基于組織工程學的組織工程技術和干細胞研究在克服組織器官損傷、修復組織器官功能缺失及減少手術并發癥等問題上現已取得很大進展。以往傳統方法是利用生物替代材料修復組織，而組織工程技術注重將種子細胞與生物材料結合，形成與自身組織結構和功能相同的生物組織來修復組織缺損，優勢在于通過組織工程技術可克服供體材料獲取的局限性，并能有效減少并發癥。組織工程技術的研究目的便是找到最終能很好替代原有組織生物學功能的合適的種子細胞、生物材料，構建適合的體內微環境。本文主要描述目前泌尿外科學中各領域組織工程的發展現狀，探討組織工程技術應用于治療復雜泌尿系統疾病的未來趨勢。本文研究結果顯示，盡管目前臨床試驗還相對較少，但現有研究在動物模型上取得的良好結果揭示了組織工程技術今后用于治療各種泌尿系統疾病的光明前景。
引用本文： 楊銘, 傅強. 泌尿外科組織工程的發展現狀及展望. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(2): 193-199. doi: 10.7507/1001-5515.201910058 復制
引言
由退行性疾病、外傷或腫瘤引起的泌尿系統組織損傷和器官缺失一直以來都是泌尿外科需面臨解決的問題，以往多采用自體組織進行替代，如生殖器皮膚、膀胱黏膜、口腔黏膜等，但常引起毛發生長、狹窄、結石形成、憩室形成等多種并發癥，況且由于取材來自于自身組織，往往受到供體材料來源的限制，且易出現供體部位的并發癥。而遇上終末期器官衰竭，則通常采用移植治療，雖然移植技術目前已經較為成熟，但是在控制免疫及抑制并發癥方面，結果并不總是令人滿意。此外，全國乃至世界范圍內器官供體數量遠遠低于移植需求，且人口老齡化逐漸嚴重，組織器官功能減退的人群日益增加；輸尿管、尿道損傷如果長度較大，修補手術有時也難以進行。因此，為解決這些問題，有必要尋找一種替代或再生受損器官和組織的方法。再生醫學和組織工程的發展讓人們能夠進一步了解組織再生的機制，據此找到再生受損組織或器官的方法。現已可以通過提高組織的再生能力，或用生物材料支架結合干細胞修復受損的組織器官，以達到恢復組織器官功能，改善患者生活質量的目的。本文對近年來有關泌尿外科組織工程技術在基礎研究和臨床應用上已取得的成果進行了綜述，以期對未來該領域的研究和創新提供方向和指導。
1 泌尿系統組織工程學概況
組織工程學是根據細胞生物學、材料科學和生物工程學的原理，構建生物替代物以維持或修復損傷組織和器官功能的一門科學。
泌尿系統組織工程的細胞來源主要包括：① 原始細胞：從自身獲取，體外培養，再用于修復損傷組織；② 尿道上皮細胞：通過膀胱活檢和細胞培養獲得，采集手段有創，但目前已可通過尿液或膀胱沖洗分離出尿道上皮細胞；③ 自體表皮細胞、口腔角化細胞、平滑肌細胞（用于恢復膀胱的收縮排尿功能）；④ 干細胞：骨髓干細胞、脂肪干細胞、尿源干細胞。
組織工程的支架材料主要包括：① 合成聚合物，如可生物降解聚合物：聚乙醇酸和聚乳酸-聚乙醇酸，均是由共價鍵結合的大分子組成的生物材料。合成聚合物的主要優點是能夠在三維空間內制造任何形態的器官結構，可定量，重現性好，成本相對較低。因為它是一種人工材料，不存在移植體或自體組織采集損傷相關的問題。此外，此類合成聚合物的許多特性可以控制，如孔隙率和機械性能等；且可通過水解途徑降解，并經由代謝途徑排除殘余碎片；還不包含任何與指導細胞活性和分化相關的分子信號，因此更有利于組織器官修復。② 生物衍生支架，它們屬于基于化學和機械手段的去細胞組織，如小腸粘膜下層（submucosa of small intestine，SIS）、膀胱脫細胞基質（bladder acellular matrix，BAM）。由于生長因子和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）蛋白的殘留，它們具有與天然 ECM 固有的生物活性和機械性相似的優點。然而，這些支架的一個主要缺點是殘留的蛋白質組成和結構可能與待植入人體自身有所差異。大多數天然支架來自于豬，因此有可能成為疾病的傳播源。此外，倫理問題也會影響其臨床使用。③ 自組裝工程組織（self-assembled engineering tissue）。該方法是利用或結合細胞的自組裝特性，構建三維的生物組織結構。在將生物來源的材料去細胞和滅菌后，外源性細胞外基質材料仍可能殘留有相當一部分會影響生物相容性的 DNA。自我組裝方法能夠產生由細胞自身構建的組織，其中致密的細胞外基質完全由自己的成纖維細胞產生。此材料的最大優勢就是消除了外源材料生物相容性的影響，通過減少免疫反應可減少炎癥和纖維化反應，從而提高手術成功率。近年來，這些方法中的部分技術已經用于泌尿系統組織的重建[1]，這些技術需要細胞能夠接收相應的信號以進行適當的分化，才能讓用于移植的工程組織與更換的目標組織盡可能相似，研究并模擬相關信號是將這些技術應用于其他組織器官需要克服的難題。
此外，如今三維打印技術已廣泛應用于各個領域，包括納米電子、醫學及組織工程等領域，它能夠準確地將不同的材料與不同基質結合，成為搭載藥物和進行個性化醫療研究的最佳選擇[2]，因此三維打印技術也逐漸成為組織工程支架構建中重要的組成部分。
2 組織工程技術在腎臟中的應用
組織工程技術中用于構建功能性腎臟結構的主要成分是活細胞、基于生物材料的支架系統、生物活性因子和促進細胞行為的適當微環境，然后在此基礎上，利用身體再生的自然愈合能力來引導新組織的生長。其方法主要是將供體組織分離成單個細胞，這些細胞或直接植入宿主體內，或培養擴增后植入，或附著在支架上擴增后植入[3]。
作為細胞生長的良好載體，膠原水凝膠已被廣泛應用于腎組織工程支架的制備。在三維膠原支架中使用混合新生大鼠腎細胞的體外重建三維腎組織，發現三維水凝膠支架內的種子細胞能自我組裝成為含有腎小管和腎小球樣結構的工程腎組織，并且三維培養的細胞能保留其表型、遷移能力和白蛋白攝取功能。水凝膠透明質酸（hyaluronic acid，HA）可以作為腎臟組織工程的支架材料，但是實際研究應用表明，水凝膠類支架和其他水凝膠聚合物支架由于機械強度低、物理形狀難以保持，導致使用時失敗率較高。為了提高機械強度，也有研究將細胞外基質衍生物與合成生物材料結合，這種復合支架被認為是組織工程中一種堅固的載體[4]。在去細胞支架方面，研究人員對大鼠腎臟進行去細胞處理，再植入上皮細胞和內皮細胞制造出含細胞的支架，然后在生物反應器中對含細胞支架進行灌注，最終植入體內，移植后的生物工程腎可在體內產生尿液和清除代謝產物[5]。
除以上研究以外，生物工程器官在體內能達到長期良好效果的另一個主要原因是血管通暢。在血管基質沒有完全和內皮細胞融合的情況下，支架的血管系統內很可能有明顯的血栓形成，使重新血管化的結構失去功能。為了解決這一問題，Ko 等[6]采用了一種內皮細胞接種方法能使內皮細胞有效覆蓋去細胞豬腎支架的血管壁。Lertkiatmongkol 等[7]的研究表明，CD31 抗體與血管基質的結合使血管內皮細胞能附著在血管上，CD31 又稱為血小板—內皮細胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）。因此在未來的研究中可以嘗試利用內皮細胞接種方法并與抗體結合有效地改善內皮細胞的附著和保留，并進一步考察這種方法是否能使工程腎血管通暢。
Machiguchi 等[8]在條件培養基內利用細胞間的相互作用在體內生成腎單位，用于腎臟修復。他們的研究證明了集合管細胞基質對血管內皮細胞和腎小管上皮細胞的抑制作用，以及血管內皮細胞和腎小管上皮細胞之間的刺激性交互作用。由于集合管細胞基質與腎小管上皮細胞基質相似，可導致間充質干細胞向腎小管上皮細胞分化。因此，可將集合管細胞基質誘導的由間充質干細胞分化的腎小管上皮細胞注入大鼠腎皮質。與未經預處理的細胞相比，在植入前使用少量凝膠復合物對細胞進行三維培養預處理，可觸發更多的腎單位樣結構的生成，說明在腎皮質內注射預處理的腎小管上皮細胞可能有利于修復功能失調的腎組織。Zhang 等[9]通過誘導脂肪干細胞向中胚層分化后種入支架，然后經腎動脈和輸尿管的再細胞化發現，誘導后的中胚層細胞分化為管狀細胞和足細胞的效率要大于脂肪干細胞，這為未來種子細胞的分化誘導提供了新思路。
為了使以上技術在臨床轉化中可行，還需要解決其他關鍵的技術難題，包括：制造具有臨床規模的無細胞腎支架[10]；利用臨床來源的細胞對支架進行有效的再細胞化，以重建完全功能的腎結構；降低培養出工程腎的周期；確保長期植入物中無嚴重血栓形成。此外，全功能性腎臟在腎臟特異性疾病的臨床應用，仍是一項具有挑戰性的工作。為實現這一目標，應均衡地開展這一領域的多學科研究，包括腎臟疾病模型的建立、組織工程腎臟構建應用的臨床前研究、免疫問題的處理方法、植入物的神經支配調節等。腎臟功能復雜，結構多樣，就目前的技術而言還難以實現在體外通過組織工程的方法完全重新構建可用于移植的工程腎，因此在未來的研究中還需要繼續選擇、優化用于制作工程腎的細胞、支架材料及培養環境，以制作出功能與正常腎臟更為接近并可用于移植的工程腎。
3 組織工程技術在輸尿管中的應用
去細胞基質是組織工程輸尿管支架的一種，特別是當與細胞一起種植時可以增加血管的生成。Koch 等[11]提出使用豬的去細胞基質交聯的輸尿管作為人輸尿管壁再生支架，研究結果發現，2 周內接種的平滑肌細胞均勻地填充了支架，使支架能夠作為輸尿管的替代物進行移植。為了提高再生效果，Zhao 等[12]提出采用在血管內皮細胞間植入間充質干細胞的方法來橋接輸尿管長間隙，間充質干細胞的分化能夠獲得具有多層次的輸尿管組織。在用 α-平滑肌肌動蛋白和平滑肌肌球蛋白重鏈染色的平滑肌組織中，尿路上皮細胞角蛋白 20 和尿路蛋白 11 呈陽性表達，這證明了這項技術在組織工程輸尿管修復中的應用前景。
臨床上輸尿管狹窄或損傷的處理方法主要為置入雙 J 管、球囊擴張、修補和皮膚造瘺。組織工程技術的應用，將使輸尿管無法修補或長缺損等不得不造瘺患者的生活質量大幅提升。臨床上替代物治療的標準方法是管狀小腸替代治療或舌粘膜替代治療，但由于并發癥多，難以達到臨床治療預期效果。另一種具有開創性思維的研究就是使用靜脈代替輸尿管[13]。靜脈是人體內液體運輸的管道，具有很好的彈性，功能上和輸尿管非常接近。但這個研究的動物數量較少，且在移植 3 個月后，腎積水的發生率仍在增加，效果并不是非常理想，進一步的研究需要有足夠好的長期結果才有機會將來應用于臨床。
在未來組織工程技術應用中，可以結合上述方法中靜脈替代的理念，利用脫細胞的靜脈作為支架，在支架上種植輸尿管上皮細胞和平滑肌細胞，以達到替代輸尿管的功能。輸尿管位置較深，發生的損傷多為醫源性損傷，且發生長段狹窄的患者年紀往往較大，對常規治療的容忍度較高，因此組織工程技術治療輸尿管狹窄的適用性缺乏有效的臨床研究。
4 組織工程技術在膀胱中的應用
膀胱組織工程的材料主要包括：① 生物材料：由膠原蛋白和海藻酸鹽制成的天然生物材料和豬身上不同類型組織制成的脫細胞組織基質，如膀胱粘膜下層、小腸粘膜下層、真皮、膀胱、膽囊和羊水組織等[14]；② 人工材料：合成支架（聚乙烯海綿、特氟龍等）；合成聚合物（如聚 α-酯）；絲基材料。這些材料具有無毒性、可生物降解性和易于調節其結構的優點。其中，絲基材料的絲膠已被從絲綢生物材料中去除，人體對絲基材料的耐受性已經和生物材料相當，因此絲基材料可以在組織工程技術中作為支架使用。此外，Shakhssalim 等[15]成功地應用靜電紡絲技術制備了用于犬膀胱壁置換的聚己內酯/聚乳酸支架，加入細胞基質用于支持種子逼尿肌平滑肌細胞，可在體內刺激局部原代細胞的生長。
就細胞的選擇而言，理論上自體細胞是誘導組織融合和再生的最佳選擇，可以有效避免產生嚴重的免疫反應，但如果采集尿源干細胞作為自體細胞來源的話，不適用于實施尿流改道術的患者，主要原因是一般實施尿流改道術的患者大多是由于罹患腫瘤性疾病，因而采集的細胞來源有可能含有腫瘤細胞。另有研究表明，體外神經病變膀胱細胞（平滑肌和尿路上皮細胞）具有較低的收縮潛能，增殖和分化能力低下[16]。因此，間充質干細胞似乎成為了膀胱組織工程中良好的細胞來源。然而由于間充質干細胞不是自體膀胱細胞，它們容易被尿毒性改變，可能影響組織再生的成功率，但其優點在于間充質干細胞似乎不受神經系統初始病理學的影響[17]。有研究證明了使用多個細胞共移植可以促進膀胱組織再生[18]。但再生膀胱組織血管化不足依然是膀胱組織工程需面臨的挑戰。Zhao 等[19]分離出具有高增殖潛能和血管生成特性的脂肪來源內皮祖細胞，用低氧預處理以提高干細胞活性，然后將豬膀胱脫細胞基質與低氧預處理的自體脂肪源內皮祖細胞同時注入大鼠膀胱重建模型，并評價其可行性和膀胱血管形成的可能性，證明了缺氧預處理可促進血管生成和組織工程膀胱功能恢復。
臨床上回腸代膀胱并發癥較復雜，以往用于膀胱重建的材料有明膠海綿、日本紙、福爾馬林保存的狗膀胱、凍干人硬腦膜、牛心包和小腸粘膜下層等[20]。這些生物材料為組織生長提供了一種臨時支架，隨著時間的推移，它們會重塑并降解。膀胱重建患者的一個常見并發癥是膀胱容量的逐漸下降，因此這些生物材料盡管能使一些患者獲益，但由于其遠期效果不佳和并發癥的存在，導致在后來的研究中都很少再被使用。為構建組織工程膀胱，Bouhout 等[21]模擬了一種自體膀胱等效物（vesical equivalent，VE），首先利用成纖維細胞和尿路上皮細胞進行三維培養以獲得重建的 VE；然后將其培養在生物反應器中，該反應器可提供高達 15 cm H2O 的循環壓力，隨后迅速降低，以實現動態培養 VE（dynamically cultured VE，DCVE）。該研究發現動態培養產生的尿路上皮輪廓與自然膀胱相似，通透性分析顯示其輪廓與自然膀胱相似，且與膀胱基底細胞組織一致，同時在縫合和處理時有適當的牽張能力。這種新的替代方法為再生醫學提供了一個新的方向，它有膀胱相似特性并可作為尿素屏障。這些特性可以顯著減少炎癥、壞死和可能的排斥反應。研究表明，與無細胞支架相比，將細胞植入支架（如：膀胱脫細胞基質；聚乙酸/聚乳酸-乙醇酸）后，細胞生長的效果更好[22-23]。臨床試驗中發現，無細胞支架只能讓尿路上皮再生，而不能使平滑肌再生而達到恢復膀胱收縮功能的效果。Bouhout 等[24]的另一項研究發現，組織工程三維球形膀胱模型使用膠原蛋白衍生的支架可以模仿膀胱的自然形狀。膀胱間充質細胞被嵌入支架內，上皮細胞被植入其表面。因此，植入模型的膀胱間充質細胞和尿路上皮細胞受到的張力與天然組織中的張力相似。該三維球形膀胱模型中出現了尿道上皮高度成熟的特征，膠原蛋白重塑，表達肌球蛋白的平滑肌細胞呈現出平行于腔表面重新排列的趨勢，具有與天然組織相當的特性，該技術可用于未來病理性膀胱的部分替換治療。
理想的組織工程再生生物材料應能使成熟的上皮細胞層均勻、持續地附著在膀胱腔表面，并在膀胱腔表面形成多個平滑肌細胞層，它還應提供足夠的機械支持，防止在體內新組織形成之前過早塌陷。但是，植入后的細胞突然暴露在一個充滿了炎癥介質和活化免疫反應的環境中，會明顯影響其增殖和作用的發揮。因此，構建的體內微環境應該對植入細胞群體的自我更新、生存和分化起到支持作用，并保護其不受有害因素的干擾[25]。研究發現，生物材料基質的繭狀結構能夠減少植入細胞成分受損害，而單純的免疫調節劑與生物材料支架的耦合可能會將其轉變為新的“免疫調節劑”生物材料，從而引起宿主主動的免疫排斥反應[26]。在未來，如果更充分地了解旁分泌信號通路和免疫機制，就能在臨床實踐中更合理地引導宿主免疫細胞的行為并進行適當的調控，使其能夠對移植物的攝取和融入周圍組織提供幫助。
5 組織工程技術在尿道修復中的應用
尿道組織結構復雜，容易受到各種損傷，愈合過程中常導致疤痕的形成。自體尿源干細胞和脂肪干細胞因其獲取的無創性，在組織工程的應用中有很大的優勢，它們可以在體外擴增，并用于組織工程和三維生物打印。但如果在體內結構化不充分，可能導致尿漏或血管形成不足，再加上如果引發自身免疫反應，容易形成尿道狹窄。通過在體外動態模擬尿道的收縮和擴張的特點，有助于生物反應器在體外組織分化過程中起到關鍵的輔助作用。長段尿道的重建需要足夠長的管狀移植物中平滑肌細胞鋪滿尿路上皮內層和外層，而由于端粒酶的活性，如果選材間充質干細胞，其增殖能力強，能很好地附著在不同支架表面，凸顯出一定優勢；當這些間充質干細胞分化為平滑肌細胞或尿路上皮細胞系時，可以檢測到典型的標記物。尿源干細胞與骨髓源干細胞兩種細胞均能成功分化為平滑肌細胞系，然而在尿源干細胞中產生尿路上皮細胞的效率更高，其原因可能與其尿路上皮來源有關[27-28]。生物反應器在體外培養過程中動態條件十分關鍵，由于其模擬了空間結構和環境，對細胞的增殖、在支架中的生長以及工程組織的成熟有積極的影響[29-30]。而三維生物打印技術的應用使在體外制備具有不同聚合物類型和結構特征的載細胞尿道成為可能。
Zhang 等[31]使用聚己內酯/聚己內酯共丙交酯［poly（ε-caprolactone）/poly（ε-caprolactone-co-lactide），PCL-PLCL］聚合物作為支架材料模擬兔尿道的結構和力學性能，并用載細胞纖維蛋白水凝膠為細胞生長提供微環境。研究結果表明，PCL-PLCL（50:50）螺旋支架的力學性能與兔尿道相當。對生物打印尿道中細胞生物活性的評估顯示，尿路上皮細胞和平滑肌細胞在打印后 7 天仍保持 80% 以上的活性。這兩種細胞類型在載細胞水凝膠中都能活躍增殖并保持著特定的生物標志物。這些結果為進一步研究尿道組織的三維仿生提供了基礎，該模型也模擬了尿道組織在力學性能和細胞生物活性方面的特性，以及在生物模型中使用生物膜構建體在尿道植入體內研究的可能性。
Simoes 等[32]利用生物支架及衍生的可溶性產物，發明了一種用豬尿道去細胞化生產脫細胞尿道支架的方法。首先用蘇木精—伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、4',6-二脒基-2-苯基吲哚［2-（4-Amidinophenyl）-6-indolecarbamidine dihydrochloride，DAPI］染色和 DNA 定量法評價細胞去除率；再通過免疫熒光染色和比色分析試劑盒檢測細胞外基質蛋白；用人骨骼肌成肌細胞、肌前體細胞和脂肪來源的基質血管組分評價脫細胞尿道生物膜的再血管化；用機械化學去細胞方法去除了約 93% 的組織 DNA，基本保留細胞外基質的成分和微結構，最終實現了再細胞化。經免疫熒光和實時熒光定量聚合酶鏈式反應證實，骨骼肌細胞外基質促進了纖維的形成和主要骨骼肌相關蛋白及基因的表達。這種方法能制造出存留重要細胞外基質蛋白的尿道生物復合物，并且易于細胞再增殖，這是制備基于尿道生物復合物的組織工程技術的關鍵第一步。
臨床上，尿道狹窄在男性中更為常見，因此研究主要集中在男性尿道重建上。但由于并發癥難以控制，目前常用的手術方法如自體生殖器皮膚、膀胱黏膜、口腔黏膜進行替代等的效果并不理想，常引起毛發生長、狹窄、結石形成、憩室產生等多種并發癥。目前還沒有標準化的支架可用于臨床。但是在 Raya-Rivera 等[33]的臨床研究中，對需要尿道重建的患者進行評估，考慮使用患者自身細胞的組織工程尿道的有效性。該研究小組選擇了 5 例有尿道缺損的男性為研究對象，對其進行組織活檢取樣，將肌細胞和上皮細胞擴增后接種于聚乙醇酸-聚丙交酯復合物支架上，患者隨后用組織工程化的管狀尿道進行尿道重建，并在術后 3、6、12、24、36、48、60、72 個月進行尿液分析、膀胱尿道鏡檢查、膀胱尿道造影和血流率測量。3、12、36 個月時，在工程尿道的不同區域進行了一系列內鏡下環狀取樣活檢；中位隨訪時間為 71 個月（36～76 個月）。抗細胞角蛋白抗體、肌動蛋白、結蛋白和肌球蛋白抗體證實了培養物上存在上皮細胞和肌肉細胞系。中位最大尿流率為 27.1 mL/s（正常范圍 16～28 mL/s），連續攝片和內鏡檢查顯示尿道寬度正常，無狹窄。尿道檢查顯示，移植后 3 個月的尿道結構正常。結果表明，管狀尿道可以在臨床環境中使用并保持功能長達 6 年，證明了工程尿道可能在未來用于需要復雜尿道重建的患者。但對于成人長段尿道的狹窄，例如與苔蘚樣硬化有關的狹窄，還是要依賴自體組織替代，目前還沒有其他有效且經過臨床試驗證明的組織工程方案可用于臨床治療尿道狹窄疾病[34]，因此該領域也將是未來尿道組織工程研究的重點突破方向。
6 展望
組織工程技術是目前醫療領域中擁有廣闊前景的新興技術，它的潛力主要表現在對組織器官發揮功能所需要的細胞、三維結構和環境的高度模仿，能達到置換后最大限度恢復其原有功能，甚至在未來可以超越其原有功能的效果。生物體，特別是發育中的胚胎，是典型的自組裝系統，組織發生和器官發生也是通過自組裝完成的。在自組裝過程中，通過細胞-細胞、細胞-細胞外基質的相互作用，發育中的有機體及其部分逐漸分化構建成最終形狀。將這種特點應用于組織工程技術中是發展組織工程的重要思路。設計和制造功能性結構和器官的成功取決于對細胞自組裝原理的研究和人們將其運用到臨床的能力。目前已經有了一些成功的案例[35]，但還沒有權威的解決方案以滿足對新型再生技術日益增長的需求。因此，未來重建受損組織和器官功能的生物制備方法（包括但不限于組織工程領域），除了集中在利用身體的再生能力外，合適的材料研究也至關重要，因此需要生物醫學與工程學更加深入融合。如今組織工程技術研究面臨的難題主要有：支架的生物相容性及力學性能、種子細胞在支架材料上的增殖達不到臨床需求以及免疫炎癥反應導致瘢痕形成影響移植效果等。三維打印技術作為一項新興技術，由于其打印出的結構可控性高，并可選擇生物相容性好的材料進行打印，在組織工程中的應用具有非常大的潛力。隨著新型材料的出現、三維打印技術的發展完善和組織工程技術及理念的不斷改進創新，以及對細胞相互作用機制的不斷深入了解，未來應用于臨床的組織工程技術將成為人類醫療史上的一座里程碑。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
由退行性疾病、外傷或腫瘤引起的泌尿系統組織損傷和器官缺失一直以來都是泌尿外科需面臨解決的問題，以往多采用自體組織進行替代，如生殖器皮膚、膀胱黏膜、口腔黏膜等，但常引起毛發生長、狹窄、結石形成、憩室形成等多種并發癥，況且由于取材來自于自身組織，往往受到供體材料來源的限制，且易出現供體部位的并發癥。而遇上終末期器官衰竭，則通常采用移植治療，雖然移植技術目前已經較為成熟，但是在控制免疫及抑制并發癥方面，結果并不總是令人滿意。此外，全國乃至世界范圍內器官供體數量遠遠低于移植需求，且人口老齡化逐漸嚴重，組織器官功能減退的人群日益增加；輸尿管、尿道損傷如果長度較大，修補手術有時也難以進行。因此，為解決這些問題，有必要尋找一種替代或再生受損器官和組織的方法。再生醫學和組織工程的發展讓人們能夠進一步了解組織再生的機制，據此找到再生受損組織或器官的方法。現已可以通過提高組織的再生能力，或用生物材料支架結合干細胞修復受損的組織器官，以達到恢復組織器官功能，改善患者生活質量的目的。本文對近年來有關泌尿外科組織工程技術在基礎研究和臨床應用上已取得的成果進行了綜述，以期對未來該領域的研究和創新提供方向和指導。
1 泌尿系統組織工程學概況
組織工程學是根據細胞生物學、材料科學和生物工程學的原理，構建生物替代物以維持或修復損傷組織和器官功能的一門科學。
泌尿系統組織工程的細胞來源主要包括：① 原始細胞：從自身獲取，體外培養，再用于修復損傷組織；② 尿道上皮細胞：通過膀胱活檢和細胞培養獲得，采集手段有創，但目前已可通過尿液或膀胱沖洗分離出尿道上皮細胞；③ 自體表皮細胞、口腔角化細胞、平滑肌細胞（用于恢復膀胱的收縮排尿功能）；④ 干細胞：骨髓干細胞、脂肪干細胞、尿源干細胞。
組織工程的支架材料主要包括：① 合成聚合物，如可生物降解聚合物：聚乙醇酸和聚乳酸-聚乙醇酸，均是由共價鍵結合的大分子組成的生物材料。合成聚合物的主要優點是能夠在三維空間內制造任何形態的器官結構，可定量，重現性好，成本相對較低。因為它是一種人工材料，不存在移植體或自體組織采集損傷相關的問題。此外，此類合成聚合物的許多特性可以控制，如孔隙率和機械性能等；且可通過水解途徑降解，并經由代謝途徑排除殘余碎片；還不包含任何與指導細胞活性和分化相關的分子信號，因此更有利于組織器官修復。② 生物衍生支架，它們屬于基于化學和機械手段的去細胞組織，如小腸粘膜下層（submucosa of small intestine，SIS）、膀胱脫細胞基質（bladder acellular matrix，BAM）。由于生長因子和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）蛋白的殘留，它們具有與天然 ECM 固有的生物活性和機械性相似的優點。然而，這些支架的一個主要缺點是殘留的蛋白質組成和結構可能與待植入人體自身有所差異。大多數天然支架來自于豬，因此有可能成為疾病的傳播源。此外，倫理問題也會影響其臨床使用。③ 自組裝工程組織（self-assembled engineering tissue）。該方法是利用或結合細胞的自組裝特性，構建三維的生物組織結構。在將生物來源的材料去細胞和滅菌后，外源性細胞外基質材料仍可能殘留有相當一部分會影響生物相容性的 DNA。自我組裝方法能夠產生由細胞自身構建的組織，其中致密的細胞外基質完全由自己的成纖維細胞產生。此材料的最大優勢就是消除了外源材料生物相容性的影響，通過減少免疫反應可減少炎癥和纖維化反應，從而提高手術成功率。近年來，這些方法中的部分技術已經用于泌尿系統組織的重建[1]，這些技術需要細胞能夠接收相應的信號以進行適當的分化，才能讓用于移植的工程組織與更換的目標組織盡可能相似，研究并模擬相關信號是將這些技術應用于其他組織器官需要克服的難題。
此外，如今三維打印技術已廣泛應用于各個領域，包括納米電子、醫學及組織工程等領域，它能夠準確地將不同的材料與不同基質結合，成為搭載藥物和進行個性化醫療研究的最佳選擇[2]，因此三維打印技術也逐漸成為組織工程支架構建中重要的組成部分。
2 組織工程技術在腎臟中的應用
組織工程技術中用于構建功能性腎臟結構的主要成分是活細胞、基于生物材料的支架系統、生物活性因子和促進細胞行為的適當微環境，然后在此基礎上，利用身體再生的自然愈合能力來引導新組織的生長。其方法主要是將供體組織分離成單個細胞，這些細胞或直接植入宿主體內，或培養擴增后植入，或附著在支架上擴增后植入[3]。
作為細胞生長的良好載體，膠原水凝膠已被廣泛應用于腎組織工程支架的制備。在三維膠原支架中使用混合新生大鼠腎細胞的體外重建三維腎組織，發現三維水凝膠支架內的種子細胞能自我組裝成為含有腎小管和腎小球樣結構的工程腎組織，并且三維培養的細胞能保留其表型、遷移能力和白蛋白攝取功能。水凝膠透明質酸（hyaluronic acid，HA）可以作為腎臟組織工程的支架材料，但是實際研究應用表明，水凝膠類支架和其他水凝膠聚合物支架由于機械強度低、物理形狀難以保持，導致使用時失敗率較高。為了提高機械強度，也有研究將細胞外基質衍生物與合成生物材料結合，這種復合支架被認為是組織工程中一種堅固的載體[4]。在去細胞支架方面，研究人員對大鼠腎臟進行去細胞處理，再植入上皮細胞和內皮細胞制造出含細胞的支架，然后在生物反應器中對含細胞支架進行灌注，最終植入體內，移植后的生物工程腎可在體內產生尿液和清除代謝產物[5]。
除以上研究以外，生物工程器官在體內能達到長期良好效果的另一個主要原因是血管通暢。在血管基質沒有完全和內皮細胞融合的情況下，支架的血管系統內很可能有明顯的血栓形成，使重新血管化的結構失去功能。為了解決這一問題，Ko 等[6]采用了一種內皮細胞接種方法能使內皮細胞有效覆蓋去細胞豬腎支架的血管壁。Lertkiatmongkol 等[7]的研究表明，CD31 抗體與血管基質的結合使血管內皮細胞能附著在血管上，CD31 又稱為血小板—內皮細胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）。因此在未來的研究中可以嘗試利用內皮細胞接種方法并與抗體結合有效地改善內皮細胞的附著和保留，并進一步考察這種方法是否能使工程腎血管通暢。
Machiguchi 等[8]在條件培養基內利用細胞間的相互作用在體內生成腎單位，用于腎臟修復。他們的研究證明了集合管細胞基質對血管內皮細胞和腎小管上皮細胞的抑制作用，以及血管內皮細胞和腎小管上皮細胞之間的刺激性交互作用。由于集合管細胞基質與腎小管上皮細胞基質相似，可導致間充質干細胞向腎小管上皮細胞分化。因此，可將集合管細胞基質誘導的由間充質干細胞分化的腎小管上皮細胞注入大鼠腎皮質。與未經預處理的細胞相比，在植入前使用少量凝膠復合物對細胞進行三維培養預處理，可觸發更多的腎單位樣結構的生成，說明在腎皮質內注射預處理的腎小管上皮細胞可能有利于修復功能失調的腎組織。Zhang 等[9]通過誘導脂肪干細胞向中胚層分化后種入支架，然后經腎動脈和輸尿管的再細胞化發現，誘導后的中胚層細胞分化為管狀細胞和足細胞的效率要大于脂肪干細胞，這為未來種子細胞的分化誘導提供了新思路。
為了使以上技術在臨床轉化中可行，還需要解決其他關鍵的技術難題，包括：制造具有臨床規模的無細胞腎支架[10]；利用臨床來源的細胞對支架進行有效的再細胞化，以重建完全功能的腎結構；降低培養出工程腎的周期；確保長期植入物中無嚴重血栓形成。此外，全功能性腎臟在腎臟特異性疾病的臨床應用，仍是一項具有挑戰性的工作。為實現這一目標，應均衡地開展這一領域的多學科研究，包括腎臟疾病模型的建立、組織工程腎臟構建應用的臨床前研究、免疫問題的處理方法、植入物的神經支配調節等。腎臟功能復雜，結構多樣，就目前的技術而言還難以實現在體外通過組織工程的方法完全重新構建可用于移植的工程腎，因此在未來的研究中還需要繼續選擇、優化用于制作工程腎的細胞、支架材料及培養環境，以制作出功能與正常腎臟更為接近并可用于移植的工程腎。
3 組織工程技術在輸尿管中的應用
去細胞基質是組織工程輸尿管支架的一種，特別是當與細胞一起種植時可以增加血管的生成。Koch 等[11]提出使用豬的去細胞基質交聯的輸尿管作為人輸尿管壁再生支架，研究結果發現，2 周內接種的平滑肌細胞均勻地填充了支架，使支架能夠作為輸尿管的替代物進行移植。為了提高再生效果，Zhao 等[12]提出采用在血管內皮細胞間植入間充質干細胞的方法來橋接輸尿管長間隙，間充質干細胞的分化能夠獲得具有多層次的輸尿管組織。在用 α-平滑肌肌動蛋白和平滑肌肌球蛋白重鏈染色的平滑肌組織中，尿路上皮細胞角蛋白 20 和尿路蛋白 11 呈陽性表達，這證明了這項技術在組織工程輸尿管修復中的應用前景。
臨床上輸尿管狹窄或損傷的處理方法主要為置入雙 J 管、球囊擴張、修補和皮膚造瘺。組織工程技術的應用，將使輸尿管無法修補或長缺損等不得不造瘺患者的生活質量大幅提升。臨床上替代物治療的標準方法是管狀小腸替代治療或舌粘膜替代治療，但由于并發癥多，難以達到臨床治療預期效果。另一種具有開創性思維的研究就是使用靜脈代替輸尿管[13]。靜脈是人體內液體運輸的管道，具有很好的彈性，功能上和輸尿管非常接近。但這個研究的動物數量較少，且在移植 3 個月后，腎積水的發生率仍在增加，效果并不是非常理想，進一步的研究需要有足夠好的長期結果才有機會將來應用于臨床。
在未來組織工程技術應用中，可以結合上述方法中靜脈替代的理念，利用脫細胞的靜脈作為支架，在支架上種植輸尿管上皮細胞和平滑肌細胞，以達到替代輸尿管的功能。輸尿管位置較深，發生的損傷多為醫源性損傷，且發生長段狹窄的患者年紀往往較大，對常規治療的容忍度較高，因此組織工程技術治療輸尿管狹窄的適用性缺乏有效的臨床研究。
4 組織工程技術在膀胱中的應用
膀胱組織工程的材料主要包括：① 生物材料：由膠原蛋白和海藻酸鹽制成的天然生物材料和豬身上不同類型組織制成的脫細胞組織基質，如膀胱粘膜下層、小腸粘膜下層、真皮、膀胱、膽囊和羊水組織等[14]；② 人工材料：合成支架（聚乙烯海綿、特氟龍等）；合成聚合物（如聚 α-酯）；絲基材料。這些材料具有無毒性、可生物降解性和易于調節其結構的優點。其中，絲基材料的絲膠已被從絲綢生物材料中去除，人體對絲基材料的耐受性已經和生物材料相當，因此絲基材料可以在組織工程技術中作為支架使用。此外，Shakhssalim 等[15]成功地應用靜電紡絲技術制備了用于犬膀胱壁置換的聚己內酯/聚乳酸支架，加入細胞基質用于支持種子逼尿肌平滑肌細胞，可在體內刺激局部原代細胞的生長。
就細胞的選擇而言，理論上自體細胞是誘導組織融合和再生的最佳選擇，可以有效避免產生嚴重的免疫反應，但如果采集尿源干細胞作為自體細胞來源的話，不適用于實施尿流改道術的患者，主要原因是一般實施尿流改道術的患者大多是由于罹患腫瘤性疾病，因而采集的細胞來源有可能含有腫瘤細胞。另有研究表明，體外神經病變膀胱細胞（平滑肌和尿路上皮細胞）具有較低的收縮潛能，增殖和分化能力低下[16]。因此，間充質干細胞似乎成為了膀胱組織工程中良好的細胞來源。然而由于間充質干細胞不是自體膀胱細胞，它們容易被尿毒性改變，可能影響組織再生的成功率，但其優點在于間充質干細胞似乎不受神經系統初始病理學的影響[17]。有研究證明了使用多個細胞共移植可以促進膀胱組織再生[18]。但再生膀胱組織血管化不足依然是膀胱組織工程需面臨的挑戰。Zhao 等[19]分離出具有高增殖潛能和血管生成特性的脂肪來源內皮祖細胞，用低氧預處理以提高干細胞活性，然后將豬膀胱脫細胞基質與低氧預處理的自體脂肪源內皮祖細胞同時注入大鼠膀胱重建模型，并評價其可行性和膀胱血管形成的可能性，證明了缺氧預處理可促進血管生成和組織工程膀胱功能恢復。
臨床上回腸代膀胱并發癥較復雜，以往用于膀胱重建的材料有明膠海綿、日本紙、福爾馬林保存的狗膀胱、凍干人硬腦膜、牛心包和小腸粘膜下層等[20]。這些生物材料為組織生長提供了一種臨時支架，隨著時間的推移，它們會重塑并降解。膀胱重建患者的一個常見并發癥是膀胱容量的逐漸下降，因此這些生物材料盡管能使一些患者獲益，但由于其遠期效果不佳和并發癥的存在，導致在后來的研究中都很少再被使用。為構建組織工程膀胱，Bouhout 等[21]模擬了一種自體膀胱等效物（vesical equivalent，VE），首先利用成纖維細胞和尿路上皮細胞進行三維培養以獲得重建的 VE；然后將其培養在生物反應器中，該反應器可提供高達 15 cm H2O 的循環壓力，隨后迅速降低，以實現動態培養 VE（dynamically cultured VE，DCVE）。該研究發現動態培養產生的尿路上皮輪廓與自然膀胱相似，通透性分析顯示其輪廓與自然膀胱相似，且與膀胱基底細胞組織一致，同時在縫合和處理時有適當的牽張能力。這種新的替代方法為再生醫學提供了一個新的方向，它有膀胱相似特性并可作為尿素屏障。這些特性可以顯著減少炎癥、壞死和可能的排斥反應。研究表明，與無細胞支架相比，將細胞植入支架（如：膀胱脫細胞基質；聚乙酸/聚乳酸-乙醇酸）后，細胞生長的效果更好[22-23]。臨床試驗中發現，無細胞支架只能讓尿路上皮再生，而不能使平滑肌再生而達到恢復膀胱收縮功能的效果。Bouhout 等[24]的另一項研究發現，組織工程三維球形膀胱模型使用膠原蛋白衍生的支架可以模仿膀胱的自然形狀。膀胱間充質細胞被嵌入支架內，上皮細胞被植入其表面。因此，植入模型的膀胱間充質細胞和尿路上皮細胞受到的張力與天然組織中的張力相似。該三維球形膀胱模型中出現了尿道上皮高度成熟的特征，膠原蛋白重塑，表達肌球蛋白的平滑肌細胞呈現出平行于腔表面重新排列的趨勢，具有與天然組織相當的特性，該技術可用于未來病理性膀胱的部分替換治療。
理想的組織工程再生生物材料應能使成熟的上皮細胞層均勻、持續地附著在膀胱腔表面，并在膀胱腔表面形成多個平滑肌細胞層，它還應提供足夠的機械支持，防止在體內新組織形成之前過早塌陷。但是，植入后的細胞突然暴露在一個充滿了炎癥介質和活化免疫反應的環境中，會明顯影響其增殖和作用的發揮。因此，構建的體內微環境應該對植入細胞群體的自我更新、生存和分化起到支持作用，并保護其不受有害因素的干擾[25]。研究發現，生物材料基質的繭狀結構能夠減少植入細胞成分受損害，而單純的免疫調節劑與生物材料支架的耦合可能會將其轉變為新的“免疫調節劑”生物材料，從而引起宿主主動的免疫排斥反應[26]。在未來，如果更充分地了解旁分泌信號通路和免疫機制，就能在臨床實踐中更合理地引導宿主免疫細胞的行為并進行適當的調控，使其能夠對移植物的攝取和融入周圍組織提供幫助。
5 組織工程技術在尿道修復中的應用
尿道組織結構復雜，容易受到各種損傷，愈合過程中常導致疤痕的形成。自體尿源干細胞和脂肪干細胞因其獲取的無創性，在組織工程的應用中有很大的優勢，它們可以在體外擴增，并用于組織工程和三維生物打印。但如果在體內結構化不充分，可能導致尿漏或血管形成不足，再加上如果引發自身免疫反應，容易形成尿道狹窄。通過在體外動態模擬尿道的收縮和擴張的特點，有助于生物反應器在體外組織分化過程中起到關鍵的輔助作用。長段尿道的重建需要足夠長的管狀移植物中平滑肌細胞鋪滿尿路上皮內層和外層，而由于端粒酶的活性，如果選材間充質干細胞，其增殖能力強，能很好地附著在不同支架表面，凸顯出一定優勢；當這些間充質干細胞分化為平滑肌細胞或尿路上皮細胞系時，可以檢測到典型的標記物。尿源干細胞與骨髓源干細胞兩種細胞均能成功分化為平滑肌細胞系，然而在尿源干細胞中產生尿路上皮細胞的效率更高，其原因可能與其尿路上皮來源有關[27-28]。生物反應器在體外培養過程中動態條件十分關鍵，由于其模擬了空間結構和環境，對細胞的增殖、在支架中的生長以及工程組織的成熟有積極的影響[29-30]。而三維生物打印技術的應用使在體外制備具有不同聚合物類型和結構特征的載細胞尿道成為可能。
Zhang 等[31]使用聚己內酯/聚己內酯共丙交酯［poly（ε-caprolactone）/poly（ε-caprolactone-co-lactide），PCL-PLCL］聚合物作為支架材料模擬兔尿道的結構和力學性能，并用載細胞纖維蛋白水凝膠為細胞生長提供微環境。研究結果表明，PCL-PLCL（50:50）螺旋支架的力學性能與兔尿道相當。對生物打印尿道中細胞生物活性的評估顯示，尿路上皮細胞和平滑肌細胞在打印后 7 天仍保持 80% 以上的活性。這兩種細胞類型在載細胞水凝膠中都能活躍增殖并保持著特定的生物標志物。這些結果為進一步研究尿道組織的三維仿生提供了基礎，該模型也模擬了尿道組織在力學性能和細胞生物活性方面的特性，以及在生物模型中使用生物膜構建體在尿道植入體內研究的可能性。
Simoes 等[32]利用生物支架及衍生的可溶性產物，發明了一種用豬尿道去細胞化生產脫細胞尿道支架的方法。首先用蘇木精—伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、4',6-二脒基-2-苯基吲哚［2-（4-Amidinophenyl）-6-indolecarbamidine dihydrochloride，DAPI］染色和 DNA 定量法評價細胞去除率；再通過免疫熒光染色和比色分析試劑盒檢測細胞外基質蛋白；用人骨骼肌成肌細胞、肌前體細胞和脂肪來源的基質血管組分評價脫細胞尿道生物膜的再血管化；用機械化學去細胞方法去除了約 93% 的組織 DNA，基本保留細胞外基質的成分和微結構，最終實現了再細胞化。經免疫熒光和實時熒光定量聚合酶鏈式反應證實，骨骼肌細胞外基質促進了纖維的形成和主要骨骼肌相關蛋白及基因的表達。這種方法能制造出存留重要細胞外基質蛋白的尿道生物復合物，并且易于細胞再增殖，這是制備基于尿道生物復合物的組織工程技術的關鍵第一步。
臨床上，尿道狹窄在男性中更為常見，因此研究主要集中在男性尿道重建上。但由于并發癥難以控制，目前常用的手術方法如自體生殖器皮膚、膀胱黏膜、口腔黏膜進行替代等的效果并不理想，常引起毛發生長、狹窄、結石形成、憩室產生等多種并發癥。目前還沒有標準化的支架可用于臨床。但是在 Raya-Rivera 等[33]的臨床研究中，對需要尿道重建的患者進行評估，考慮使用患者自身細胞的組織工程尿道的有效性。該研究小組選擇了 5 例有尿道缺損的男性為研究對象，對其進行組織活檢取樣，將肌細胞和上皮細胞擴增后接種于聚乙醇酸-聚丙交酯復合物支架上，患者隨后用組織工程化的管狀尿道進行尿道重建，并在術后 3、6、12、24、36、48、60、72 個月進行尿液分析、膀胱尿道鏡檢查、膀胱尿道造影和血流率測量。3、12、36 個月時，在工程尿道的不同區域進行了一系列內鏡下環狀取樣活檢；中位隨訪時間為 71 個月（36～76 個月）。抗細胞角蛋白抗體、肌動蛋白、結蛋白和肌球蛋白抗體證實了培養物上存在上皮細胞和肌肉細胞系。中位最大尿流率為 27.1 mL/s（正常范圍 16～28 mL/s），連續攝片和內鏡檢查顯示尿道寬度正常，無狹窄。尿道檢查顯示，移植后 3 個月的尿道結構正常。結果表明，管狀尿道可以在臨床環境中使用并保持功能長達 6 年，證明了工程尿道可能在未來用于需要復雜尿道重建的患者。但對于成人長段尿道的狹窄，例如與苔蘚樣硬化有關的狹窄，還是要依賴自體組織替代，目前還沒有其他有效且經過臨床試驗證明的組織工程方案可用于臨床治療尿道狹窄疾病[34]，因此該領域也將是未來尿道組織工程研究的重點突破方向。
6 展望
組織工程技術是目前醫療領域中擁有廣闊前景的新興技術，它的潛力主要表現在對組織器官發揮功能所需要的細胞、三維結構和環境的高度模仿，能達到置換后最大限度恢復其原有功能，甚至在未來可以超越其原有功能的效果。生物體，特別是發育中的胚胎，是典型的自組裝系統，組織發生和器官發生也是通過自組裝完成的。在自組裝過程中，通過細胞-細胞、細胞-細胞外基質的相互作用，發育中的有機體及其部分逐漸分化構建成最終形狀。將這種特點應用于組織工程技術中是發展組織工程的重要思路。設計和制造功能性結構和器官的成功取決于對細胞自組裝原理的研究和人們將其運用到臨床的能力。目前已經有了一些成功的案例[35]，但還沒有權威的解決方案以滿足對新型再生技術日益增長的需求。因此，未來重建受損組織和器官功能的生物制備方法（包括但不限于組織工程領域），除了集中在利用身體的再生能力外，合適的材料研究也至關重要，因此需要生物醫學與工程學更加深入融合。如今組織工程技術研究面臨的難題主要有：支架的生物相容性及力學性能、種子細胞在支架材料上的增殖達不到臨床需求以及免疫炎癥反應導致瘢痕形成影響移植效果等。三維打印技術作為一項新興技術，由于其打印出的結構可控性高，并可選擇生物相容性好的材料進行打印，在組織工程中的應用具有非常大的潛力。隨著新型材料的出現、三維打印技術的發展完善和組織工程技術及理念的不斷改進創新，以及對細胞相互作用機制的不斷深入了解，未來應用于臨床的組織工程技術將成為人類醫療史上的一座里程碑。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。