.4）稀釋至鐵濃度0.10、0.19、0.30、0.40、0.51 mmol/L，PAsp-DAFe/PEG溶液經磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液，10 mmol/L，pH=7.4）稀釋至鐵濃度0.12、0.24、0.48、0.97、1.94 mmol/L，置于測試瓶中，室溫下(25 ℃)分別采用0.5 T弛豫率分析儀、1.41 T小核磁分析儀、臨床3.0 T磁共振成像系統測定T1弛豫效能（r1）和T2弛豫效能（r2）。
1.6 紫外－可見光吸收光譜
分別取少量PAsp-g-DA/PEG、PAsp-DAFe/PEG溶液于比色皿中，加入PBS緩沖液，稀釋到0.5 mg/mL（聚合物濃度），以PBS溶液為對照，進行紫外吸收光譜測定，平行測定兩次取其一。
1.7 光熱轉換
分別取PBS、PAsp-g-DA/PEG溶液及不同多巴胺濃度的PAsp-DAFe/PEG溶液各1 mL于EP管中，用808 nm近紅外激光（光功率密度：5 W/cm2）照射每個EP管中的溶液，持續10 min，并用紅外熱像儀記錄每1 min溶液溫度變化。選取多巴胺濃度1.3 mmol/L的PAsp-DAFe/PEG溶液予以近紅外光照射10 min，然后停止照射15 min，持續循環4次，并在該過程中記錄每1 min溫度變化。
1.8 大鼠體內磁共振增強成像
整個掃描過程均使用呼吸麻醉機給予大鼠異氟烷持續吸入性麻醉（麻醉濃度1%～2%，氧流量800～1 500 mL/min）。將麻醉下的大鼠放入GE3.0 T磁共振大鼠專用線圈中，俯臥位，頭先進，行平掃和增強掃描。平掃和增強掃描均采用如下序列和參數：T1加權成像（T1-weighted imaging，T1WI），重復時間 = 6 ms，回波時間 = 3 ms，層厚 = 0.8 mm，視野 = 120 mm × 120 mm，激勵次數 = 2～3。在完成冠狀位平掃后尾靜脈注射PAsp-DAFe/PEG（Fe：2.5 mg/kg劑量）以0.1 mL/s的速率推入，進行增強掃描，序列同平掃，于不同時間點對大鼠體部行磁共振掃描。在此基礎上測量在不同時間點肝臟、腎臟同一層面的信號強度變化，分析該造影劑在大鼠體內的增強效果及代謝情況。
2 結 果
2.1 PAsp-g-DA/PEG合成與表征
本文以PSI為原料，通過其氨解反應獲得了共價接枝多巴胺和聚乙二醇的聚天冬氨酸接枝聚合物PAsp-g-DA/PEG。實驗中對原料和產物進行了1H核磁譜表征，結果如圖1所示。PAsp-g-DA/PEG譜圖中增加了多巴胺苯環特征峰（峰3、4、5）和聚乙二醇特征峰（峰6、7），證明多巴胺和聚乙二醇成功共價接枝到聚天冬氨酸側鏈上。通過對聚天冬氨酸、多巴胺和聚乙二醇特征峰進行積分，計算得本批次產物的多巴胺接枝率約為30%，聚乙二醇接枝率約為15%。多巴胺和聚乙二醇的接枝率可通過調節反應投料比以及反應溫度進行有效控制。
圖1
PSI（DMSO）和PAsp-g-DA/PEG（D2O）的1H核磁譜圖及特征峰標注
Figure1.
1H NMR spectra and characteristic peak labeling of PSI (DMSO) and PAsp-g-DA/PEG (D2O)
2.2 PAsp-DAFe/PEG弛豫效能的表征
實驗首先測試了不同濃度樣品的縱向和橫向弛豫時間（Ti，i = 1或2），再將其倒數（1/Ti）與鐵離子濃度（CFe）做曲線，曲線的斜率即是造影劑的縱向和橫向弛豫效能（ri，i = 1或2）。實驗中分別在0.5 T弛豫率分析儀、1.41 T小核磁分析儀和3.0 T磁共振成像系統下測試了PAsp-DAFe/PEG的r1和r2，并以檸檬酸鐵作為對照（見表1）。結果顯示，檸檬酸鐵溶液在0.5～3.0 T下弛豫效能較低。根據文獻推測檸檬酸鐵可能難以應用于臨床磁共振增強成像[11]。相同磁場強度下PAsp-DAFe/PEG的r1明顯高于檸檬酸鐵，并且r2/r1更低，是一種良好的T1磁共振造影劑。
表1
樣品的T1、T2弛豫效能（r1、r2單位：Fe mmol?1·L· s?1）
Table1.
T1 and T2 relaxation efficiency of samples (r1 and r2 units: Fe mmol?1·L· s?1)
2.3 紫外－可見光吸收光譜
分別將少量PAsp-g-DA/PEG和PAsp-DAFe/PEG均勻分散在PBS溶液中，進行吸光度測試，研究其紫外－可見光吸收性能。結果如圖2所示。圖2中很明顯地觀察到兩種物質在波長220～900 nm間有典型的吸收帶，其中300～900 nm間PAsp-DAFe/PEG的吸收值始終高于PAsp-g-DA/PEG，而PAsp-g-DA/PEG在300 nm左右表現出較好的吸收峰，并且展示了兩者在近紅外光波長區域中的吸收性能，結果顯示，PAsp-DAFe/PEG具有更加明顯的近紅外光吸收。
圖2
紫外－可見光吸收光譜圖
Figure2.
Ultraviolet -visible absorption spectra
2.4 光熱轉換
與同類研究[12]相似，本文以波長808 nm、光功率密度為5 W/cm2的近紅外激光作為光源，考察不同濃度PAsp-DAFe/PEG水溶液在近紅外激光照射下溫度隨時間的變化。溫度變化曲線如圖3a所示，DA濃度為0.26 mmol/L的PAsp-DAFe/PEG溶液10 min內溫度從26 ℃升至38.5 ℃。隨著樣品濃度增加，溶液的溫度也隨之提高，當DA濃度達到1.30 mmol/L時溶液10 min內溫度上升至57.6 ℃，超過了癌細胞的耐受溫度（50 ℃）[13]。在相同條件下對照組PAsp-g-DA/PEG溫度僅升高至32 ℃，PBS水溶液溫度僅升高至29.8 ℃，說明PAsp-g-DA/PEG與Fe3+螯合后大大增加了聚合物的光熱轉換能力。圖3b為PAsp-DAFe/PEG（DA：1.30 mmol/L）水溶液反復經過近紅外光照射（10 min）然后停止照射（15 min）持續循環4次的溫度隨時間變化的曲線，結果顯示每次循環曲線基本一致且溫度均能達到第一次照射時所達到的最高溫度，說明PAsp-DAFe/PEG具有良好的光熱穩定性。圖3c為808 nm近紅外激光照射10 min的熱成像圖，直觀地顯示了樣品在808 nm近紅外激光照射下溫度的變化和分布。
圖3
PAsp-DAFe/PEG光熱轉換及穩定性
a. 光熱轉換示意圖；b. 光熱穩定性示意圖；c. 熱成像圖。不同濃度的PAsp-DAFe/PEG：① DA：0.26 mmol/L；② DA：0.65 mmol/L；③ DA：1.30 mmol/L
Figure3. Photothermal conversion and stability of PAsp-DAFe/PEGa. schematic diagram of photothermal conversion; b. schematic diagram of photothermal stability; c. diagram of thermal image. Different concentrations of PAsp-DAFe/PEG: ① DA: 0.26 mmol/L; ② DA: 0.65 mmol/L; ③ DA: 1.30 mmol/L
2.5 大鼠體內磁共振增強成像
圖4為尾靜脈注射PAsp-DAFe/PEG前和注射后1、10、20、30、1 440、2 880 min行磁共振掃描采集的腎臟和肝臟動態增強圖像。PAsp-DAFe/PEG可通過血液循環分散在大鼠體內，并可能富集于某些器官，本研究經過信號強度對比分析，檢測了組織富集及信號改變情況。圖4a中可觀察到大鼠在增強前肝臟和腎臟呈低信號，在造影劑注射完成后直接行磁共振掃描，肝腎的亮度均高于增強前的水平。圖4b可觀察到肝臟信號值在1 min達到最高，在1 min到24 h的信號強度逐漸降低，但始終高于增強前腎臟信號強度，直到48 h后信號強度恢復到增強前水平；腎臟信號值在1 min達到最高，然后信號強度逐漸降低，在48 h其信號強度降至增強前水平。結果說明PAsp-DAFe/PEG具有較好的體內增強成像效果，可通過腎臟較快排泄，少量殘留體內經過48 h逐漸代謝完全。
圖4
大鼠肝、腎磁共振成像和信號強度變化
a. 3.0 T磁共振T1WI掃描大鼠肝、腎圖像；b. 大鼠肝、腎信號強度變化
Figure4. Liver and kidney magnetic resonance imaging and signal intensity changes in ratsa. T1 weighted magnetic resonance imaging of liver and kidney in rats at 3.0 T; b. changes of signal intensity of liver and kidney in rats
3 討論
本文設計和制備了一種以聚天冬氨酸為骨架，接枝修飾多巴胺和聚乙二醇的接枝聚合物配體PAsp-g-DA/PEG，并螯合順磁性Fe3+，研究其作為磁共振可視化光熱轉換劑的潛力[14]。磁共振可視化的光熱治療劑應同時具有良好的磁共振成像增強效果和較高的光熱轉換效率。藥物通過靜脈注射進入體內后，一方面，具有良好的磁共振成像增強效果才能有效示蹤藥物體內分布，通過磁共振信號變化有效觀察在病變組織的聚集與代謝情況；另一方面，具有較高的光熱轉換效率，才能保證將近紅外激光轉換為足夠的熱量殺死腫瘤細胞。磁共振成像中，弛豫效能是評價造影劑產生對比增強效果的重要指標[15-16]，本文選擇臨床常用磁場（0.5 T、1.5 T和3.0 T）測試了PAsp-DAFe/PEG的T1和T2弛豫效能（r1和r2）。結果顯示PAsp-DAFe/PEG的r1在2~3 mmol-1·L·s?1，明顯高于Fe3+（實驗中以檸檬酸鐵溶液為對照），接近于臨床用釓劑[17]，具有良好的磁共振T1造影增強效果。在臨床3.0 T磁共振的大鼠成像實驗中，通過尾靜脈注射PAsp-DAFe/PEG，大鼠肝臟和腎臟T1加權圖像呈現出良好的對比增強效果，磁共振信號明顯增高，隨后逐漸降低，48 h后肝腎器官的信號值恢復到正常水平，造影劑基本被代謝掉。光熱轉換方面，實驗測試了PAsp-DAFe/PEG紫外－可見光吸收波譜和808 nm近紅外激光下的光熱效應。紫外－可見光吸收波譜顯示，PAsp-DAFe/PEG在280 nm和600 nm波長處出現兩個較大吸收峰。在近紅外光區域PAsp-DAFe/PEG比PAsp-g-DA/PEG表現出更強的吸收。從電子轉移角度分析，Fe3+是一種高氧化態的過渡金屬離子，具有未充滿的d軌道，可以作為電子接受體；聚合物中含有多巴胺分子，多巴胺分子結構中含有很多鄰苯二酚結構（可氧化性配體），可以作為電子給予體。因此，Fe3+與鄰苯二酚結構發生氧化還原，隨Fe3+還原能力增強，電荷轉移吸收帶向長波長移動。Fe3+具強氧化能力，顏色加深，螯合鐵離子后的共聚物在近紅外光區域的吸光度更高[18]。近紅外激光具有一定的生物組織穿透效果[19]，近紅外光熱治療劑更具發展優勢。從808 nm近紅外激光下的光熱曲線可以看出，當DA濃度為1.3 mmol/L時PAsp-DAFe/PEG溶液在10 min內溫度可升至57.6 ℃，產生較好的加熱效果。在腫瘤熱療過程中，腫瘤組織溫度達到41～46 ℃即會刺激機體產生免疫應答，對腫瘤細胞發揮非特異性的殺傷作用[20-22]。因此，PAsp-DAFe/PEG既是一種良好的磁共振造影劑，也是具有很大潛力的近紅外光熱治療劑，有望在磁共振可視化的光熱治療中發揮巨大作用。
Fe3+為一種順磁性金屬離子，是生物體內的一種必需元素，生物安全性高于臨床中常用的釓造影劑，但弛豫效率較低[23]，提高其在磁共振增強成像中的組織對比度是一項重大的挑戰。多巴胺上的鄰苯二酚結構對Fe3+具有較高的螯合能力，該特性已在生物體和仿生系統中得到了廣泛應用[24-25]。聚多巴胺與生物體內黑色素相似，具有較好的光熱轉換效果，近年來廣泛用于光熱轉換劑研究。聚天冬氨酸是一種生物降解性好、安全無毒的氨基酸聚合物，被廣泛用于環境、衛生、農業、日化等領域，是一種較理想的藥物載體。將多巴胺接枝到聚天冬氨酸上同樣可以獲得類似聚多巴胺結構，聚合物上的多價鄰苯二酚基團可有效螯合Fe3+同時獲得磁共振造影和光熱轉換效果。聚天冬氨酸側鏈上含有大量羧基，未接枝多巴胺的游離羧基可進一步修飾活性分子，實現聚合物的多功能化。本文修飾了具有良好生物相容性的聚乙二醇，以增加其在血液循環中的穩定性[26]。聚天冬氨酸側鏈的羧基可與帶氨基的分子通過縮合方式化合鏈接，但往往反應活性較低，不能獲得較高的接枝率。本文選擇了聚天冬氨酸的前體聚琥珀酰亞胺為原料，與多巴胺、端氨基聚乙二醇氨解，一步獲得接枝多巴胺和聚乙二醇的聚天冬氨酸接枝聚合物。實驗結果顯示該制備方法接枝效率高且接枝率可通過投料比調節。
本研究證實了該配合物在磁共振可視化的條件下進行光熱治療的潛力，但808 nm波長的近紅外激光能穿透的組織深度有限，可以考慮應用于較淺部位的癌細胞或腫瘤組織的光熱治療。例如食管癌，可以考慮制作近紅外激光－內鏡裝置，找到食管癌所在的位置后經近紅外激光照射治療或者通過微創手術對處于較深部位的腫瘤組織實施近紅外激光照射治療。
綜上所述，本研究設計制備的PAsp-DAFe/PEG具有較好的磁共振增強成像效果和良好的近紅外光熱轉換能力。該聚合物各成分均為生物相容性材料，具有較大的臨床轉化潛力，可為磁共振可視化光熱治療腫瘤提供新的方法及思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：杜亮參與實驗設計、數據收集與分析及論文寫作，盧福麟參與數據收集和論文修改，吳昌強參與實驗設計與指導工作。
倫理聲明：本研究通過了川北醫學院倫理委員會的審批（批文編號：[2021]79號）。
