膀胱作為儲尿排尿器官具有重要的生理功能，許多病理原因導致的膀胱損傷往往需要進行膀胱重建。臨床上膀胱重建的金標準是胃腸道代膀胱術，但是胃腸道的結構和功能與膀胱有著本質的區別，導致腸段置換術易產生血尿、排尿困難、結石、腫瘤等并發癥。近年來，隨著組織工程及再生醫學的誕生及發展，為膀胱缺損修復提供了新的思路和技術手段。本文就膀胱組織工程的三個方面——種子細胞、支架材料及生長因子的最新進展進行了綜述。
引用本文： 張秀珍, 陳秋竹, 張藝琪, 解慧琪. 膀胱組織工程研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(2): 200-206. doi: 10.7507/1001-5515.201911075 復制
引言
臨床上許多病理原因，如脊髓損傷、創傷、先天性畸形、惡性腫瘤等造成的膀胱功能障礙，均需要膀胱重建才能更好地發揮其儲尿排尿功能。一些晚期膀胱疾病通常也需要通過膀胱擴大術，實現增加膀胱容量、降低膀胱內壓的目的，以此減輕尿液返流對上尿路造成的影響[1]。到目前為止，膀胱置換和擴大術的金標準依然是通過植入腸段（胃、小腸或大腸組織）進行膀胱重建，但此種手術方式往往會導致嚴重的并發癥，如代謝異常、異位黏液產生、尿路感染、結石等，甚至會導致泌尿系腫瘤的發生，因此臨床對組織工程膀胱替代物有著廣泛的需求[1]。
膀胱組織工程是泌尿外科研究的一個重要方向，其主要研究內容包括種子細胞、支架材料和細胞因子[1]。在過去的二十年里，許多不同來源和性質的支架材料［膠原、豬小腸黏膜下層（porcine small intestinal submucosa，SIS）、脫細胞膀胱基質（bladder acellular matrix，BAM）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）和聚（乳酸-乙醇酸）（poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA）等］被應用于膀胱組織工程研究中。為了結合各類材料的優勢，近年來也有較多關于新型復合支架材料的研究及應用。復合支架材料能夠為不同組織結構細胞的長入提供適宜的組織微環境，更好地誘導膀胱組織再生。雖然支架材料能夠起到一定的力學支撐及誘導周圍組織再生的作用，但單純支架材料植入往往會導致植入體攣縮和纖維化。為進一步提高組織再生效率，改善支架材料功能，促進支架材料與周圍組織結構和功能的整合，減輕植入物纖維化，往往會在支架材料上復合細胞。自體細胞雖然無免疫原性，但其擴增困難、易老化，且較難獲取足夠數量的正常自體細胞用于組織工程膀胱構建。干細胞具有自我更新及多向分化潛能，現被廣泛應用于組織工程再生研究中。眾多研究表明干細胞能夠通過旁分泌作用明顯改善組織再生水平，此外，干細胞還表現出一定的免疫調節能力，可以影響再生組織炎癥微環境，促進組織重塑。另外，為保證植入細胞的存活、增殖、遷移及分化，往往會在支架材料上復合各類生長因子[1]。移植細胞/支架復合材料成功的基礎是微觀及超微結構特征的重現，以模擬組織本身的結構，為了進一步調節組織再生的過程，在結構基礎上重建組織功能，往往需要各類生物生長因子的協調配合。生物源性支架材料（SIS 和 BAM 等）負載的生長因子以及特定細胞類型，如膀胱平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）、尿路上皮細胞（urethral epithelial cells，UCs）和間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等細胞中表達的生長因子，提供了啟動和加速組織再生的基本元素[2]。
綜上所述，膀胱組織工程的研究和應用可作為經典的胃腸代膀胱重建術的替代修復手段，有望避免或改善經典術式引發的一系列并發癥，是一個有前景并具有挑戰性的研究領域。本文綜述了近年來膀胱組織工程在種子細胞、支架材料及生長因子研究和應用方面的一些進展，以期為膀胱組織工程的發展及轉化提供借鑒。
1 種子細胞
大量研究表明，在支架材料上復合種子細胞可以促進組織再生，提高工程化組織修復效果[3]。在膀胱組織工程中，植入細胞的支架材料用于修復、重建膀胱組織時可以明顯提高膀胱順應性，改善膀胱功能，且可以有效地避免組織纖維化。
1.1 自體細胞
應用于膀胱組織工程的自體膀胱細胞主要包括 UCs 和 SMCs。從病變器官提取分離自體膀胱細胞，體外擴增到一定數量后接種于支架材料上，經過一段時間的復合培養即可植入宿主體內。應用自體細胞可避免植入后的免疫排斥反應，以及異體移植需長期使用免疫抑制藥物的問題，但自體細胞的應用較為受限。一方面，膀胱重建最主要的適應證是腫瘤和神經源性功能障礙，其中膀胱癌可轉移到尿路多處部位，所以從患者自身收集或提取的用于重建的細胞很可能存在致癌風險[4]；而神經源性膀胱功能障礙患者來源的平滑肌細胞用于膀胱修復時，表現出細胞增殖能力增強、黏附能力減弱、收縮能力降低等病理改變[5]；其他如先天性疾病、感染、輻射等造成膀胱損傷的患者中，從受損組織中獲得的異常細胞也不適于重建新的膀胱組織[6-7]，故較難從患者體內提取足夠數量的正常 UCs 或 SMCs 進行體外擴增。另一方面，已分化成熟的自體細胞在體外培養擴增時，存在去分化、結構和功能喪失、老化等問題。
1.2 間充質干細胞
隨著干細胞分離提取技術的發展，從多種組織提取干細胞成為可能。干細胞具有自我更新和多向分化潛能，并且具有低免疫原性的特點，在膀胱組織工程應用中潛力巨大。在膀胱修復過程中，干細胞通常以三種方式發揮作用：分泌細胞因子、招募常駐細胞、誘導 MSCs 分化為 SMCs 和 UCs[6]。
MSCs 是一種多能干細胞，可從全身各組織，如骨髓、脂肪、外周血、臍帶血、肝臟等組織中分離獲得，在體外和體內均能增殖和分化為多種細胞類型。MSCs 可以分化為平滑肌細胞促進膀胱修復，并通過旁分泌刺激血管、神經生成[8]。
骨髓間充質干細胞是一種來源于骨髓的 MSCs。骨髓來源的基質細胞中 MSCs 含量很少，盡管數量有限，但其具有長時間自我更新及在適當條件下分化為多種不同特化細胞類型的潛能[9]，是最常用的 MSCs。由于膀胱癌不會向骨髓轉移，因此可以保證骨髓來源 MSCs 的安全性。
脂肪間充質干細胞在促進血供重建、神經元修復和中胚層再生方面具有特殊的作用，且在人體中豐度高，獲取分離相對簡單。脂肪間充質干細胞可分化為 SMCs，表達相關標志物分子，并維持支架材料中平滑肌的增殖和分化能力。此外，Sharma 等[10]的研究表明，脂肪間充質干細胞可通過分泌調節細胞遷移、增殖的肽生長因子和細胞因子來影響周圍微環境，促進膀胱平滑肌再生[4, 11]。Leite 等[12]研究發現，脂肪間充質干細胞能夠分泌多種與血管生成相關的細胞因子，包括血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），可誘導內源性細胞遷移和再生通路活化。
尿源性干細胞（urine-derived stem cells，USCs）是從尿液中獲得的多能細胞，可通過無創、簡單、低成本的方法獲得并大量擴增，但數量稀少，一般只占尿液的 0.2%[1]。USCs 可通過誘導高效分化為SMCs和 UCs，還能夠分化為脂肪源性、軟骨源性、內皮細胞、間質細胞、神經源性、成骨和骨骼肌源性細胞譜系[6, 11]。USCs 還有旁分泌促血管生成作用，以及表達與腎組織相關的標記物。USCs 易于培養，且經過幾次傳代后基因仍較穩定，并保持良好的分化能力。由于上尿路膀胱癌的發病率較低，為 0.7%～3.4%，因此 USCs 具有較高的生物安全性[11]。
成體干細胞的研究與應用仍需面對許多挑戰，其主要問題是它們在培養過程中容易老化，形成祖細胞進行修復、重建受損組織的能力逐漸減弱。而且，干細胞在成人組織中的數量極低，分離高純度和高質量的成體干細胞仍然是一個挑戰。如果從病變組織或患有遺傳疾病的患者體內分離成體干細胞，可能需要進行基因修飾才能應用于臨床[11]。
1.3 誘導多能干細胞
誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是一種通過重編程成體細胞獲得的多能干細胞，可表現出胚胎干細胞的形態和生物學特性，有望成為再生醫學領域具有患者特異性的干細胞來源。iPSC 來源十分廣泛，大多數體細胞類型都可以通過激活 c-MYC、KLF4、OCT4 和 SOX2 等基因或通過體細胞核轉移獲得 iPSC，并可分化為三個胚層中的各種細胞，在體外適當的條件下無限增殖[11]。研究顯示，iPSC 可以定向分化為內胚層特定細胞，通過表達轉錄調控因子 IFR1 和 GATA4，或誘導平滑肌細胞分化為膀胱成熟細胞，如 UCs[13]。盡管 iPSC 有巨大的潛力，但對其重編程和多能誘導的機制仍知之甚少，且可能導致癌變或畸胎瘤的發生，使其在臨床應用受限[11]。
2 支架材料
支架材料是組織工程學研究的重點內容之一。用于再生醫學的生物支架材料應具備良好的生物相容性、細胞行為可調控性、生物可降解性以及良好的生物力學性能等特點。目前應用于膀胱組織工程的生物支架材料有兩種來源：天然來源及合成聚合材料[14]。
2.1 天然材料
2.1.1 天然來源的支架材料
天然來源的支架材料有很多種，包括膠原、糖胺聚糖和絲素蛋白（silk fibroin，SF）。Ⅰ型膠原和絲素蛋白在膀胱組織工程中的應用較為廣泛。Ⅰ型膠原具有來源廣、易于制備且生物相容性良好等優勢，被廣泛應用于膀胱組織工程。有研究表明膠原水凝膠可支持正常的 UCs 生長以及維持 SMCs 的收縮表型[15]。膠原水凝膠雖已廣泛應用于組織再生，但其機械強度不足以用于組織壁重建[16]。Mudera 等[17]在研究中發現將Ⅰ型膠原蛋白凝膠進行塑性壓縮，可在較短時間內將膠原蛋白的機械性能控制在接近組織水平，塑性壓縮膠原水凝膠可作為改善再生組織機械性能的方法之一。與膠原蛋白相比，SF 具有優異的拉伸特性和彈性，與合成聚合物支架材料相比，SF 植入體內后的免疫原性和炎癥反應較低[18-19]，SF 支架表現出更優的生物力學性能和生物相容性。SF 移植物用于膀胱重建的可行性已在小鼠模型中得到驗證[20]，將凝膠紡絲 SF 支架與 SIS、PGA 同時植入小鼠膀胱缺損模型中進行評估，結果發現進行凝膠紡絲 SF 移植的動物的存活率高于植入 SIS 和 PGA 的存活率，能夠支持 SMCs 和 UCs 的再生，同時急性炎癥反應較輕，膀胱容量和排尿體積相對增加，膀胱功能得到明顯改善[21]。
2.1.2 脫細胞基質支架
脫細胞基質支架材料是通過從人或動物的組織中去除具有免疫原性的細胞成分，而形成的僅保留細胞外基質成分的生物源性材料。脫細胞基質材料保存原有組織較為完整的三維結構，能夠為細胞的長入提供理想的載體，可用于在離體培養條件下構建疾病模型，以及探索健康和患病組織中細胞-細胞外基質的相互作用機制。脫細胞基質材料能夠維持 UCs 和 SMCs 的增殖，促進 SMCs 從鄰近組織再生以及神經組織和血管的再生[22]。
BAM 是膀胱組織工程研究中最常用的脫細胞基質支架，可以通過物理破壞（即凍融）、化學方法（例如十二烷基硫酸鈉、鈉脫氧膽酸鹽等化學試劑處理）、酶處理法等方式從膀胱組織中去除細胞[23-25]。Guyette 等[24]用灌注法對整個膀胱進行了脫細胞處理，通過形態學觀察及功能學評價發現 BAM 中的蛋白質（膠原蛋白、彈性蛋白等）的結構以及排列方式沒有受到明顯破壞，其機械性能和天然的膀胱組織黏膜下層的機械性能沒有顯著差異[24]，所得的脫細胞支架可單獨使用或接種細胞。
Brown 等[26]發現，BAM 具有支持豬 SMCs 和 UCs 聯合生長的能力，通過體外共培養體系，評估 UCs 對于 SMCs 介導的肌肉收縮的影響，以及 UCs 促進 SMCs 長入 BAM 的作用。研究結果表明，UCs 共培養可增強 SMCs 的浸潤和收縮能力，原因可能是明膠酶活性增加。膀胱 UCs 對體外 SMCs 行為的影響表明，BAM 可能包含一些關鍵的誘導性因子，這些因子可促進重要的膀胱細胞間和細胞外基質間的相互作用。Geng 等[27]與 Yoo 等[23]的實驗研究結果均表明，沒有植入細胞的 BAM 會隨時間的增加而出現收縮，從而導致膀胱容量減少，將膀胱上皮細胞和膀胱 SMCs 均植入到同種異體膀胱黏膜下層后，與植入未接種細胞的膀胱黏膜下層相比，植入細胞后膀胱容量顯著增加。由此 Yoo 等[23]推測，接種細胞的同種異體 BAM 可作為一種用于膀胱擴增的生物材料。
SIS 主要是通過機械法將豬小腸的黏膜層、肌層及漿膜層刮除，保留黏膜下層而制備的脫細胞基質材料。SIS 在跨物種移植中不會引發宿主產生不良反應，具有良好的生物相容性。在 20 世紀 90 年代，SIS 就已被用作修復各種組織的支架材料，包括疝[7]、硬腦膜[28]、動靜脈組織[29-30]、肌腱[29-31]、皮膚[32]等。在膀胱重建中，SIS 作為支架材料，通過細胞外基質來協調宿主膀胱細胞的再生能力[33-35]。SIS 制備時的變量的差異，如豬齡、所取用小腸區域及滅菌方法，可能會使 SIS 在體內外的細胞反應中所具備的物理特性、生化特性、炎性細胞浸潤和再生能力有所差異[36]。Lin 等[35]的綜述中總結了導致 SIS 介導的嚙齒動物和犬科動物的膀胱再生不一致的原因，其中包括：SIS 的滅菌方法、所用豬的年齡以及所用的腸段所在區域。因此，有必要在動物模型和臨床研究中對 SIS 性能進行評估。
2.2 合成聚合材料
到目前為止，已有較多合成聚合物作為膀胱組織工程支架材料的研究。某些合成聚合物，例如 PLA、PGA 和 PLGA 等已獲美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于醫療器械。PGA、PLA 和 PLGA 的降解產物是無毒的天然代謝產物，最終以二氧化碳和水的形式從體內清除。合成材料的優點在于：它們可以大規模快速地制備，由于這些聚合物是熱塑性材料，因此可以被加工以獲得所需的強度、微觀結構和降解速率。加工方法之一是將合成聚合材料電紡成亞微米或納米纖維支架，以模仿細胞外基質的微觀結構，并使材料具有適當的機械性能。Baker 等[37]在研究中發現膀胱組織膠原網絡的自然排列反映了平滑肌細胞束的方向，基于此開發了一種特性良好的電紡聚苯乙烯支架，研究中發現排列整齊的電紡聚苯乙烯支架促進人膀胱平滑肌內肌動蛋白絲的整齊排列，可將其用于膀胱細胞的三維培養實驗。
合成聚合物在組織工程支架材料的應用上有很大潛力，其機械性能和化學性質可控性更強，而且合成聚合物更易獲得和制備，可在與細胞相容的溫和條件下進行加工。但由于合成聚合物缺乏天然材料固有的可以促進所需細胞反應的生物學因子，因此如何選擇和修飾合成聚合物以滿足作為組織工程支架的生物學要求是研究的重點。
Rohman 等[38]研究了聚酯薄膜的物理性質對 UCs 和 SMCs 的黏附和生長的影響，研究發現，細胞黏附和生長的模式與膜的表面形態無關，而生物材料的的機械性能會影響細胞的生長。Ardeshirylajimi 等[39]將轉化生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）負載到殼聚糖納米顆粒上，并與合成聚合物聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）復合，將其用于誘導人脂肪間充質干細胞分化為平滑肌，研究該支架材料在膀胱組織工程中的應用。結果顯示 PVDF-TGFβ 組的平滑肌再生水平明顯高于 PVDF 組，復合生長因子的支架材料能夠促進 MSCs 定向分化為功能細胞，促進膀胱組織功能重塑。
2.3 膀胱支架材料的力學相容性
生物力學是研究生物系統中力、運動、應力和應變的學科，可用于量化和描述各種生物組織的內在力學性質。由于膀胱本身就是一個肌性器官，深入地了解膀胱壁的力學性能對于進一步認識膀胱的功能以及構建功能化組織工程膀胱至關重要。膀胱壁纖維主要由膠原纖維和彈性纖維組成，交錯的膠原纖維和彈性纖維賦予了膀胱壁彈性和延展性。該組織與其他軟組織相似，表現出粘彈性特性，因此可以通過評估遲滯、應力松弛和蠕變來評價膀胱壁的力學特性[40]。量化膀胱壁力學性能的研究有很多，有些研究是在主動充盈-排尿周期下進行體內整體器官評估（尿動力學檢測）[41]，有些則是在體外對切下的組織壁進行單軸和/或多軸加載條帶實驗（被動實驗）[42]。
組織工程和再生醫學的目標是修復、維持和改善受損組織和器官的結構和功能，支架材料是組織工程的關鍵技術之一，組織工程支架除了要模擬膀胱壁的組織結構外還要有一定的力學強度，才能有效維持膀胱功能[43]。許多生物支架的力學特性在植入前后進行了被動力學檢測和主動力學檢測，最終通過動物實驗進一步開發用于臨床的支架材料。Xiao 等[41]在利用三維水凝膠復合支架修復大鼠膀胱全層缺損的實驗研究中，在體外分別評價了膀胱脫細胞基質移植物（bladder acellular matrix graft，BAMG）、BAMG 復合膠原及 BAMG 復合膠原后負載細胞的力學特性，其力學分析結果顯示復合材料負載細胞可以明顯改善支架材料的彈性模量和載荷；通過尿動力學檢測膀胱順應性的結果同樣表明，復合材料負載細胞后大鼠膀胱儲尿量增加，順應性增強。Baker 等[37]體外研究時發現膀胱上皮細胞和平滑肌細胞在模量最低的多孔 PLGA 和 PCL 支架上的生長情況最好，還觀察到與 PLGA 支架相比，PCL 支架上細胞的黏附和增殖顯著增強，因為 PCL 支架的儲能模量約為 PLGA 儲能模量的一半，而這個值又接近天然膀胱組織的正常值。無論是什么類型的支架材料均可通過主動和（或）被動力學檢測評價其力學性能，它們的結合將給我們帶來更有用的力學信息，在未來膀胱組織工程研究中生物力學的評價將變得更為重要和完善。
3 生長因子
生長因子是指能夠在細胞間傳遞信息并對細胞生長、增殖及分化具有調節作用的多肽類物質。生長因子廣泛參與了胚胎發育及組織修復過程，在組織工程、創傷修復、神經系統疾病治療等方面具有重要作用。生長因子在膀胱組織工程構建中應用非常廣泛，主要發揮調節細胞功能、促進血管生成及誘導組織再生的作用[44]。但由于生長因子穩定性差，半衰期短，直接使用會受到較大限制，在應用過程中往往需要將其與生物材料或者納米遞送系統相結合，以達到靶向、持久發揮生物作用的目的。
3.1 血管內皮生長因子
目前影響組織工程種子細胞定植和存活的主要原因是在功能血管叢形成的初始階段，無法為移植細胞提供充分的營養物質和氧氣輸送，由此產生的缺氧微環境會導致移植細胞凋亡及壞死，破壞移植代替物的定植，大大延緩再生修復過程。因此修復組織的早期血管化對于組織再生至關重要[45]。VEGF 屬于血小板衍生生長因子家族，具有促進內皮細胞增殖，誘導血管新生的作用。Zhang 等[46]將 VEGF 與絲素蛋白-脫細胞膀胱基質（SF-BAMG）復合支架結合，用于兔膀胱缺損的修復，結果顯示結合生長因子的支架材料能夠快速實現早期血管化，有利于膀胱功能恢復。由于 VEGF 的半衰期短、清除速度快，Youssif 等[47]與 Jiang 等[48]分別采用水凝膠遞送系統及納米遞送系統實現了 VEGF 的持久、有效釋放，其研究結果表明 VEGF 在促進新生膀胱組織血管生成的同時，能夠加快神經及膀胱平滑肌的再生與修復。
3.2 堿性成纖維細胞生長因子
堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一類肝素結合生長因子，通過與多種內皮細胞表面受體（包括酪氨酸激酶受體、肝素-硫酸蛋白聚糖和整合素）相互作用發揮促血管生成活性。Kanematsu 等[49]將 bFGF 蛋白溶液直接復合到 BAM 上，用于小鼠膀胱缺損修復，研究顯示隨著支架材料的降解，4 周時 bFGF 仍能以劑量依賴性的方式促進血管生成，并且可以顯著抑制移植物的收縮。與其他生長因子相同，bFGF 也存在擴散快、半衰期短、副作用多等缺陷，臨床應用受到限制。Shi 等[50]將一個特定的膠原結合域（collagen-binding domain，CBD）融合到天然 bFGF 的 N 端，在不影響 bFGF 細胞因子活性的情況下，表現出了明顯的膠原結合能力。進一步將 CBD-bFGF/BAM 材料用于犬半膀胱缺損修復重建，研究結果顯示該支架可促進損傷膀胱的再生和功能恢復。CBD 結合生長因子的復合支架操作簡單，并且可以實現對生長因子用量的精細化控制，此外由于其具有靶向性，功能材料可以有效地利用 bFGF，減少副作用，顯示了 CBD-bFGF 復合材料用于膀胱壁重建的優越性。
3.3 胰島素樣生長因子
胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF-1）已被證明與傷口愈合有關，其通過體內血液因子與纖維蛋白凝塊的相互作用參與傷口愈合級聯反應。其在一系列組織（骨骼肌、心肌、神經、軟骨和骨）中的再生機制也得到了深入的探索。IGF-1 作用廣泛，涉及多種細胞過程，如增殖、分化、凋亡等，多項研究表明 IGF-1 與平滑肌細胞增殖和存活呈正相關關系[51-52]。Lorentz 等[53]將 IGF-1 與纖維蛋白凝膠結合，發現與單純的纖維蛋白凝膠相比，一定劑量的 IGF-1 能夠顯著促進膀胱平滑肌的再生。Vardar 等[54]將 IGF-1 與塑性壓縮的多層膠原纖維復合，構建功能化的膠原蛋白-纖維蛋白-膠原蛋白支架用于裸鼠膀胱擴大術，觀察到膠原蛋白-纖維蛋白-膠原蛋白支架能夠有效促進平滑肌細胞在膀胱缺損區域浸潤，促進平滑肌的再生。
4 展望
雖然組織工程化膀胱要實現真正的臨床應用還有很長的路要走，但在國內外學者的共同努力下，隨著技術手段不斷進步以及研究的逐步深入，必將獲得在結構和功能上與正常膀胱相似、符合臨床要求的替代物。因此，應加強跨專業合作的聯合攻關研究方式，如聯合高分子材料研究者進行材料的研發和優選，聯合藥物緩釋與活性控釋的研究者進行材料上細胞活性物質添加工藝的研制與改進，研究模擬體內生理環境下細胞培養的代謝及增殖、細胞與支架材料間的最佳結合方式等。與此同時，應結合微陣列分析及轉錄組學測序技術研究宿主反應與支架之間的復雜相互作用，了解再生過程及其相關機制。相信隨著研究的不斷深入，采用組織工程技術對膀胱進行體內外構建具有廣闊的臨床治療前景，膀胱修復重建將會由傳統的組織替代走向組織工程化替代。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
臨床上許多病理原因，如脊髓損傷、創傷、先天性畸形、惡性腫瘤等造成的膀胱功能障礙，均需要膀胱重建才能更好地發揮其儲尿排尿功能。一些晚期膀胱疾病通常也需要通過膀胱擴大術，實現增加膀胱容量、降低膀胱內壓的目的，以此減輕尿液返流對上尿路造成的影響[1]。到目前為止，膀胱置換和擴大術的金標準依然是通過植入腸段（胃、小腸或大腸組織）進行膀胱重建，但此種手術方式往往會導致嚴重的并發癥，如代謝異常、異位黏液產生、尿路感染、結石等，甚至會導致泌尿系腫瘤的發生，因此臨床對組織工程膀胱替代物有著廣泛的需求[1]。
膀胱組織工程是泌尿外科研究的一個重要方向，其主要研究內容包括種子細胞、支架材料和細胞因子[1]。在過去的二十年里，許多不同來源和性質的支架材料［膠原、豬小腸黏膜下層（porcine small intestinal submucosa，SIS）、脫細胞膀胱基質（bladder acellular matrix，BAM）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）和聚（乳酸-乙醇酸）（poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA）等］被應用于膀胱組織工程研究中。為了結合各類材料的優勢，近年來也有較多關于新型復合支架材料的研究及應用。復合支架材料能夠為不同組織結構細胞的長入提供適宜的組織微環境，更好地誘導膀胱組織再生。雖然支架材料能夠起到一定的力學支撐及誘導周圍組織再生的作用，但單純支架材料植入往往會導致植入體攣縮和纖維化。為進一步提高組織再生效率，改善支架材料功能，促進支架材料與周圍組織結構和功能的整合，減輕植入物纖維化，往往會在支架材料上復合細胞。自體細胞雖然無免疫原性，但其擴增困難、易老化，且較難獲取足夠數量的正常自體細胞用于組織工程膀胱構建。干細胞具有自我更新及多向分化潛能，現被廣泛應用于組織工程再生研究中。眾多研究表明干細胞能夠通過旁分泌作用明顯改善組織再生水平，此外，干細胞還表現出一定的免疫調節能力，可以影響再生組織炎癥微環境，促進組織重塑。另外，為保證植入細胞的存活、增殖、遷移及分化，往往會在支架材料上復合各類生長因子[1]。移植細胞/支架復合材料成功的基礎是微觀及超微結構特征的重現，以模擬組織本身的結構，為了進一步調節組織再生的過程，在結構基礎上重建組織功能，往往需要各類生物生長因子的協調配合。生物源性支架材料（SIS 和 BAM 等）負載的生長因子以及特定細胞類型，如膀胱平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）、尿路上皮細胞（urethral epithelial cells，UCs）和間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等細胞中表達的生長因子，提供了啟動和加速組織再生的基本元素[2]。
綜上所述，膀胱組織工程的研究和應用可作為經典的胃腸代膀胱重建術的替代修復手段，有望避免或改善經典術式引發的一系列并發癥，是一個有前景并具有挑戰性的研究領域。本文綜述了近年來膀胱組織工程在種子細胞、支架材料及生長因子研究和應用方面的一些進展，以期為膀胱組織工程的發展及轉化提供借鑒。
1 種子細胞
大量研究表明，在支架材料上復合種子細胞可以促進組織再生，提高工程化組織修復效果[3]。在膀胱組織工程中，植入細胞的支架材料用于修復、重建膀胱組織時可以明顯提高膀胱順應性，改善膀胱功能，且可以有效地避免組織纖維化。
1.1 自體細胞
應用于膀胱組織工程的自體膀胱細胞主要包括 UCs 和 SMCs。從病變器官提取分離自體膀胱細胞，體外擴增到一定數量后接種于支架材料上，經過一段時間的復合培養即可植入宿主體內。應用自體細胞可避免植入后的免疫排斥反應，以及異體移植需長期使用免疫抑制藥物的問題，但自體細胞的應用較為受限。一方面，膀胱重建最主要的適應證是腫瘤和神經源性功能障礙，其中膀胱癌可轉移到尿路多處部位，所以從患者自身收集或提取的用于重建的細胞很可能存在致癌風險[4]；而神經源性膀胱功能障礙患者來源的平滑肌細胞用于膀胱修復時，表現出細胞增殖能力增強、黏附能力減弱、收縮能力降低等病理改變[5]；其他如先天性疾病、感染、輻射等造成膀胱損傷的患者中，從受損組織中獲得的異常細胞也不適于重建新的膀胱組織[6-7]，故較難從患者體內提取足夠數量的正常 UCs 或 SMCs 進行體外擴增。另一方面，已分化成熟的自體細胞在體外培養擴增時，存在去分化、結構和功能喪失、老化等問題。
1.2 間充質干細胞
隨著干細胞分離提取技術的發展，從多種組織提取干細胞成為可能。干細胞具有自我更新和多向分化潛能，并且具有低免疫原性的特點，在膀胱組織工程應用中潛力巨大。在膀胱修復過程中，干細胞通常以三種方式發揮作用：分泌細胞因子、招募常駐細胞、誘導 MSCs 分化為 SMCs 和 UCs[6]。
MSCs 是一種多能干細胞，可從全身各組織，如骨髓、脂肪、外周血、臍帶血、肝臟等組織中分離獲得，在體外和體內均能增殖和分化為多種細胞類型。MSCs 可以分化為平滑肌細胞促進膀胱修復，并通過旁分泌刺激血管、神經生成[8]。
骨髓間充質干細胞是一種來源于骨髓的 MSCs。骨髓來源的基質細胞中 MSCs 含量很少，盡管數量有限，但其具有長時間自我更新及在適當條件下分化為多種不同特化細胞類型的潛能[9]，是最常用的 MSCs。由于膀胱癌不會向骨髓轉移，因此可以保證骨髓來源 MSCs 的安全性。
脂肪間充質干細胞在促進血供重建、神經元修復和中胚層再生方面具有特殊的作用，且在人體中豐度高，獲取分離相對簡單。脂肪間充質干細胞可分化為 SMCs，表達相關標志物分子，并維持支架材料中平滑肌的增殖和分化能力。此外，Sharma 等[10]的研究表明，脂肪間充質干細胞可通過分泌調節細胞遷移、增殖的肽生長因子和細胞因子來影響周圍微環境，促進膀胱平滑肌再生[4, 11]。Leite 等[12]研究發現，脂肪間充質干細胞能夠分泌多種與血管生成相關的細胞因子，包括血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），可誘導內源性細胞遷移和再生通路活化。
尿源性干細胞（urine-derived stem cells，USCs）是從尿液中獲得的多能細胞，可通過無創、簡單、低成本的方法獲得并大量擴增，但數量稀少，一般只占尿液的 0.2%[1]。USCs 可通過誘導高效分化為SMCs和 UCs，還能夠分化為脂肪源性、軟骨源性、內皮細胞、間質細胞、神經源性、成骨和骨骼肌源性細胞譜系[6, 11]。USCs 還有旁分泌促血管生成作用，以及表達與腎組織相關的標記物。USCs 易于培養，且經過幾次傳代后基因仍較穩定，并保持良好的分化能力。由于上尿路膀胱癌的發病率較低，為 0.7%～3.4%，因此 USCs 具有較高的生物安全性[11]。
成體干細胞的研究與應用仍需面對許多挑戰，其主要問題是它們在培養過程中容易老化，形成祖細胞進行修復、重建受損組織的能力逐漸減弱。而且，干細胞在成人組織中的數量極低，分離高純度和高質量的成體干細胞仍然是一個挑戰。如果從病變組織或患有遺傳疾病的患者體內分離成體干細胞，可能需要進行基因修飾才能應用于臨床[11]。
1.3 誘導多能干細胞
誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是一種通過重編程成體細胞獲得的多能干細胞，可表現出胚胎干細胞的形態和生物學特性，有望成為再生醫學領域具有患者特異性的干細胞來源。iPSC 來源十分廣泛，大多數體細胞類型都可以通過激活 c-MYC、KLF4、OCT4 和 SOX2 等基因或通過體細胞核轉移獲得 iPSC，并可分化為三個胚層中的各種細胞，在體外適當的條件下無限增殖[11]。研究顯示，iPSC 可以定向分化為內胚層特定細胞，通過表達轉錄調控因子 IFR1 和 GATA4，或誘導平滑肌細胞分化為膀胱成熟細胞，如 UCs[13]。盡管 iPSC 有巨大的潛力，但對其重編程和多能誘導的機制仍知之甚少，且可能導致癌變或畸胎瘤的發生，使其在臨床應用受限[11]。
2 支架材料
支架材料是組織工程學研究的重點內容之一。用于再生醫學的生物支架材料應具備良好的生物相容性、細胞行為可調控性、生物可降解性以及良好的生物力學性能等特點。目前應用于膀胱組織工程的生物支架材料有兩種來源：天然來源及合成聚合材料[14]。
2.1 天然材料
2.1.1 天然來源的支架材料
天然來源的支架材料有很多種，包括膠原、糖胺聚糖和絲素蛋白（silk fibroin，SF）。Ⅰ型膠原和絲素蛋白在膀胱組織工程中的應用較為廣泛。Ⅰ型膠原具有來源廣、易于制備且生物相容性良好等優勢，被廣泛應用于膀胱組織工程。有研究表明膠原水凝膠可支持正常的 UCs 生長以及維持 SMCs 的收縮表型[15]。膠原水凝膠雖已廣泛應用于組織再生，但其機械強度不足以用于組織壁重建[16]。Mudera 等[17]在研究中發現將Ⅰ型膠原蛋白凝膠進行塑性壓縮，可在較短時間內將膠原蛋白的機械性能控制在接近組織水平，塑性壓縮膠原水凝膠可作為改善再生組織機械性能的方法之一。與膠原蛋白相比，SF 具有優異的拉伸特性和彈性，與合成聚合物支架材料相比，SF 植入體內后的免疫原性和炎癥反應較低[18-19]，SF 支架表現出更優的生物力學性能和生物相容性。SF 移植物用于膀胱重建的可行性已在小鼠模型中得到驗證[20]，將凝膠紡絲 SF 支架與 SIS、PGA 同時植入小鼠膀胱缺損模型中進行評估，結果發現進行凝膠紡絲 SF 移植的動物的存活率高于植入 SIS 和 PGA 的存活率，能夠支持 SMCs 和 UCs 的再生，同時急性炎癥反應較輕，膀胱容量和排尿體積相對增加，膀胱功能得到明顯改善[21]。
2.1.2 脫細胞基質支架
脫細胞基質支架材料是通過從人或動物的組織中去除具有免疫原性的細胞成分，而形成的僅保留細胞外基質成分的生物源性材料。脫細胞基質材料保存原有組織較為完整的三維結構，能夠為細胞的長入提供理想的載體，可用于在離體培養條件下構建疾病模型，以及探索健康和患病組織中細胞-細胞外基質的相互作用機制。脫細胞基質材料能夠維持 UCs 和 SMCs 的增殖，促進 SMCs 從鄰近組織再生以及神經組織和血管的再生[22]。
BAM 是膀胱組織工程研究中最常用的脫細胞基質支架，可以通過物理破壞（即凍融）、化學方法（例如十二烷基硫酸鈉、鈉脫氧膽酸鹽等化學試劑處理）、酶處理法等方式從膀胱組織中去除細胞[23-25]。Guyette 等[24]用灌注法對整個膀胱進行了脫細胞處理，通過形態學觀察及功能學評價發現 BAM 中的蛋白質（膠原蛋白、彈性蛋白等）的結構以及排列方式沒有受到明顯破壞，其機械性能和天然的膀胱組織黏膜下層的機械性能沒有顯著差異[24]，所得的脫細胞支架可單獨使用或接種細胞。
Brown 等[26]發現，BAM 具有支持豬 SMCs 和 UCs 聯合生長的能力，通過體外共培養體系，評估 UCs 對于 SMCs 介導的肌肉收縮的影響，以及 UCs 促進 SMCs 長入 BAM 的作用。研究結果表明，UCs 共培養可增強 SMCs 的浸潤和收縮能力，原因可能是明膠酶活性增加。膀胱 UCs 對體外 SMCs 行為的影響表明，BAM 可能包含一些關鍵的誘導性因子，這些因子可促進重要的膀胱細胞間和細胞外基質間的相互作用。Geng 等[27]與 Yoo 等[23]的實驗研究結果均表明，沒有植入細胞的 BAM 會隨時間的增加而出現收縮，從而導致膀胱容量減少，將膀胱上皮細胞和膀胱 SMCs 均植入到同種異體膀胱黏膜下層后，與植入未接種細胞的膀胱黏膜下層相比，植入細胞后膀胱容量顯著增加。由此 Yoo 等[23]推測，接種細胞的同種異體 BAM 可作為一種用于膀胱擴增的生物材料。
SIS 主要是通過機械法將豬小腸的黏膜層、肌層及漿膜層刮除，保留黏膜下層而制備的脫細胞基質材料。SIS 在跨物種移植中不會引發宿主產生不良反應，具有良好的生物相容性。在 20 世紀 90 年代，SIS 就已被用作修復各種組織的支架材料，包括疝[7]、硬腦膜[28]、動靜脈組織[29-30]、肌腱[29-31]、皮膚[32]等。在膀胱重建中，SIS 作為支架材料，通過細胞外基質來協調宿主膀胱細胞的再生能力[33-35]。SIS 制備時的變量的差異，如豬齡、所取用小腸區域及滅菌方法，可能會使 SIS 在體內外的細胞反應中所具備的物理特性、生化特性、炎性細胞浸潤和再生能力有所差異[36]。Lin 等[35]的綜述中總結了導致 SIS 介導的嚙齒動物和犬科動物的膀胱再生不一致的原因，其中包括：SIS 的滅菌方法、所用豬的年齡以及所用的腸段所在區域。因此，有必要在動物模型和臨床研究中對 SIS 性能進行評估。
2.2 合成聚合材料
到目前為止，已有較多合成聚合物作為膀胱組織工程支架材料的研究。某些合成聚合物，例如 PLA、PGA 和 PLGA 等已獲美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于醫療器械。PGA、PLA 和 PLGA 的降解產物是無毒的天然代謝產物，最終以二氧化碳和水的形式從體內清除。合成材料的優點在于：它們可以大規模快速地制備，由于這些聚合物是熱塑性材料，因此可以被加工以獲得所需的強度、微觀結構和降解速率。加工方法之一是將合成聚合材料電紡成亞微米或納米纖維支架，以模仿細胞外基質的微觀結構，并使材料具有適當的機械性能。Baker 等[37]在研究中發現膀胱組織膠原網絡的自然排列反映了平滑肌細胞束的方向，基于此開發了一種特性良好的電紡聚苯乙烯支架，研究中發現排列整齊的電紡聚苯乙烯支架促進人膀胱平滑肌內肌動蛋白絲的整齊排列，可將其用于膀胱細胞的三維培養實驗。
合成聚合物在組織工程支架材料的應用上有很大潛力，其機械性能和化學性質可控性更強，而且合成聚合物更易獲得和制備，可在與細胞相容的溫和條件下進行加工。但由于合成聚合物缺乏天然材料固有的可以促進所需細胞反應的生物學因子，因此如何選擇和修飾合成聚合物以滿足作為組織工程支架的生物學要求是研究的重點。
Rohman 等[38]研究了聚酯薄膜的物理性質對 UCs 和 SMCs 的黏附和生長的影響，研究發現，細胞黏附和生長的模式與膜的表面形態無關，而生物材料的的機械性能會影響細胞的生長。Ardeshirylajimi 等[39]將轉化生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）負載到殼聚糖納米顆粒上，并與合成聚合物聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）復合，將其用于誘導人脂肪間充質干細胞分化為平滑肌，研究該支架材料在膀胱組織工程中的應用。結果顯示 PVDF-TGFβ 組的平滑肌再生水平明顯高于 PVDF 組，復合生長因子的支架材料能夠促進 MSCs 定向分化為功能細胞，促進膀胱組織功能重塑。
2.3 膀胱支架材料的力學相容性
生物力學是研究生物系統中力、運動、應力和應變的學科，可用于量化和描述各種生物組織的內在力學性質。由于膀胱本身就是一個肌性器官，深入地了解膀胱壁的力學性能對于進一步認識膀胱的功能以及構建功能化組織工程膀胱至關重要。膀胱壁纖維主要由膠原纖維和彈性纖維組成，交錯的膠原纖維和彈性纖維賦予了膀胱壁彈性和延展性。該組織與其他軟組織相似，表現出粘彈性特性，因此可以通過評估遲滯、應力松弛和蠕變來評價膀胱壁的力學特性[40]。量化膀胱壁力學性能的研究有很多，有些研究是在主動充盈-排尿周期下進行體內整體器官評估（尿動力學檢測）[41]，有些則是在體外對切下的組織壁進行單軸和/或多軸加載條帶實驗（被動實驗）[42]。
組織工程和再生醫學的目標是修復、維持和改善受損組織和器官的結構和功能，支架材料是組織工程的關鍵技術之一，組織工程支架除了要模擬膀胱壁的組織結構外還要有一定的力學強度，才能有效維持膀胱功能[43]。許多生物支架的力學特性在植入前后進行了被動力學檢測和主動力學檢測，最終通過動物實驗進一步開發用于臨床的支架材料。Xiao 等[41]在利用三維水凝膠復合支架修復大鼠膀胱全層缺損的實驗研究中，在體外分別評價了膀胱脫細胞基質移植物（bladder acellular matrix graft，BAMG）、BAMG 復合膠原及 BAMG 復合膠原后負載細胞的力學特性，其力學分析結果顯示復合材料負載細胞可以明顯改善支架材料的彈性模量和載荷；通過尿動力學檢測膀胱順應性的結果同樣表明，復合材料負載細胞后大鼠膀胱儲尿量增加，順應性增強。Baker 等[37]體外研究時發現膀胱上皮細胞和平滑肌細胞在模量最低的多孔 PLGA 和 PCL 支架上的生長情況最好，還觀察到與 PLGA 支架相比，PCL 支架上細胞的黏附和增殖顯著增強，因為 PCL 支架的儲能模量約為 PLGA 儲能模量的一半，而這個值又接近天然膀胱組織的正常值。無論是什么類型的支架材料均可通過主動和（或）被動力學檢測評價其力學性能，它們的結合將給我們帶來更有用的力學信息，在未來膀胱組織工程研究中生物力學的評價將變得更為重要和完善。
3 生長因子
生長因子是指能夠在細胞間傳遞信息并對細胞生長、增殖及分化具有調節作用的多肽類物質。生長因子廣泛參與了胚胎發育及組織修復過程，在組織工程、創傷修復、神經系統疾病治療等方面具有重要作用。生長因子在膀胱組織工程構建中應用非常廣泛，主要發揮調節細胞功能、促進血管生成及誘導組織再生的作用[44]。但由于生長因子穩定性差，半衰期短，直接使用會受到較大限制，在應用過程中往往需要將其與生物材料或者納米遞送系統相結合，以達到靶向、持久發揮生物作用的目的。
3.1 血管內皮生長因子
目前影響組織工程種子細胞定植和存活的主要原因是在功能血管叢形成的初始階段，無法為移植細胞提供充分的營養物質和氧氣輸送，由此產生的缺氧微環境會導致移植細胞凋亡及壞死，破壞移植代替物的定植，大大延緩再生修復過程。因此修復組織的早期血管化對于組織再生至關重要[45]。VEGF 屬于血小板衍生生長因子家族，具有促進內皮細胞增殖，誘導血管新生的作用。Zhang 等[46]將 VEGF 與絲素蛋白-脫細胞膀胱基質（SF-BAMG）復合支架結合，用于兔膀胱缺損的修復，結果顯示結合生長因子的支架材料能夠快速實現早期血管化，有利于膀胱功能恢復。由于 VEGF 的半衰期短、清除速度快，Youssif 等[47]與 Jiang 等[48]分別采用水凝膠遞送系統及納米遞送系統實現了 VEGF 的持久、有效釋放，其研究結果表明 VEGF 在促進新生膀胱組織血管生成的同時，能夠加快神經及膀胱平滑肌的再生與修復。
3.2 堿性成纖維細胞生長因子
堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一類肝素結合生長因子，通過與多種內皮細胞表面受體（包括酪氨酸激酶受體、肝素-硫酸蛋白聚糖和整合素）相互作用發揮促血管生成活性。Kanematsu 等[49]將 bFGF 蛋白溶液直接復合到 BAM 上，用于小鼠膀胱缺損修復，研究顯示隨著支架材料的降解，4 周時 bFGF 仍能以劑量依賴性的方式促進血管生成，并且可以顯著抑制移植物的收縮。與其他生長因子相同，bFGF 也存在擴散快、半衰期短、副作用多等缺陷，臨床應用受到限制。Shi 等[50]將一個特定的膠原結合域（collagen-binding domain，CBD）融合到天然 bFGF 的 N 端，在不影響 bFGF 細胞因子活性的情況下，表現出了明顯的膠原結合能力。進一步將 CBD-bFGF/BAM 材料用于犬半膀胱缺損修復重建，研究結果顯示該支架可促進損傷膀胱的再生和功能恢復。CBD 結合生長因子的復合支架操作簡單，并且可以實現對生長因子用量的精細化控制，此外由于其具有靶向性，功能材料可以有效地利用 bFGF，減少副作用，顯示了 CBD-bFGF 復合材料用于膀胱壁重建的優越性。
3.3 胰島素樣生長因子
胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF-1）已被證明與傷口愈合有關，其通過體內血液因子與纖維蛋白凝塊的相互作用參與傷口愈合級聯反應。其在一系列組織（骨骼肌、心肌、神經、軟骨和骨）中的再生機制也得到了深入的探索。IGF-1 作用廣泛，涉及多種細胞過程，如增殖、分化、凋亡等，多項研究表明 IGF-1 與平滑肌細胞增殖和存活呈正相關關系[51-52]。Lorentz 等[53]將 IGF-1 與纖維蛋白凝膠結合，發現與單純的纖維蛋白凝膠相比，一定劑量的 IGF-1 能夠顯著促進膀胱平滑肌的再生。Vardar 等[54]將 IGF-1 與塑性壓縮的多層膠原纖維復合，構建功能化的膠原蛋白-纖維蛋白-膠原蛋白支架用于裸鼠膀胱擴大術，觀察到膠原蛋白-纖維蛋白-膠原蛋白支架能夠有效促進平滑肌細胞在膀胱缺損區域浸潤，促進平滑肌的再生。
4 展望
雖然組織工程化膀胱要實現真正的臨床應用還有很長的路要走，但在國內外學者的共同努力下，隨著技術手段不斷進步以及研究的逐步深入，必將獲得在結構和功能上與正常膀胱相似、符合臨床要求的替代物。因此，應加強跨專業合作的聯合攻關研究方式，如聯合高分子材料研究者進行材料的研發和優選，聯合藥物緩釋與活性控釋的研究者進行材料上細胞活性物質添加工藝的研制與改進，研究模擬體內生理環境下細胞培養的代謝及增殖、細胞與支架材料間的最佳結合方式等。與此同時，應結合微陣列分析及轉錄組學測序技術研究宿主反應與支架之間的復雜相互作用，了解再生過程及其相關機制。相信隨著研究的不斷深入，采用組織工程技術對膀胱進行體內外構建具有廣闊的臨床治療前景，膀胱修復重建將會由傳統的組織替代走向組織工程化替代。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。