凍凝膠是采用低溫冷凍聚合方法制備的一類凝膠材料，由于其具有優良的生物相容性、三維貫通多孔結構、形狀記憶功能及可注射性等，是一類極具應用潛力的組織工程支架材料，可有效修復或重建受損組織或者器官。本文首先介紹了凍凝膠的基本概念及其主要性能、制備方法以及相關工藝參數。然后，梳理了近年來凍凝膠在不同的組織工程領域的研究進展。最后指出了當前一些亟需解決的關鍵問題，并展望了未來的發展方向，以期為相關領域的研究者提供參考和借鑒。
引用本文： 劉爽, 肖靖, 陳可, 肖文謙, 李波. 三維多孔凍凝膠在組織工程中的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(2): 393-398, 404. doi: 10.7507/1001-5515.202008057 復制
引言
組織工程是根據生物學和工程學的原理，把具有三維結構的支架與擴增的種子細胞相結合，在體外構建出能夠植入體內的具有生物活性的種植體，實現對受損組織的形態、結構或功能的修復與重建[1]。其核心是使用模擬天然細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的三維支架與種子細胞構建出工程化復合體。理想的組織工程支架應具有以下特點：① 具有優良的生物相容性，能為細胞生長提供三維空間結構，并能促進細胞黏附以及與材料相互作用；② 允許營養物質和代謝廢物在支架材料中的擴散和交換；③ 具有適宜的力學性能和降解速率從而實現與天然組織的整合[2]。除了部分可注射支架外，大多數支架材料需要預先制成三維多孔結構，不僅能為氧氣和營養物質的傳輸及代謝廢物的清除提供必要的通道，同時有利于細胞遷移和血管生成。因此，構建具有三維多孔結構的支架也一直是組織工程領域研究的熱點。
水凝膠是親水性聚合物以共價鍵、氫鍵、疏水作用或范德華力等形成的三維交聯網絡，是一種能在溶液中溶脹且長時間保持水分的材料形態，水凝膠由于其具有諸多優良的性質被認為是一種理想的組織工程支架材料并得到了廣泛的應用[3]。然而，傳統水凝膠的孔徑多為納米級別，與天然 ECM 的兼具微米多孔和納米纖維的孔結構不同，過小的孔徑直接導致包裹在凝膠中的細胞存活率下降以及在凝膠體中的遷移受阻，容易形成不規則的細胞分布。同時也很難支持血管網絡貫穿整個支架生成，繼而難以解決長期困擾組織工程的血管化不足的問題[4]。因此，如何制備出具有微米級的貫通多孔結構的凝膠材料是發展組織工程水凝膠支架材料的關鍵和趨勢。
凍凝膠（cryogel）是近年來快速發展的一種新型的生物材料，廣泛應用于干細胞移植、組織工程、藥物控釋以及免疫治療的研究領域[5-8]。凍凝膠是預聚物在零攝氏度以下冷凍聚合，以冰晶作為致孔劑，形成具有大孔結構的海綿狀材料。凍凝膠的制備過程如圖 1 所示，通常分成三個步驟：① 形成冰晶的相分離過程；② 集中在冰晶之間的非凍結液相中的反應物的交聯/聚合反應；③ 解凍冰晶形成開放的和相互連接的多孔聚合物網絡結構[9-10]。具體而言，低溫導致溶劑（如水）相分離為凍結相（冰晶）和冰晶周圍的非凍結相，在溶劑結晶過程中，溶劑晶體不斷長大，直到與另一個晶面接觸，形成高度互聯的晶體結構。此時，凝膠的前驅體則被排出結晶相中，此過程也被稱為“低溫濃縮”，濃縮后的預聚物在冰晶周圍交聯，可有效提高交聯度和反應效率，對其力學性能的提升至關重要。隨后，在室溫下解凍后的冰晶形成了一種具有高度彈性和穩定性的多孔海綿狀凝膠。由于冷凍結晶的過程本質上是高度互連的，利用冷凍溶劑晶體作為相互連接的致孔劑，有效地避免了傳統致孔劑法的孔貫通性不佳以及致孔劑殘留導致的細胞毒性等問題[11]。凍凝膠材料具有微米級的貫通多孔結構以及諸多獨特的性能，例如柔軟而富有彈性，可以壓縮到初始體積的 90% 以上且不會造成任何永久性的機械損傷；能夠快速溶脹，促進細胞的增殖和遷移，有利于血管網絡的生成[5, 12-13]。此外，大多數凍凝膠具有可注射性，可以承受注射器注射過程中遇到的壓應力，與傳統的可注射凝膠相比，這種預成型注射方式可以有效避免凝膠預聚物泄漏到周圍組織或被體液稀釋的問題[14-15]。部分凍凝膠甚至還可通過高壓蒸汽滅菌，且不影響其相關性能，極大地方便了臨床應用[16]。
圖1
凍凝膠支架材料的制備過程示意圖及其主要特性
Figure1.
Schematic of the process to fabricate cryogel scaffolds and their main properties
凍凝膠的性質受多個工藝參數影響，例如交聯類型[17]、凝膠預聚物的組成[10]、冷凍溫度、時間及速率等[18]。與普通水凝膠類似，凍凝膠可以通過化學或物理交聯聚合的方式制備。交聯方式直接影響著凝膠形成過程的動力學、穩定性及力學性能。物理交聯主要是通過非共價的相互作用，如離子交聯、結晶或者氫鍵等相互作用，例如聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）可以通過“冷凍-解凍”法制備凍凝膠，其最大的優勢在于其優良的生物相容性，缺點在于孔徑較小（<10 μm），而且力學性能和長期穩定性都相對較差[9]。與之相反，采用化學交聯制備的凍凝膠的孔徑分布在組織工程理想的孔徑范圍（100～200 μm），而且表現出優異的力學性能和穩定性。其中，自由基聚合是當前凍凝膠制備中最常用的技術，這一過程主要通過引發劑分解成為自由基，引發大分子單體上的官能團進行聚合和交聯，從而在冰晶周圍形成連續的聚合物網絡。發生聚合的官能團一般是碳碳雙鍵，多采用氧化還原的引發劑體系，例如，過硫酸銨（ammonium persulphate，APS）/四甲基乙二胺（N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine，TEMED）體系等，具有分解勢能低、引發速率快和反應動力學高的特點。許多天然和人工合成聚合物，如透明質酸、明膠、海藻酸鈉、殼聚糖和聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）等都可通過乙烯基團的功能化，通過自由基聚合實現交聯制備得到凍凝膠。此外，一些例如納米羥基磷灰石、聚吡咯、磁性納米顆粒、碳納米管等都可以摻雜到凍凝膠體系中，以賦予其獨特的生物活性、導電性以及磁性等以滿足不同組織或器官構建的需求[19]。正因為多孔凍凝膠材料具有諸多獨特的優點，目前已經在骨、軟骨、皮膚及神經等組織工程領域中發揮出巨大的應用潛力。
1 骨組織工程
骨是人體最重要的器官之一，起到保護內臟和為運動提供力學支撐的作用，同時還參與了多種生理功能。盡管骨具有自我再生和修復的能力，但臨床的大段骨缺損目前只能通過骨移植來修復，但骨移植卻受到供體短缺以及免疫排斥等限制，骨組織工程是臨床用于大段骨缺損治療的一種新途徑[20]。凍凝膠由于具有獨特的物理特性和抵御外界刺激的能力，以及具有適宜骨細胞生長和增殖以及實現血管化的三維貫通大孔結構，是一種理想的骨組織工程支架。骨組織工程的首要挑戰就是體外重建由膠原和羥基磷灰石晶體組成的模擬骨 ECM 的支架材料。Hixon 等[21]將不同形貌的羥基磷灰石晶體摻入到殼聚糖-明膠凍凝膠支架中。這類材料具有合適的孔徑及孔隙率、優良的孔貫通性及溶脹性等，同時能支持細胞黏附和礦化，有效地促進骨愈合和再生。Salgado 等[22]制備了一種膠原/納米羥基磷灰石復合凍凝膠并評價了其與骨髓間充質干細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSC）的相互作用。實驗結果顯示：該凍凝膠在體外能有效維持細胞的活性并促進其生長及增殖，而且整個培養周期（28 d）沒有觀察到明顯的細胞毒性反應，動物實驗也證實了該支架優良的生物相容性，并能促進骨缺損的修復和再生。Shalumon 等[23]報道了一種納米微球-凍凝膠雜化的骨組織工程支架，兼具承重和骨再生能力。當該支架與 BMSC 共培養后，其楊氏模量以及特定成骨標志物的基因表達都顯著地增加，并且具有修復兔脛骨中段缺損的能力。最近，該小組以不同的明膠凍凝膠為原料，考察了納米羥基磷灰石和交聯劑對支架性能及其對誘導 BMSC 成骨分化的影響，證明了可以利用支架的化學信號或動態細胞培養產生的物理信號來調節 BMSC 的成骨分化。他們成功地實現了將體外培養的冷凍膠/BMSC 復合體用于修復兔顱骨臨界尺寸的缺損[24]。Gu 等[25]將羥基磷灰石納米線作為增強相摻入到甲基丙烯酸酐改性的明膠凍凝膠中，制備出一種纖維增強的多孔雜化凍凝膠，實驗結果顯示凍凝膠的抗壓強度和穩定性都隨納米線含量的增加而提高，同時能夠支持 BMSC 增殖并顯著誘導其向成骨方向分化。
除了能模擬 ECM 外，理想的骨組織工程支架還應具有優良的力學強度、可加工性及生物相容性。Ferreira 等[26]制備了一種可用于體內骨修復的納米纖維素/生物活性玻璃的復合凍凝膠材料，具有輕質、高強度和貫通多孔結構等特點，實驗表明，凍凝膠的高孔隙率、羥基磷灰石的形成以及相關離子緩釋的共同作用能顯著誘導干細胞的成骨分化，促進骨折部位的細胞釋放出促進骨再生的相關生長因子，從而促進了新骨形成。其次，骨再生是一個受多種生長因子調控的復雜生理過程。其中，血管內皮生長因子（vasular endothelial growth factor，VEGF）和骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是公認的誘導血管生成及骨再生的關鍵生長因子。為了充分發揮兩種生長因子的協同效應，Lee 等[27]分別以明膠/殼聚糖凍凝膠和明膠/肝素凍凝膠為原料，研制出一種具有順序釋放動力學的雙層凍凝膠材料。他們將 VEGF 負載于外層的明膠/肝素凍凝膠中，VEGF 的早期釋放能誘導血管快速生成，為缺損區提供必要的血供；將 BMP-4 負載于內層的明膠/殼聚糖凍凝膠中，使其持續緩慢釋放誘導成骨，這種生長因子順序釋放體系能顯著上調成骨相關基因表達，最后通過一個體內顱骨缺損模型證實了該體系能促進骨缺損部位的修復和再生。盡管取得了一些進展，但凍凝膠的多孔結構與材料力學性能之間的矛盾是當前凍凝膠材料應用于骨組織工程材料的一大難題。其次，由于凍凝膠的大孔特征也極易造成生長因子的早期突釋效應，如何精確控制外源性成骨與成血管生物因子的釋放行為也是今后研究中的一個關鍵問題。
2 軟骨組織工程
由創傷、衰老、先天性疾病或腫瘤等引起的軟骨損傷在臨床上非常常見，由于缺乏血管和神經組織，軟骨組織的自我修復能力很差，盡管臨床治療方法較多，但普遍療效較差。組織工程為臨床軟骨修復提供了一條全新的治療方案。凍凝膠支架的多孔結構不僅能促進軟骨細胞的生長和增殖，更能模擬軟骨 ECM 的力學及結構特性，為細胞生長提供合適的三維空間及物理刺激，在軟骨組織工程中展現出廣闊的應用潛力。Han 等[28]將甲基丙烯酸酐改性的明膠與透明質酸或硫酸軟骨素共聚，制備出兩種能模擬軟骨 ECM 的凍凝膠支架。通過對比發現，明膠-硫酸軟骨素凍凝膠組對軟骨組織的生長有明顯的促進作用。他們將裝載有細胞的明膠基凍凝膠植入小鼠皮下組織，細胞分布均勻而且能維持正常的軟骨細胞表型。最后，將凍凝膠植入兔的軟骨缺損處，能形成與宿主完全整合的軟骨組織，實現了對軟骨缺損的功能性恢復。此外，可注射軟骨組織工程支架具有創傷小、操作簡單以及能修復不規則缺損等優點，是軟骨組織工程領域一個重要的研究方向[29-30]。在一項研究中，He 等[31]利用凍凝膠材料的形狀記憶功能，設計了一種可注射的透明質酸凍凝膠支架，該支架可以承受高達 90% 的應變，且能迅速恢復其原來形狀，能在關節鏡的輔助下進行微創注射，而且包裹在凝膠中的軟骨細胞能在注射后維持較高的代謝活性，并能有效實現缺損軟骨的修復。其次，一些生長因子在軟骨細胞表型的維持、抑制去分化中起到關鍵作用，為了實現相關生長因子的控釋并促進軟骨再生，Gupta 等[32]制備了一種裝載有轉化生長因子 β1（transforming growth factor beta，TGF-β1）的殼聚糖-瓊脂-明膠的復合凍凝膠支架。隨后通過兔軟骨下軟骨缺損模型證實了使用同時裝載有軟骨細胞和 TGF-β1 的凍凝膠能顯著地促進受損軟骨的修復。在未來的研究中，如果構建出具有適宜的力學性能凍凝膠支架，不僅能夠為關節軟骨提供臨時的支撐同時也能維持長期的負重及剪切力作用；而如何控制凍凝膠材料的降解速度與軟骨新生速度相匹配；如何利用凍凝膠建立多種生長因子的協同作用體系，進一步明確對軟骨細胞的生長、增殖及分化的調節機制等都將是凍凝膠體系應用于軟骨組織工程的研究的重點問題。
3 皮膚組織工程
皮膚是人體最大的器官，不僅是體表屏障，還承擔了包括免疫、內分泌、神經傳導等諸多生理功能，因燒傷、創傷或疾病造成的大面積皮膚缺損和慢性皮膚損傷，嚴重威脅著患者的身心健康。目前使用的治療方法主要有創面敷料、自體移植和同種異體移植，但存在治療效果有限、供體不足及免疫排斥等問題。利用組織工程原理構建的工程化皮膚成為一種有效的解決途徑，可以有效改善創面微環境，促進創周及創基的細胞增殖與血管形成，縮短傷口愈合時間。凍凝膠的大孔結構為細胞獲取營養、生長、增殖及代謝提供了一個理想的空間，同時其多孔海綿狀的結構及優良的親水性能還可以有效防止液體在傷口中積聚和感染，是一種極具潛力的皮膚組織工程支架[33-34]。為制備出一種能支持細胞生長并模擬皮膚多層細胞分布結構的皮膚組織工程支架，Wang 等[35]最早開發了一種基于透明質酸、膠原和明膠組成的用于傷口愈合的多孔凍凝膠，與商業化皮膚敷料相比，該材料表現出更高的吸水能力和優良的生物相容性。進一步將表皮角質形成細胞、黑色素細胞和真皮成纖維細胞種植在多孔支架上，免疫熒光染色表明該工程化組織具有類似天然皮膚組織的多層細胞分布結構。動物實驗證實了該支架可減少中性粒細胞浸潤并能實現新生皮膚的增厚，促進了創面的愈合。Tyeb 等[36]將脂肪組織來源干細胞（adipose-derived stem cell，ADSC）與包被有層粘連蛋白（laminin）的明膠-絲膠凍凝膠結合形成皮膚類似物，實驗結果表明：該支架對自由基攻擊有很好的保護作用，在支架上培養的成纖維細胞、角質形成細胞及脂肪來源的干細胞表現出更高的代謝活性，而且 laminin 涂層可促進內皮細胞的增殖和管狀結構的形成。通過大鼠糖尿病皮膚潰瘍的模型證明，負載有 ADSC 的凍凝膠支架具有更好的促進皮膚再生、膠原重塑以及血管生成的功能。此外，為了制備一種兼具抗感染和誘導組織再生功能的組織工程皮膚支架，Priya 等[37]將聚乙烯吡咯烷酮碘與明膠構建出雙層多孔凍凝膠材料有望用于全層皮膚缺損的修復。該雙層冷凍膠具有良好的抗菌性能，并能增強角質形成細胞和成纖維細胞的黏附和增殖。當該材料植入動物體內后能快速地促進傷口愈合，并實現受損皮膚的再生，且無明顯的炎癥反應。
由于凍凝膠具有可注射性，在注射后可以很快地恢復到預定的幾何形狀，可以匹配特定的皮膚損傷。Zeng 等[38]開發了一種可注射明膠微凍凝膠，以實現細胞輸送和細胞相關的治療。體外實驗證實該凝膠能促進 ADSC 相關基因的表達和生長因子的分泌，具有促進創傷愈合的功能。在裸鼠全層皮膚創傷模型中，與單純游離細胞注射相比，多點注射攜帶人脂肪干細胞的凍凝膠能直接作用于創面基底層，促進創面愈合，為慢性糖尿病潰瘍或放射性皮膚創傷等難治性傷口提供一個新的微創治療策略。
盡管凍凝膠在組織工程皮膚的構建上目前取得了可喜的進展，但是由于人體正常皮膚在組成、結構和功能等方面的高度復雜性也對未來支架材料的發展提出了更高的要求和挑戰，例如如何利用多孔凍凝膠構建適宜微環境，如何調控干細胞命運，構建具有皮膚附屬結構的完整組織工程化皮膚，加速與促進受傷皮膚修復后功能的重建等。其次，將凍凝膠與三維打印技術結合，有可能實現制備出與人體皮膚結構完全一致的仿生組織工程皮膚，同時也可實現大批量生產以滿足市場需求。
4 神經組織工程
外周神經系統或中樞神經系統的損傷，會造成患者永久性的認知、運動或精神障礙，并嚴重降低患者的生活質量。由于受損后局部生理環境的改變和膠質瘢痕的形成，導致了神經再生的困難。基于生物材料的組織工程方法，可以在損傷部位實現神經再生和修復，是目前神經損傷治療的一個重要手段。凍凝膠材料因其高孔隙率和可注射性，而且采用定向冷凍技術制備的支架能為神經細胞生長提供支持和引導，因此在神經組織工程中也備受關注。Jurga 等[39]將 laminin 化學偶聯在葡聚糖或明膠基凍凝膠中，以賦予凍凝膠的神經再生特性。實驗結果表明，這種凍凝膠能夠在體外誘導人臍血來源干細胞向神經細胞分化，促進神經組織的形成。體外構建的組織工程復合體可以移植到大鼠的腦部，且不會導致炎癥反應或膠質瘢痕形成，同時也可以顯著促進宿主成神經細胞（neuroblasts）的浸潤生長。然而，將較大尺寸的固體移植物植入腦部可能會導致進一步的組織損傷，顯然這不是一種理想的神經重建方法。通過結合凍凝膠材料的可注射性能及形狀記憶功能，Béduer 等[40]開發了一種可注射的海藻酸鈉和羧甲基纖維素凍凝膠材料。這類凍凝膠可以通過微創注射的方式移植到神經病變部位，該材料具有較高的局部楊氏模量，可以在注射過程中有效保護種子細胞的活性及功能，同時具有較低的宏觀楊氏模量，允許支架整合到周圍軟組織中，可以有效地促進神經突觸生長和分化。
周圍神經再生的主要方法是采用工程化的神經組織導管，為神經再生提供良好的再生微環境，以協助神經在臨界大小的缺損中再生。理想的神經導管應具有適當的孔徑和孔隙率，可引導軸突從近端向遠端再生，允許組織液和營養物質自由交換，為神經再生募集相關生長因子，同時抑制損傷部位瘢痕組織的生長[41]。Singh 等[42]制備了一種用于周圍神經再生的具有抗氧化性能的聚氨酯導管，并填充有定向孔結構的殼聚糖-明膠凍凝膠材料，用于外周神經再生。在體外背根神經節培養中，細胞呈定向排列生長，并能沿定向的孔進行遷移。神經端端吻合是治療周圍神經損傷最常用的方法。Tao 等[43]通過三維打印模具成型制備出具有形狀記憶功能的多孔明膠凍凝膠導管，用于促進神經吻合后周圍神經的功能恢復。實驗證實，可生物降解的凍凝膠導管可以有效防止成纖維細胞的浸潤，降低瘢痕組織的風險，為神經再生提供了有利的環境。該研究還通過大鼠坐骨神經橫斷模型評價了該導管在促進神經吻合后周圍神經再生方面的有效性，具有潛在的臨床應用價值。鑒于神經系統的復雜性，未來將綜合考慮凍凝膠材料的生物相容性、基質硬度、導電特性、藥物釋放等問題，并綜合最適條件進行組織構建；其次需要建立有效的神經生長因子的時空控制釋放體系和相互協同作用；最后，還需要與先進的制造技術結合，制造出具有復雜結構和多種細胞分布的工程化神經組織。
5 總結及展望
綜上所述，具有獨特大孔結構及形狀記憶功能的凍凝膠在組織工程領域具有獨特的優勢。目前，已在骨、軟骨、皮膚和神經等組織的修復和再生中表現出良好的適用性和巨大的應用潛力。為了進一步推動該材料在臨床上的應用，未來還存在一些亟待解決的關鍵問題，例如：如何精確控制工藝參數，確保凍凝膠大規模制備時材料性能的重復性；此外，凍凝膠的降解行為較難控制，需要采用更多的策略來調控它們的降解速率以滿足不同組織構建的需求。同時，裝載的藥物或生長因子的不可控釋放也是許多凍凝膠面臨的一個主要問題，可以將冷凍膠與控釋載體復合，以控制藥物或者生長因子的釋放行為。此外，也還需要研究和開發更為有效的生物分子偶聯接枝技術，以增強細胞與凝膠基質的相互作用。最后，還可以與先進的制造技術相結合，體外構建出性能可控，接近體內生理條件的三維微環境，有助于制備出更加仿生的工程化組織。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
組織工程是根據生物學和工程學的原理，把具有三維結構的支架與擴增的種子細胞相結合，在體外構建出能夠植入體內的具有生物活性的種植體，實現對受損組織的形態、結構或功能的修復與重建[1]。其核心是使用模擬天然細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的三維支架與種子細胞構建出工程化復合體。理想的組織工程支架應具有以下特點：① 具有優良的生物相容性，能為細胞生長提供三維空間結構，并能促進細胞黏附以及與材料相互作用；② 允許營養物質和代謝廢物在支架材料中的擴散和交換；③ 具有適宜的力學性能和降解速率從而實現與天然組織的整合[2]。除了部分可注射支架外，大多數支架材料需要預先制成三維多孔結構，不僅能為氧氣和營養物質的傳輸及代謝廢物的清除提供必要的通道，同時有利于細胞遷移和血管生成。因此，構建具有三維多孔結構的支架也一直是組織工程領域研究的熱點。
水凝膠是親水性聚合物以共價鍵、氫鍵、疏水作用或范德華力等形成的三維交聯網絡，是一種能在溶液中溶脹且長時間保持水分的材料形態，水凝膠由于其具有諸多優良的性質被認為是一種理想的組織工程支架材料并得到了廣泛的應用[3]。然而，傳統水凝膠的孔徑多為納米級別，與天然 ECM 的兼具微米多孔和納米纖維的孔結構不同，過小的孔徑直接導致包裹在凝膠中的細胞存活率下降以及在凝膠體中的遷移受阻，容易形成不規則的細胞分布。同時也很難支持血管網絡貫穿整個支架生成，繼而難以解決長期困擾組織工程的血管化不足的問題[4]。因此，如何制備出具有微米級的貫通多孔結構的凝膠材料是發展組織工程水凝膠支架材料的關鍵和趨勢。
凍凝膠（cryogel）是近年來快速發展的一種新型的生物材料，廣泛應用于干細胞移植、組織工程、藥物控釋以及免疫治療的研究領域[5-8]。凍凝膠是預聚物在零攝氏度以下冷凍聚合，以冰晶作為致孔劑，形成具有大孔結構的海綿狀材料。凍凝膠的制備過程如圖 1 所示，通常分成三個步驟：① 形成冰晶的相分離過程；② 集中在冰晶之間的非凍結液相中的反應物的交聯/聚合反應；③ 解凍冰晶形成開放的和相互連接的多孔聚合物網絡結構[9-10]。具體而言，低溫導致溶劑（如水）相分離為凍結相（冰晶）和冰晶周圍的非凍結相，在溶劑結晶過程中，溶劑晶體不斷長大，直到與另一個晶面接觸，形成高度互聯的晶體結構。此時，凝膠的前驅體則被排出結晶相中，此過程也被稱為“低溫濃縮”，濃縮后的預聚物在冰晶周圍交聯，可有效提高交聯度和反應效率，對其力學性能的提升至關重要。隨后，在室溫下解凍后的冰晶形成了一種具有高度彈性和穩定性的多孔海綿狀凝膠。由于冷凍結晶的過程本質上是高度互連的，利用冷凍溶劑晶體作為相互連接的致孔劑，有效地避免了傳統致孔劑法的孔貫通性不佳以及致孔劑殘留導致的細胞毒性等問題[11]。凍凝膠材料具有微米級的貫通多孔結構以及諸多獨特的性能，例如柔軟而富有彈性，可以壓縮到初始體積的 90% 以上且不會造成任何永久性的機械損傷；能夠快速溶脹，促進細胞的增殖和遷移，有利于血管網絡的生成[5, 12-13]。此外，大多數凍凝膠具有可注射性，可以承受注射器注射過程中遇到的壓應力，與傳統的可注射凝膠相比，這種預成型注射方式可以有效避免凝膠預聚物泄漏到周圍組織或被體液稀釋的問題[14-15]。部分凍凝膠甚至還可通過高壓蒸汽滅菌，且不影響其相關性能，極大地方便了臨床應用[16]。
圖1
凍凝膠支架材料的制備過程示意圖及其主要特性
Figure1.
Schematic of the process to fabricate cryogel scaffolds and their main properties
凍凝膠的性質受多個工藝參數影響，例如交聯類型[17]、凝膠預聚物的組成[10]、冷凍溫度、時間及速率等[18]。與普通水凝膠類似，凍凝膠可以通過化學或物理交聯聚合的方式制備。交聯方式直接影響著凝膠形成過程的動力學、穩定性及力學性能。物理交聯主要是通過非共價的相互作用，如離子交聯、結晶或者氫鍵等相互作用，例如聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）可以通過“冷凍-解凍”法制備凍凝膠，其最大的優勢在于其優良的生物相容性，缺點在于孔徑較小（<10 μm），而且力學性能和長期穩定性都相對較差[9]。與之相反，采用化學交聯制備的凍凝膠的孔徑分布在組織工程理想的孔徑范圍（100～200 μm），而且表現出優異的力學性能和穩定性。其中，自由基聚合是當前凍凝膠制備中最常用的技術，這一過程主要通過引發劑分解成為自由基，引發大分子單體上的官能團進行聚合和交聯，從而在冰晶周圍形成連續的聚合物網絡。發生聚合的官能團一般是碳碳雙鍵，多采用氧化還原的引發劑體系，例如，過硫酸銨（ammonium persulphate，APS）/四甲基乙二胺（N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine，TEMED）體系等，具有分解勢能低、引發速率快和反應動力學高的特點。許多天然和人工合成聚合物，如透明質酸、明膠、海藻酸鈉、殼聚糖和聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）等都可通過乙烯基團的功能化，通過自由基聚合實現交聯制備得到凍凝膠。此外，一些例如納米羥基磷灰石、聚吡咯、磁性納米顆粒、碳納米管等都可以摻雜到凍凝膠體系中，以賦予其獨特的生物活性、導電性以及磁性等以滿足不同組織或器官構建的需求[19]。正因為多孔凍凝膠材料具有諸多獨特的優點，目前已經在骨、軟骨、皮膚及神經等組織工程領域中發揮出巨大的應用潛力。
1 骨組織工程
骨是人體最重要的器官之一，起到保護內臟和為運動提供力學支撐的作用，同時還參與了多種生理功能。盡管骨具有自我再生和修復的能力，但臨床的大段骨缺損目前只能通過骨移植來修復，但骨移植卻受到供體短缺以及免疫排斥等限制，骨組織工程是臨床用于大段骨缺損治療的一種新途徑[20]。凍凝膠由于具有獨特的物理特性和抵御外界刺激的能力，以及具有適宜骨細胞生長和增殖以及實現血管化的三維貫通大孔結構，是一種理想的骨組織工程支架。骨組織工程的首要挑戰就是體外重建由膠原和羥基磷灰石晶體組成的模擬骨 ECM 的支架材料。Hixon 等[21]將不同形貌的羥基磷灰石晶體摻入到殼聚糖-明膠凍凝膠支架中。這類材料具有合適的孔徑及孔隙率、優良的孔貫通性及溶脹性等，同時能支持細胞黏附和礦化，有效地促進骨愈合和再生。Salgado 等[22]制備了一種膠原/納米羥基磷灰石復合凍凝膠并評價了其與骨髓間充質干細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSC）的相互作用。實驗結果顯示：該凍凝膠在體外能有效維持細胞的活性并促進其生長及增殖，而且整個培養周期（28 d）沒有觀察到明顯的細胞毒性反應，動物實驗也證實了該支架優良的生物相容性，并能促進骨缺損的修復和再生。Shalumon 等[23]報道了一種納米微球-凍凝膠雜化的骨組織工程支架，兼具承重和骨再生能力。當該支架與 BMSC 共培養后，其楊氏模量以及特定成骨標志物的基因表達都顯著地增加，并且具有修復兔脛骨中段缺損的能力。最近，該小組以不同的明膠凍凝膠為原料，考察了納米羥基磷灰石和交聯劑對支架性能及其對誘導 BMSC 成骨分化的影響，證明了可以利用支架的化學信號或動態細胞培養產生的物理信號來調節 BMSC 的成骨分化。他們成功地實現了將體外培養的冷凍膠/BMSC 復合體用于修復兔顱骨臨界尺寸的缺損[24]。Gu 等[25]將羥基磷灰石納米線作為增強相摻入到甲基丙烯酸酐改性的明膠凍凝膠中，制備出一種纖維增強的多孔雜化凍凝膠，實驗結果顯示凍凝膠的抗壓強度和穩定性都隨納米線含量的增加而提高，同時能夠支持 BMSC 增殖并顯著誘導其向成骨方向分化。
除了能模擬 ECM 外，理想的骨組織工程支架還應具有優良的力學強度、可加工性及生物相容性。Ferreira 等[26]制備了一種可用于體內骨修復的納米纖維素/生物活性玻璃的復合凍凝膠材料，具有輕質、高強度和貫通多孔結構等特點，實驗表明，凍凝膠的高孔隙率、羥基磷灰石的形成以及相關離子緩釋的共同作用能顯著誘導干細胞的成骨分化，促進骨折部位的細胞釋放出促進骨再生的相關生長因子，從而促進了新骨形成。其次，骨再生是一個受多種生長因子調控的復雜生理過程。其中，血管內皮生長因子（vasular endothelial growth factor，VEGF）和骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是公認的誘導血管生成及骨再生的關鍵生長因子。為了充分發揮兩種生長因子的協同效應，Lee 等[27]分別以明膠/殼聚糖凍凝膠和明膠/肝素凍凝膠為原料，研制出一種具有順序釋放動力學的雙層凍凝膠材料。他們將 VEGF 負載于外層的明膠/肝素凍凝膠中，VEGF 的早期釋放能誘導血管快速生成，為缺損區提供必要的血供；將 BMP-4 負載于內層的明膠/殼聚糖凍凝膠中，使其持續緩慢釋放誘導成骨，這種生長因子順序釋放體系能顯著上調成骨相關基因表達，最后通過一個體內顱骨缺損模型證實了該體系能促進骨缺損部位的修復和再生。盡管取得了一些進展，但凍凝膠的多孔結構與材料力學性能之間的矛盾是當前凍凝膠材料應用于骨組織工程材料的一大難題。其次，由于凍凝膠的大孔特征也極易造成生長因子的早期突釋效應，如何精確控制外源性成骨與成血管生物因子的釋放行為也是今后研究中的一個關鍵問題。
2 軟骨組織工程
由創傷、衰老、先天性疾病或腫瘤等引起的軟骨損傷在臨床上非常常見，由于缺乏血管和神經組織，軟骨組織的自我修復能力很差，盡管臨床治療方法較多，但普遍療效較差。組織工程為臨床軟骨修復提供了一條全新的治療方案。凍凝膠支架的多孔結構不僅能促進軟骨細胞的生長和增殖，更能模擬軟骨 ECM 的力學及結構特性，為細胞生長提供合適的三維空間及物理刺激，在軟骨組織工程中展現出廣闊的應用潛力。Han 等[28]將甲基丙烯酸酐改性的明膠與透明質酸或硫酸軟骨素共聚，制備出兩種能模擬軟骨 ECM 的凍凝膠支架。通過對比發現，明膠-硫酸軟骨素凍凝膠組對軟骨組織的生長有明顯的促進作用。他們將裝載有細胞的明膠基凍凝膠植入小鼠皮下組織，細胞分布均勻而且能維持正常的軟骨細胞表型。最后，將凍凝膠植入兔的軟骨缺損處，能形成與宿主完全整合的軟骨組織，實現了對軟骨缺損的功能性恢復。此外，可注射軟骨組織工程支架具有創傷小、操作簡單以及能修復不規則缺損等優點，是軟骨組織工程領域一個重要的研究方向[29-30]。在一項研究中，He 等[31]利用凍凝膠材料的形狀記憶功能，設計了一種可注射的透明質酸凍凝膠支架，該支架可以承受高達 90% 的應變，且能迅速恢復其原來形狀，能在關節鏡的輔助下進行微創注射，而且包裹在凝膠中的軟骨細胞能在注射后維持較高的代謝活性，并能有效實現缺損軟骨的修復。其次，一些生長因子在軟骨細胞表型的維持、抑制去分化中起到關鍵作用，為了實現相關生長因子的控釋并促進軟骨再生，Gupta 等[32]制備了一種裝載有轉化生長因子 β1（transforming growth factor beta，TGF-β1）的殼聚糖-瓊脂-明膠的復合凍凝膠支架。隨后通過兔軟骨下軟骨缺損模型證實了使用同時裝載有軟骨細胞和 TGF-β1 的凍凝膠能顯著地促進受損軟骨的修復。在未來的研究中，如果構建出具有適宜的力學性能凍凝膠支架，不僅能夠為關節軟骨提供臨時的支撐同時也能維持長期的負重及剪切力作用；而如何控制凍凝膠材料的降解速度與軟骨新生速度相匹配；如何利用凍凝膠建立多種生長因子的協同作用體系，進一步明確對軟骨細胞的生長、增殖及分化的調節機制等都將是凍凝膠體系應用于軟骨組織工程的研究的重點問題。
3 皮膚組織工程
皮膚是人體最大的器官，不僅是體表屏障，還承擔了包括免疫、內分泌、神經傳導等諸多生理功能，因燒傷、創傷或疾病造成的大面積皮膚缺損和慢性皮膚損傷，嚴重威脅著患者的身心健康。目前使用的治療方法主要有創面敷料、自體移植和同種異體移植，但存在治療效果有限、供體不足及免疫排斥等問題。利用組織工程原理構建的工程化皮膚成為一種有效的解決途徑，可以有效改善創面微環境，促進創周及創基的細胞增殖與血管形成，縮短傷口愈合時間。凍凝膠的大孔結構為細胞獲取營養、生長、增殖及代謝提供了一個理想的空間，同時其多孔海綿狀的結構及優良的親水性能還可以有效防止液體在傷口中積聚和感染，是一種極具潛力的皮膚組織工程支架[33-34]。為制備出一種能支持細胞生長并模擬皮膚多層細胞分布結構的皮膚組織工程支架，Wang 等[35]最早開發了一種基于透明質酸、膠原和明膠組成的用于傷口愈合的多孔凍凝膠，與商業化皮膚敷料相比，該材料表現出更高的吸水能力和優良的生物相容性。進一步將表皮角質形成細胞、黑色素細胞和真皮成纖維細胞種植在多孔支架上，免疫熒光染色表明該工程化組織具有類似天然皮膚組織的多層細胞分布結構。動物實驗證實了該支架可減少中性粒細胞浸潤并能實現新生皮膚的增厚，促進了創面的愈合。Tyeb 等[36]將脂肪組織來源干細胞（adipose-derived stem cell，ADSC）與包被有層粘連蛋白（laminin）的明膠-絲膠凍凝膠結合形成皮膚類似物，實驗結果表明：該支架對自由基攻擊有很好的保護作用，在支架上培養的成纖維細胞、角質形成細胞及脂肪來源的干細胞表現出更高的代謝活性，而且 laminin 涂層可促進內皮細胞的增殖和管狀結構的形成。通過大鼠糖尿病皮膚潰瘍的模型證明，負載有 ADSC 的凍凝膠支架具有更好的促進皮膚再生、膠原重塑以及血管生成的功能。此外，為了制備一種兼具抗感染和誘導組織再生功能的組織工程皮膚支架，Priya 等[37]將聚乙烯吡咯烷酮碘與明膠構建出雙層多孔凍凝膠材料有望用于全層皮膚缺損的修復。該雙層冷凍膠具有良好的抗菌性能，并能增強角質形成細胞和成纖維細胞的黏附和增殖。當該材料植入動物體內后能快速地促進傷口愈合，并實現受損皮膚的再生，且無明顯的炎癥反應。
由于凍凝膠具有可注射性，在注射后可以很快地恢復到預定的幾何形狀，可以匹配特定的皮膚損傷。Zeng 等[38]開發了一種可注射明膠微凍凝膠，以實現細胞輸送和細胞相關的治療。體外實驗證實該凝膠能促進 ADSC 相關基因的表達和生長因子的分泌，具有促進創傷愈合的功能。在裸鼠全層皮膚創傷模型中，與單純游離細胞注射相比，多點注射攜帶人脂肪干細胞的凍凝膠能直接作用于創面基底層，促進創面愈合，為慢性糖尿病潰瘍或放射性皮膚創傷等難治性傷口提供一個新的微創治療策略。
盡管凍凝膠在組織工程皮膚的構建上目前取得了可喜的進展，但是由于人體正常皮膚在組成、結構和功能等方面的高度復雜性也對未來支架材料的發展提出了更高的要求和挑戰，例如如何利用多孔凍凝膠構建適宜微環境，如何調控干細胞命運，構建具有皮膚附屬結構的完整組織工程化皮膚，加速與促進受傷皮膚修復后功能的重建等。其次，將凍凝膠與三維打印技術結合，有可能實現制備出與人體皮膚結構完全一致的仿生組織工程皮膚，同時也可實現大批量生產以滿足市場需求。
4 神經組織工程
外周神經系統或中樞神經系統的損傷，會造成患者永久性的認知、運動或精神障礙，并嚴重降低患者的生活質量。由于受損后局部生理環境的改變和膠質瘢痕的形成，導致了神經再生的困難。基于生物材料的組織工程方法，可以在損傷部位實現神經再生和修復，是目前神經損傷治療的一個重要手段。凍凝膠材料因其高孔隙率和可注射性，而且采用定向冷凍技術制備的支架能為神經細胞生長提供支持和引導，因此在神經組織工程中也備受關注。Jurga 等[39]將 laminin 化學偶聯在葡聚糖或明膠基凍凝膠中，以賦予凍凝膠的神經再生特性。實驗結果表明，這種凍凝膠能夠在體外誘導人臍血來源干細胞向神經細胞分化，促進神經組織的形成。體外構建的組織工程復合體可以移植到大鼠的腦部，且不會導致炎癥反應或膠質瘢痕形成，同時也可以顯著促進宿主成神經細胞（neuroblasts）的浸潤生長。然而，將較大尺寸的固體移植物植入腦部可能會導致進一步的組織損傷，顯然這不是一種理想的神經重建方法。通過結合凍凝膠材料的可注射性能及形狀記憶功能，Béduer 等[40]開發了一種可注射的海藻酸鈉和羧甲基纖維素凍凝膠材料。這類凍凝膠可以通過微創注射的方式移植到神經病變部位，該材料具有較高的局部楊氏模量，可以在注射過程中有效保護種子細胞的活性及功能，同時具有較低的宏觀楊氏模量，允許支架整合到周圍軟組織中，可以有效地促進神經突觸生長和分化。
周圍神經再生的主要方法是采用工程化的神經組織導管，為神經再生提供良好的再生微環境，以協助神經在臨界大小的缺損中再生。理想的神經導管應具有適當的孔徑和孔隙率，可引導軸突從近端向遠端再生，允許組織液和營養物質自由交換，為神經再生募集相關生長因子，同時抑制損傷部位瘢痕組織的生長[41]。Singh 等[42]制備了一種用于周圍神經再生的具有抗氧化性能的聚氨酯導管，并填充有定向孔結構的殼聚糖-明膠凍凝膠材料，用于外周神經再生。在體外背根神經節培養中，細胞呈定向排列生長，并能沿定向的孔進行遷移。神經端端吻合是治療周圍神經損傷最常用的方法。Tao 等[43]通過三維打印模具成型制備出具有形狀記憶功能的多孔明膠凍凝膠導管，用于促進神經吻合后周圍神經的功能恢復。實驗證實，可生物降解的凍凝膠導管可以有效防止成纖維細胞的浸潤，降低瘢痕組織的風險，為神經再生提供了有利的環境。該研究還通過大鼠坐骨神經橫斷模型評價了該導管在促進神經吻合后周圍神經再生方面的有效性，具有潛在的臨床應用價值。鑒于神經系統的復雜性，未來將綜合考慮凍凝膠材料的生物相容性、基質硬度、導電特性、藥物釋放等問題，并綜合最適條件進行組織構建；其次需要建立有效的神經生長因子的時空控制釋放體系和相互協同作用；最后，還需要與先進的制造技術結合，制造出具有復雜結構和多種細胞分布的工程化神經組織。
5 總結及展望
綜上所述，具有獨特大孔結構及形狀記憶功能的凍凝膠在組織工程領域具有獨特的優勢。目前，已在骨、軟骨、皮膚和神經等組織的修復和再生中表現出良好的適用性和巨大的應用潛力。為了進一步推動該材料在臨床上的應用，未來還存在一些亟待解決的關鍵問題，例如：如何精確控制工藝參數，確保凍凝膠大規模制備時材料性能的重復性；此外，凍凝膠的降解行為較難控制，需要采用更多的策略來調控它們的降解速率以滿足不同組織構建的需求。同時，裝載的藥物或生長因子的不可控釋放也是許多凍凝膠面臨的一個主要問題，可以將冷凍膠與控釋載體復合，以控制藥物或者生長因子的釋放行為。此外，也還需要研究和開發更為有效的生物分子偶聯接枝技術，以增強細胞與凝膠基質的相互作用。最后，還可以與先進的制造技術相結合，體外構建出性能可控，接近體內生理條件的三維微環境，有助于制備出更加仿生的工程化組織。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
