外泌體是活細胞分泌的直徑為 30～100 nm 的囊泡，是細胞間信息交流的重要媒介。近年來研究發現，外泌體不僅可作為疾病診斷的生物標志，而且可作為天然的藥物傳遞載體。外泌體能夠負載的治療物質包括小分子化合物、蛋白質、寡核苷酸等。外泌體獨特的生物兼容性、高穩定性、腫瘤靶向性使其在未來腫瘤治療中有很大的利用價值。雖然外泌體具有傳遞生物活性分子的潛在優勢，但是目前人們對于外泌體的認知和將其作為理想的藥物載體之間尚有很大差距。本文簡單介紹了外泌體的功能及組成，重點總結并歸納外泌體作為藥物載體的潛在優勢及挑戰，以期為外泌體作為藥物載體的開發提供新的思路。
引用本文： 孟婉蓉, 李靈, 朱桂全. 外泌體作為藥物傳遞系統的前景及挑戰. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(4): 714-720. doi: 10.7507/1001-5515.201810027 復制
引言
外泌體（exosomes）是細胞在正常或病理狀態都能分泌的一類細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），最初曾被認為是細胞產生的垃圾[1]。隨著研究的深入，逐漸發現外泌體在細胞間通信中扮演著十分重要的角色。目前對于外泌體的研究涉及包括腫瘤的發生發展、侵襲轉移機制、腫瘤診斷標志物以及藥物傳遞系統等諸多方面[2-4]。在已有的研究基礎上，本研究團隊首次探索了 γδT 細胞來源的外泌體作為抑癌微小 RNA（microRNAs，miRNAs）的傳遞載體，及其在腫瘤治療中潛在的應用價值。研究結果表明，γδ T 細胞外泌體具有直接的抗腫瘤效應和間接的腫瘤免疫促進效應，是一種較為理想的核酸藥物傳遞載體[5]。
現有的藥物載體，如人工制造的脂質體能在體內引起蓄積毒性和免疫原性，因此限制了此類藥物載體的廣泛應用。外泌體作為一種天然的藥物傳遞載體，具有生物兼容性、高穩定性、腫瘤靶向性的顯著優勢，已受到了國內外學者越來越多的關注，但是要將其轉化為臨床應用，還需要完善很多的問題。本文就目前外泌體作為藥物載體的應用及存在的問題予以綜述，并對此藥物傳遞載體的前景進行展望，旨在為今后外泌體作為藥物傳遞系統的開發和臨床應用奠定基礎。
1 外泌體的組成及功能
1.1 外泌體的組成及提取
外泌體膜內包被各種生物活性分子，是細胞間信號交流的重要介質，更是自身負載大分子物質并參與全身運輸的天然載體[6]。澳大利亞拉籌伯大學（la trobe university，LTU）創建了外泌體蛋白、RNA、脂質數據庫（exosomes protein，RNA and lipid database，ExoCarta）（網址為：http://exocarta.org/credits），該數據庫統計了外泌體中包含的 9 769 種蛋白質，1 116 種脂質，3 408 種 mRNAs 和 2 838 種 miRNAs，可為相關領域研究提供樣本資源。
外泌體的組成及結構如圖 1 所示。外泌體內含有 DNA、miRNAs、mRNA、長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，LncRNA）、酶、蛋白質和細胞代謝物等。除此之外，外泌體膜表面還鑲嵌大量蛋白分子。為了分析其內部組成，目前已經開發出 5 大類外泌體提取方法：① 基于超速離心的分離方法；② 基于外泌體大小的濾過方法；③ 基于免疫親和性的分離方法；④ 基于外泌體沉降試劑盒的提取方法；⑤ 基于微流體技術的分離方法[7]。不同的提取方法各有利弊，而方法的選用則取決于外泌體在具體實驗中的應用目的。
圖1
外泌體的組成
Figure1.
Composition of exosomes
1.2 外泌體的功能
外泌體的主要功能是進行細胞間信息交流，一般是通過傳遞膜表面或腔內的生物分子來進行細胞間信號傳遞，從而調節細胞的正常生理功能[8]。不同的外泌體在調控腫瘤細胞增殖的作用中功效不同：一方面，來自于成熟樹突細胞（dendritic cells，DCs）外泌體的脂肪酸二十二碳六烯酸和溶磷脂酰膽堿能增強 DCs 的抗原提呈能力，從而抑制腫瘤細胞增殖[9]；另一方面，腫瘤細胞產生的外泌體傳遞致瘤 miRNAs 顯著促進腫瘤細胞增殖，同時此類外泌體中攜帶的高含量的前列腺素和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）能促進腫瘤細胞免疫逃逸[3]。Crewe 等[10]最近報道了內皮細胞能夠將細胞外生物分子包裹進 EVs，進而 EVs 能攜帶生物分子傳遞到脂肪組織中。此類納米級藥物傳遞系統的膜表面蛋白直接與受體細胞接觸，因此在體內靶向識別目標組織和促進藥物遞送方面具有重要作用。有研究表明，當以非腫瘤細胞來源的外泌體作為載體輸送抗癌藥物時，抗癌藥產生的相應副作用比無載體抗癌藥的副作用更小，且藥物利用率較高[11]。不同來源的外泌體具有不同的生理作用，作為藥物傳遞載體的外泌體應是正常細胞產生的具有特定性質的囊泡。
2 外泌體作為藥物載體的挑戰
2.1 作為藥物載體的外泌體來源
雖然大多數細胞都能產生外泌體，但不是所有細胞來源的外泌體都適合作為藥物載體。作為藥物載體的外泌體應該具有嚴格的質量標準，具體指標包括：外泌體表面蛋白種類以及細胞的產出能力等。DCs 來源的外泌體可用于免疫治療，因其富含組織相容復合物（major histocompatibility complex，MHC），包括 MHC -I 和 MHC -II，以及 T 細胞共刺激分子，能在體內激活 T 淋巴細胞，進而抑制腫瘤細胞增殖[12]。因上述 DCs 來源的外泌體具有相應的免疫治療作用，研究者在小鼠宮頸癌的治療研究上已取得一定進展[13]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）產生的外泌體也可作為藥物載體。Mendt 等[14]建立了以藥品生產質量管理規范（good manufacturing practice，GMP）為標準的基于生物反應器的大規模臨床級外泌體的生產方法。他們利用骨髓來源的 MSCs 生產 GMP 標準的外泌體，并通過體內外實驗證明 GMP 標準的外泌體對鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）的抑制作用，從而提高了胰腺癌小鼠的存活率。除以上細胞外，γδT 細胞、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）、腫瘤細胞等均有研究報道可作為載藥級別外泌體的細胞來源[15-16]；此外，由乳腺細胞分泌的牛奶中，也含有可作為載體的外泌體[17]。如何選擇不同來源的母細胞是目前外泌體遞藥系統存在的問題之一。由于外泌體能繼承母細胞的部分生物學特點并發揮相應的功能，因此不同來源的外泌體具有異質性。現階段，個性化給藥能提供較好的解決方案，因此可以根據疾病種類和負載藥物的類型選擇合適的外泌體母細胞。外泌體藥物傳遞系統開發流程如圖 2 所示。
圖2
外泌體藥物傳遞系統開發流程
Figure2.
Development process of exosomes-based drug delivery systems
2.2 外泌體的靶向設計
某些細胞來源的外泌體本身具有一定的內在靶向性，如中樞神經細胞來源的外泌體能通過血腦屏障，靶向特定的神經元[18]，如缺氧腫瘤細胞來源的外泌體傾向于向缺氧腫瘤組織內募集[19]。另外，外泌體的外源靶向性還可通過在外泌體膜表面設計與靶細胞特異性結合的抗體、配體或受體來實現。比如，以生物工程技術修飾 DCs 使其表達融合蛋白，建立溶酶體相關膜蛋白 2 b（lysosomal associated membrane protein 2b，Lamp2b）融合狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG）的融合蛋白。Lamp2b 是外泌體的跨膜蛋白，RVG 是一種神經元特異性糖蛋白，以上兩種蛋白的融合表達賦予了外泌體識別和靶向神經元、小膠質細胞、少突膠質細胞的功能[20]。通過生物工程方法將分化群 3（cluster of differentiation 3，CD3）抗體和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體同時表達于外泌體表面。分化群（cluster of differentiation，CD）是指來自不同實驗室的單克隆抗體所識別的同一分化抗原歸為一個分化群，每一 CD 分子代表一種或一類分化抗原，從 CD1 開始依序編號。經過修飾的外泌體可以同時識別 EGFR 陽性的腫瘤細胞和 CD3 陽性 T 細胞，因此賦予了 CD3 陽性 T 細胞對腫瘤細胞特異性結合的能力[21]。通過基因工程技術表達設計錨蛋白重復蛋白（designed ankyrin repeat protein，DARPin）于外泌體表面，借助 DARPin 與人類表皮生長因子受體 2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）的特異性結合，實現外泌體對 HER2 陽性乳腺癌細胞靶向識別的目的[22]。外源靶向性增強措施依賴于靶細胞表面存在特異性標志物，利用生物工程技術在外泌體膜表面表達與這一標志物特異性結合的分子，從而增加外泌體的靶向性。
2.3 外泌體的生產方法
將外泌體遞藥系統轉化為臨床應用，需要高質量且高產量的外泌體供給。目前大規模生產外泌體的方法主要是自發生產和非自發生產[23]。自發生產通過依賴中空纖維生物反應器為細胞生長提供高表面積比，進而支持高密度的細胞自發釋放外泌體[24-25]。研究表明，自發生產方式時間成本較高，14 d 內 106 個細胞只能釋放 5 μg 外泌體，因此不適于工業化生產[24]。非自發生產方式主要通過增加外部刺激條件來觸發細胞釋放大量外泌體，非自發生產方式可分為三類：① 生物刺激；② 化學刺激；③ 物理刺激。
血清饑餓處理細胞和缺氧處理細胞是最簡單的生物刺激方式。Sun 等[26]發現，血清饑餓處理的人骨髓瘤細胞能釋放 2.5 倍的外泌體，缺氧條件下肺癌和乳腺癌細胞的外泌體釋放量也增加[27-28]。除此之外，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素 8（interleukin-8，IL-8）和白細胞三烯 B4（leukotriene B4，LTB4）等細胞因子能活化細胞并誘導其分泌大量外泌體[29]。化學刺激主要是利用細胞松弛素 B 抑制肌動蛋白的聚合從而促進外泌體的釋放[30-31]。除此之外，Momen-Heravi 等[32]發現乙醇能增加肝癌細胞釋放 10 倍量的外泌體。化學刺激和細胞因子刺激的生產方法雖然能在短時間內獲得大量外泌體，但是由于生物活性劑的加入，生產的外泌體殘留大量生物活性劑，需要進一步的純化。物理刺激不需要加入任何刺激分子，通過對細胞施加物理和機械應力誘導外泌體分泌。Jo 等[33]和 Piffoux 等[34]利用微流控裝置在層流中通過剪切應力誘導外泌體釋放，高剪切應力刺激顯著增加了細胞的外泌體產量。
2.4 外泌體的藥物裝載方法
目前外泌體的藥物裝載方法可分為三類：① 前裝載方法；② 后裝載方法；③ 其他裝載方法。前裝載方法是首先將藥物加載到母細胞中，隨后外泌體形成并包裹藥物分泌到細胞外。目前常用的方法如轉染、共孵育等屬于前裝載[35-36]。后裝載方法是直接將藥物加載到外泌體中，例如孵育、電穿孔、超聲、擠出、凍融循環等[37-40]。其他加載方法主要是通過生物工程修飾母細胞來實現。Li 等[41]報道了一種工程化外泌體，通過人抗原 R（human antigen R，HuR）與 CD9 序列的融合來修飾母細胞。修飾后的細胞表達融合蛋白 HuR-CD9，由于 HuR 對 RNA 具有超高親和力，且 CD9 是外泌體的跨膜蛋白，因此母細胞產生的外泌體能主動增加 RNA 的裝載量。不同裝載方法具有不同的裝載效率，方法的選擇取決于裝載藥物類型。例如，Kim 等[39]報道了 3 種不同的裝載方法下（室溫孵育、電穿孔及超聲），紫杉醇在外泌體中的裝載效率為: 室溫孵育 < 電穿孔 < < 超聲。Haney 等[40]以 4 種不同的裝載方法考察過氧化氫酶在外泌體中的裝載效率，得到以下結果: 常溫孵育 < 凍融循環 < 超聲≈擠壓。綜上，不同的裝載方法決定外泌體對藥物的裝載量。而藥物裝載效率也取決于外泌體的來源細胞。Kanchanapally 等[42]利用共同孵育的方法將阿霉素加載到 3 種不同細胞來源（胰腺癌細胞、胰腺星狀細胞、巨噬細胞）的外泌體中，結果發現胰腺癌細胞外泌體的裝載效率最高，其他兩者次之。雖然外泌體的藥物裝載方法種類較多且裝載效率也各有高低，但是相對于人工制造脂質體的高效工業化生產，外泌體的藥物裝載效率是極低的。針對外泌體的種類和被裝載藥物的性質來制定優化的裝載方案是提高外泌體藥物裝載效率的關鍵。
2.5 外泌體作為藥物載體的應用實例
外泌體能夠裝載的治療物質包括小分子化合物、蛋白質、寡核苷酸等。作為小分子化合物載體，外泌體裝載姜黃素、紫杉醇、阿霉素等主要是用于抗腫瘤研究[43-45]。外泌體作為核酸分子的藥物載體主要用于基因治療。外泌體裝載小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）和 miRNAs 用于治療相關疾病的研究則較多[46-48]。最近的研究表明，外泌體裝載核酸分子再聯合化學治療手段，能減弱癌細胞對抗腫瘤藥物的耐藥性[49]。外泌體內部和表面都含有大量的蛋白質分子，這些蛋白分子既能提供與受體細胞表面配體結合的位點，也可作為其他治療方式的輔助手段[50]。例如，Haney 等[40]開發了一種基于外泌體的抗氧化劑和過氧化氫酶傳遞系統。Hong 等[45]設計了基于外泌體的透明質酸酶和阿霉素的共傳遞納米系統，透明質酸酶通過溶解腫瘤微環境的細胞外基質，進而增強了外泌體的腫瘤滲透效應和藥物遞送效率。
3 外泌體作為藥物傳遞系統的優勢
3.1 生物兼容性
外泌體作為藥物載體與現有的人工制造脂質體相比的優勢在于其良好的生物兼容性。目前，脂質體是 siRNA 和其他 RNA 的主要遞送裝置。脂質體能在人體內引起毒性免疫應答，對肝臟等器官造成蓄積毒性，不能達到良好的預期效果。外泌體具有更好的生物兼容性，能克服脂質體所引起的免疫原性和體內蓄積毒性的缺點。Kamerkar 等[51]利用外泌體遞送 siRNA 阻止 KRAS 突變蛋白產生。研究結果顯示，相較于脂質體，靜脈注射負載 siRNA 的外泌體能更好地抑制 KRAS 蛋白表達，且在體內無免疫原性。Usman 等[52]利用電穿孔技術將反義寡核苷酸導入紅細胞來源的外泌體，結果顯示，外泌體裝載反義寡核苷酸對乳腺癌細胞有顯著抑制作用且在體內無免疫原性。外泌體與其他 RNA 藥物遞送載體（如腺病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、脂質體）相比無免疫原性和細胞毒性，表現出良好的生物兼容性。
3.2 生物穩定性
外泌體作為藥物載體的優勢之一，是具有生物穩定性。抗原提呈細胞來源的外泌體能表達膜結合補體調控因子 CD55 和 CD59，用以增強體內循環的穩定性。研究顯示，外泌體即使暴露在炎性環境下仍然具有較長的體內循環時間[53]。外泌體膜表面表達的 CD47 分子能保護外泌體遠離單核巨噬細胞系統，從而避免被清除，因此也增加了外泌體在體內的循環時間[51]。大量的研究證明，納米顆粒因其尺寸較小（≤ 100 nm），能通過增強滲透和保留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）達到對腫瘤組織的靶向聚集[54]。外泌體的尺寸在 30～100 nm 之間，對腫瘤組織的靶向作用同樣遵循 EPR 效應。此外，聚乙二醇修飾的外泌體的體內循環時間能達到 60 min 以上[55]。聚乙二醇修飾的外泌體通過延長體內清除時間顯著提高外泌體在體內的生物穩定性，使外泌體作為藥物載體的研究更具有前景。
3.3 靶向性
某些細胞來源的外泌體具有內在靶向功能。例如，中樞神經細胞來源的外泌體能通過血腦屏障，靶向特定的神經元；缺氧腫瘤細胞來源的外泌體傾向于向缺氧腫瘤組織內募集[18-19]。生物分布的研究結果也表明，外泌體在腫瘤組織中的聚集取決于母細胞種類。因此研究對特定組織或細胞具有靶向作用的外泌體時，需考慮其來源細胞對靶向效率的影響[14]。Zhuang 等[43]將負載姜黃素的 EVs 通過鼻腔給藥方式傳遞到小鼠大腦，結果表明 EVs 對血腦屏障有良好的穿透性。該研究成果為腦部腫瘤靶向制劑的開發提供了新的思路。除了這些內生的靶向通路，人們也可以通過生物工程設計具有靶向功能的外泌體藥物遞送系統。
4 存在問題的總結與展望
雖然外泌體作為藥物載體具有生物兼容性、穩定性和內在靶向性等潛在優勢，但是外泌體在藥物遞送中的應用研究才剛剛起步，尚有以下問題需要解決：① 選擇何種細胞作為外泌體的供體；② 如何修飾外泌體的靶向性；③ 如何提高藥物裝載效率；④ 如何實現外泌體的大量生產。針對這些問題本文介紹了相應的解決辦法和改進策略。
外泌體藥物遞送系統不能提供一個普適的遞藥策略，這是由外泌體的異質性決定的[56]。研究者必須根據所傳遞治療物質的類型、目標組織的特點等進行針對性的策略調整。盡管有臨床前實驗數據表明，使用外泌體作為藥物載體能達到靶向治療的目的，但要真正為臨床所用，對外泌體的體內運輸機制及其生產質量控制標準的研究十分重要。
綜上所述，通過對外泌體的組成和功能的簡單介紹，以及對其作為藥物載體存在的問題以及潛在優勢的重點總結，期望本文可為后續關于外泌體作為藥物載體的相關研究提供可借鑒的思路。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
外泌體（exosomes）是細胞在正常或病理狀態都能分泌的一類細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），最初曾被認為是細胞產生的垃圾[1]。隨著研究的深入，逐漸發現外泌體在細胞間通信中扮演著十分重要的角色。目前對于外泌體的研究涉及包括腫瘤的發生發展、侵襲轉移機制、腫瘤診斷標志物以及藥物傳遞系統等諸多方面[2-4]。在已有的研究基礎上，本研究團隊首次探索了 γδT 細胞來源的外泌體作為抑癌微小 RNA（microRNAs，miRNAs）的傳遞載體，及其在腫瘤治療中潛在的應用價值。研究結果表明，γδ T 細胞外泌體具有直接的抗腫瘤效應和間接的腫瘤免疫促進效應，是一種較為理想的核酸藥物傳遞載體[5]。
現有的藥物載體，如人工制造的脂質體能在體內引起蓄積毒性和免疫原性，因此限制了此類藥物載體的廣泛應用。外泌體作為一種天然的藥物傳遞載體，具有生物兼容性、高穩定性、腫瘤靶向性的顯著優勢，已受到了國內外學者越來越多的關注，但是要將其轉化為臨床應用，還需要完善很多的問題。本文就目前外泌體作為藥物載體的應用及存在的問題予以綜述，并對此藥物傳遞載體的前景進行展望，旨在為今后外泌體作為藥物傳遞系統的開發和臨床應用奠定基礎。
1 外泌體的組成及功能
1.1 外泌體的組成及提取
外泌體膜內包被各種生物活性分子，是細胞間信號交流的重要介質，更是自身負載大分子物質并參與全身運輸的天然載體[6]。澳大利亞拉籌伯大學（la trobe university，LTU）創建了外泌體蛋白、RNA、脂質數據庫（exosomes protein，RNA and lipid database，ExoCarta）（網址為：http://exocarta.org/credits），該數據庫統計了外泌體中包含的 9 769 種蛋白質，1 116 種脂質，3 408 種 mRNAs 和 2 838 種 miRNAs，可為相關領域研究提供樣本資源。
外泌體的組成及結構如圖 1 所示。外泌體內含有 DNA、miRNAs、mRNA、長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，LncRNA）、酶、蛋白質和細胞代謝物等。除此之外，外泌體膜表面還鑲嵌大量蛋白分子。為了分析其內部組成，目前已經開發出 5 大類外泌體提取方法：① 基于超速離心的分離方法；② 基于外泌體大小的濾過方法；③ 基于免疫親和性的分離方法；④ 基于外泌體沉降試劑盒的提取方法；⑤ 基于微流體技術的分離方法[7]。不同的提取方法各有利弊，而方法的選用則取決于外泌體在具體實驗中的應用目的。
圖1
外泌體的組成
Figure1.
Composition of exosomes
1.2 外泌體的功能
外泌體的主要功能是進行細胞間信息交流，一般是通過傳遞膜表面或腔內的生物分子來進行細胞間信號傳遞，從而調節細胞的正常生理功能[8]。不同的外泌體在調控腫瘤細胞增殖的作用中功效不同：一方面，來自于成熟樹突細胞（dendritic cells，DCs）外泌體的脂肪酸二十二碳六烯酸和溶磷脂酰膽堿能增強 DCs 的抗原提呈能力，從而抑制腫瘤細胞增殖[9]；另一方面，腫瘤細胞產生的外泌體傳遞致瘤 miRNAs 顯著促進腫瘤細胞增殖，同時此類外泌體中攜帶的高含量的前列腺素和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）能促進腫瘤細胞免疫逃逸[3]。Crewe 等[10]最近報道了內皮細胞能夠將細胞外生物分子包裹進 EVs，進而 EVs 能攜帶生物分子傳遞到脂肪組織中。此類納米級藥物傳遞系統的膜表面蛋白直接與受體細胞接觸，因此在體內靶向識別目標組織和促進藥物遞送方面具有重要作用。有研究表明，當以非腫瘤細胞來源的外泌體作為載體輸送抗癌藥物時，抗癌藥產生的相應副作用比無載體抗癌藥的副作用更小，且藥物利用率較高[11]。不同來源的外泌體具有不同的生理作用，作為藥物傳遞載體的外泌體應是正常細胞產生的具有特定性質的囊泡。
2 外泌體作為藥物載體的挑戰
2.1 作為藥物載體的外泌體來源
雖然大多數細胞都能產生外泌體，但不是所有細胞來源的外泌體都適合作為藥物載體。作為藥物載體的外泌體應該具有嚴格的質量標準，具體指標包括：外泌體表面蛋白種類以及細胞的產出能力等。DCs 來源的外泌體可用于免疫治療，因其富含組織相容復合物（major histocompatibility complex，MHC），包括 MHC -I 和 MHC -II，以及 T 細胞共刺激分子，能在體內激活 T 淋巴細胞，進而抑制腫瘤細胞增殖[12]。因上述 DCs 來源的外泌體具有相應的免疫治療作用，研究者在小鼠宮頸癌的治療研究上已取得一定進展[13]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）產生的外泌體也可作為藥物載體。Mendt 等[14]建立了以藥品生產質量管理規范（good manufacturing practice，GMP）為標準的基于生物反應器的大規模臨床級外泌體的生產方法。他們利用骨髓來源的 MSCs 生產 GMP 標準的外泌體，并通過體內外實驗證明 GMP 標準的外泌體對鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）的抑制作用，從而提高了胰腺癌小鼠的存活率。除以上細胞外，γδT 細胞、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）、腫瘤細胞等均有研究報道可作為載藥級別外泌體的細胞來源[15-16]；此外，由乳腺細胞分泌的牛奶中，也含有可作為載體的外泌體[17]。如何選擇不同來源的母細胞是目前外泌體遞藥系統存在的問題之一。由于外泌體能繼承母細胞的部分生物學特點并發揮相應的功能，因此不同來源的外泌體具有異質性。現階段，個性化給藥能提供較好的解決方案，因此可以根據疾病種類和負載藥物的類型選擇合適的外泌體母細胞。外泌體藥物傳遞系統開發流程如圖 2 所示。
圖2
外泌體藥物傳遞系統開發流程
Figure2.
Development process of exosomes-based drug delivery systems
2.2 外泌體的靶向設計
某些細胞來源的外泌體本身具有一定的內在靶向性，如中樞神經細胞來源的外泌體能通過血腦屏障，靶向特定的神經元[18]，如缺氧腫瘤細胞來源的外泌體傾向于向缺氧腫瘤組織內募集[19]。另外，外泌體的外源靶向性還可通過在外泌體膜表面設計與靶細胞特異性結合的抗體、配體或受體來實現。比如，以生物工程技術修飾 DCs 使其表達融合蛋白，建立溶酶體相關膜蛋白 2 b（lysosomal associated membrane protein 2b，Lamp2b）融合狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG）的融合蛋白。Lamp2b 是外泌體的跨膜蛋白，RVG 是一種神經元特異性糖蛋白，以上兩種蛋白的融合表達賦予了外泌體識別和靶向神經元、小膠質細胞、少突膠質細胞的功能[20]。通過生物工程方法將分化群 3（cluster of differentiation 3，CD3）抗體和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體同時表達于外泌體表面。分化群（cluster of differentiation，CD）是指來自不同實驗室的單克隆抗體所識別的同一分化抗原歸為一個分化群，每一 CD 分子代表一種或一類分化抗原，從 CD1 開始依序編號。經過修飾的外泌體可以同時識別 EGFR 陽性的腫瘤細胞和 CD3 陽性 T 細胞，因此賦予了 CD3 陽性 T 細胞對腫瘤細胞特異性結合的能力[21]。通過基因工程技術表達設計錨蛋白重復蛋白（designed ankyrin repeat protein，DARPin）于外泌體表面，借助 DARPin 與人類表皮生長因子受體 2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）的特異性結合，實現外泌體對 HER2 陽性乳腺癌細胞靶向識別的目的[22]。外源靶向性增強措施依賴于靶細胞表面存在特異性標志物，利用生物工程技術在外泌體膜表面表達與這一標志物特異性結合的分子，從而增加外泌體的靶向性。
2.3 外泌體的生產方法
將外泌體遞藥系統轉化為臨床應用，需要高質量且高產量的外泌體供給。目前大規模生產外泌體的方法主要是自發生產和非自發生產[23]。自發生產通過依賴中空纖維生物反應器為細胞生長提供高表面積比，進而支持高密度的細胞自發釋放外泌體[24-25]。研究表明，自發生產方式時間成本較高，14 d 內 106 個細胞只能釋放 5 μg 外泌體，因此不適于工業化生產[24]。非自發生產方式主要通過增加外部刺激條件來觸發細胞釋放大量外泌體，非自發生產方式可分為三類：① 生物刺激；② 化學刺激；③ 物理刺激。
血清饑餓處理細胞和缺氧處理細胞是最簡單的生物刺激方式。Sun 等[26]發現，血清饑餓處理的人骨髓瘤細胞能釋放 2.5 倍的外泌體，缺氧條件下肺癌和乳腺癌細胞的外泌體釋放量也增加[27-28]。除此之外，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素 8（interleukin-8，IL-8）和白細胞三烯 B4（leukotriene B4，LTB4）等細胞因子能活化細胞并誘導其分泌大量外泌體[29]。化學刺激主要是利用細胞松弛素 B 抑制肌動蛋白的聚合從而促進外泌體的釋放[30-31]。除此之外，Momen-Heravi 等[32]發現乙醇能增加肝癌細胞釋放 10 倍量的外泌體。化學刺激和細胞因子刺激的生產方法雖然能在短時間內獲得大量外泌體，但是由于生物活性劑的加入，生產的外泌體殘留大量生物活性劑，需要進一步的純化。物理刺激不需要加入任何刺激分子，通過對細胞施加物理和機械應力誘導外泌體分泌。Jo 等[33]和 Piffoux 等[34]利用微流控裝置在層流中通過剪切應力誘導外泌體釋放，高剪切應力刺激顯著增加了細胞的外泌體產量。
2.4 外泌體的藥物裝載方法
目前外泌體的藥物裝載方法可分為三類：① 前裝載方法；② 后裝載方法；③ 其他裝載方法。前裝載方法是首先將藥物加載到母細胞中，隨后外泌體形成并包裹藥物分泌到細胞外。目前常用的方法如轉染、共孵育等屬于前裝載[35-36]。后裝載方法是直接將藥物加載到外泌體中，例如孵育、電穿孔、超聲、擠出、凍融循環等[37-40]。其他加載方法主要是通過生物工程修飾母細胞來實現。Li 等[41]報道了一種工程化外泌體，通過人抗原 R（human antigen R，HuR）與 CD9 序列的融合來修飾母細胞。修飾后的細胞表達融合蛋白 HuR-CD9，由于 HuR 對 RNA 具有超高親和力，且 CD9 是外泌體的跨膜蛋白，因此母細胞產生的外泌體能主動增加 RNA 的裝載量。不同裝載方法具有不同的裝載效率，方法的選擇取決于裝載藥物類型。例如，Kim 等[39]報道了 3 種不同的裝載方法下（室溫孵育、電穿孔及超聲），紫杉醇在外泌體中的裝載效率為: 室溫孵育 < 電穿孔 < < 超聲。Haney 等[40]以 4 種不同的裝載方法考察過氧化氫酶在外泌體中的裝載效率，得到以下結果: 常溫孵育 < 凍融循環 < 超聲≈擠壓。綜上，不同的裝載方法決定外泌體對藥物的裝載量。而藥物裝載效率也取決于外泌體的來源細胞。Kanchanapally 等[42]利用共同孵育的方法將阿霉素加載到 3 種不同細胞來源（胰腺癌細胞、胰腺星狀細胞、巨噬細胞）的外泌體中，結果發現胰腺癌細胞外泌體的裝載效率最高，其他兩者次之。雖然外泌體的藥物裝載方法種類較多且裝載效率也各有高低，但是相對于人工制造脂質體的高效工業化生產，外泌體的藥物裝載效率是極低的。針對外泌體的種類和被裝載藥物的性質來制定優化的裝載方案是提高外泌體藥物裝載效率的關鍵。
2.5 外泌體作為藥物載體的應用實例
外泌體能夠裝載的治療物質包括小分子化合物、蛋白質、寡核苷酸等。作為小分子化合物載體，外泌體裝載姜黃素、紫杉醇、阿霉素等主要是用于抗腫瘤研究[43-45]。外泌體作為核酸分子的藥物載體主要用于基因治療。外泌體裝載小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）和 miRNAs 用于治療相關疾病的研究則較多[46-48]。最近的研究表明，外泌體裝載核酸分子再聯合化學治療手段，能減弱癌細胞對抗腫瘤藥物的耐藥性[49]。外泌體內部和表面都含有大量的蛋白質分子，這些蛋白分子既能提供與受體細胞表面配體結合的位點，也可作為其他治療方式的輔助手段[50]。例如，Haney 等[40]開發了一種基于外泌體的抗氧化劑和過氧化氫酶傳遞系統。Hong 等[45]設計了基于外泌體的透明質酸酶和阿霉素的共傳遞納米系統，透明質酸酶通過溶解腫瘤微環境的細胞外基質，進而增強了外泌體的腫瘤滲透效應和藥物遞送效率。
3 外泌體作為藥物傳遞系統的優勢
3.1 生物兼容性
外泌體作為藥物載體與現有的人工制造脂質體相比的優勢在于其良好的生物兼容性。目前，脂質體是 siRNA 和其他 RNA 的主要遞送裝置。脂質體能在人體內引起毒性免疫應答，對肝臟等器官造成蓄積毒性，不能達到良好的預期效果。外泌體具有更好的生物兼容性，能克服脂質體所引起的免疫原性和體內蓄積毒性的缺點。Kamerkar 等[51]利用外泌體遞送 siRNA 阻止 KRAS 突變蛋白產生。研究結果顯示，相較于脂質體，靜脈注射負載 siRNA 的外泌體能更好地抑制 KRAS 蛋白表達，且在體內無免疫原性。Usman 等[52]利用電穿孔技術將反義寡核苷酸導入紅細胞來源的外泌體，結果顯示，外泌體裝載反義寡核苷酸對乳腺癌細胞有顯著抑制作用且在體內無免疫原性。外泌體與其他 RNA 藥物遞送載體（如腺病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、脂質體）相比無免疫原性和細胞毒性，表現出良好的生物兼容性。
3.2 生物穩定性
外泌體作為藥物載體的優勢之一，是具有生物穩定性。抗原提呈細胞來源的外泌體能表達膜結合補體調控因子 CD55 和 CD59，用以增強體內循環的穩定性。研究顯示，外泌體即使暴露在炎性環境下仍然具有較長的體內循環時間[53]。外泌體膜表面表達的 CD47 分子能保護外泌體遠離單核巨噬細胞系統，從而避免被清除，因此也增加了外泌體在體內的循環時間[51]。大量的研究證明，納米顆粒因其尺寸較小（≤ 100 nm），能通過增強滲透和保留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）達到對腫瘤組織的靶向聚集[54]。外泌體的尺寸在 30～100 nm 之間，對腫瘤組織的靶向作用同樣遵循 EPR 效應。此外，聚乙二醇修飾的外泌體的體內循環時間能達到 60 min 以上[55]。聚乙二醇修飾的外泌體通過延長體內清除時間顯著提高外泌體在體內的生物穩定性，使外泌體作為藥物載體的研究更具有前景。
3.3 靶向性
某些細胞來源的外泌體具有內在靶向功能。例如，中樞神經細胞來源的外泌體能通過血腦屏障，靶向特定的神經元；缺氧腫瘤細胞來源的外泌體傾向于向缺氧腫瘤組織內募集[18-19]。生物分布的研究結果也表明，外泌體在腫瘤組織中的聚集取決于母細胞種類。因此研究對特定組織或細胞具有靶向作用的外泌體時，需考慮其來源細胞對靶向效率的影響[14]。Zhuang 等[43]將負載姜黃素的 EVs 通過鼻腔給藥方式傳遞到小鼠大腦，結果表明 EVs 對血腦屏障有良好的穿透性。該研究成果為腦部腫瘤靶向制劑的開發提供了新的思路。除了這些內生的靶向通路，人們也可以通過生物工程設計具有靶向功能的外泌體藥物遞送系統。
4 存在問題的總結與展望
雖然外泌體作為藥物載體具有生物兼容性、穩定性和內在靶向性等潛在優勢，但是外泌體在藥物遞送中的應用研究才剛剛起步，尚有以下問題需要解決：① 選擇何種細胞作為外泌體的供體；② 如何修飾外泌體的靶向性；③ 如何提高藥物裝載效率；④ 如何實現外泌體的大量生產。針對這些問題本文介紹了相應的解決辦法和改進策略。
外泌體藥物遞送系統不能提供一個普適的遞藥策略，這是由外泌體的異質性決定的[56]。研究者必須根據所傳遞治療物質的類型、目標組織的特點等進行針對性的策略調整。盡管有臨床前實驗數據表明，使用外泌體作為藥物載體能達到靶向治療的目的，但要真正為臨床所用，對外泌體的體內運輸機制及其生產質量控制標準的研究十分重要。
綜上所述，通過對外泌體的組成和功能的簡單介紹，以及對其作為藥物載體存在的問題以及潛在優勢的重點總結，期望本文可為后續關于外泌體作為藥物載體的相關研究提供可借鑒的思路。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
