目前脫細胞基質是一種治療皮膚損傷的有效修復替代材料，但是關于其性能的系統性評價研究較少。本研究實驗組采用兩種脫細胞方法制備基質：一種是過氧乙酸（0.2% PAA/4% 乙醇溶液）滅菌后高滲鹽水脫細胞（A 組）；另一種是 γ 射線滅菌后 0.05% Trypsin 酶/EDTA 脫細胞（B 組）；對照組進行 PBS 浸泡（C 組），檢測三組組織物理特性和化學成分。不同方法處理后，蘇木精伊紅（HE）染色表明 B 組脫細胞效果良好；A、B 組組織孔隙率均在 84.9% 以上；A 組壓縮彈性模量（9.94 ± 3.81）MPa、B 組壓縮彈性模量（12.59 ± 5.50）MPa 分別與 C 組相比差異無統計學意義；A、B 組脫細胞基質中膠原蛋白總含量均顯著低于 C 組含量（1.662 ± 0.229）mg/g，但膠原Ⅰ/Ⅲ的比值 B 組與 C 組相比差異無統計學意義；掃描電鏡（SEM）、原子力顯微鏡（AFM）觀測組織微觀結構無明顯差異；定性檢測各組纖連蛋白和彈性蛋白與 C 組材料基本一致。因此，B 組脫細胞基質作為支架材料性能更好。實驗結果說明，采用 γ 射線滅菌、0.05% Trypsin 酶/EDTA 制備的脫細胞基質可用于組織工程皮膚的構建，還可為異種真皮脫細胞基質的制備及裱襯提供參考，為靜電紡絲或三維打印組織工程皮膚支架提供理化參數。
引用本文： 楊彩仙, 郭繼強, 王景輝, 范佳玉, 邢彥雪, 張利, 安美文. 兩種常見的脫細胞法對真皮脫細胞基質理化特性的影響. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(5): 911-918. doi: 10.7507/1001-5515.202103019 復制
引言
脫細胞基質是一種治療皮膚損傷的有效修復替代材料[1]，制備與人體真皮結構相近的脫細胞基質是當前研究的難點。真皮損傷修復手段主要有自體移植、異種真皮脫細胞基質移植、同種異體真皮脫細胞基質移植，但臨床效果不一。目前，國外有關真皮脫細胞基質的主要產品有 AlloDerm 和 AlloDerm RTU 等，國內有“瑞諾”和“桀亞”等，但關于理化性質方面的系統性評價研究較少。
常用的脫細胞基質制備方法包括物理處理、化學處理、生物酶處理或以上幾種方法結合起來對組織進行脫細胞處理[2-3]。由于細胞密度、基質密度、組織厚度和形狀等原因，不同組織和器官脫細胞的最佳方法不同[4-7]，針對皮膚組織的最優、最快組織工程皮膚構建方法報道較少[8-9]。單純的物理脫細胞方法對細胞內容物去除效果不佳[10]；化學處理方法中去垢劑如十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）脫細胞效果較強，可以完全去核[11]，但存在細胞外基質（extracellular matrix，ECM）超微結構破壞、生長因子消除和化學試劑殘留等問題[12-14]；生物酶處理如 Trypsin 酶可以使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散，可以高特異性地去除細胞殘留或不良的 ECM 成分，從致密組織中完全去除細胞核[15-18]。
本研究在前期研究的基礎上，簡化處理步驟，防止氫氧化鈉等對人體會產生危害的試劑殘留，選用對人體較安全的酶或高滲鹽水進行脫細胞[8, 19-22]，并且增加滅菌的步驟以避免未滅菌人體真皮具有傳染性疾病的危害[8]。兩步法處理脫細胞基質如下：采用 γ 射線和過氧乙酸（peroxyacetic acid，PAA）兩種方法分別對人體皮膚組織進行滅菌[23]，采用 Trypsin 酶和高滲鹽水分別進行脫細胞處理。將兩組材料理化參數與正常皮膚組織對比分析，得出脫細胞基質的物理結構、生物化學成分等參數，可為異種真皮脫細胞基質的制備及裱襯提供參考，為靜電紡絲或三維（three-dimensional，3D）打印組織工程皮膚支架提供理化參數。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
主要試劑為 DMEM 培養液（HyClone，美國）、DMSO（生工，上海）、4% 多聚甲醛（C0402，Sigma，美國）、Trypsin 酶/EDTA 液（ScienCell，美國）、過氧乙酸 AB 型（瑞泰奇，山東）、苦味酸天狼星紅染液（Sirius Red，F3D，美國）、纖連蛋白染色抗體（Anti-Fibronectin Rabbit pAb，山羊抗兔二抗，賽維爾，武漢）、羥脯氨酸試劑盒（凡科維，青島）、CCK-8（碧云天，上海）等。主要儀器為超低溫冰箱（Eppendorf，德國）、CO2 培養箱（Thermo Forma，美國）、掃描電子顯微鏡（JSM-7100F，Jeol，日本）、原子力顯微鏡（L01K180，BRUKE，德國）、熒光顯微成像系統（iX70，Olympus，日本）、電熱鼓風干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅實業有限公司醫療設備廠，中國）、萬能試驗機（Instron 5544，英斯特朗上海材料試驗機公司，中國）、酶標檢測儀（Rayto Rt2100c，Rayto，美國）、紅外光譜儀（Bruker，德國）等。
1.2 支架材料制備
經過太原理工大學倫理委員會批準，收集山西白求恩醫院門診行包皮環切術的包皮標本。取樣后用生理鹽水反復沖洗，碘伏消毒，使用含 1% 青-鏈霉素的 PBS（青霉素及鏈霉素濃度分別為 10 000 U/mL、10 000 μg/mL）浸潤消毒 30 min，PBS 洗 3 遍。隨機將 30 例包皮分為 3 組，A 組為過氧乙酸（0.2% PAA/4% 乙醇溶液）滅菌、高滲鹽水脫細胞；B 組為 γ 射線滅菌、0.05%Trypsin 酶/EDTA 脫細胞；C 組為對照組，進行 PBS 浸泡處理。
取 A 組樣品在搖床上用 0.2% PAA/4% 乙醇溶液滅菌 6 h，用含 1% 青-鏈霉素的無菌 PBS 沖洗，然后加入濃度為 58.5 g/L 的 NaCl 溶液 100 mL，置于 4℃ 冰箱中 24 h，最后使用含 1% 青-鏈霉素的無菌 PBS 搖床清洗 24 h。B 組樣品使用劑量率為 1 000 Gy/h，總劑量 25 kGy 的 γ 射線照射，再以 0.05% Trypsin 酶/EDTA 液孵育 24 h，最后使用含 1% 青-鏈霉素的無菌 PBS 搖床清洗 24 h。C 組僅使用含 1% 青-鏈霉素的無菌 PBS 搖床清洗 24 h。以下檢測全部在真皮上進行。
1.3 檢測指標
1.3.1 支架顯微結構檢測
將 3 組樣品切下后用 PBS 洗滌，甲醛溶液固定，常規乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，光學顯微鏡觀察脫細胞情況。將 3 組組織使用 2.5% 戊二醛磷酸緩沖液室溫固定 4 h，乙醇梯度脫水后冷凍干燥樣品，掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察并拍照，使用 Image J 統計纖維直徑數值。原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）檢測：將 2 種（n = 3）脫細胞基質以及對照組樣品風干后貼附在直徑 35 mm 的培養皿上，室溫空氣中使用一個探針（模型 NCHV，BRUKER，美國）和 1 Hz 掃描頻率在輕敲模式下掃描組織表面，掃描面尺寸為 10 μm × 10 μm。使用 Nanoscope 軟件對結果進行評估。
1.3.2 孔隙率測量及生物力學壓縮性能
每組支架（n = 3）冷凍干燥，每個支架干燥后稱重記為 m1，置入 50 mL 含體積分數 75% 的乙醇離心管。抽真空至不再有氣泡溢出，稱含有乙醇和支架材料離心管 m2，將含有乙醇的支架材料取出，稱剩余的乙醇及離心管 m3。按式（1）計算孔隙率（P）：
 |
將各組支架（n = 3）制成適當尺寸，每個樣品三次測量其厚度，取平均值計算其應變達到 80% 的位移，采用 Instron 5544 萬能試驗機，設置下降速率為 1 mm/min，結束條件為應變達到 80%。使用文獻報道的模型對實驗獲得的載荷-位移曲線進行分析，按照式（2）計算獲得皮膚的整體剛度，其中 F 表示載荷，E 為皮膚的整體剛度，a 為探針半徑，s 表示位移，
表示泊松比，此處取值為 0.5。
 |
1.3.3 膠原總含量和膠原成分比例測定
根據凡科維試劑盒組織樣品處理方法處理組織并檢測各組樣品（n = 3）中羥脯氨酸含量，同時與標準液吸光度值繪制出的標準曲線相比，按羥脯氨酸含量占膠原總含量約 10% 換算出測試樣品的膠原總含量。將石蠟切片脫蠟，苦味酸天狼星紅染液浸染 1 h，蘇木精復染。偏振光顯微鏡觀察三組樣品中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分布情況，通過 Image J 分析各組樣品Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的比例。
1.3.4 纖連蛋白和彈性蛋白檢測
將石蠟切片按照操作規程進行脫蠟和水化后，高溫修復抗原；滴加 H2O2，室溫孵育；滴加一滴非免疫動物血清，室溫孵育；滴加一抗和二抗，室溫孵育后 DAB 顯色和蘇木素復染。采用衰減全反射法（attenuated total refraction，ATR），在紅外光譜儀波數 4 000～400 cm–1的測試條件下掃描每組樣品（n = 3），采集樣品的紅外光譜。
1.3.5 細胞活性檢測
設置對照孔（僅有細胞），把人真皮成纖維細胞 4～6 代與脫細胞基質（n = 3）共培養于 24 孔板，接種密度為 1 000 個/孔，使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養細胞 24 h 后，采用 CCK-8 孵育 1 h，在酶標儀 450 nm 處檢測對照孔及各組基質的培養液吸光度值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS24.0 軟件進行統計學分析。定量數據采用平均值 ± 標準差表示，測試樣本為 3，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準為 0.05。
2 結果
2.1 真皮脫細胞效果及脫細胞基質的顯微結構
HE 染色中蘇木精使細胞核內的染色質與胞質內的核酸著藍紫色，伊紅使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。各組材料 HE 染色結果見圖 1a。C 組作為陰性對照組，真皮中存在大量細胞，A 組基質脫細胞效果較差，分布著較多核酸成分；B 組脫細胞效果良好，基本無核酸成分。SEM 是利用二次電子信號成像來觀察樣品的表面形態。使用 SEM 觀察了三組材料內部結構（從表面裂縫觀察），由圖 1b 可見三種材料內部縱橫交錯的纖維，呈現孔隙較均勻的三維網狀結構。
圖1
各組材料脫細胞效果及基質內部結構（
± SD）
a. HE 染色圖（Bar = 50 μm）；b. SEM 觀察材料內部圖（Bar = 10 μm）；c.各組材料纖維直徑；d.各組材料纖維直徑分布情況
Figure1. Acellularization effect and matrix internal structure of each group (
± SD)
a. HE staining diagram (Bar = 50 μm); b. SEM to observe the internal drawing of the material (Bar = 10 μm); c. fiber diameter of each group; d. fiber diameter distribution of each group
統計膠原纖維的直徑，A 組為（1.2 ± 0.4）μm，B 組為（1.7 ± 0.7）μm，C 組為（1.7 ± 0.2）μm，直方圖如圖 1c 所示。每張圖統計與隨機直線相交的前 5 條纖維，每組共有 15 條纖維，分別按纖維直徑小于 1、2、3、4、5 μm 統計各段的纖維直徑出現的總頻數，得到各組纖維分布情況如圖 1d 所示。
從圖 1c 和圖 1d 中纖維直徑分布可以看出，與 C 組纖維直徑相比，A 組較大直徑的膠原纖維損失嚴重，表現為僅存在直徑 ≤ 3 μm 的纖維，統計纖維分布發現 A 組纖維直徑主要集中在 1～2 μm。從不同直徑的分布情況看，不同組別之間存在一定的趨勢，A 組處理方法纖維直徑平均值具有低于其他組的趨勢。
AFM 的分辨率為納米量級，圖 2a 是使用 AFM 觀察到的三組材料表面微形貌，圖 2b 是各組材料微觀表面高度，圖 2c 是各組材料表面粗糙度結果。A、B、C 組高度分別為（1 577.3 ± 1 204.4）、（2 451.0 ± 404.4）、（1 659.3 ± 605.4）nm；粗糙度分別為 0.746 ± 0.047、0.819 ± 0.007、0.790 ± 0.035。原子力檢測支架表面 100 μm2的面積內發現最高高度和粗糙度在 A、B 與 C 組之間差異無統計學意義，即 A、B 組處理方法均未改變基質的微觀結構。
圖2
各組材料表面微結構（
± SD）
a. AFM 高度模式圖；b.各組材料表面微區高度平均值；c.各組材料表面粗糙度值
Figure2. Surface microstructure of each group (
± SD)
a. AFM height pattern diagram; b. average height of microzone on the surface of each group of materials; c. surface roughness of each group of materials
2.2 脫細胞基質的孔隙率及生物力學壓縮性能測試結果
固體材料孔隙率可反映材料的疏密程度。通過測量支架孔隙率，本文發現 A 組（84.9 ± 5.0）%、B 組（86.7 ± 2.1）% 相比 C 組的孔隙率（59.2 ± 9.9）% 均上升，差異有統計學意義，分別為 P = 0.001、P = 0.000。表明細胞脫除使得組織孔隙率增大，具體數值如圖 3a 所示。A 組材料的壓縮彈性模量最小，為（9.94 ± 3.81）MPa；B 組材料壓縮彈性模量最大，為（12.59 ± 5.50）MPa。A 組和 B 組材料的壓縮彈性模量與 C 組壓縮彈性模量（6.75 ± 2.20）MPa 相比差異無統計學意義（P > 0.05），結果如圖 3b 所示。
圖3
各組材料孔隙率及壓縮彈性模量（
± SD）
a.各組材料孔隙率；b.各組材料壓縮彈性模量。**表示
± SD)
a. void ratio of each group of materials; b. modulus of compression elasticity of each group of materials. **
2.3 脫細胞基質的膠原總含量及膠原Ⅰ/Ⅲ的比值
檢測 A、B、C 組膠原總含量分別為（1.227 ± 0.061）、（1.255 ± 0.025）、（1.662 ± 0.229）mg/g，A、B 組中膠原蛋白總含量均低于 C 組含量，且與 C 組相比差異具有統計學意義，分別為 P = 0.003、P = 0.004，結果如圖 4b 所示。在偏振光顯微鏡下觀察，Ⅰ型膠原纖維顯示很強的雙折光性，為紅色或黃色纖維，Ⅲ型膠原顯示弱的雙折光性，為綠色細纖維，染色結果如圖 4a 所示。統計膠原Ⅰ/Ⅲ的比值，發現 B 組（1.003 ± 0.002）與 C 組（1.006 ± 0.007）相比無顯著差異，但 A 組（0.999 ± 0.003）與 C 組相比，差異具有統計學意義（P = 0.004），直方圖如圖 4c 所示。
圖4
各組材料的膠原總含量及膠原比值（
± SD）
a.各組材料天狼星紅染色圖（Bar = 50 μm）；b.各組材料膠原總含量；c.各組材料膠原比例。*表示
± SD)
a. Sirius red staining of each group of materials (Bar = 50 μm); b. total collagen content in each group; c. proportion of collagen in each group. *
2.4 脫細胞基質的纖連蛋白染色及彈性蛋白定性
三組材料纖連蛋白均表現陽性結果，B 組陽性結果較弱，說明 B 組處理方法導致纖連蛋白含量下降，A 組陽性與 C 組程度一致，說明 A 組處理過程中未顯著破壞組織的纖連蛋白，染色結果如圖 5a 所示。紅外譜圖中存在彈性蛋白與膠原蛋白、糖胺聚糖、纖連蛋白等蛋白質都有的 1 650 cm–1附近酰胺Ⅰ、1 550 cm–1附近酰胺Ⅱ的特征峰外，還存在彈性蛋白在 3 309.8、1 651、1 539.1、1 238.2 cm–1處的四個特征吸收峰，分別對應于酰胺-A 帶中的 N－H 伸縮振動吸收峰、酰胺-Ⅰ帶中的 C=O 伸縮振動吸收峰、酰胺-Ⅱ帶的 C－N 伸縮振動吸收峰和酰胺-Ⅲ帶的 N－H 彎曲振動吸收峰，說明三組材料均存在彈性蛋白，結果如圖 5b 所示。
圖5
各組材料纖連蛋白染色及彈性蛋白定性檢測結果
a.纖連蛋白免疫組化染色（Bar = 50 μm）；b.各組材料彈性蛋白紅外檢測結果
Figure5. The results of fibronectin staining and elastin qualitative determinationa. fibronectin immunohistochemical staining (Bar = 50 μm); b. infrared detection results of elastin in each group
2.5 成纖維細胞在脫細胞基質中的增殖情況
接種人真皮成纖維細胞后，對照組（C 組）及 A、B 組材料周圍細胞生長狀況如圖 6a 所示，CCK-8 檢測細胞活性直方圖如圖 6b 所示。24 h 細胞活性檢測 A、B 組與對照孔差異無統計學意義。
圖6
對照孔及各組材料周圍細胞活性
a.對照孔及各組材料周圍細胞生長狀況（Bar = 100 μm）；b.對照組與各組材料 CCK-8 細胞活力檢測結果
Figure6. Cell activity around the control hole and materials of each groupa. growth of cells around the control hole and each group of materials (Bar = 100 μm); b. CCK-8 cell viability test results of control group and each group
3 討論
在調節生物物理刺激、生物化學和分子信號以及空間結構方面，天然 ECM 發揮著重要作用。脫細胞組織來自天然 ECM，在植入體內后，隨時間延長可逐漸被患者自身的組織所取代[1]。脫細胞方案的理想目標是去除所有的細胞物質，而不影響剩余 ECM 的組成、機械完整性和生物化學活性[22]，但是脫細胞過程總會造成 ECM 的改變。為了研究這種改變，本研究將脫細胞真皮基質與未脫除細胞的皮膚組織進行對比，篩選出理化性能最接近人體正常皮膚的脫細胞基質，其可用于組織工程皮膚的構建，還可為異種真皮脫細胞基質的制備及裱襯提供參考，為靜電紡絲或 3D 打印組織工程皮膚支架提供理化參數。
本文使用了兩種常用的組織移植物滅菌方法：γ 射線和 PAA。這兩種方法滅菌操作簡便、高效、安全。γ 射線照射可去除細胞中易引起免疫排斥反應的成分，被廣泛應用于藥物和脫細胞豬角膜等材料的滅菌[24-26]。由于 γ 射線穿透性強，滅菌同時可因電離作用使細胞死亡。已有研究表明 PAA 可以在低濃度下滅活病毒、真菌和細菌，同時可通過電子轉移氧化細胞膜上的基團，從而引發細胞死亡，產生的副產物為水、氧和二氧化碳[3]，對人體較安全。此外，有研究指出先滅菌有利于提高細胞的脫除效率[8]，故本文使用這兩種滅菌方法作為脫細胞的前處理。
脫細胞真皮基質要脫除具有免疫抗原性的細胞，本文通過 HE 染色發現 B 組無核酸成分，脫細胞效果優于 A 組，說明酶對細胞脫除具有顯著的效果。使用 SEM 和 AFM 觀察材料微觀結構[27-31]，結果顯示 A、B 組材料在微觀結構方面與 C 組相比差異均無統計學意義，但 A 組纖維直徑相對 B 組與 C 組較小，提示 PAA 滅菌后高滲鹽處理對纖維直徑的破壞較大。
孔隙率反映材料內部的疏松程度，孔隙率越大，材料內部越疏松，細胞越容易長入材料內部。A、B 組孔隙率均遠大于對照組 C 組，而 A 組與 B 組孔隙率相比差異無統計學意義，提示兩種方法處理的基質內部孔隙基本一致。一般方法的支架孔隙率約為（74.28 ± 2.06）%[32-34]，而本研究的脫細胞真皮基質孔隙率為（84.9 ± 5.0）% 和（86.7 ± 2.1）%，高于傳統方法。檢測發現正常組織中間也存在空隙，對比正常組織孔隙率可間接證明本文細胞脫除的有效性。較大的孔隙率初步表明本文脫細胞真皮基質的結構便于細胞長入[35-36]。支架移植后需要包扎治療，承受壓力，故本研究檢測脫除細胞前、后的支架壓縮彈性模量[37]，結果表明 A 組高滲鹽水處理、B 組酶處理后脫細胞真皮基質的壓縮彈性模量接近正常皮膚，說明脫細胞處理未影響基質壓縮彈性模量。
為了探索本文脫細胞基質在化學組分上是否有利于細胞長入，我們檢測了樣品脫細胞前、后的組分及含量變化。檢測膠原總含量變化發現，與 C 組相比，A、B 組膠原總含量下降，差異具有統計學意義（均為 P < 0.01）。A 組或許是酸性環境加速了膠原蛋白的水解，B 組或許是 γ 射線使膠原缺失[3]。Ⅰ、Ⅲ型膠原是皮膚中含量最多的兩種膠原成分，分別占皮膚膠原總量的 80%～85% 和 10%～15%[38]，據文獻報道膠原比例與人的年齡與取皮位置有關[39-41]，成人Ⅰ/Ⅲ型膠原比值范圍為 1～2。本研究檢測這兩種膠原比例比值約為 1，與邱林[42]報道的比值 1.2～1.3 相近，且經處理后膠原比例在 B 組與對照組之間差異無統計學意義。說明 B 組很好地保留了膠原比例，即 γ 射線滅菌、酶處理未顯著破壞膠原Ⅰ/Ⅲ的比例。兩組基質脫細胞后膠原蛋白總含量均有所下降，但是 B 組Ⅰ/Ⅲ型膠原的比例與對照組相比差異無統計學意義，說明 B 組脫細胞后細胞外基質的改變較小。
纖連蛋白可影響細胞的黏附、遷移，本文 B 組纖連蛋白明顯少于 C 組，暗示 γ 射線照射和酶處理會使基質損失一部分纖連蛋白，而 PAA 滅菌、高滲鹽水脫細胞的纖連蛋白保留效果較好。彈性纖維蛋白與支架彈性相關，故本文通過紅外光譜圖定性檢測了脫細胞前、后各組彈性蛋白[43]，發現 A、B 組與對照組均出現彈性蛋白特征峰，說明兩組脫細胞方法對彈性蛋白無影響。脫細胞支架使用目的是要植入人體，要求脫細胞基質對細胞無毒性。A、B 組材料的生物學活性差異無統計學意義，猜測與支架的微觀形貌結構差異無統計學意義有關，與材料的化學組分結構、成分相近有關。
綜上所述，A 組與 B 組性能對比發現，A 組纖連蛋白保留較好，但細胞脫除效果不如 B 組；B 組對膠原比例的破壞低于 A 組，且細胞脫除效果優于 A 組；基質與細胞共培養 24 h 以上發現，A、B 組基質對細胞生長的影響差異無統計學意義，但這只是短期的培養，若要應用于人體，后期需要檢測材料與細胞共培養較長時間細胞的生長狀態。
4 結論
本文認為 γ 射線滅菌后，Trypsin 酶脫細胞對脫細胞真皮基質的理化特性無顯著破壞作用，其制備的脫細胞真皮基質的理化特性較 PAA 滅菌后高滲鹽脫細胞更接近于對照組。故本文認為 γ 射線滅菌、0.05% Trypsin 酶/EDTA 脫細胞制備脫細胞基質性能較好。本文中 γ 射線滅菌后，Trypsin 酶脫細胞構建的脫細胞基質不僅可以直接用于組織工程皮膚的構建，還可為異種真皮脫細胞基質的制備及裱襯提供參考，為靜電紡絲或 3D 打印組織工程皮膚支架提供理化參數。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
脫細胞基質是一種治療皮膚損傷的有效修復替代材料[1]，制備與人體真皮結構相近的脫細胞基質是當前研究的難點。真皮損傷修復手段主要有自體移植、異種真皮脫細胞基質移植、同種異體真皮脫細胞基質移植，但臨床效果不一。目前，國外有關真皮脫細胞基質的主要產品有 AlloDerm 和 AlloDerm RTU 等，國內有“瑞諾”和“桀亞”等，但關于理化性質方面的系統性評價研究較少。
常用的脫細胞基質制備方法包括物理處理、化學處理、生物酶處理或以上幾種方法結合起來對組織進行脫細胞處理[2-3]。由于細胞密度、基質密度、組織厚度和形狀等原因，不同組織和器官脫細胞的最佳方法不同[4-7]，針對皮膚組織的最優、最快組織工程皮膚構建方法報道較少[8-9]。單純的物理脫細胞方法對細胞內容物去除效果不佳[10]；化學處理方法中去垢劑如十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）脫細胞效果較強，可以完全去核[11]，但存在細胞外基質（extracellular matrix，ECM）超微結構破壞、生長因子消除和化學試劑殘留等問題[12-14]；生物酶處理如 Trypsin 酶可以使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散，可以高特異性地去除細胞殘留或不良的 ECM 成分，從致密組織中完全去除細胞核[15-18]。
本研究在前期研究的基礎上，簡化處理步驟，防止氫氧化鈉等對人體會產生危害的試劑殘留，選用對人體較安全的酶或高滲鹽水進行脫細胞[8, 19-22]，并且增加滅菌的步驟以避免未滅菌人體真皮具有傳染性疾病的危害[8]。兩步法處理脫細胞基質如下：采用 γ 射線和過氧乙酸（peroxyacetic acid，PAA）兩種方法分別對人體皮膚組織進行滅菌[23]，采用 Trypsin 酶和高滲鹽水分別進行脫細胞處理。將兩組材料理化參數與正常皮膚組織對比分析，得出脫細胞基質的物理結構、生物化學成分等參數，可為異種真皮脫細胞基質的制備及裱襯提供參考，為靜電紡絲或三維（three-dimensional，3D）打印組織工程皮膚支架提供理化參數。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
主要試劑為 DMEM 培養液（HyClone，美國）、DMSO（生工，上海）、4% 多聚甲醛（C0402，Sigma，美國）、Trypsin 酶/EDTA 液（ScienCell，美國）、過氧乙酸 AB 型（瑞泰奇，山東）、苦味酸天狼星紅染液（Sirius Red，F3D，美國）、纖連蛋白染色抗體（Anti-Fibronectin Rabbit pAb，山羊抗兔二抗，賽維爾，武漢）、羥脯氨酸試劑盒（凡科維，青島）、CCK-8（碧云天，上海）等。主要儀器為超低溫冰箱（Eppendorf，德國）、CO2 培養箱（Thermo Forma，美國）、掃描電子顯微鏡（JSM-7100F，Jeol，日本）、原子力顯微鏡（L01K180，BRUKE，德國）、熒光顯微成像系統（iX70，Olympus，日本）、電熱鼓風干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅實業有限公司醫療設備廠，中國）、萬能試驗機（Instron 5544，英斯特朗上海材料試驗機公司，中國）、酶標檢測儀（Rayto Rt2100c，Rayto，美國）、紅外光譜儀（Bruker，德國）等。
1.2 支架材料制備
經過太原理工大學倫理委員會批準，收集山西白求恩醫院門診行包皮環切術的包皮標本。取樣后用生理鹽水反復沖洗，碘伏消毒，使用含 1% 青-鏈霉素的 PBS（青霉素及鏈霉素濃度分別為 10 000 U/mL、10 000 μg/mL）浸潤消毒 30 min，PBS 洗 3 遍。隨機將 30 例包皮分為 3 組，A 組為過氧乙酸（0.2% PAA/4% 乙醇溶液）滅菌、高滲鹽水脫細胞；B 組為 γ 射線滅菌、0.05%Trypsin 酶/EDTA 脫細胞；C 組為對照組，進行 PBS 浸泡處理。
取 A 組樣品在搖床上用 0.2% PAA/4% 乙醇溶液滅菌 6 h，用含 1% 青-鏈霉素的無菌 PBS 沖洗，然后加入濃度為 58.5 g/L 的 NaCl 溶液 100 mL，置于 4℃ 冰箱中 24 h，最后使用含 1% 青-鏈霉素的無菌 PBS 搖床清洗 24 h。B 組樣品使用劑量率為 1 000 Gy/h，總劑量 25 kGy 的 γ 射線照射，再以 0.05% Trypsin 酶/EDTA 液孵育 24 h，最后使用含 1% 青-鏈霉素的無菌 PBS 搖床清洗 24 h。C 組僅使用含 1% 青-鏈霉素的無菌 PBS 搖床清洗 24 h。以下檢測全部在真皮上進行。
1.3 檢測指標
1.3.1 支架顯微結構檢測
將 3 組樣品切下后用 PBS 洗滌，甲醛溶液固定，常規乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，光學顯微鏡觀察脫細胞情況。將 3 組組織使用 2.5% 戊二醛磷酸緩沖液室溫固定 4 h，乙醇梯度脫水后冷凍干燥樣品，掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察并拍照，使用 Image J 統計纖維直徑數值。原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）檢測：將 2 種（n = 3）脫細胞基質以及對照組樣品風干后貼附在直徑 35 mm 的培養皿上，室溫空氣中使用一個探針（模型 NCHV，BRUKER，美國）和 1 Hz 掃描頻率在輕敲模式下掃描組織表面，掃描面尺寸為 10 μm × 10 μm。使用 Nanoscope 軟件對結果進行評估。
1.3.2 孔隙率測量及生物力學壓縮性能
每組支架（n = 3）冷凍干燥，每個支架干燥后稱重記為 m1，置入 50 mL 含體積分數 75% 的乙醇離心管。抽真空至不再有氣泡溢出，稱含有乙醇和支架材料離心管 m2，將含有乙醇的支架材料取出，稱剩余的乙醇及離心管 m3。按式（1）計算孔隙率（P）：
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將各組支架（n = 3）制成適當尺寸，每個樣品三次測量其厚度，取平均值計算其應變達到 80% 的位移，采用 Instron 5544 萬能試驗機，設置下降速率為 1 mm/min，結束條件為應變達到 80%。使用文獻報道的模型對實驗獲得的載荷-位移曲線進行分析，按照式（2）計算獲得皮膚的整體剛度，其中 F 表示載荷，E 為皮膚的整體剛度，a 為探針半徑，s 表示位移， 表示泊松比，此處取值為 0.5。
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1.3.3 膠原總含量和膠原成分比例測定
根據凡科維試劑盒組織樣品處理方法處理組織并檢測各組樣品（n = 3）中羥脯氨酸含量，同時與標準液吸光度值繪制出的標準曲線相比，按羥脯氨酸含量占膠原總含量約 10% 換算出測試樣品的膠原總含量。將石蠟切片脫蠟，苦味酸天狼星紅染液浸染 1 h，蘇木精復染。偏振光顯微鏡觀察三組樣品中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分布情況，通過 Image J 分析各組樣品Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的比例。
1.3.4 纖連蛋白和彈性蛋白檢測
將石蠟切片按照操作規程進行脫蠟和水化后，高溫修復抗原；滴加 H2O2，室溫孵育；滴加一滴非免疫動物血清，室溫孵育；滴加一抗和二抗，室溫孵育后 DAB 顯色和蘇木素復染。采用衰減全反射法（attenuated total refraction，ATR），在紅外光譜儀波數 4 000～400 cm–1的測試條件下掃描每組樣品（n = 3），采集樣品的紅外光譜。
1.3.5 細胞活性檢測
設置對照孔（僅有細胞），把人真皮成纖維細胞 4～6 代與脫細胞基質（n = 3）共培養于 24 孔板，接種密度為 1 000 個/孔，使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養細胞 24 h 后，采用 CCK-8 孵育 1 h，在酶標儀 450 nm 處檢測對照孔及各組基質的培養液吸光度值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS24.0 軟件進行統計學分析。定量數據采用平均值 ± 標準差表示，測試樣本為 3，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準為 0.05。
2 結果
2.1 真皮脫細胞效果及脫細胞基質的顯微結構
HE 染色中蘇木精使細胞核內的染色質與胞質內的核酸著藍紫色，伊紅使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。各組材料 HE 染色結果見圖 1a。C 組作為陰性對照組，真皮中存在大量細胞，A 組基質脫細胞效果較差，分布著較多核酸成分；B 組脫細胞效果良好，基本無核酸成分。SEM 是利用二次電子信號成像來觀察樣品的表面形態。使用 SEM 觀察了三組材料內部結構（從表面裂縫觀察），由圖 1b 可見三種材料內部縱橫交錯的纖維，呈現孔隙較均勻的三維網狀結構。
圖1
各組材料脫細胞效果及基質內部結構（ ± SD）
a. HE 染色圖（Bar = 50 μm）；b. SEM 觀察材料內部圖（Bar = 10 μm）；c.各組材料纖維直徑；d.各組材料纖維直徑分布情況
Figure1. Acellularization effect and matrix internal structure of each group ( ± SD)
a. HE staining diagram (Bar = 50 μm); b. SEM to observe the internal drawing of the material (Bar = 10 μm); c. fiber diameter of each group; d. fiber diameter distribution of each group
統計膠原纖維的直徑，A 組為（1.2 ± 0.4）μm，B 組為（1.7 ± 0.7）μm，C 組為（1.7 ± 0.2）μm，直方圖如圖 1c 所示。每張圖統計與隨機直線相交的前 5 條纖維，每組共有 15 條纖維，分別按纖維直徑小于 1、2、3、4、5 μm 統計各段的纖維直徑出現的總頻數，得到各組纖維分布情況如圖 1d 所示。
從圖 1c 和圖 1d 中纖維直徑分布可以看出，與 C 組纖維直徑相比，A 組較大直徑的膠原纖維損失嚴重，表現為僅存在直徑 ≤ 3 μm 的纖維，統計纖維分布發現 A 組纖維直徑主要集中在 1～2 μm。從不同直徑的分布情況看，不同組別之間存在一定的趨勢，A 組處理方法纖維直徑平均值具有低于其他組的趨勢。
AFM 的分辨率為納米量級，圖 2a 是使用 AFM 觀察到的三組材料表面微形貌，圖 2b 是各組材料微觀表面高度，圖 2c 是各組材料表面粗糙度結果。A、B、C 組高度分別為（1 577.3 ± 1 204.4）、（2 451.0 ± 404.4）、（1 659.3 ± 605.4）nm；粗糙度分別為 0.746 ± 0.047、0.819 ± 0.007、0.790 ± 0.035。原子力檢測支架表面 100 μm2的面積內發現最高高度和粗糙度在 A、B 與 C 組之間差異無統計學意義，即 A、B 組處理方法均未改變基質的微觀結構。
圖2
各組材料表面微結構（ ± SD）
a. AFM 高度模式圖；b.各組材料表面微區高度平均值；c.各組材料表面粗糙度值
Figure2. Surface microstructure of each group ( ± SD)
a. AFM height pattern diagram; b. average height of microzone on the surface of each group of materials; c. surface roughness of each group of materials
2.2 脫細胞基質的孔隙率及生物力學壓縮性能測試結果
固體材料孔隙率可反映材料的疏密程度。通過測量支架孔隙率，本文發現 A 組（84.9 ± 5.0）%、B 組（86.7 ± 2.1）% 相比 C 組的孔隙率（59.2 ± 9.9）% 均上升，差異有統計學意義，分別為 P = 0.001、P = 0.000。表明細胞脫除使得組織孔隙率增大，具體數值如圖 3a 所示。A 組材料的壓縮彈性模量最小，為（9.94 ± 3.81）MPa；B 組材料壓縮彈性模量最大，為（12.59 ± 5.50）MPa。A 組和 B 組材料的壓縮彈性模量與 C 組壓縮彈性模量（6.75 ± 2.20）MPa 相比差異無統計學意義（P > 0.05），結果如圖 3b 所示。
圖3
各組材料孔隙率及壓縮彈性模量（ ± SD）
a.各組材料孔隙率；b.各組材料壓縮彈性模量。**表示
± SD)
a. void ratio of each group of materials; b. modulus of compression elasticity of each group of materials. **
2.3 脫細胞基質的膠原總含量及膠原Ⅰ/Ⅲ的比值
檢測 A、B、C 組膠原總含量分別為（1.227 ± 0.061）、（1.255 ± 0.025）、（1.662 ± 0.229）mg/g，A、B 組中膠原蛋白總含量均低于 C 組含量，且與 C 組相比差異具有統計學意義，分別為 P = 0.003、P = 0.004，結果如圖 4b 所示。在偏振光顯微鏡下觀察，Ⅰ型膠原纖維顯示很強的雙折光性，為紅色或黃色纖維，Ⅲ型膠原顯示弱的雙折光性，為綠色細纖維，染色結果如圖 4a 所示。統計膠原Ⅰ/Ⅲ的比值，發現 B 組（1.003 ± 0.002）與 C 組（1.006 ± 0.007）相比無顯著差異，但 A 組（0.999 ± 0.003）與 C 組相比，差異具有統計學意義（P = 0.004），直方圖如圖 4c 所示。
圖4
各組材料的膠原總含量及膠原比值（ ± SD）
a.各組材料天狼星紅染色圖（Bar = 50 μm）；b.各組材料膠原總含量；c.各組材料膠原比例。*表示
± SD)
a. Sirius red staining of each group of materials (Bar = 50 μm); b. total collagen content in each group; c. proportion of collagen in each group. *
2.4 脫細胞基質的纖連蛋白染色及彈性蛋白定性
三組材料纖連蛋白均表現陽性結果，B 組陽性結果較弱，說明 B 組處理方法導致纖連蛋白含量下降，A 組陽性與 C 組程度一致，說明 A 組處理過程中未顯著破壞組織的纖連蛋白，染色結果如圖 5a 所示。紅外譜圖中存在彈性蛋白與膠原蛋白、糖胺聚糖、纖連蛋白等蛋白質都有的 1 650 cm–1附近酰胺Ⅰ、1 550 cm–1附近酰胺Ⅱ的特征峰外，還存在彈性蛋白在 3 309.8、1 651、1 539.1、1 238.2 cm–1處的四個特征吸收峰，分別對應于酰胺-A 帶中的 N－H 伸縮振動吸收峰、酰胺-Ⅰ帶中的 C=O 伸縮振動吸收峰、酰胺-Ⅱ帶的 C－N 伸縮振動吸收峰和酰胺-Ⅲ帶的 N－H 彎曲振動吸收峰，說明三組材料均存在彈性蛋白，結果如圖 5b 所示。
圖5
各組材料纖連蛋白染色及彈性蛋白定性檢測結果
a.纖連蛋白免疫組化染色（Bar = 50 μm）；b.各組材料彈性蛋白紅外檢測結果
Figure5. The results of fibronectin staining and elastin qualitative determinationa. fibronectin immunohistochemical staining (Bar = 50 μm); b. infrared detection results of elastin in each group
2.5 成纖維細胞在脫細胞基質中的增殖情況
接種人真皮成纖維細胞后，對照組（C 組）及 A、B 組材料周圍細胞生長狀況如圖 6a 所示，CCK-8 檢測細胞活性直方圖如圖 6b 所示。24 h 細胞活性檢測 A、B 組與對照孔差異無統計學意義。
圖6
對照孔及各組材料周圍細胞活性
a.對照孔及各組材料周圍細胞生長狀況（Bar = 100 μm）；b.對照組與各組材料 CCK-8 細胞活力檢測結果
Figure6. Cell activity around the control hole and materials of each groupa. growth of cells around the control hole and each group of materials (Bar = 100 μm); b. CCK-8 cell viability test results of control group and each group
3 討論
在調節生物物理刺激、生物化學和分子信號以及空間結構方面，天然 ECM 發揮著重要作用。脫細胞組織來自天然 ECM，在植入體內后，隨時間延長可逐漸被患者自身的組織所取代[1]。脫細胞方案的理想目標是去除所有的細胞物質，而不影響剩余 ECM 的組成、機械完整性和生物化學活性[22]，但是脫細胞過程總會造成 ECM 的改變。為了研究這種改變，本研究將脫細胞真皮基質與未脫除細胞的皮膚組織進行對比，篩選出理化性能最接近人體正常皮膚的脫細胞基質，其可用于組織工程皮膚的構建，還可為異種真皮脫細胞基質的制備及裱襯提供參考，為靜電紡絲或 3D 打印組織工程皮膚支架提供理化參數。
本文使用了兩種常用的組織移植物滅菌方法：γ 射線和 PAA。這兩種方法滅菌操作簡便、高效、安全。γ 射線照射可去除細胞中易引起免疫排斥反應的成分，被廣泛應用于藥物和脫細胞豬角膜等材料的滅菌[24-26]。由于 γ 射線穿透性強，滅菌同時可因電離作用使細胞死亡。已有研究表明 PAA 可以在低濃度下滅活病毒、真菌和細菌，同時可通過電子轉移氧化細胞膜上的基團，從而引發細胞死亡，產生的副產物為水、氧和二氧化碳[3]，對人體較安全。此外，有研究指出先滅菌有利于提高細胞的脫除效率[8]，故本文使用這兩種滅菌方法作為脫細胞的前處理。
脫細胞真皮基質要脫除具有免疫抗原性的細胞，本文通過 HE 染色發現 B 組無核酸成分，脫細胞效果優于 A 組，說明酶對細胞脫除具有顯著的效果。使用 SEM 和 AFM 觀察材料微觀結構[27-31]，結果顯示 A、B 組材料在微觀結構方面與 C 組相比差異均無統計學意義，但 A 組纖維直徑相對 B 組與 C 組較小，提示 PAA 滅菌后高滲鹽處理對纖維直徑的破壞較大。
孔隙率反映材料內部的疏松程度，孔隙率越大，材料內部越疏松，細胞越容易長入材料內部。A、B 組孔隙率均遠大于對照組 C 組，而 A 組與 B 組孔隙率相比差異無統計學意義，提示兩種方法處理的基質內部孔隙基本一致。一般方法的支架孔隙率約為（74.28 ± 2.06）%[32-34]，而本研究的脫細胞真皮基質孔隙率為（84.9 ± 5.0）% 和（86.7 ± 2.1）%，高于傳統方法。檢測發現正常組織中間也存在空隙，對比正常組織孔隙率可間接證明本文細胞脫除的有效性。較大的孔隙率初步表明本文脫細胞真皮基質的結構便于細胞長入[35-36]。支架移植后需要包扎治療，承受壓力，故本研究檢測脫除細胞前、后的支架壓縮彈性模量[37]，結果表明 A 組高滲鹽水處理、B 組酶處理后脫細胞真皮基質的壓縮彈性模量接近正常皮膚，說明脫細胞處理未影響基質壓縮彈性模量。
為了探索本文脫細胞基質在化學組分上是否有利于細胞長入，我們檢測了樣品脫細胞前、后的組分及含量變化。檢測膠原總含量變化發現，與 C 組相比，A、B 組膠原總含量下降，差異具有統計學意義（均為 P < 0.01）。A 組或許是酸性環境加速了膠原蛋白的水解，B 組或許是 γ 射線使膠原缺失[3]。Ⅰ、Ⅲ型膠原是皮膚中含量最多的兩種膠原成分，分別占皮膚膠原總量的 80%～85% 和 10%～15%[38]，據文獻報道膠原比例與人的年齡與取皮位置有關[39-41]，成人Ⅰ/Ⅲ型膠原比值范圍為 1～2。本研究檢測這兩種膠原比例比值約為 1，與邱林[42]報道的比值 1.2～1.3 相近，且經處理后膠原比例在 B 組與對照組之間差異無統計學意義。說明 B 組很好地保留了膠原比例，即 γ 射線滅菌、酶處理未顯著破壞膠原Ⅰ/Ⅲ的比例。兩組基質脫細胞后膠原蛋白總含量均有所下降，但是 B 組Ⅰ/Ⅲ型膠原的比例與對照組相比差異無統計學意義，說明 B 組脫細胞后細胞外基質的改變較小。
纖連蛋白可影響細胞的黏附、遷移，本文 B 組纖連蛋白明顯少于 C 組，暗示 γ 射線照射和酶處理會使基質損失一部分纖連蛋白，而 PAA 滅菌、高滲鹽水脫細胞的纖連蛋白保留效果較好。彈性纖維蛋白與支架彈性相關，故本文通過紅外光譜圖定性檢測了脫細胞前、后各組彈性蛋白[43]，發現 A、B 組與對照組均出現彈性蛋白特征峰，說明兩組脫細胞方法對彈性蛋白無影響。脫細胞支架使用目的是要植入人體，要求脫細胞基質對細胞無毒性。A、B 組材料的生物學活性差異無統計學意義，猜測與支架的微觀形貌結構差異無統計學意義有關，與材料的化學組分結構、成分相近有關。
綜上所述，A 組與 B 組性能對比發現，A 組纖連蛋白保留較好，但細胞脫除效果不如 B 組；B 組對膠原比例的破壞低于 A 組，且細胞脫除效果優于 A 組；基質與細胞共培養 24 h 以上發現，A、B 組基質對細胞生長的影響差異無統計學意義，但這只是短期的培養，若要應用于人體，后期需要檢測材料與細胞共培養較長時間細胞的生長狀態。
4 結論
本文認為 γ 射線滅菌后，Trypsin 酶脫細胞對脫細胞真皮基質的理化特性無顯著破壞作用，其制備的脫細胞真皮基質的理化特性較 PAA 滅菌后高滲鹽脫細胞更接近于對照組。故本文認為 γ 射線滅菌、0.05% Trypsin 酶/EDTA 脫細胞制備脫細胞基質性能較好。本文中 γ 射線滅菌后，Trypsin 酶脫細胞構建的脫細胞基質不僅可以直接用于組織工程皮膚的構建，還可為異種真皮脫細胞基質的制備及裱襯提供參考，為靜電紡絲或 3D 打印組織工程皮膚支架提供理化參數。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
