中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）在免疫血栓的形成過程中扮演著重要角色，然而血管內皮細胞如何介導 NETs 的形成，尚未完全明晰。我們利用脂多糖（LPS）或佛波酯（PMA）對穩定黏附于內皮細胞表面細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的中性粒細胞進行 4 h 刺激，再利用 Sytox green 染料標記 NETs-DNA，通過熒光顯微鏡觀察 NETs 形成，分析 NETs-DNA 的面積和熒光強度以量化 NETs 的形成情況。結果顯示，PMA 和 LPS 均能誘導穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞產生 NETs。PMA 誘導產生的 NETs 不依賴于 β2 整合素淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）或巨噬細胞抗原復合物-1（Mac-1）。相反，LPS 刺激產生 NETs 依賴于 β2 整合素中 Mac-1，而不依賴 LFA-1。抑制肌動蛋白絲或踝蛋白-1（Talin-1），無論是 LPS 或 PMA 刺激，NETs 的形成均顯著下降。本研究揭示了炎癥條件下中性粒細胞與內皮細胞直接相互作用產生 NETs 的機制，為相關疾病的治療和新藥物的開發提供了新的理論基礎。
引用本文： 洪天添, 劉望, 黃嘉祺, 趙柏松, 方穎, 吳建華, 林蔣國. LPS 刺激穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞形成胞外誘捕網依賴于整合素 Mac-1 和細胞骨架蛋白. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(5): 903-910. doi: 10.7507/1001-5515.202105019 復制
引言
中性粒細胞是循環血液中最豐富的白細胞亞群，在先天免疫和炎癥過程中起著關鍵作用[1]。2004 年，Brinkmann 等[2]首次發現中性粒細胞會釋放胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）。NETs 由中性粒細胞放出的 DNA 網絡和附著其上的多種顆粒蛋白組成，包括瓜氨酸化組蛋白（citrullinated histone H3，CitH3）、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等。NETs 被認為是中性粒細胞的一種初始免疫防御形式和新型抗菌策略[3–5]。隨著研究的深入，越來越多證據表明 NETs 是把雙刃劍[6]。NETs 參與了腫瘤遷移[3,7]、膿毒癥[8–10]、動脈粥樣硬化[11]和血栓[12-13]等多種疾病的發生和發展過程。
中性粒細胞被募集到局部炎癥部位，需要經歷滾動、黏附、穩定黏附、爬行和遷移過程[14-15]。其中，內皮細胞表面的細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和中性粒細胞表面的 β2 整合素的相互作用，介導了中性粒細胞的黏附和遷移過程[16-17]。研究表明，NETs 在免疫血栓形成中發揮著關鍵性作用，其大型的 DNA 網絡結構除能捕獲細菌和真菌等病原體外，還能捕獲血小板和紅細胞等血細胞形成血栓凝塊，堵塞血管[13,18]。
在膿毒癥后期，由 NETs 介導的靜脈血栓形成是膿毒癥致死的主要原因[19]。關于血管內 NETs 的形成，目前，多數研究聚焦于活化的血小板介導中性粒細胞形成 NETs 的機制研究。激活后的血小板通過 Toll 樣受體 4（toll like receptor 4，TLR4）介導與中性粒細胞的相互作用，導致中性粒細胞激活，在靜態或流體條件下產生 NETs[20-21]。內皮細胞介導 NETs 形成的研究相對較少，但有研究發現，激活的內皮細胞能釋放白介素-8（interleukin-8，IL-8），導致中性粒細胞激活并釋放 NETs[22]。然而，在感染條件下，血管內皮細胞與中性粒細胞的直接相互作用是否會產生 NETs，其機制如何，尚未完全清楚。針對上述科學問題，本文通過多種刺激劑脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）對中性粒細胞進行刺激，考察穩定黏附在 ICAM-1 表面的中性粒細胞產生 NETs 的能力，并探明此過程中的信號通路。本研究將進一步加深我們對免疫血栓形成的認識，為臨床研究和藥物開發提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 細胞
中性粒細胞通過分離健康志愿者外周靜脈血獲得。本課題實驗方法及內容已通過廣州市婦女兒童醫療中心倫理委員會的審查。
1.2 試劑與耗材
重組人 ICAM-1/CD54 購自 R&D；LPS（E.coli 0111:B4）、PMA、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）以及牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自 Sigma；μ-slide 8 孔腔室載玻片購自 Ibidi；中性粒細胞分離試劑盒購自天津灝洋；RPMI 1640 培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）以及磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自 Gibco；脫氧核糖核酸酶 1（deoxyribonuclease 1，DNase 1）購自 Roche；Sytox green 和 Hoechst33342 染料購自 Invitrogen；淋巴細胞功能相關抗原-1（lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1）抗體 Hl111、巨噬細胞抗原復合物-1（macrophage antigen complex-1，Mac-1）抗體 M1/70 及同型 IgG 均購自 Biolegend；細胞骨架抑制劑細胞松弛素 D（cytochalasin D，CytoD）購自 Abcam；踝蛋白-1（Talin-1）抑制劑 3,4-亞甲基二氧-β-硝基苯乙烯（3,4-methylenedioxy-β-nitrostyrene，MNS）購自 Selleckchem；MnCl2 購自天津大茂。
1.3 中性粒細胞提取
向 15 mL 離心管底部加入 6 mL 中性粒細胞分離液，用注射器將外周血液緩慢注入到分離液上層，室溫下以 2 300 r/min 離心 30 min；待血液分層，用膠頭滴管收集中性粒細胞層（從下至上第二層）；向離心管中加入清洗液（來源中性粒細胞分離試劑盒，下稱為試劑盒），室溫下 1 400 r/min 離心 10 min；去除上清，加入紅細胞裂解液（試劑盒），充分吹打混勻細胞，在 37 ℃ 下以 6～7 r/min 的轉速在垂直培養儀上處理 7～10 min；加滿清洗液，混勻，室溫下以 1 400 r/min 離心 10 min；去除上清，獲得細胞沉淀；加入 2 mL RPMI 1640+10% FBS 培養液混勻細胞，進行細胞計數；加入培養液將細胞密度稀釋至 1×106/mL。
1.4 底板功能化與中性粒細胞孵育
向 Ibidi 8 孔板每孔加入 10 μL 濃度為 100 μg/mL 的 ICAM-1，室溫孵育 1 h；孵育完成后，加入 2% BSA 溶液，對孔板進行封閉，室溫孵育 1 h，以阻斷非特異性黏附；在細胞孵育至孔板前，向細胞密度為 1×106/mL 的中性粒細胞液中加入終濃度為 1 mmol/L MnCl2 溶液，以激活中性粒細胞上 β2 整合素至中等親和力狀態；隨后將細胞液移至 Ibidi 8 孔板中，在 CO2 濃度為 5%、37 ℃ 細胞培養箱中孵育 30 min，確保細胞穩定黏附于 ICAM-1 包被的孔板上。
1.5 抑制劑處理
獲得細胞密度為 1×106/mL 的中性粒細胞液后，分別加入 Mac-1 抗體 M1/70（10 μg/mL）、LFA-1 抗體 Hl111（10 μg/mL）、isotype IgG（10 μg/mL）、細胞骨架抑制劑 CytoD（10 μg/mL）或 Talin-1 抑制劑 MNS（20 μmol/L），對中性粒細胞進行相應的處理；同時設置空白對照組和溶劑對照組，相應加入等體積的細胞培養液或 DMSO 至細胞液中；將抑制組、溶劑對照組（DMSO）和空白對照組（Ctrl）移至垂直培養儀上，在 37 ℃ 下以 6～7 r/min 的轉速同時處理 30 min。處理完畢后，按照上述 1.4 小節中性粒細胞孵育步驟，將細胞穩定黏附于 ICAM-1 包被的孔板上。
1.6 中性粒細胞胞外誘捕網的產生和觀察
細胞孵育完畢后，移除未黏附的細胞，加入含 10% FBS 的 RPMI 1640 培養液清洗一次；避光加入 200 μL 濃度為 100 ng/mL 的 LPS 或 PMA 至 Ibidi 8 孔板中；在 37 ℃ 細胞培養箱中刺激 4 h，加入 PBS，清洗殘余刺激劑；避光加入 200 μL 濃度為 5 μmol/L Sytox green 和 10 μg/mL Hoechst33342 染料進行 DNA 染色 15 min。Sytox green 熒光染料不能通過活細胞的細胞膜，用于標記由中性粒細胞釋放至胞外的 DNA，以此表征 NETs 形成。利用倒置熒光顯微鏡（Nikon eclipse Ti2）對樣品進行觀察。在 60 倍鏡下，每個視野分別拍攝明場白光、綠色（488 nm）和藍色（405 nm）熒光通道圖片。每一條件進行 3 次以上的獨立實驗，每次實驗拍攝 10～15 個視野。
1.7 統計學分析
使用軟件 Image J 統計視野中的細胞個數，并獲取免疫熒光圖片中陽性信號的面積和熒光強度等信息。為了排除穩定黏附細胞個數不同的影響，每幅圖像陽性信號的面積和熒光強度均除以視野中的細胞數。為排除個體差異性對結果的影響，量化結果均以對照組平均數值為基準進行歸一化處理，表示為相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度。使用 GraphPad Prism 7.0 進行數據處理，數據統計分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和 Tukey 多重比較檢驗統計學差異。檢驗水準為 0.05，數據以均數±標準誤（mean ± SEM）表示。
2 結果
2.1 LPS 和 PMA 刺激穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞產生 NETs
PMA 是最常用的誘導中性粒細胞產生 NETs 的強刺激劑。本研究首先利用 PMA 對穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞進行 4 h 刺激，并利用非細胞膜通透的染料 Sytox green 對胞外 DNA 進行染色。通過熒光顯微鏡觀察發現，PMA 刺激后，視野中有大量彌漫性 DNA 結構形成（見圖1a 中），且與未刺激組（unstimulated，US）相比，PMA 刺激組的 DNA 面積和熒光強度均顯著增加，分別為（41.95 ± 8.23）倍（P ≤ 0.01）和（50.50 ± 18.38）倍（P ≤ 0.05）（見圖1b 和 c）。為了進一步確認此條件下 NETs 的產生，我們利用 DNase 1 酶消化胞外 DNA。DNase 1 酶處理后，DNA 網狀結構覆蓋面積顯著性降低（見圖1a 下）；量化結果顯示，相較于 PMA 刺激組，DNase 1 酶處理組 DNA 面積降低了（83 ± 7）% （P ≤ 0.01），其熒光強度降低了（88 ± 3）%（P ≤ 0.05）（見圖1b 和 c）。上述結果表明，PMA 刺激穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞產生了 NETs。
圖1
LPS 和 PMA 刺激穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞產生 NETs
a. PMA（100 ng/mL）刺激下中性粒細胞形成 NETs 的免疫熒光代表性圖片，DNA 用 Hoechst33342（藍色）顯示，NETs-DNA 用 Sytox green（綠色）顯示，全文一致；b 和 c. 分別為未刺激組（US）與 PMA 刺激 4 h 以及 DNase 1 酶消化后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果；d. LPS（100 ng/mL）刺激下中性粒細胞形成 NETs 的免疫熒光代表性圖片；e 和 f. 分別為未刺激組（US）與 LPS 刺激 4 h 以及 DNase 1 酶消化后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果。代表性圖片中的比例尺為 50 μm，使用 One-way ANOVA 檢驗并進行 Tukey 多重比較。*，
a. the representative immunofluorescent images of NETs formation by neutrophils under PMA (100 ng/mL) stimulation; DNA was stained with Hoechst33342 (blue) and NETs-DNA was stained with Sytox green (green), and the color code was consistent throughout the text; b and c. the quantitative results of the relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity of the unstimulated group (US), PMA stimulation for 4 h, and DNase 1 enzyme digestion; d. the representative immunofluorescent images of NETs formation by neutrophils under LPS (100 ng/mL) stimulation; e and f. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity of the unstimulated group (US), LPS stimulation for 4 h, and DNase 1 enzyme digestion. The scale bar in representative images was 50 μm. A One-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison was used. *,
PMA 是種化學刺激劑，其對中性粒細胞的刺激與生理或病理條件相差甚遠。為了探究在感染條件下（如革蘭氏陰性菌感染），穩定黏附于血管內皮細胞上的中性粒細胞是否會產生 NETs，我們利用 LPS（革蘭氏陰性菌細胞壁成分）刺激穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞。在熒光顯微鏡下同樣觀察到大量彌漫性的 DNA 結構（見圖1d 中）。相比于 US 組，LPS 刺激組的 DNA 面積增加了（5.98 ± 0.78）倍（P ≤ 0.001），DNA 熒光強度增加了（2.15 ± 0.64）倍（P ≤ 0.05）（見圖1e 和 f）。DNase 1 酶處理后，綠色熒光信號顯著減少（見圖1d 下）。與 LPS 刺激組相比，DNase 1 酶處理組的 DNA 面積降低了（73 ± 7）%（P ≤ 0.01），其熒光強度降低了（69 ± 16）%（P ≤ 0.05）（見圖1e 和 f）。上述結果表明 LPS 刺激穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞可以發生 NETosis。
上述結果顯示，穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞無論是在 PMA 還是在 LPS 刺激條件下，都能夠產生 NETs，且通過 DNase 1 酶對 NETs-DNA 進行消化處理，進一步確證了 NETs 的產生。
2.2 β2 整合素 Mac-1 調控 LPS 刺激中性粒細胞 NETs 的形成
中性粒細胞上 β2 整合素與 ICAM-1 結合，介導中性粒細胞黏附至內皮細胞表面。β2 整合素中 LFA-1 介導中性粒細胞的慢速滾動和黏附，Mac-1 則介導中性粒細胞的爬行和遷移[23]。為了探究 β2 整合素 LFA-1 或 Mac-1 是否參與 NETs 的產生，我們利用 Mac-1 阻斷性抗體 M1/70 或 LFA-1 阻斷性抗體 Hl111 及 isotype IgG 預處理中性粒細胞，再利用 LPS 或 PMA 進行 4 h 刺激，考察 NETs 生成的變化。
LPS 刺激下，Hl111 阻斷 LFA-1 對于 NETs-DNA 的形成無顯著影響，然而 M1/70 阻斷 Mac-1 能夠顯著下調 NETs 生成（見圖2a）。M1/70 阻斷 Mac-1 后，DNA 面積較 LPS-only 組或 isotype IgG 對照組分別下降了（66 ± 10）%（P ≤ 0.001）和（86 ± 16）%（P ≤ 0.01），熒光強度也分別下降了（73 ± 9）%（P ≤ 0.001）和（71 ± 20）%（P ≤ 0.05）；isotype IgG 組的 NETs 面積和熒光強度與 LPS-only 組之間的差異無統計學意義（見圖2b 和 c）。
圖2
β2 整合素不介導 PMA 刺激的 NETs 形成，Mac-1 而不是 LFA-1 參與 LPS 誘導的 NETs 形成
a 和 d. Hl111 或 M1/70 分別抑制 LFA-1 或 Mac-1 后，在 LPS 或 PMA 刺激下中性粒細胞形成 NETs 的免疫熒光代表性圖片；b 和 c. 為 LPS 刺激 β2 整合素抑制后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果；e 和 f. 為 PMA 刺激 β2 整合素抑制后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果。比例尺為 50 μm，使用 One-way ANOVA 檢驗并進行 Tukey 多重比較。ns，差異無統計學意義；*，
a and d. the representative immunofluorescence images of NETs formation by neutrophils under LPS or PMA stimulation after inhibition of LFA-1 or Mac-1 by Hl111 or M1/70, respectively; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after LPS stimulated β2 integrin inhibition; e and f. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after PMA stimulated β2 integrin inhibition. The scale bar was 50 μm. A One-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison was used. ns, no significant; *,
經 M1/70 或 Hl111 預處理后，向穩定黏附在 ICAM-1 上的中性粒細胞施以 PMA 刺激。如圖2d 所示，抑制劑處理組（M1/70 或 Hl111）仍存在大量彌漫性 DNA。量化分析顯示，isotype IgG 處理組、LFA-1 抑制組（Hl111）和 Mac-1 抑制組（M1/70）的 NETs 面積分別為 PMA-only 組的（1.04 ± 0.07）、（1.17 ± 0.09）和（1.12 ± 0.09）倍（見圖2e）；上述三組的熒光強度分別為 PMA-only 組的（1.13 ± 0.12）、（1.05 ± 0.06）和（1.01 ± 0.18）倍（見圖2f），各組間差異無統計學意義。
上述結果表明，是 Mac-1 而非 LFA-1 參與了 LPS 誘導的穩定黏附在 ICAM-1 上的中性粒細胞 NETs 的釋放。與之不同的是，LFA-1 和 Mac-1 均不參與 PMA 刺激中性粒細胞產生 NETs 的過程。
2.3 細胞骨架參與了 LPS 或 PMA 刺激中性粒細胞 NETs 的形成
前一部分的結果表明，Mac-1 介導中性粒細胞的黏附是 LPS 誘導 NETs 產生的條件之一。Mac-1 介導的中性粒細胞黏附同樣發生在其爬行和遷移等過程中，涉及到細胞骨架的重排[24]。為了考察肌動蛋白細胞骨架在 NETs 形成中的作用，我們利用 CytoD 對中性粒細胞進行預處理以阻斷其肌動蛋白絲的聚合。經 CytoD 預處理的中性粒細胞響應 LPS 刺激形成 NETs 的能力受到顯著抑制（見圖3a）：DNA 面積和熒光強度較 LPS-only 組均下降了 95%（P ≤ 0.001）（見圖3b 和 c）。類似地，在 PMA 刺激下，CytoD 抑制中性粒細胞骨架重排后 NETs 形成也顯著減少：DNA 面積下降（68 ± 11）%（P ≤ 0.01），熒光強度下調（61 ± 7）%（P ≤ 0.001），但較 LPS 下降幅度少約 30%（見圖3d、e 和 f）。
圖3
抑制中性粒細胞細胞骨架重排減弱了 LPS 或 PMA 刺激的 NETs 形成
a 和 d. CytoD 抑制細胞骨架重排后，在 LPS 或 PMA 刺激下中性粒細胞形成 NETs 的免疫熒光代表性圖片；b 和 c. LPS 刺激細胞骨架重排抑制后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果；e 和 f. PMA 刺激細胞骨架重排抑制后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果。比例尺為 50 μm，使用 One-way ANOVA 檢驗并進行 Tukey 多重比較。*，
a and d. the representative immunofluorescence images of NETs formation by neutrophils under LPS or PMA stimulation after cytoskeletal rearrangement inhibition by CytoD; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after LPS stimulated cytoskeleton rearrangement inhibition; e and f. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after PMA stimulated cytoskeleton rearrangement inhibition. The scale bar was 50 μm. A One-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison was used. *,
以上結果表明，抑制細胞骨架重排后，LPS 或 PMA 誘導的穩定黏附于 ICAM-1 上中性粒細胞 NETs 的釋放均受到顯著下調。有趣的是，相比于 PMA 刺激，LPS 刺激導致 NETs 的產生受 CytoD 的影響更大。
2.4 Talin-1 參與了 LPS 或 PMA 刺激中性粒細胞 NETs 的形成
踝蛋白（Talin）是一類重要的細胞骨架連接蛋白。中性粒細胞胞質中存在的是 Talin-1，其通過一個柔性桿結構域與肌動蛋白結合，并通過其頭部結構與 β2 整合素的胞質區結構域結合，將 β2 整合素與細胞骨架連接起來[25-26]。為了考察 Talin-1 對于穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞響應不同刺激生成 NETs 的影響，本研究利用 Talin-1 抑制劑（MNS）預處理中性粒細胞，而后進行 LPS 或 PMA 刺激誘導中性粒細胞 NETs 形成。
結果顯示，中性粒細胞在抑制 Talin-1 后，胞外彌漫性 DNA 結構明顯減少（見圖4a 和 d）。統計分析表明，LPS 刺激下，與 LPS-only 組相比，MNS 抑制組的 DNA 面積下降了（82±7）%（P ≤ 0.001）（見圖4b），DNA 熒光強度降低了（87 ± 3）%（P ≤ 0.001）（見圖4c）。在 PMA 刺激下，MNS 處理后 NETs DNA 面積和熒光強度分別降低了（75 ± 5）% 和（71 ± 3）%（P ≤ 0.001）（見圖4e 和 f）。以上結果表明，中性粒細胞響應 LPS 或 PMA 刺激，形成 NETs 均受到 Talin-1 的調控；就 Talin-1 抑制對于 NETs 形成的作用而言，LPS 組大于 PMA 組。
圖4
抑制中性粒細胞 Talin-1 減弱了 LPS 或 PMA 刺激的 NETs 形成
a 和 d. MNS 抑制 Talin-1 后，在 LPS 或 PMA 刺激下中性粒細胞形成 NETs 的免疫熒光代表性圖片；b 和 c. LPS 刺激 Talin-1 抑制后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果；e 和 f. PMA 刺激 Talin-1 抑制后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果。比例尺為 50 μm，使用 One-way ANOVA 檢驗并進行 Tukey 多重比較。*，
a and d. the representative immunofluorescence images of NETs formation by neutrophils after MNS inhibition of Talin-1 in response to LPS or PMA stimulation; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after LPS stimulation of Talin-1 inhibition; e and f. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after PMA stimulation of Talin-1 inhibition. The scale bar was 50 μm. A One-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison was used. *,
3 討論
本研究中，我們利用 LPS 模擬革蘭氏陰性菌感染導致膿毒癥的情形，考察在此炎癥環境下，中性粒細胞和內皮細胞的直接相互作用介導的 NETs 的形成。結果顯示，在 LPS 刺激下，穩定黏附于內皮 ICAM-1 表面的中性粒細胞發生了 NETosis。受細菌感染的內皮細胞會高表達 ICAM-1[14]，這可能是膿毒癥患者容易產生 NETs 的原因之一。LPS 刺激導致 NETs 的產生受 Mac-1 整合素的調控；而 β2 整合素并不參與由 PMA 誘導的 NETs 形成過程。這一結果提示 LPS 刺激中性粒細胞產生 NETs 需要中性粒細胞的黏附，這與 Erpenbeck 等[27]的觀察一致。Erpenbeck 等利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）處理多聚賴氨酸（poly-l-lysine，PLL）功能化底板抑制細胞黏附，LPS 誘導的 NETs 形成受到了顯著抑制，而 PMA 刺激誘導的 NETosis 不受細胞黏附抑制的影響。
有研究指出，肌動蛋白細胞骨架參與了 PMA 刺激黏附在 PLL 上的中性粒細胞 NETs 的形成[24]。PLL 作為一種化學合成的分子膠水強行將細胞黏附下來，與血管內皮生理環境差距甚遠。而 ICAM-1 是通過與 β2 整合素的相互作用將中性粒細胞黏附于表面。因此，黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞響應刺激的行為可能與黏附于 PLL 的存在差異。我們的結果顯示，細胞骨架參與了調控 LPS 刺激下 NETs 的釋放；細胞骨架同樣也參與了 PMA 誘導的中性粒細胞 NETs 的釋放，這與文獻報道的黏附在 PLL 上的中性粒細胞行為一致。值得注意的是，抑制細胞骨架對 LPS 誘導的 NETs 形成的影響大于 PMA 誘導的 NETs 形成的影響。
Talin-1 是中性粒細胞胞質中一種重要的細胞骨架接頭蛋白。它通過其頭部結構與 β2 整合素胞質結構域相互作用，通過其尾部與肌動蛋白 Actin 結合，從而將 β2 整合素與細胞骨架連接起來[28-29]。Talin-1 與另一細胞骨架連接蛋白 Kindlin-3 一起參與了中性粒細胞 β2 整合素由內到外信號（inside-out signaling）介導的活化過程[30]。我們的研究顯示 Mac-1 和細胞骨架均參與了 NETs 的形成，因此我們懷疑 Talin-1 同樣參與此過程。確實，在抑制中性粒細胞 Talin-1 之后，LPS 或 PMA 刺激穩定黏附在內皮細胞 ICAM-1 表面的中性粒細胞 NETs 的形成顯著下調。這一結果提示，雖然 LPS 和 PMA 刺激中性粒細胞可能經由不同的信號通路導致 NETs 的形成，但是細胞骨架的重排可能是 NETs 形成過程中共同的關鍵細胞事件。
4 總結
在炎癥環境下，中性粒細胞與內皮細胞的相互作用產生 NETs，在免疫血栓的形成過程中起著重要的作用。本研究表明，中性粒細胞 β2 整合素 Mac-1 協同細胞骨架和 Talin-1，參與調控 LPS 誘導穩定黏附于 ICAM-1 表面的中性粒細胞發生 NETosis；PMA 誘導的 NETs 產生則不需要 β2 整合素的參與，但需要 Talin-1 和細胞骨架的參與。本研究進一步加深了我們對膿毒癥（特別是由革蘭氏陰性菌導致的膿毒癥）條件下血管內 NETs 形成機制的理解，為免疫血栓的臨床研究和藥物開發提供了理論依據。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
中性粒細胞是循環血液中最豐富的白細胞亞群，在先天免疫和炎癥過程中起著關鍵作用[1]。2004 年，Brinkmann 等[2]首次發現中性粒細胞會釋放胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）。NETs 由中性粒細胞放出的 DNA 網絡和附著其上的多種顆粒蛋白組成，包括瓜氨酸化組蛋白（citrullinated histone H3，CitH3）、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等。NETs 被認為是中性粒細胞的一種初始免疫防御形式和新型抗菌策略[3–5]。隨著研究的深入，越來越多證據表明 NETs 是把雙刃劍[6]。NETs 參與了腫瘤遷移[3,7]、膿毒癥[8–10]、動脈粥樣硬化[11]和血栓[12-13]等多種疾病的發生和發展過程。
中性粒細胞被募集到局部炎癥部位，需要經歷滾動、黏附、穩定黏附、爬行和遷移過程[14-15]。其中，內皮細胞表面的細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和中性粒細胞表面的 β2 整合素的相互作用，介導了中性粒細胞的黏附和遷移過程[16-17]。研究表明，NETs 在免疫血栓形成中發揮著關鍵性作用，其大型的 DNA 網絡結構除能捕獲細菌和真菌等病原體外，還能捕獲血小板和紅細胞等血細胞形成血栓凝塊，堵塞血管[13,18]。
在膿毒癥后期，由 NETs 介導的靜脈血栓形成是膿毒癥致死的主要原因[19]。關于血管內 NETs 的形成，目前，多數研究聚焦于活化的血小板介導中性粒細胞形成 NETs 的機制研究。激活后的血小板通過 Toll 樣受體 4（toll like receptor 4，TLR4）介導與中性粒細胞的相互作用，導致中性粒細胞激活，在靜態或流體條件下產生 NETs[20-21]。內皮細胞介導 NETs 形成的研究相對較少，但有研究發現，激活的內皮細胞能釋放白介素-8（interleukin-8，IL-8），導致中性粒細胞激活并釋放 NETs[22]。然而，在感染條件下，血管內皮細胞與中性粒細胞的直接相互作用是否會產生 NETs，其機制如何，尚未完全清楚。針對上述科學問題，本文通過多種刺激劑脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）對中性粒細胞進行刺激，考察穩定黏附在 ICAM-1 表面的中性粒細胞產生 NETs 的能力，并探明此過程中的信號通路。本研究將進一步加深我們對免疫血栓形成的認識，為臨床研究和藥物開發提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 細胞
中性粒細胞通過分離健康志愿者外周靜脈血獲得。本課題實驗方法及內容已通過廣州市婦女兒童醫療中心倫理委員會的審查。
1.2 試劑與耗材
重組人 ICAM-1/CD54 購自 R&D；LPS（E.coli 0111:B4）、PMA、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）以及牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自 Sigma；μ-slide 8 孔腔室載玻片購自 Ibidi；中性粒細胞分離試劑盒購自天津灝洋；RPMI 1640 培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）以及磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自 Gibco；脫氧核糖核酸酶 1（deoxyribonuclease 1，DNase 1）購自 Roche；Sytox green 和 Hoechst33342 染料購自 Invitrogen；淋巴細胞功能相關抗原-1（lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1）抗體 Hl111、巨噬細胞抗原復合物-1（macrophage antigen complex-1，Mac-1）抗體 M1/70 及同型 IgG 均購自 Biolegend；細胞骨架抑制劑細胞松弛素 D（cytochalasin D，CytoD）購自 Abcam；踝蛋白-1（Talin-1）抑制劑 3,4-亞甲基二氧-β-硝基苯乙烯（3,4-methylenedioxy-β-nitrostyrene，MNS）購自 Selleckchem；MnCl2 購自天津大茂。
1.3 中性粒細胞提取
向 15 mL 離心管底部加入 6 mL 中性粒細胞分離液，用注射器將外周血液緩慢注入到分離液上層，室溫下以 2 300 r/min 離心 30 min；待血液分層，用膠頭滴管收集中性粒細胞層（從下至上第二層）；向離心管中加入清洗液（來源中性粒細胞分離試劑盒，下稱為試劑盒），室溫下 1 400 r/min 離心 10 min；去除上清，加入紅細胞裂解液（試劑盒），充分吹打混勻細胞，在 37 ℃ 下以 6～7 r/min 的轉速在垂直培養儀上處理 7～10 min；加滿清洗液，混勻，室溫下以 1 400 r/min 離心 10 min；去除上清，獲得細胞沉淀；加入 2 mL RPMI 1640+10% FBS 培養液混勻細胞，進行細胞計數；加入培養液將細胞密度稀釋至 1×106/mL。
1.4 底板功能化與中性粒細胞孵育
向 Ibidi 8 孔板每孔加入 10 μL 濃度為 100 μg/mL 的 ICAM-1，室溫孵育 1 h；孵育完成后，加入 2% BSA 溶液，對孔板進行封閉，室溫孵育 1 h，以阻斷非特異性黏附；在細胞孵育至孔板前，向細胞密度為 1×106/mL 的中性粒細胞液中加入終濃度為 1 mmol/L MnCl2 溶液，以激活中性粒細胞上 β2 整合素至中等親和力狀態；隨后將細胞液移至 Ibidi 8 孔板中，在 CO2 濃度為 5%、37 ℃ 細胞培養箱中孵育 30 min，確保細胞穩定黏附于 ICAM-1 包被的孔板上。
1.5 抑制劑處理
獲得細胞密度為 1×106/mL 的中性粒細胞液后，分別加入 Mac-1 抗體 M1/70（10 μg/mL）、LFA-1 抗體 Hl111（10 μg/mL）、isotype IgG（10 μg/mL）、細胞骨架抑制劑 CytoD（10 μg/mL）或 Talin-1 抑制劑 MNS（20 μmol/L），對中性粒細胞進行相應的處理；同時設置空白對照組和溶劑對照組，相應加入等體積的細胞培養液或 DMSO 至細胞液中；將抑制組、溶劑對照組（DMSO）和空白對照組（Ctrl）移至垂直培養儀上，在 37 ℃ 下以 6～7 r/min 的轉速同時處理 30 min。處理完畢后，按照上述 1.4 小節中性粒細胞孵育步驟，將細胞穩定黏附于 ICAM-1 包被的孔板上。
1.6 中性粒細胞胞外誘捕網的產生和觀察
細胞孵育完畢后，移除未黏附的細胞，加入含 10% FBS 的 RPMI 1640 培養液清洗一次；避光加入 200 μL 濃度為 100 ng/mL 的 LPS 或 PMA 至 Ibidi 8 孔板中；在 37 ℃ 細胞培養箱中刺激 4 h，加入 PBS，清洗殘余刺激劑；避光加入 200 μL 濃度為 5 μmol/L Sytox green 和 10 μg/mL Hoechst33342 染料進行 DNA 染色 15 min。Sytox green 熒光染料不能通過活細胞的細胞膜，用于標記由中性粒細胞釋放至胞外的 DNA，以此表征 NETs 形成。利用倒置熒光顯微鏡（Nikon eclipse Ti2）對樣品進行觀察。在 60 倍鏡下，每個視野分別拍攝明場白光、綠色（488 nm）和藍色（405 nm）熒光通道圖片。每一條件進行 3 次以上的獨立實驗，每次實驗拍攝 10～15 個視野。
1.7 統計學分析
使用軟件 Image J 統計視野中的細胞個數，并獲取免疫熒光圖片中陽性信號的面積和熒光強度等信息。為了排除穩定黏附細胞個數不同的影響，每幅圖像陽性信號的面積和熒光強度均除以視野中的細胞數。為排除個體差異性對結果的影響，量化結果均以對照組平均數值為基準進行歸一化處理，表示為相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度。使用 GraphPad Prism 7.0 進行數據處理，數據統計分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和 Tukey 多重比較檢驗統計學差異。檢驗水準為 0.05，數據以均數±標準誤（mean ± SEM）表示。
2 結果
2.1 LPS 和 PMA 刺激穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞產生 NETs
PMA 是最常用的誘導中性粒細胞產生 NETs 的強刺激劑。本研究首先利用 PMA 對穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞進行 4 h 刺激，并利用非細胞膜通透的染料 Sytox green 對胞外 DNA 進行染色。通過熒光顯微鏡觀察發現，PMA 刺激后，視野中有大量彌漫性 DNA 結構形成（見圖1a 中），且與未刺激組（unstimulated，US）相比，PMA 刺激組的 DNA 面積和熒光強度均顯著增加，分別為（41.95 ± 8.23）倍（P ≤ 0.01）和（50.50 ± 18.38）倍（P ≤ 0.05）（見圖1b 和 c）。為了進一步確認此條件下 NETs 的產生，我們利用 DNase 1 酶消化胞外 DNA。DNase 1 酶處理后，DNA 網狀結構覆蓋面積顯著性降低（見圖1a 下）；量化結果顯示，相較于 PMA 刺激組，DNase 1 酶處理組 DNA 面積降低了（83 ± 7）% （P ≤ 0.01），其熒光強度降低了（88 ± 3）%（P ≤ 0.05）（見圖1b 和 c）。上述結果表明，PMA 刺激穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞產生了 NETs。
圖1
LPS 和 PMA 刺激穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞產生 NETs
a. PMA（100 ng/mL）刺激下中性粒細胞形成 NETs 的免疫熒光代表性圖片，DNA 用 Hoechst33342（藍色）顯示，NETs-DNA 用 Sytox green（綠色）顯示，全文一致；b 和 c. 分別為未刺激組（US）與 PMA 刺激 4 h 以及 DNase 1 酶消化后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果；d. LPS（100 ng/mL）刺激下中性粒細胞形成 NETs 的免疫熒光代表性圖片；e 和 f. 分別為未刺激組（US）與 LPS 刺激 4 h 以及 DNase 1 酶消化后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果。代表性圖片中的比例尺為 50 μm，使用 One-way ANOVA 檢驗并進行 Tukey 多重比較。*，
a. the representative immunofluorescent images of NETs formation by neutrophils under PMA (100 ng/mL) stimulation; DNA was stained with Hoechst33342 (blue) and NETs-DNA was stained with Sytox green (green), and the color code was consistent throughout the text; b and c. the quantitative results of the relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity of the unstimulated group (US), PMA stimulation for 4 h, and DNase 1 enzyme digestion; d. the representative immunofluorescent images of NETs formation by neutrophils under LPS (100 ng/mL) stimulation; e and f. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity of the unstimulated group (US), LPS stimulation for 4 h, and DNase 1 enzyme digestion. The scale bar in representative images was 50 μm. A One-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison was used. *,
PMA 是種化學刺激劑，其對中性粒細胞的刺激與生理或病理條件相差甚遠。為了探究在感染條件下（如革蘭氏陰性菌感染），穩定黏附于血管內皮細胞上的中性粒細胞是否會產生 NETs，我們利用 LPS（革蘭氏陰性菌細胞壁成分）刺激穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞。在熒光顯微鏡下同樣觀察到大量彌漫性的 DNA 結構（見圖1d 中）。相比于 US 組，LPS 刺激組的 DNA 面積增加了（5.98 ± 0.78）倍（P ≤ 0.001），DNA 熒光強度增加了（2.15 ± 0.64）倍（P ≤ 0.05）（見圖1e 和 f）。DNase 1 酶處理后，綠色熒光信號顯著減少（見圖1d 下）。與 LPS 刺激組相比，DNase 1 酶處理組的 DNA 面積降低了（73 ± 7）%（P ≤ 0.01），其熒光強度降低了（69 ± 16）%（P ≤ 0.05）（見圖1e 和 f）。上述結果表明 LPS 刺激穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞可以發生 NETosis。
上述結果顯示，穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞無論是在 PMA 還是在 LPS 刺激條件下，都能夠產生 NETs，且通過 DNase 1 酶對 NETs-DNA 進行消化處理，進一步確證了 NETs 的產生。
2.2 β2 整合素 Mac-1 調控 LPS 刺激中性粒細胞 NETs 的形成
中性粒細胞上 β2 整合素與 ICAM-1 結合，介導中性粒細胞黏附至內皮細胞表面。β2 整合素中 LFA-1 介導中性粒細胞的慢速滾動和黏附，Mac-1 則介導中性粒細胞的爬行和遷移[23]。為了探究 β2 整合素 LFA-1 或 Mac-1 是否參與 NETs 的產生，我們利用 Mac-1 阻斷性抗體 M1/70 或 LFA-1 阻斷性抗體 Hl111 及 isotype IgG 預處理中性粒細胞，再利用 LPS 或 PMA 進行 4 h 刺激，考察 NETs 生成的變化。
LPS 刺激下，Hl111 阻斷 LFA-1 對于 NETs-DNA 的形成無顯著影響，然而 M1/70 阻斷 Mac-1 能夠顯著下調 NETs 生成（見圖2a）。M1/70 阻斷 Mac-1 后，DNA 面積較 LPS-only 組或 isotype IgG 對照組分別下降了（66 ± 10）%（P ≤ 0.001）和（86 ± 16）%（P ≤ 0.01），熒光強度也分別下降了（73 ± 9）%（P ≤ 0.001）和（71 ± 20）%（P ≤ 0.05）；isotype IgG 組的 NETs 面積和熒光強度與 LPS-only 組之間的差異無統計學意義（見圖2b 和 c）。
圖2
β2 整合素不介導 PMA 刺激的 NETs 形成，Mac-1 而不是 LFA-1 參與 LPS 誘導的 NETs 形成
a 和 d. Hl111 或 M1/70 分別抑制 LFA-1 或 Mac-1 后，在 LPS 或 PMA 刺激下中性粒細胞形成 NETs 的免疫熒光代表性圖片；b 和 c. 為 LPS 刺激 β2 整合素抑制后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果；e 和 f. 為 PMA 刺激 β2 整合素抑制后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果。比例尺為 50 μm，使用 One-way ANOVA 檢驗并進行 Tukey 多重比較。ns，差異無統計學意義；*，
a and d. the representative immunofluorescence images of NETs formation by neutrophils under LPS or PMA stimulation after inhibition of LFA-1 or Mac-1 by Hl111 or M1/70, respectively; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after LPS stimulated β2 integrin inhibition; e and f. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after PMA stimulated β2 integrin inhibition. The scale bar was 50 μm. A One-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison was used. ns, no significant; *,
經 M1/70 或 Hl111 預處理后，向穩定黏附在 ICAM-1 上的中性粒細胞施以 PMA 刺激。如圖2d 所示，抑制劑處理組（M1/70 或 Hl111）仍存在大量彌漫性 DNA。量化分析顯示，isotype IgG 處理組、LFA-1 抑制組（Hl111）和 Mac-1 抑制組（M1/70）的 NETs 面積分別為 PMA-only 組的（1.04 ± 0.07）、（1.17 ± 0.09）和（1.12 ± 0.09）倍（見圖2e）；上述三組的熒光強度分別為 PMA-only 組的（1.13 ± 0.12）、（1.05 ± 0.06）和（1.01 ± 0.18）倍（見圖2f），各組間差異無統計學意義。
上述結果表明，是 Mac-1 而非 LFA-1 參與了 LPS 誘導的穩定黏附在 ICAM-1 上的中性粒細胞 NETs 的釋放。與之不同的是，LFA-1 和 Mac-1 均不參與 PMA 刺激中性粒細胞產生 NETs 的過程。
2.3 細胞骨架參與了 LPS 或 PMA 刺激中性粒細胞 NETs 的形成
前一部分的結果表明，Mac-1 介導中性粒細胞的黏附是 LPS 誘導 NETs 產生的條件之一。Mac-1 介導的中性粒細胞黏附同樣發生在其爬行和遷移等過程中，涉及到細胞骨架的重排[24]。為了考察肌動蛋白細胞骨架在 NETs 形成中的作用，我們利用 CytoD 對中性粒細胞進行預處理以阻斷其肌動蛋白絲的聚合。經 CytoD 預處理的中性粒細胞響應 LPS 刺激形成 NETs 的能力受到顯著抑制（見圖3a）：DNA 面積和熒光強度較 LPS-only 組均下降了 95%（P ≤ 0.001）（見圖3b 和 c）。類似地，在 PMA 刺激下，CytoD 抑制中性粒細胞骨架重排后 NETs 形成也顯著減少：DNA 面積下降（68 ± 11）%（P ≤ 0.01），熒光強度下調（61 ± 7）%（P ≤ 0.001），但較 LPS 下降幅度少約 30%（見圖3d、e 和 f）。
圖3
抑制中性粒細胞細胞骨架重排減弱了 LPS 或 PMA 刺激的 NETs 形成
a 和 d. CytoD 抑制細胞骨架重排后，在 LPS 或 PMA 刺激下中性粒細胞形成 NETs 的免疫熒光代表性圖片；b 和 c. LPS 刺激細胞骨架重排抑制后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果；e 和 f. PMA 刺激細胞骨架重排抑制后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果。比例尺為 50 μm，使用 One-way ANOVA 檢驗并進行 Tukey 多重比較。*，
a and d. the representative immunofluorescence images of NETs formation by neutrophils under LPS or PMA stimulation after cytoskeletal rearrangement inhibition by CytoD; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after LPS stimulated cytoskeleton rearrangement inhibition; e and f. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after PMA stimulated cytoskeleton rearrangement inhibition. The scale bar was 50 μm. A One-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison was used. *,
以上結果表明，抑制細胞骨架重排后，LPS 或 PMA 誘導的穩定黏附于 ICAM-1 上中性粒細胞 NETs 的釋放均受到顯著下調。有趣的是，相比于 PMA 刺激，LPS 刺激導致 NETs 的產生受 CytoD 的影響更大。
2.4 Talin-1 參與了 LPS 或 PMA 刺激中性粒細胞 NETs 的形成
踝蛋白（Talin）是一類重要的細胞骨架連接蛋白。中性粒細胞胞質中存在的是 Talin-1，其通過一個柔性桿結構域與肌動蛋白結合，并通過其頭部結構與 β2 整合素的胞質區結構域結合，將 β2 整合素與細胞骨架連接起來[25-26]。為了考察 Talin-1 對于穩定黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞響應不同刺激生成 NETs 的影響，本研究利用 Talin-1 抑制劑（MNS）預處理中性粒細胞，而后進行 LPS 或 PMA 刺激誘導中性粒細胞 NETs 形成。
結果顯示，中性粒細胞在抑制 Talin-1 后，胞外彌漫性 DNA 結構明顯減少（見圖4a 和 d）。統計分析表明，LPS 刺激下，與 LPS-only 組相比，MNS 抑制組的 DNA 面積下降了（82±7）%（P ≤ 0.001）（見圖4b），DNA 熒光強度降低了（87 ± 3）%（P ≤ 0.001）（見圖4c）。在 PMA 刺激下，MNS 處理后 NETs DNA 面積和熒光強度分別降低了（75 ± 5）% 和（71 ± 3）%（P ≤ 0.001）（見圖4e 和 f）。以上結果表明，中性粒細胞響應 LPS 或 PMA 刺激，形成 NETs 均受到 Talin-1 的調控；就 Talin-1 抑制對于 NETs 形成的作用而言，LPS 組大于 PMA 組。
圖4
抑制中性粒細胞 Talin-1 減弱了 LPS 或 PMA 刺激的 NETs 形成
a 和 d. MNS 抑制 Talin-1 后，在 LPS 或 PMA 刺激下中性粒細胞形成 NETs 的免疫熒光代表性圖片；b 和 c. LPS 刺激 Talin-1 抑制后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果；e 和 f. PMA 刺激 Talin-1 抑制后的相對 NETs 面積和相對 NETs 熒光強度的量化結果。比例尺為 50 μm，使用 One-way ANOVA 檢驗并進行 Tukey 多重比較。*，
a and d. the representative immunofluorescence images of NETs formation by neutrophils after MNS inhibition of Talin-1 in response to LPS or PMA stimulation; b and c. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after LPS stimulation of Talin-1 inhibition; e and f. the quantitative results of relative NETs area and relative NETs fluorescent intensity after PMA stimulation of Talin-1 inhibition. The scale bar was 50 μm. A One-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison was used. *,
3 討論
本研究中，我們利用 LPS 模擬革蘭氏陰性菌感染導致膿毒癥的情形，考察在此炎癥環境下，中性粒細胞和內皮細胞的直接相互作用介導的 NETs 的形成。結果顯示，在 LPS 刺激下，穩定黏附于內皮 ICAM-1 表面的中性粒細胞發生了 NETosis。受細菌感染的內皮細胞會高表達 ICAM-1[14]，這可能是膿毒癥患者容易產生 NETs 的原因之一。LPS 刺激導致 NETs 的產生受 Mac-1 整合素的調控；而 β2 整合素并不參與由 PMA 誘導的 NETs 形成過程。這一結果提示 LPS 刺激中性粒細胞產生 NETs 需要中性粒細胞的黏附，這與 Erpenbeck 等[27]的觀察一致。Erpenbeck 等利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）處理多聚賴氨酸（poly-l-lysine，PLL）功能化底板抑制細胞黏附，LPS 誘導的 NETs 形成受到了顯著抑制，而 PMA 刺激誘導的 NETosis 不受細胞黏附抑制的影響。
有研究指出，肌動蛋白細胞骨架參與了 PMA 刺激黏附在 PLL 上的中性粒細胞 NETs 的形成[24]。PLL 作為一種化學合成的分子膠水強行將細胞黏附下來，與血管內皮生理環境差距甚遠。而 ICAM-1 是通過與 β2 整合素的相互作用將中性粒細胞黏附于表面。因此，黏附于 ICAM-1 上的中性粒細胞響應刺激的行為可能與黏附于 PLL 的存在差異。我們的結果顯示，細胞骨架參與了調控 LPS 刺激下 NETs 的釋放；細胞骨架同樣也參與了 PMA 誘導的中性粒細胞 NETs 的釋放，這與文獻報道的黏附在 PLL 上的中性粒細胞行為一致。值得注意的是，抑制細胞骨架對 LPS 誘導的 NETs 形成的影響大于 PMA 誘導的 NETs 形成的影響。
Talin-1 是中性粒細胞胞質中一種重要的細胞骨架接頭蛋白。它通過其頭部結構與 β2 整合素胞質結構域相互作用，通過其尾部與肌動蛋白 Actin 結合，從而將 β2 整合素與細胞骨架連接起來[28-29]。Talin-1 與另一細胞骨架連接蛋白 Kindlin-3 一起參與了中性粒細胞 β2 整合素由內到外信號（inside-out signaling）介導的活化過程[30]。我們的研究顯示 Mac-1 和細胞骨架均參與了 NETs 的形成，因此我們懷疑 Talin-1 同樣參與此過程。確實，在抑制中性粒細胞 Talin-1 之后，LPS 或 PMA 刺激穩定黏附在內皮細胞 ICAM-1 表面的中性粒細胞 NETs 的形成顯著下調。這一結果提示，雖然 LPS 和 PMA 刺激中性粒細胞可能經由不同的信號通路導致 NETs 的形成，但是細胞骨架的重排可能是 NETs 形成過程中共同的關鍵細胞事件。
4 總結
在炎癥環境下，中性粒細胞與內皮細胞的相互作用產生 NETs，在免疫血栓的形成過程中起著重要的作用。本研究表明，中性粒細胞 β2 整合素 Mac-1 協同細胞骨架和 Talin-1，參與調控 LPS 誘導穩定黏附于 ICAM-1 表面的中性粒細胞發生 NETosis；PMA 誘導的 NETs 產生則不需要 β2 整合素的參與，但需要 Talin-1 和細胞骨架的參與。本研究進一步加深了我們對膿毒癥（特別是由革蘭氏陰性菌導致的膿毒癥）條件下血管內 NETs 形成機制的理解，為免疫血栓的臨床研究和藥物開發提供了理論依據。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
