甲狀旁腺素（PTH）具有調節骨重構、促血管生成等多重作用，是一種極具應用潛力的骨修復活性因子。近年來，隨著支架材料負載策略、甲狀旁腺素相關肽（PTHrPs）的發展，支架材料原位負載 PTH 或 PTHrPs 治療促進骨缺損愈合逐漸成為可能。本文基于系統間歇性 PTH（iPTH）應用于骨組織工程的現狀與挑戰，就 PTH 的原位負載策略及 PTHrPs 的構建兩方面進行闡述，并探討了該領域存在的問題及未來的研究方向，以期促進支架材料原位負載 PTH 或 PTHrPs 的臨床應用。
引用本文： 郝卓文, 李景峰. 甲狀旁腺素及甲狀旁腺素相關肽在骨組織工程中的原位應用. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(5): 1028-1034. doi: 10.7507/1001-5515.202104045 復制
引言
骨組織在損傷后具有一定的自愈能力，但骨延遲愈合或不愈合在臨床發生率高于 10%，若合并有骨質疏松癥等慢性疾病，患者的骨愈合能力將進一步退化[1]。目前，我國 50 歲以上患有骨質疏松癥人數達 6 940 萬[2]，而年齡超過 50 歲的女性骨質疏松性骨折的發生率高達 40%，同年齡段男性則為 14%[3]。骨質疏松性骨折危害極大，尤其是髖部骨折，嚴重影響患者生活質量，甚至導致老年患者殘疾或死亡[4]。除骨折外，骨感染、骨腫瘤切除等均可造成大段骨缺損，當缺損超過一定范圍，往往不能自行愈合[5-6]。
自體骨移植是外科骨修復的金標準，但可能導致出血、感染、慢性疼痛等并發癥而無法滿足臨床需求[7-8]。目前，骨組織工程逐漸成為臨床治療骨缺損、修復骨折的理想方法，其主要由三大基本要素構成：支架材料、種子細胞及活性因子[9]。骨形態發生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）是一種目前已用于臨床治療骨缺損、修復骨折的活性因子，但大量的臨床證據表明高劑量 BMP-2 容易導致一系列臨床副反應，包括脊神經根炎、異位成骨、椎體骨質溶解、血腫形成、腫瘤發生等[10-11]。因此，原位使用 BMP-2 的替代活性因子具有重要意義。
甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）及氮端活性序列 PTH1-34（商品名為：特立帕肽）可作用于骨組織，通過骨重構維持血清鈣磷的含量[12-13]。PTH 和 PTH1-34 兼具成骨作用及破骨作用，而 PTH 和 PTH1-34 的劑量及持續時間影響骨量的增減。當患者患有原發性甲狀旁腺功能亢進癥（primary hyperparathyroidism，PHPT）時，患者骨皮質的骨密度減少；而當骨質疏松癥患者每日接受間歇性皮下注射低劑量 PTH 或 PTH1-34 治療時，患者皮質骨及松質骨的骨密度增加[14]。有研究表明當持續性、高劑量 PTH 或 PTH1-34 作用于骨組織時，PTH 或 PTH1-34 發揮破骨作用；當間歇性、低劑量 PTH 或 PTH1-34 作用于骨組織時，PTH 或 PTH1-34 發揮成骨作用[15]。此外，輕度 PHPT 患者可以維持骨松質骨密度，但患者發生骨折的風險與 PHPT 的嚴重程度并無相關性，因此預測持續性 PTH 介導成骨作用抑或破骨作用時可能存在閾值，即持續釋放的 PTH 劑量高于閾值時表現為破骨作用，而低于閾值時則表現為成骨作用[16]。綜上研究表明，間歇性、低劑量或持續性、低劑量 PTH 或 PTH1-34 發揮成骨作用。本文首先概述了間歇性 PTH（intermittent PTH，iPTH）應用于骨組織工程的現狀與挑戰，接著綜述了 PTH 原位應用于骨組織工程的負載策略以及相對減低破骨能力的 PTH 相關肽（PTH-related peptides，PTHrPs）的構建策略，最后探討了該領域存在的問題及未來的研究方向。本文有望為科研人員研發其他全新的 PTHrPs 提供思路，并期待對 PTH 及 PTHrPs 在骨組織工程中的臨床應用奠定理論基礎。
1 間歇性甲狀旁腺素應用于骨組織工程的現狀與挑戰
iPTH 已得到美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于治療臨床絕經后女性骨質疏松癥，具體治療方式為系統性每日皮下注射低劑量 PTH1-34[17]。近年來，iPTH 逐漸用于骨缺損、骨再生的研究。例如，Jiang 等[18]將鈦棒植入老年大鼠股骨遠端，接著對大鼠每日行 iPTH 治療，結果表明 iPTH 促進骨再生、血管生成及移植物整合。另有研究將自組裝肽水凝膠作為一種支架材料原位移植于大鼠牙周骨缺損部位，同時對大鼠每 2 d 行 iPTH 治療，原位移植自組裝肽水凝膠協同 iPTH 顯著促進了牙周骨愈合[19]。最近，有研究認為，iPTH 治療可在臨床相關大動物骨缺損模型中促進上頜骨骨缺損愈合，進一步推動 iPTH 在臨床中的應用[20]。這些研究結果表明，移植物或支架材料聯合 iPTH 治療，可以促進骨缺損部位骨再生，是一種較理想的臨床骨修復治療措施。
目前，iPTH 存在諸多缺陷：① PTH1-34 價格昂貴，長時間使用患者經濟負擔較重；② 每日皮下注射往往導致患者依從性差；③ PTH1-34 半衰期短，iPTH 治療無法有效確保局部 PTH1-34 的生物學活性；④ iPTH 可導致全身其他系統不良反應。針對上述缺點，原位應用 PTH 或 PTH1-34 是一種替代 iPTH 的理想策略。原位應用策略可將 PTH 或 PTH1-34 局部遞送到骨缺損部位，規避 PTH 或 PTH1-34 對其他系統的影響，同時治療總劑量遠低于 iPTH 治療劑量，可減輕患者負擔，節約社會資源。目前關于原位應用 PTH 或 PTH1-34 促進骨再生的研究相對較少，其面臨的困難主要在于如何合理地負載 PTH 或 PTH1-34，以及如何相對減低 PTH 或 PTH1-34 的破骨活性。因此，目前研究重點在于探究 PTH 或 PTH1-34 的原位負載策略以及探究可相對降低破骨活性的 PTHrPs。
2 甲狀旁腺素在骨組織工程中的原位應用
2.1 甲狀旁腺素脈沖式釋放
PTH 脈沖式釋放是一種將 PTH 或 PTH1-34 分層負載于脈沖式釋放支架，模擬間歇性、低劑量 PTH 或 PTH1-34 釋放，從而促進骨再生的技術方法。脈沖式釋放支架由藥物隔離層及藥物儲存層間隔構成，兩層均為可降解材料。當隔離層溶解或降解后，藥物從儲存層迅速釋放，藥物釋放速率取決于隔離層的結構及厚度[21]。
2017 年，Dang 等[21]構建了一種 PTH 脈沖式釋放支架，該支架采取一種表面可降解的聚酸酐（polyanhydride，PA）作為藥物隔離層，將 PTH1-34 與海藻酸混合并冷凍干燥，制備了藥物儲存層。PA 層與聚四氟乙烯薄膜摩擦后在 PA 層表面產生正電荷，含 PTH1-34 的海藻酸層與玻璃薄片摩擦后表面產生負電荷，一層帶正電荷的 PA 膜與一層帶負電荷的 PTH/海藻酸膜通過靜電吸引形成一個雙層單元。進而將 21 個雙層單元堆疊，周圍三面由聚己內酯/二氯甲烷封閉，而敞開一面供 PTH1-34 單向釋放。該 PTH 脈沖式釋放支架可實現 PTH1-34 間歇性、低劑量釋放長達 21 d，從而有效避免破骨細胞的過量激活，可通過介導骨重構促進新骨生成。進一步，研究人員在小鼠顱骨臨界尺寸骨缺損部位同時植入一種三維仿生納米纖維支架及該 PTH 脈沖釋放式支架，PTH1-34 可從后者間歇性釋放至前者。研究結果表明，PTH 脈沖釋放式支架可有效促進三維仿生納米纖維支架形成交聯且強健的新生骨組織，實現骨缺損愈合。此外，該脈沖式釋放支架促成骨效果優于 iPTH 治療組，誘導的新生骨組織質量更高，表明 PTH 脈沖式釋放支架可避免 PTH1-34 被外周組織降解，骨再生效率更高[22]。因此，原位移植 PTH 脈沖式釋放支架是一種優于 iPTH 的治療策略。
在保證同等骨再生能力的基礎上，若將 PTH 脈沖式釋放支架的釋放間隔調整為每 2 d 或每 3 d 脈沖式釋放一次，則可進一步減低 PTH 或 PTH1-34 使用總劑量，甚至延長 PTH 脈沖式釋放支架的有效使用時長。但是鑒于目前研究尚處于實驗室階段，PTH 脈沖式釋放支架的成骨作用仍需在大動物骨缺損模型及臨床中進一步驗證。
2.2 甲狀旁腺素緩釋
PTH 緩釋是一種將 PTH 或 PTH1-34 負載于具有控制釋放能力的支架內，基于持續性、小劑量 PTH 或 PTH1-34 釋放而促進骨再生的技術手段。根據形態，具有控制釋放能力的支架可分為水凝膠及固態生物材料支架。
2.2.1 水凝膠負載
水凝膠是一種含水量高具有多孔結構的三維交聯網絡，擁有與天然細胞外基質相似的三維環境，可作為支架材料供細胞生長、增殖及分化，同時也可作為生長因子緩釋支架[23-24]。Wojda 等[25]將 PTH 直接溶解于巰基聚乙二醇（poly（ethylene glycol），PEG）水凝膠基質內，約 80% 的 PTH 于前 3 d 暴釋，而剩余 20%PTH 緩慢釋放至第 14 d，這可能是由于 PTH 小于水凝膠孔隙造成的。研究人員將未負載或負載 PTH 的水凝膠滲透于具有骨傳導性的支架材料內，并移植入大鼠股骨臨界尺寸骨缺損。根據 PTH 的含量，該研究分三個組別，分別為對照組（0 μg PTH）和治療組（10 μg PTH 組、30 μg PTH 組）。術后 12 周，對照組、10 μg PTH 治療組及 30 μg PTH 治療組的骨缺損均未完全由新生骨組織填充，但 10 μg PTH 治療組的骨缺損可由骨與軟骨組織復合物完全愈合，且 10 μg PTH 治療組的骨生成能力優于 30 μg PTH 治療組。實驗結果進一步表明，在一定釋放規律下，PTH 發揮骨合成作用時存在一定閾值，低于該閾值時，連續性 PTH 發揮骨合成代謝作用。另一項研究中，研究人員將 PTH 以基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可降解的氨基酸序列共價連接于巰基 PEG 水凝膠基質[26]。體外實驗表明，最初兩周只有 8% 的 PTH 從體系釋放，而隨著 PEG 水凝膠的水解，80% 的 PTH 在第 8～21 d 釋放，而 PTH 全部釋放則需要 28 d[26]。體系移植入體內，相比于 30 μg PTH 治療組，負載 3 μg 及 10 μg 的 PTH 治療組生成骨量較多，缺損融合率更高。3 μg PTH 治療組骨缺損由軟骨及骨的復合物完全連接，若觀測時間超過 12 周，骨缺損部位可能由骨組織完全愈合。同樣，亦有較早的研究將 PTH1-34 通過纖溶酶可降解序列及轉谷氨酰胺酶因子（transglutaminase，TG）XIIIa 序列（TGXIIIa）共價結合獲得一種 PTH 前體藥物[27]。該前體藥物通過 TGXIIIa 共價結合于纖維蛋白水凝膠，將 PTH1-34 的生物學活性降低了 80 倍。而 PTH1-34 經酶解作用釋放后可恢復生物學活性，因此成功避免了原位破骨細胞大量激活所介導的骨吸收。將共價結合 PTH1-34 的纖維蛋白水凝膠移植入羊干骺端及骺端骨缺損，與未負載 PTH1-34 的纖維蛋白水凝膠相比，共價結合 PTH1-34 的水凝膠明顯促進骨缺損部位骨再生，同時組織學分析表明，含有 100 μg/mL PTH 前體藥物的纖維蛋白水凝膠具有較高的新骨生成潛能[27]。
上述研究表明，水凝膠負載 PTH 或 PTH1-34 可有兩種方式，其一為將 PTH 或 PTH1-34 直接溶解于水凝膠基質，PTH 或 PTH1-34 通過水凝膠纖維所形成的三維孔隙而緩釋；其二為將 PTH 或 PTH1-34 通過特定的氨基酸或氨基酸序列共價結合于水凝膠基質，通過水解作用或酶解作用實現 PTH 或 PTH1-34 的緩釋。顯然，不同負載方式及不同負載材料促進骨愈合所需劑量不同，該領域有諸多問題尚需解決。對于第一種負載策略，應當優選水凝膠體系，通過減小孔隙而減少初始 PTH 或 PTH1-34 暴釋，但孔隙過小可能影響細胞遷移、增殖、分化及生長。第二種負載策略可有效避免初始 PTH 或 PTH1-34 暴釋，緩釋效果更優，可能更適用于 PTH 或 PTH1-34 的原位負載。
有機-無機兩相水凝膠較單獨水凝膠機械性能得到提高。Zou 等[28]將納米羥基磷灰石封裝于殼聚糖/海藻酸水凝膠體系內構建有機—無機兩相水凝膠，同時也將 PTH1-34 直接溶解于水凝膠基質內。該負載有 PTH1-34 的兩相水凝膠支架可通過 Notch 信號通路誘導大鼠骨髓來源間充質干細胞成骨分化。體內顱骨缺損再生實驗進一步證實聯合負載 PTH1-34 及納米羥基磷灰石的水凝膠誘導生成更多的新生骨組織，表明納米羥基磷灰石與 PTH1-34 協同負載可促進骨再生。未來研究可將具有生物學活性的無機物顆粒，如非晶態鎂磷酸鹽[29]，封裝入水凝膠，以進一步促進移植體系的骨再生能力。此外，由多種天然生物材料（如膠原、明膠、殼聚糖等）、合成生物材料（如聚環氧乙烷，聚乙烯醇，聚富馬酸丙酯等）通過物理或化學方法構建的可注射水凝膠可通過微創注射的方式遞送于骨缺損部位（尤其適合于形態不規則的骨缺損），可避免開放性手術對患者的創傷，因此使用可注射水凝膠負載 PTH 或 PTH1-34 具有潛在臨床應用價值[30]。
2.2.2 固態生物材料支架負載
PTH 或 PTH1-34 除可負載于水凝膠促進骨組織再生，亦可負載于具有控制釋放能力的固態生物材料支架內。在含有 PTH 的改進模擬體液中，采取共沉淀的方法，可在固態生物材料支架表面形成包裹有 PTH 的鈣磷涂層，隨著局部鈣磷涂層的溶解，PTH 可原位緩釋于骨再生微環境[31]。然而，通過鈣磷涂層負載 PTH 的技術手段無法精確控制 PTH 的釋放，不同批次產品間 PTH 含量不同，不具有可重復性，因此研究人員逐漸將 PTH 或 PTH1-34 直接負載于固態生物材料支架。膠原支架是一種可原位負載 PTH 或 PTH1-34 用于骨組織再生的固態生物材料支架。研究人員將 20 μg PTH 直接浸潤于膠原支架，接著移植于大鼠顱骨臨界尺寸骨缺損，術后 15 d 行組織學檢測，實驗結果表明負載有 PTH 的膠原支架比未負載 PTH 的膠原支架誘導產生更多的新生骨組織[32]。由于骨主要由無機物與有機物構成，理想的固態生物材料支架應通過構建無機—有機復合固態生物材料支架模擬骨組織成分。Tao 等[33]使用 β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）聯合膠原構建一種無機—有機復合固態生物材料支架，向該支架材料滴加了 1 μg 的 PTH1-34 懸液（PTH1-34/β-TCP/膠原組）后，移植于骨質疏松性大鼠股骨干骺端骨缺損部位，而未滴加 PTH1-34 懸液的 β-TCP 聯合膠原生物材料支架（β-TCP/膠原組）作為對照，該研究結果顯示 PTH1-34/β-TCP/膠原組較 β-TCP/膠原組明顯促進骨缺損愈合。此外，PTH1-34 負載于磷酸八鈣/膠原復合固態支架材料也可促進骨組織再生[34-36]。鑒于鋅、鍶等元素可進一步促進骨組織再生，選用摻有鋅、鍶等活性金屬的固態生物材料支架可能更具有臨床價值[37]。
3 甲狀旁腺素相關肽在骨組織工程的原位應用
目前，持續性、小劑量 PTH 或 PTH1-34 的成骨相關細胞及分子機制尚未完全闡明，且成骨效果并不理想，近年來，構建成骨能力增強、破骨能力減弱的 PTHrPs 更具有應用前景。PTHrPs 指一系列與 PTH 類似并可通過激活 PTH1 型受體（PTH type 1 receptor，PTH1R）而發揮骨重構作用的活性多肽，包括 PTH1-34、PTHrP1、PTHrP2、PTHrP、PTHrP1-37、阿巴洛肽等。PTH 及 PTHrPs 主要通過氮端前 14 個氨基酸與 PTH1R 的跨膜區結合，第 15 個氨基酸以后的序列與 PTH1R 的氮端細胞外結構域結合，從而激活環磷酸腺苷-蛋白激酶 A 信號通路而發揮骨重構作用[38]。常見的 PTHrPs 的氨基酸序列如表 1 所示。
表1
PTHrPs 及其氨基酸序列
Table1.
PTHrPs and their amino acid sequences
3.1 甲狀旁腺素相關肽 1 與甲狀旁腺素相關肽 2
本課題組基于 PTH1-34，對氮端絲氨酸磷酸化，分別向碳端添加三個重復的酸性氨基酸序列 DDD 或 EEE，研發出了具有自主知識產權的專利多肽 PTHrP1 及 PTHrP2[39-41]。對絲氨酸行磷酸化處理及添加酸性氨基酸賦予 PTH1-34 礦化能力，而 PTHrP1 與 PTHrP2 也可通過酸性氨基酸序列吸附于鈣磷支架表面，更有利于暴露活性位點。研究表明，PTHrP1 負載于鼠尾膠原可誘導異位骨形成[42]，而 PTHrP1、PTHrP2 負載于鈣磷支架材料可介導修復兔或大鼠臨界尺寸骨缺損[43-44]。通過改性，PTHrP1 及 PTHrP2 成骨活性增強而破骨活性減弱，這可能與改構后 PTHrP1 及 PTHrP2 與 PTH1R 的結合位點改變有關，但具體機制仍需進一步研究[44]。
除將具有礦化黏附能力的 DDD 及 EEE 等共價結合 PTH1-34，亦可將其他具有生物學活性的短肽序列共價結合于碳端以探究新構建的 PTHrPs 是否具有相同的抑制破骨能力。根據可添加活性短肽的功能，可以分為三類：具有礦化功能的無機黏附肽（如羥基磷灰石黏附肽[45]）、促成骨肽（如成骨生長肽 10-14[46]）、抑破骨肽（如 PTHrP107-111[47]）。但構建時應盡可能選擇短肽，因為較長的肽鏈可能影響 PTHrPs 的整體結構而影響生物學活性。
3.2 甲狀旁腺素相關肽 1-36 與阿巴洛肽
PTHrP 是一種天然存在于人體但通過旁分泌或自分泌發揮骨重構作用的生物活性因子[48-49]。PTHrP 與 PTH 有相似的氨基端，均激活 PTH1R 發揮作用，但兩者下游通路存在差異。在結構上，PTH1R 存在兩種構象，分別為 G 蛋白依賴構象（G-protein-dependent conformation，RG）及 G 蛋白非依賴構象（G-protein-independent conformation，R0）。當配體與 PTH1R（RG）結合時，活環磷酸腺苷-蛋白激酶 A 信號通路激活時間較長，從而產生較多的環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）；而當配體與 PTH1R（RG）結合時，活環磷酸腺苷-蛋白激酶 A 信號通路激活時間較短，從而產生較少的 cAMP[50]。PTH 與 PTHrP 對 PTH1R（RG）親和力相近，但 PTHrP 與 PTH1R（R0）的親和力是 PTH 與 PTH1R（R0 構象）親和力的四分之一，因此 PTHrP 誘導更少的 cAMP 生成，從而避免細胞核因子 κB 受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）過量生成并減低 PTH 的破骨效果[51]。然而，PTHrP 高度不穩定，而 PTHrP1-36 是 PTHrP 氮端活性序列[49]，PTHrP1-37 目前已用于骨缺損部位骨再生研究[47]。阿巴洛肽是一種 PTHrP1-34 類似物，與 PTHrP1-34 有 76% 的相似性，與 PTH1-34 有 41% 的相似性，于 2017 年 4 月得到 FDA 批準用于絕經后女性骨質疏松癥治療[52-53]。相比于 PTHrP1-34，第 22～34 氨基酸部分替換后結構更加穩定，且誘導產生的 cAMP 含量低于 PTHrP[51]，因此對阿巴洛肽的應用可能優于 PTHrP1-37。
與 PTH1-34、PTHrP1-36 相比，阿巴洛肽成骨能力更強而破骨能力減弱[50]，可能更適合未來骨組織工程研究。基于水凝膠負載 PTH 或 PTH1-34，Ning 等[54]將阿巴洛肽負載于光誘導的甲基丙烯酸明膠水凝膠基質內，該水凝膠體系可以促進小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（MC3T3-E1）成骨分化及礦化。該研究表明，移植入體內后，負載有 2 mg/mL 及 4 mg/mL 阿巴洛肽的水凝膠均可明顯誘導骨組織生成，而以 2 mg/mL 阿巴洛肽水凝膠體系成骨效果更優。相較于負載 PTH，原位負載阿巴洛肽在未來骨組織工程中可能更具有潛力，然而目前對阿巴洛肽原位負載促進缺損部位骨再生研究較少，未來具有巨大的探索價值。
4 結論與展望
PTH 及 PTHrPs 是一類可用于臨床骨缺損治療及可替代 BMP-2 的理想活性因子。PTH 或 PTHrPs 若原位負載于支架材料用于骨缺損治療，可有效地彌補 iPTH 當前應用于臨床所面臨的挑戰。PTH 及 PTHrPs 原位負載于支架材料盡管在修復骨缺損中具有顯著療效，但研究目前尚處于動物實驗階段，還存在諸多問題暫未能應用于臨床治療，例如間歇性、小劑量及持續性、小劑量 PTH 發揮成骨作用的相關細胞及分子機制尚未完全闡明；持續性、小劑量 PTH 發揮成骨作用時閾值是否存在，若有，其在人體中具體數值是多少？PTH 脈沖式釋放支架在大動物及人體骨缺損中是否有效？可負載 PTH 的最優水凝膠生物材料是什么？PTH 負載于水凝膠的方式，以物理溶解的方式成骨作用更強，還是以化學結合的方式成骨作用更強？將 PTH 化學結合于水凝膠基生物材料時，應以氮端相連接還是應以碳端相連接？PTH 結合于水凝膠基生物材料時應以哪種連接體連接將盡可能保護 PTH 的成骨活性？阿巴洛肽可否負載于其他水凝膠或固態支架材料促進局部臨界尺寸骨缺損愈合？可否將其他具有生物學活性的短肽共價結合于 PTH1-34 或阿巴洛肽碳端以構建新的 PTHrPs，且這些新構建的 PTHrPs 是否具有原位應用于骨組織修復的潛力？上述問題都值得科研人員進一步研究。
綜上所述，隨著研究人員對 PTH 及 PTHrPs 的成骨作用機制研究的不斷深入，并進一步探明 PTH 及 PTHrPs 的負載方式及適宜支架材料，將更有利于促進 PTH 及 PTHrPs 在骨組織工程中的臨床應用。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
骨組織在損傷后具有一定的自愈能力，但骨延遲愈合或不愈合在臨床發生率高于 10%，若合并有骨質疏松癥等慢性疾病，患者的骨愈合能力將進一步退化[1]。目前，我國 50 歲以上患有骨質疏松癥人數達 6 940 萬[2]，而年齡超過 50 歲的女性骨質疏松性骨折的發生率高達 40%，同年齡段男性則為 14%[3]。骨質疏松性骨折危害極大，尤其是髖部骨折，嚴重影響患者生活質量，甚至導致老年患者殘疾或死亡[4]。除骨折外，骨感染、骨腫瘤切除等均可造成大段骨缺損，當缺損超過一定范圍，往往不能自行愈合[5-6]。
自體骨移植是外科骨修復的金標準，但可能導致出血、感染、慢性疼痛等并發癥而無法滿足臨床需求[7-8]。目前，骨組織工程逐漸成為臨床治療骨缺損、修復骨折的理想方法，其主要由三大基本要素構成：支架材料、種子細胞及活性因子[9]。骨形態發生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）是一種目前已用于臨床治療骨缺損、修復骨折的活性因子，但大量的臨床證據表明高劑量 BMP-2 容易導致一系列臨床副反應，包括脊神經根炎、異位成骨、椎體骨質溶解、血腫形成、腫瘤發生等[10-11]。因此，原位使用 BMP-2 的替代活性因子具有重要意義。
甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）及氮端活性序列 PTH1-34（商品名為：特立帕肽）可作用于骨組織，通過骨重構維持血清鈣磷的含量[12-13]。PTH 和 PTH1-34 兼具成骨作用及破骨作用，而 PTH 和 PTH1-34 的劑量及持續時間影響骨量的增減。當患者患有原發性甲狀旁腺功能亢進癥（primary hyperparathyroidism，PHPT）時，患者骨皮質的骨密度減少；而當骨質疏松癥患者每日接受間歇性皮下注射低劑量 PTH 或 PTH1-34 治療時，患者皮質骨及松質骨的骨密度增加[14]。有研究表明當持續性、高劑量 PTH 或 PTH1-34 作用于骨組織時，PTH 或 PTH1-34 發揮破骨作用；當間歇性、低劑量 PTH 或 PTH1-34 作用于骨組織時，PTH 或 PTH1-34 發揮成骨作用[15]。此外，輕度 PHPT 患者可以維持骨松質骨密度，但患者發生骨折的風險與 PHPT 的嚴重程度并無相關性，因此預測持續性 PTH 介導成骨作用抑或破骨作用時可能存在閾值，即持續釋放的 PTH 劑量高于閾值時表現為破骨作用，而低于閾值時則表現為成骨作用[16]。綜上研究表明，間歇性、低劑量或持續性、低劑量 PTH 或 PTH1-34 發揮成骨作用。本文首先概述了間歇性 PTH（intermittent PTH，iPTH）應用于骨組織工程的現狀與挑戰，接著綜述了 PTH 原位應用于骨組織工程的負載策略以及相對減低破骨能力的 PTH 相關肽（PTH-related peptides，PTHrPs）的構建策略，最后探討了該領域存在的問題及未來的研究方向。本文有望為科研人員研發其他全新的 PTHrPs 提供思路，并期待對 PTH 及 PTHrPs 在骨組織工程中的臨床應用奠定理論基礎。
1 間歇性甲狀旁腺素應用于骨組織工程的現狀與挑戰
iPTH 已得到美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于治療臨床絕經后女性骨質疏松癥，具體治療方式為系統性每日皮下注射低劑量 PTH1-34[17]。近年來，iPTH 逐漸用于骨缺損、骨再生的研究。例如，Jiang 等[18]將鈦棒植入老年大鼠股骨遠端，接著對大鼠每日行 iPTH 治療，結果表明 iPTH 促進骨再生、血管生成及移植物整合。另有研究將自組裝肽水凝膠作為一種支架材料原位移植于大鼠牙周骨缺損部位，同時對大鼠每 2 d 行 iPTH 治療，原位移植自組裝肽水凝膠協同 iPTH 顯著促進了牙周骨愈合[19]。最近，有研究認為，iPTH 治療可在臨床相關大動物骨缺損模型中促進上頜骨骨缺損愈合，進一步推動 iPTH 在臨床中的應用[20]。這些研究結果表明，移植物或支架材料聯合 iPTH 治療，可以促進骨缺損部位骨再生，是一種較理想的臨床骨修復治療措施。
目前，iPTH 存在諸多缺陷：① PTH1-34 價格昂貴，長時間使用患者經濟負擔較重；② 每日皮下注射往往導致患者依從性差；③ PTH1-34 半衰期短，iPTH 治療無法有效確保局部 PTH1-34 的生物學活性；④ iPTH 可導致全身其他系統不良反應。針對上述缺點，原位應用 PTH 或 PTH1-34 是一種替代 iPTH 的理想策略。原位應用策略可將 PTH 或 PTH1-34 局部遞送到骨缺損部位，規避 PTH 或 PTH1-34 對其他系統的影響，同時治療總劑量遠低于 iPTH 治療劑量，可減輕患者負擔，節約社會資源。目前關于原位應用 PTH 或 PTH1-34 促進骨再生的研究相對較少，其面臨的困難主要在于如何合理地負載 PTH 或 PTH1-34，以及如何相對減低 PTH 或 PTH1-34 的破骨活性。因此，目前研究重點在于探究 PTH 或 PTH1-34 的原位負載策略以及探究可相對降低破骨活性的 PTHrPs。
2 甲狀旁腺素在骨組織工程中的原位應用
2.1 甲狀旁腺素脈沖式釋放
PTH 脈沖式釋放是一種將 PTH 或 PTH1-34 分層負載于脈沖式釋放支架，模擬間歇性、低劑量 PTH 或 PTH1-34 釋放，從而促進骨再生的技術方法。脈沖式釋放支架由藥物隔離層及藥物儲存層間隔構成，兩層均為可降解材料。當隔離層溶解或降解后，藥物從儲存層迅速釋放，藥物釋放速率取決于隔離層的結構及厚度[21]。
2017 年，Dang 等[21]構建了一種 PTH 脈沖式釋放支架，該支架采取一種表面可降解的聚酸酐（polyanhydride，PA）作為藥物隔離層，將 PTH1-34 與海藻酸混合并冷凍干燥，制備了藥物儲存層。PA 層與聚四氟乙烯薄膜摩擦后在 PA 層表面產生正電荷，含 PTH1-34 的海藻酸層與玻璃薄片摩擦后表面產生負電荷，一層帶正電荷的 PA 膜與一層帶負電荷的 PTH/海藻酸膜通過靜電吸引形成一個雙層單元。進而將 21 個雙層單元堆疊，周圍三面由聚己內酯/二氯甲烷封閉，而敞開一面供 PTH1-34 單向釋放。該 PTH 脈沖式釋放支架可實現 PTH1-34 間歇性、低劑量釋放長達 21 d，從而有效避免破骨細胞的過量激活，可通過介導骨重構促進新骨生成。進一步，研究人員在小鼠顱骨臨界尺寸骨缺損部位同時植入一種三維仿生納米纖維支架及該 PTH 脈沖釋放式支架，PTH1-34 可從后者間歇性釋放至前者。研究結果表明，PTH 脈沖釋放式支架可有效促進三維仿生納米纖維支架形成交聯且強健的新生骨組織，實現骨缺損愈合。此外，該脈沖式釋放支架促成骨效果優于 iPTH 治療組，誘導的新生骨組織質量更高，表明 PTH 脈沖式釋放支架可避免 PTH1-34 被外周組織降解，骨再生效率更高[22]。因此，原位移植 PTH 脈沖式釋放支架是一種優于 iPTH 的治療策略。
在保證同等骨再生能力的基礎上，若將 PTH 脈沖式釋放支架的釋放間隔調整為每 2 d 或每 3 d 脈沖式釋放一次，則可進一步減低 PTH 或 PTH1-34 使用總劑量，甚至延長 PTH 脈沖式釋放支架的有效使用時長。但是鑒于目前研究尚處于實驗室階段，PTH 脈沖式釋放支架的成骨作用仍需在大動物骨缺損模型及臨床中進一步驗證。
2.2 甲狀旁腺素緩釋
PTH 緩釋是一種將 PTH 或 PTH1-34 負載于具有控制釋放能力的支架內，基于持續性、小劑量 PTH 或 PTH1-34 釋放而促進骨再生的技術手段。根據形態，具有控制釋放能力的支架可分為水凝膠及固態生物材料支架。
2.2.1 水凝膠負載
水凝膠是一種含水量高具有多孔結構的三維交聯網絡，擁有與天然細胞外基質相似的三維環境，可作為支架材料供細胞生長、增殖及分化，同時也可作為生長因子緩釋支架[23-24]。Wojda 等[25]將 PTH 直接溶解于巰基聚乙二醇（poly（ethylene glycol），PEG）水凝膠基質內，約 80% 的 PTH 于前 3 d 暴釋，而剩余 20%PTH 緩慢釋放至第 14 d，這可能是由于 PTH 小于水凝膠孔隙造成的。研究人員將未負載或負載 PTH 的水凝膠滲透于具有骨傳導性的支架材料內，并移植入大鼠股骨臨界尺寸骨缺損。根據 PTH 的含量，該研究分三個組別，分別為對照組（0 μg PTH）和治療組（10 μg PTH 組、30 μg PTH 組）。術后 12 周，對照組、10 μg PTH 治療組及 30 μg PTH 治療組的骨缺損均未完全由新生骨組織填充，但 10 μg PTH 治療組的骨缺損可由骨與軟骨組織復合物完全愈合，且 10 μg PTH 治療組的骨生成能力優于 30 μg PTH 治療組。實驗結果進一步表明，在一定釋放規律下，PTH 發揮骨合成作用時存在一定閾值，低于該閾值時，連續性 PTH 發揮骨合成代謝作用。另一項研究中，研究人員將 PTH 以基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可降解的氨基酸序列共價連接于巰基 PEG 水凝膠基質[26]。體外實驗表明，最初兩周只有 8% 的 PTH 從體系釋放，而隨著 PEG 水凝膠的水解，80% 的 PTH 在第 8～21 d 釋放，而 PTH 全部釋放則需要 28 d[26]。體系移植入體內，相比于 30 μg PTH 治療組，負載 3 μg 及 10 μg 的 PTH 治療組生成骨量較多，缺損融合率更高。3 μg PTH 治療組骨缺損由軟骨及骨的復合物完全連接，若觀測時間超過 12 周，骨缺損部位可能由骨組織完全愈合。同樣，亦有較早的研究將 PTH1-34 通過纖溶酶可降解序列及轉谷氨酰胺酶因子（transglutaminase，TG）XIIIa 序列（TGXIIIa）共價結合獲得一種 PTH 前體藥物[27]。該前體藥物通過 TGXIIIa 共價結合于纖維蛋白水凝膠，將 PTH1-34 的生物學活性降低了 80 倍。而 PTH1-34 經酶解作用釋放后可恢復生物學活性，因此成功避免了原位破骨細胞大量激活所介導的骨吸收。將共價結合 PTH1-34 的纖維蛋白水凝膠移植入羊干骺端及骺端骨缺損，與未負載 PTH1-34 的纖維蛋白水凝膠相比，共價結合 PTH1-34 的水凝膠明顯促進骨缺損部位骨再生，同時組織學分析表明，含有 100 μg/mL PTH 前體藥物的纖維蛋白水凝膠具有較高的新骨生成潛能[27]。
上述研究表明，水凝膠負載 PTH 或 PTH1-34 可有兩種方式，其一為將 PTH 或 PTH1-34 直接溶解于水凝膠基質，PTH 或 PTH1-34 通過水凝膠纖維所形成的三維孔隙而緩釋；其二為將 PTH 或 PTH1-34 通過特定的氨基酸或氨基酸序列共價結合于水凝膠基質，通過水解作用或酶解作用實現 PTH 或 PTH1-34 的緩釋。顯然，不同負載方式及不同負載材料促進骨愈合所需劑量不同，該領域有諸多問題尚需解決。對于第一種負載策略，應當優選水凝膠體系，通過減小孔隙而減少初始 PTH 或 PTH1-34 暴釋，但孔隙過小可能影響細胞遷移、增殖、分化及生長。第二種負載策略可有效避免初始 PTH 或 PTH1-34 暴釋，緩釋效果更優，可能更適用于 PTH 或 PTH1-34 的原位負載。
有機-無機兩相水凝膠較單獨水凝膠機械性能得到提高。Zou 等[28]將納米羥基磷灰石封裝于殼聚糖/海藻酸水凝膠體系內構建有機—無機兩相水凝膠，同時也將 PTH1-34 直接溶解于水凝膠基質內。該負載有 PTH1-34 的兩相水凝膠支架可通過 Notch 信號通路誘導大鼠骨髓來源間充質干細胞成骨分化。體內顱骨缺損再生實驗進一步證實聯合負載 PTH1-34 及納米羥基磷灰石的水凝膠誘導生成更多的新生骨組織，表明納米羥基磷灰石與 PTH1-34 協同負載可促進骨再生。未來研究可將具有生物學活性的無機物顆粒，如非晶態鎂磷酸鹽[29]，封裝入水凝膠，以進一步促進移植體系的骨再生能力。此外，由多種天然生物材料（如膠原、明膠、殼聚糖等）、合成生物材料（如聚環氧乙烷，聚乙烯醇，聚富馬酸丙酯等）通過物理或化學方法構建的可注射水凝膠可通過微創注射的方式遞送于骨缺損部位（尤其適合于形態不規則的骨缺損），可避免開放性手術對患者的創傷，因此使用可注射水凝膠負載 PTH 或 PTH1-34 具有潛在臨床應用價值[30]。
2.2.2 固態生物材料支架負載
PTH 或 PTH1-34 除可負載于水凝膠促進骨組織再生，亦可負載于具有控制釋放能力的固態生物材料支架內。在含有 PTH 的改進模擬體液中，采取共沉淀的方法，可在固態生物材料支架表面形成包裹有 PTH 的鈣磷涂層，隨著局部鈣磷涂層的溶解，PTH 可原位緩釋于骨再生微環境[31]。然而，通過鈣磷涂層負載 PTH 的技術手段無法精確控制 PTH 的釋放，不同批次產品間 PTH 含量不同，不具有可重復性，因此研究人員逐漸將 PTH 或 PTH1-34 直接負載于固態生物材料支架。膠原支架是一種可原位負載 PTH 或 PTH1-34 用于骨組織再生的固態生物材料支架。研究人員將 20 μg PTH 直接浸潤于膠原支架，接著移植于大鼠顱骨臨界尺寸骨缺損，術后 15 d 行組織學檢測，實驗結果表明負載有 PTH 的膠原支架比未負載 PTH 的膠原支架誘導產生更多的新生骨組織[32]。由于骨主要由無機物與有機物構成，理想的固態生物材料支架應通過構建無機—有機復合固態生物材料支架模擬骨組織成分。Tao 等[33]使用 β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）聯合膠原構建一種無機—有機復合固態生物材料支架，向該支架材料滴加了 1 μg 的 PTH1-34 懸液（PTH1-34/β-TCP/膠原組）后，移植于骨質疏松性大鼠股骨干骺端骨缺損部位，而未滴加 PTH1-34 懸液的 β-TCP 聯合膠原生物材料支架（β-TCP/膠原組）作為對照，該研究結果顯示 PTH1-34/β-TCP/膠原組較 β-TCP/膠原組明顯促進骨缺損愈合。此外，PTH1-34 負載于磷酸八鈣/膠原復合固態支架材料也可促進骨組織再生[34-36]。鑒于鋅、鍶等元素可進一步促進骨組織再生，選用摻有鋅、鍶等活性金屬的固態生物材料支架可能更具有臨床價值[37]。
3 甲狀旁腺素相關肽在骨組織工程的原位應用
目前，持續性、小劑量 PTH 或 PTH1-34 的成骨相關細胞及分子機制尚未完全闡明，且成骨效果并不理想，近年來，構建成骨能力增強、破骨能力減弱的 PTHrPs 更具有應用前景。PTHrPs 指一系列與 PTH 類似并可通過激活 PTH1 型受體（PTH type 1 receptor，PTH1R）而發揮骨重構作用的活性多肽，包括 PTH1-34、PTHrP1、PTHrP2、PTHrP、PTHrP1-37、阿巴洛肽等。PTH 及 PTHrPs 主要通過氮端前 14 個氨基酸與 PTH1R 的跨膜區結合，第 15 個氨基酸以后的序列與 PTH1R 的氮端細胞外結構域結合，從而激活環磷酸腺苷-蛋白激酶 A 信號通路而發揮骨重構作用[38]。常見的 PTHrPs 的氨基酸序列如表 1 所示。
表1
PTHrPs 及其氨基酸序列
Table1.
PTHrPs and their amino acid sequences
3.1 甲狀旁腺素相關肽 1 與甲狀旁腺素相關肽 2
本課題組基于 PTH1-34，對氮端絲氨酸磷酸化，分別向碳端添加三個重復的酸性氨基酸序列 DDD 或 EEE，研發出了具有自主知識產權的專利多肽 PTHrP1 及 PTHrP2[39-41]。對絲氨酸行磷酸化處理及添加酸性氨基酸賦予 PTH1-34 礦化能力，而 PTHrP1 與 PTHrP2 也可通過酸性氨基酸序列吸附于鈣磷支架表面，更有利于暴露活性位點。研究表明，PTHrP1 負載于鼠尾膠原可誘導異位骨形成[42]，而 PTHrP1、PTHrP2 負載于鈣磷支架材料可介導修復兔或大鼠臨界尺寸骨缺損[43-44]。通過改性，PTHrP1 及 PTHrP2 成骨活性增強而破骨活性減弱，這可能與改構后 PTHrP1 及 PTHrP2 與 PTH1R 的結合位點改變有關，但具體機制仍需進一步研究[44]。
除將具有礦化黏附能力的 DDD 及 EEE 等共價結合 PTH1-34，亦可將其他具有生物學活性的短肽序列共價結合于碳端以探究新構建的 PTHrPs 是否具有相同的抑制破骨能力。根據可添加活性短肽的功能，可以分為三類：具有礦化功能的無機黏附肽（如羥基磷灰石黏附肽[45]）、促成骨肽（如成骨生長肽 10-14[46]）、抑破骨肽（如 PTHrP107-111[47]）。但構建時應盡可能選擇短肽，因為較長的肽鏈可能影響 PTHrPs 的整體結構而影響生物學活性。
3.2 甲狀旁腺素相關肽 1-36 與阿巴洛肽
PTHrP 是一種天然存在于人體但通過旁分泌或自分泌發揮骨重構作用的生物活性因子[48-49]。PTHrP 與 PTH 有相似的氨基端，均激活 PTH1R 發揮作用，但兩者下游通路存在差異。在結構上，PTH1R 存在兩種構象，分別為 G 蛋白依賴構象（G-protein-dependent conformation，RG）及 G 蛋白非依賴構象（G-protein-independent conformation，R0）。當配體與 PTH1R（RG）結合時，活環磷酸腺苷-蛋白激酶 A 信號通路激活時間較長，從而產生較多的環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）；而當配體與 PTH1R（RG）結合時，活環磷酸腺苷-蛋白激酶 A 信號通路激活時間較短，從而產生較少的 cAMP[50]。PTH 與 PTHrP 對 PTH1R（RG）親和力相近，但 PTHrP 與 PTH1R（R0）的親和力是 PTH 與 PTH1R（R0 構象）親和力的四分之一，因此 PTHrP 誘導更少的 cAMP 生成，從而避免細胞核因子 κB 受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）過量生成并減低 PTH 的破骨效果[51]。然而，PTHrP 高度不穩定，而 PTHrP1-36 是 PTHrP 氮端活性序列[49]，PTHrP1-37 目前已用于骨缺損部位骨再生研究[47]。阿巴洛肽是一種 PTHrP1-34 類似物，與 PTHrP1-34 有 76% 的相似性，與 PTH1-34 有 41% 的相似性，于 2017 年 4 月得到 FDA 批準用于絕經后女性骨質疏松癥治療[52-53]。相比于 PTHrP1-34，第 22～34 氨基酸部分替換后結構更加穩定，且誘導產生的 cAMP 含量低于 PTHrP[51]，因此對阿巴洛肽的應用可能優于 PTHrP1-37。
與 PTH1-34、PTHrP1-36 相比，阿巴洛肽成骨能力更強而破骨能力減弱[50]，可能更適合未來骨組織工程研究。基于水凝膠負載 PTH 或 PTH1-34，Ning 等[54]將阿巴洛肽負載于光誘導的甲基丙烯酸明膠水凝膠基質內，該水凝膠體系可以促進小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（MC3T3-E1）成骨分化及礦化。該研究表明，移植入體內后，負載有 2 mg/mL 及 4 mg/mL 阿巴洛肽的水凝膠均可明顯誘導骨組織生成，而以 2 mg/mL 阿巴洛肽水凝膠體系成骨效果更優。相較于負載 PTH，原位負載阿巴洛肽在未來骨組織工程中可能更具有潛力，然而目前對阿巴洛肽原位負載促進缺損部位骨再生研究較少，未來具有巨大的探索價值。
4 結論與展望
PTH 及 PTHrPs 是一類可用于臨床骨缺損治療及可替代 BMP-2 的理想活性因子。PTH 或 PTHrPs 若原位負載于支架材料用于骨缺損治療，可有效地彌補 iPTH 當前應用于臨床所面臨的挑戰。PTH 及 PTHrPs 原位負載于支架材料盡管在修復骨缺損中具有顯著療效，但研究目前尚處于動物實驗階段，還存在諸多問題暫未能應用于臨床治療，例如間歇性、小劑量及持續性、小劑量 PTH 發揮成骨作用的相關細胞及分子機制尚未完全闡明；持續性、小劑量 PTH 發揮成骨作用時閾值是否存在，若有，其在人體中具體數值是多少？PTH 脈沖式釋放支架在大動物及人體骨缺損中是否有效？可負載 PTH 的最優水凝膠生物材料是什么？PTH 負載于水凝膠的方式，以物理溶解的方式成骨作用更強，還是以化學結合的方式成骨作用更強？將 PTH 化學結合于水凝膠基生物材料時，應以氮端相連接還是應以碳端相連接？PTH 結合于水凝膠基生物材料時應以哪種連接體連接將盡可能保護 PTH 的成骨活性？阿巴洛肽可否負載于其他水凝膠或固態支架材料促進局部臨界尺寸骨缺損愈合？可否將其他具有生物學活性的短肽共價結合于 PTH1-34 或阿巴洛肽碳端以構建新的 PTHrPs，且這些新構建的 PTHrPs 是否具有原位應用于骨組織修復的潛力？上述問題都值得科研人員進一步研究。
綜上所述，隨著研究人員對 PTH 及 PTHrPs 的成骨作用機制研究的不斷深入，并進一步探明 PTH 及 PTHrPs 的負載方式及適宜支架材料，將更有利于促進 PTH 及 PTHrPs 在骨組織工程中的臨床應用。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
