核酸適配體是經過指數富集配體系統進化技術（SELEX）篩選得到的寡核苷酸序列。已有研究表明，核酸適配體在腫瘤診斷及治療方面具有良好的應用前景。因此，本文主要針對肺癌細胞核酸適配體的篩選、表征等方面展開論述，初步探討核酸適配體作為靶向載體和靶向藥物在腫瘤診斷治療中的作用，為腫瘤的早期診斷及早期治療提供新思路。
引用本文： 許金苓, 廖世奇, 田彩萍, 張蕾, 翟蒙, 陳聰盈, 唐金舟, 曾家豫. 基于細胞的指數富集配體系統進化技術的肺癌細胞核酸適配體的篩選及其在腫瘤診治中的應用. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(6): 964-969. doi: 10.7507/1001-5515.201806006 復制
引言
惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一，其中肺癌的發生率居惡性腫瘤之首，是我國死亡率最高的惡性腫瘤，并且其發生率和死亡率仍在逐年增長[1]。盡管通過城市早篩早治項目、手術、放療、化療及分子靶向治療等技術對肺癌的控制與治療現已取得一定的成果，但是大多數患者（≥ 70%）確診時已經是中、晚期，失去了最佳治療機會。目前臨床上常用的腫瘤疾病的診療手段主要有腫瘤細胞的形態學檢查、彩超、電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）或是磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）。但這些檢查手段尚無法實現腫瘤疾病的早期診斷，即在機體開始發生腫瘤病變時不能有效地進行檢測。隨著科學技術的發展，適配體篩選檢測進入人們的視野，指數富集配體系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponentail enrichment，SELEX）是一項新的體外篩選方法，其是 90 年代初由美國兩個研究組最早提出的一項篩選和擴增技術。它應用大容量的隨機寡核苷酸庫，并結合聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）體外擴增技術，經過幾輪或數十輪的篩選，可獲得高親和力、高特異性的核酸配體（aptamer）。該技術對靶物質無特殊要求，現已篩選出多種靶物質的適配子，包括金屬離子、有機染料、藥物、氨基酸、核苷酸、多肽等。此外，適配子的靶蛋白還有：酶、生長因子、抗體、基因調控因子、細胞黏附因子以及外源凝集素等[2-3]。因其具有靶分子范圍廣、親和力高、特異性強等特點，篩選到的適配子能夠特異地與疾病發生發展中起重要作用的靶分子結合，阻斷或封閉靶分子的功能，從而達到治療疾病的目的。基于此，核酸適配體作為一種新型的分子探針在藥物篩選、疾病診斷、臨床治療等方面顯示出廣闊的應用前景，對腫瘤的診斷和治療具有重要意義。
本文對基于細胞的指數級富集配體系統進化技術（systematic evolution of ligands for cell exponential enrichment technology，Cell-SELEX）的肺癌細胞核酸適配體的篩選及其適配體在腫瘤診斷治療中的應用進行初步探討，以期為腫瘤的早期診斷及早期治療提供新思路。
1 核酸適配體
核酸適配體是一小段單鏈脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）分子，通常是經過 SELEX 技術體外篩選得到。1990 年，Tuerk 等[4]和 Ellington 等[5]首次應用 SELEX 技術成功篩選出第一個 RNA 適配體。此后，核酸適配體一直在不斷發展，已成為新一代的分子識別元件。單鏈寡核苷酸因序列不同，可形成構象不同且熱力學上穩定的二級和三級結構，如發卡、口袋、假結、G 四聚體等。由于隨機序列的存在，文庫中的單鏈寡核苷酸因序列各異而形成多樣且獨特的空間構象，適配體能夠通過堿基配對、范德華力、氫鍵和靜電等作用力和靶標結合，主要是通過特異性莖環識別靶標，實現與靶分子高特異性、高親和力的結合。另外，低分子量的適配體容易合成與修飾，可以識別天然狀態下細胞表面的靶向蛋白質，正是這些特點使核酸適配體在腫瘤的早期診斷、靶向治療中具有重要的作用[6]。
2 Cell-SELEX 技術
2.1 Cell-SELEX 技術概述
雖然 SELEX 技術已經篩選到許多高特異性的適配體，但實際應用到生物體內之后，在生理條件下可能發生翻譯后修飾或三維構象的改變，使得利用體外 SELEX 技術篩選得到的適配體無法識別該靶標在細胞膜表面的天然構象。與傳統 SELEX 技術不同的是，Cell-SELEX 的靶標是完整的活細胞，可以篩選出細胞表面分子的適配體，該技術最大的優點是在篩選過程中能夠同時以多種呈天然構象的膜蛋白為靶標分子，并且不需要預先了解細胞表面蛋白的種類及其表達水平。Cell-SELEX 技術篩選的靶標主要是癌細胞，還有正常細胞和炎癥細胞等，涉及到的器官和組織有腦、肺、肝、胰腺、乳腺和卵巢等[7]。2006 年，Shangguan 等[8]首次建立了 Cell-SELEX 篩選模型。該課題組以急性淋巴細胞白血病細胞系（CCRF-CEM）為靶細胞，以來自人 Burkitt 淋巴瘤的 AB 細胞系 Ramos 為對照細胞，篩選出了 10 條與靶細胞 CCRF-CEM 特異性結合的核酸適配體。利用 Cell-SELEX 技術能夠篩選出特異識別一類癌細胞而不與正常細胞或其他癌細胞結合的核酸適配體，而且篩選過程是在具有多種蛋白質受體的活細胞上進行的，所以可以得到一系列適配體探針。這些探針在腫瘤的基礎研究與分子成像[9]、靶向藥物傳送[10]和臨床早期診斷[11]中具有重要的作用。
2.2 篩選方法
細胞是由多種生物大分子和小分子組成的生命體，代謝過程復雜，其細胞膜組成成分也很復雜，包括蛋白質、糖鏈和脂類等多種物質，因此以細胞為靶標進行篩選時，有一定的難度。本文簡述其篩選過程主要包括以下 5 個步驟，即：① 初始文庫與靶細胞的結合（正向篩選）、② 洗去未與靶細胞結合的序列、③ 結合序列與反篩細胞的結合（反向篩選）、④ 洗去與反篩細胞結合的序列，并保留未結合的序列、⑤ 構建次級文庫用于下一輪篩選[12]。重復上述步驟進行 10～20 輪的篩選[13-14]，就可以獲得與靶細胞特異性結合的核酸適配體。為了提高適配體的特異性，在第三輪時，加入反向篩選，即與靶細胞結合后的文庫與反篩細胞結合，其目的是減少背景，提高核酸適配體的特異性。所選擇的反篩細胞與靶細胞相關，培養條件與靶細胞相同。具體篩選過程如圖 1 所示。
圖1
Cell-SELEX 技術篩選流程
Figure1.
The screening process of Cell-SELEX
3 肺癌細胞核酸適配體的篩選
肺癌死亡率高，對人們的健康造成嚴重的危害[15]。對各種癌細胞的核酸適配體的篩選有很多，目前已經篩選出了幾種肺癌細胞核酸適配體，如表 1 所示。Chen 等[16]利用 Cell-SELEX 技術篩選出了能夠特異性結合人小細胞肺癌細胞（NCI-H69）的核酸適配體，但很少結合其他肺癌亞型或其他類型的癌癥（例如：白血病或肝癌）。Kunii 等[17]為了檢測小細胞肺癌細胞表面潛在的生物標志物胃泌素釋放肽前體（pro-gastrin-releasing peptide，pro-GRP），篩選出了能夠與小細胞肺癌細胞（SBC3）高特異性結合的核酸適配體，這種適配體與對照細胞以及其他肺癌細胞的結合力不高，說明該適配體的特異性很強。而另一項研究中，Zhao 等[18]篩選出了能夠特異性結合肺腺癌細胞（A549）的核酸適配體。
表1
篩選出的肺癌細胞核酸適配體
Table1.
Aptamers of Lung cancer cell screened
另外，在復雜的生物環境中（如：人類血液）適配體也具有很強的結合力。以循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTCs）為例，其包含了完整的遺傳信息，與此相關的研究發展迅猛。如：Zamay 等[19]經過 11 輪篩選之后，獲得了與肺腺癌細胞特異性結合的核酸適配體。采用流式細胞術鑒定后發現，該適配體具有較高的特異性，不與正常細胞和淋巴細胞結合，此類特異性的適配體探針能夠檢測到血液中的 CTCs，這不僅可以用于肺癌的無創化診斷，也對評估肺癌治療效率有一定的幫助[20]，為實現肺癌的精準化治療奠定了基礎。
量子點（quantum dot，QDs）由于其獨特的強熒光性和光穩定性，廣泛應用于生物檢測領域[21]。Wu 等[22]研發了一種 QDs—適配體復合系統用于檢測 A549 細胞，該方法既便捷、靈敏度又高，同時還避免了 QDs 的空間位阻對適體構象的影響，提高了適配體的特異性。具體操作為：首先利用鏈霉親和素和生物素分別標記 A549 細胞的核酸適配體 S11e 與 QDs，然后將 QDs—S11e 復合系統同時與 A549 細胞和人舌癌細胞（Tca）孵育。結果顯示，A549 細胞中檢測到很強的熒光，而 Tca 細胞中沒有檢測到熒光，這為癌細胞的體外診斷提供了一種新方法。目前，關于肺癌細胞核酸適配體篩選的研究還有很多，相信未來可以在肺癌的早期診斷治療中發揮重要作用。
4 適配體的表征
基于 Cell-SELEX 技術的核酸適配體在生物醫藥、臨床疾病的診斷和治療方面具有潛在的應用價值，因此研究靶細胞與適配體之間的相互作用關系對生物醫學的發展具有至關重要的作用。盡管核酸適配體可以折疊成三維結構，并通過氫鍵、疏水作用、范德華力與靶細胞結合，但是其具體的結合行為還不是很明確，尤其適配體與細胞分子水平之間的結合關系尚不明朗[24]。目前主流技術是通過流式細胞術、熒光共聚焦顯微鏡、單分子力普技術（single-molecule force spectroscopy，SMFS）等檢測細胞與適配體之間的結合情況。
4.1 流式細胞術
流式細胞術可以監測篩選過程中文庫的富集程度以及檢測適配體與靶細胞的結合程度，其優勢是能夠計算出適配體與靶細胞結合的平衡解離常數。將不同濃度梯度的帶異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的核酸適配體分別與靶細胞孵育，測定適配體與靶細胞結合的熒光強度，以判斷結合效果。熒光強度越強，適配體與靶細胞的親和力越高，反之越小[25]。使用科學圖表繪制軟件 SigmaPlot 12.0（Sigma，中國），通過方程 Y = Bmax·X/（Kd + X）計算出平衡解離常數 Kd[26]（Y：熒光強度；X：不同濃度的核酸適配體的具體濃度；Bmax：所測得的最大熒光強度；Kd：平衡解離常數）
4.2 熒光共聚焦顯微鏡
將 FITC 標記的核酸適配體分別與靶細胞和對照細胞孵育，檢測被 FITC 標記的細胞數量。如果熒光標記的靶細胞數量明顯多于對照細胞的數量，就可證明篩選出了能夠與靶細胞特異性結合的的核酸適配體[27]。
4.3 SMFS 技術
SMFS 技術能夠檢測靶細胞與適配體的結合位點，更重要的是可以清楚地顯示分子之間的相互作用[28]。基于 SMFS 技術的原子力顯微鏡是一種探究分子內或分子間相互作用的強有力的工具，利用好這項技術對適配體探針的設計具有很大的意義。
5 核酸適配體在腫瘤早期診斷治療中的應用
核酸適配體是高度結構化的單鏈寡核苷酸，其特異性和親和力在復雜的生物環境中仍然具有很強的作用，因此將其作為一種新型的分子探針，在疾病的臨床診斷和治療方面具有較高的潛在應用價值[29]。
5.1 核酸適配體在腫瘤診斷中的應用
5.1.1 用于生物傳感器
大多數的生物傳感器是基于抗體—抗原結合的原理來設計的[30]，利用兩種不同類型的抗體來檢測靶分子，但是由于這些抗體的親和力不同，對于將生物傳感器用于疾病診斷帶來了困擾。與抗體相比，核酸適配體具有很多優良特性，更重要的是與靶分子結合后，其構象會發生變化，這為設計獨特、可變傳感器提供了可能，如表 2 所示。因此，核酸適配體作為一種具有前景的生物傳感器，已被用于與腫瘤相關的生物標志物傳感器的設計中，包括：光適體傳感器、電化學傳感器等。
表2
核酸適配體與抗體的性質比較
Table2.
Property comparison of aptamer and antibody
5.1.2 用于腫瘤的體內外成像
由于核酸適配體具有分子量小、容易合成與修飾等優點，可以與熒光染料或納米材料結合，用于體內外組織或細胞的成像，這對提高腫瘤預后具有非常重要的作用。Kunii 等[17]利用 FITC 修飾的 DNA 適配體對小細胞肺癌細胞進行識別和成像。結果表明，靶細胞表面具有很強的熒光性，而其他類型的細胞表面沒有檢測到熒光。Zhao 等[18]研發了一種新型適配體探針，利用四甲基羅丹明（tetramethylrhodamine，TAMRA）標記的熒光適配體將腺癌細胞從正常的肺組織或其他類型的肺癌中區分出來，這對非小細胞肺癌的診斷和治療具有非常重要的意義。Yin 等[31]將新型納米材料與 DNA 適配體 AS1411 結合，用于腫瘤細胞成像。此研究表明，納米材料—適配體復合物同時具有熒光成像能力與磁共振成像能力，可以顯示出針對靶癌細胞的特異性診斷圖像，可用于監測疾病的發展進程。
5.1.3 用于腫瘤標志物的檢測
腫瘤標志物是腫瘤發生、增殖、擴散或轉移過程中，由癌細胞生物合成、分泌的一類分子，大多數是核酸與蛋白質[32]。了解腫瘤發展的生物機制以及準確識別標志物的類型，對腫瘤的準確診斷、治療具有至關重要的作用。核酸適配體作為新型的分子識別元件，已檢測到了與肺癌相關的幾種標志物，如波形蛋白（vimentin，VIM）[19, 21]、組蛋白 H2B（histone-H2B）、微管蛋白（tubulin，TUB）和肌動蛋白（actin，ACT）等[21]。Glod 等[33]研發了一種基于慢速適配體（slow off-rate modified，SOMAmer）的蛋白質陣列技術，可以大規模地檢測少量樣品中的蛋白質組譜。與普通適配體相比，該適配體具有較強的疏水性，更容易與蛋白質結合，對新型生物標志物的檢測有一定的幫助。
5.2 用于腫瘤的治療
很多放化療藥物會給患者帶來很大的副作用，從而限制了其在臨床上的應用。因此，如何將藥物傳送到癌細胞或組織中成為治療過程中的關鍵問題。核酸適配體不僅可以用于腫瘤的診斷，還在腫瘤的治療過程中發揮作用。
5.2.1 作為載體
核酸適配體可以與靶分子特異性結合，為靶向藥物的傳送提供了良好的平臺。核酸適配體還可以與化療劑、納米材料、脂質體、QDs 等載體結合，將藥物直接傳送到腫瘤細胞中，一方面提高了治療的效率，另一方面減少了對正常細胞的傷害。
阿霉素（doxorubicine，DOX）是一種廣泛使用的化學抗癌藥物，其抗癌原理是插入 DNA 片段之后，導致 DNA 的復制和轉錄中斷。因此，可以通過特異性適配體將 DOX 遞送到腫瘤細胞中來阻斷 DNA 鏈的復制，從而阻止腫瘤細胞的擴散和轉移[34]。Almasi 等[35]利用核酸適配體與前列腺癌細胞（LNCaP）上的特異性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）的高特異性，將 DOX 輸送到 LNCaP 細胞中，與沒有 PSMA 表達的前列腺癌細胞 PC3 相比，針對 LNCaP 細胞的處理達到了明顯的治療效果。結果證明，DOX 和核酸適配體的復合物可以對腫瘤細胞進行靶向治療，同時減少了對非靶細胞的副作用。
小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）是短 RNA 分子，可以通過參與 RNA 干擾導致基因沉默。因此，siRNA 已被廣泛應用于很多疾病的治療，在腫瘤的治療中具有很大的應用前景，但是如何把 siRNA 傳遞到細胞中以及高效地發揮作用，一直是個難題。由于核酸適配體具有較好的穩定性、特異性高、親和力強，并易于修飾等優點，可以將修飾的適配體與 siRNA 偶聯，有利于解決 siRNA 的靶向傳遞問題。Lai 等[36]通過核仁蛋白（nucleolin，NCL）介導的內吞作用，將核仁蛋白適配體—siRNA 嵌合體（aptNCL-SLUGsiR 和 aptNCL-NRP1siR）傳送到肺腺癌細胞（CL1-5）中。結果表明，aptNCL-siRNA 嵌合體使 CL1-5 細胞中的 Snail 家族鋅指轉錄因子（snail family zinc finger 2，SLUG）和神經纖毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP1）的表達量明顯降低，從而阻斷了參與肺癌轉移的關鍵信號通路，抑制了腫瘤侵襲、血管生成和循環腫瘤細胞的數量，達到了靶向治療的目的。Perepelyuk 等[37]將適配體—新型納米材料綴合成遞送系統，選擇性地將微小 RNA-29b（miRNA-29b，miR-29b）傳送到表達粘蛋白-1（mucin 1，MUC1）的 A549 細胞中，使 DNA 甲基化轉移酶 3b（DNA methyltransferase3b，DNMT3b）和髓細胞白血病基因-1（myeloid cell leukemia-1，MCL1）的表達量顯著下調，減緩了 A549 細胞的增殖，同時誘導了細胞的凋亡，從而提高了肺癌的治療效率。
5.2.2 作為藥物
核酸適配體由于其無免疫原性，并具有較好的組織滲透性和化學穩定性，容易進入細胞，因此可用于細胞生命活動的調節。所以核酸適配體除了在臨床診斷和靶向載體方面具有重要作用外，還可以作為治療劑來治療疾病。其原理是作為藥物結合腫瘤細胞中的相關分子來影響細胞代謝途徑，從而使細胞凋亡或殺傷細胞，進一步阻止了腫瘤細胞的擴散和轉移，達到治療疾病的目的[38]。2004 年，第一個適配體基礎藥物（Macugen）被美國食品藥品監督管理局批準上市，用于治療黃斑病變（age-related macular degeneration，AMD）性疾病，Macugen 上市之后，其他適配體藥物相繼進入研發或臨床試驗階段。相信隨著技術的發展，核酸適配體藥物在未來將會有更廣闊的應用前景。
6 展望
雖然以細胞為靶標的核酸適配體篩選技術已經達到成熟的階段，但尚存在許多不足，仍有很多方面需要進一步完善。細胞與文庫的比例、孵育時間、孵育溫度、洗滌力度、洗滌液濃度、PCR 條件以及次級文庫的制備方法等都需要逐步探索。核酸適配體作為一種新型的分子探針，在很多疾病的治療中起著重要的作用，然而基于適配體診斷和治療的方法仍處于早期階段，要把核酸適配體應用于臨床還需要進一步確定其有效性和安全性[39]。因此，研究者需要不斷優化和解決這些問題，才有利于今后將核酸適配體廣泛應用于疾病的診斷和治療中。
引言
惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一，其中肺癌的發生率居惡性腫瘤之首，是我國死亡率最高的惡性腫瘤，并且其發生率和死亡率仍在逐年增長[1]。盡管通過城市早篩早治項目、手術、放療、化療及分子靶向治療等技術對肺癌的控制與治療現已取得一定的成果，但是大多數患者（≥ 70%）確診時已經是中、晚期，失去了最佳治療機會。目前臨床上常用的腫瘤疾病的診療手段主要有腫瘤細胞的形態學檢查、彩超、電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）或是磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）。但這些檢查手段尚無法實現腫瘤疾病的早期診斷，即在機體開始發生腫瘤病變時不能有效地進行檢測。隨著科學技術的發展，適配體篩選檢測進入人們的視野，指數富集配體系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponentail enrichment，SELEX）是一項新的體外篩選方法，其是 90 年代初由美國兩個研究組最早提出的一項篩選和擴增技術。它應用大容量的隨機寡核苷酸庫，并結合聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）體外擴增技術，經過幾輪或數十輪的篩選，可獲得高親和力、高特異性的核酸配體（aptamer）。該技術對靶物質無特殊要求，現已篩選出多種靶物質的適配子，包括金屬離子、有機染料、藥物、氨基酸、核苷酸、多肽等。此外，適配子的靶蛋白還有：酶、生長因子、抗體、基因調控因子、細胞黏附因子以及外源凝集素等[2-3]。因其具有靶分子范圍廣、親和力高、特異性強等特點，篩選到的適配子能夠特異地與疾病發生發展中起重要作用的靶分子結合，阻斷或封閉靶分子的功能，從而達到治療疾病的目的。基于此，核酸適配體作為一種新型的分子探針在藥物篩選、疾病診斷、臨床治療等方面顯示出廣闊的應用前景，對腫瘤的診斷和治療具有重要意義。
本文對基于細胞的指數級富集配體系統進化技術（systematic evolution of ligands for cell exponential enrichment technology，Cell-SELEX）的肺癌細胞核酸適配體的篩選及其適配體在腫瘤診斷治療中的應用進行初步探討，以期為腫瘤的早期診斷及早期治療提供新思路。
1 核酸適配體
核酸適配體是一小段單鏈脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）分子，通常是經過 SELEX 技術體外篩選得到。1990 年，Tuerk 等[4]和 Ellington 等[5]首次應用 SELEX 技術成功篩選出第一個 RNA 適配體。此后，核酸適配體一直在不斷發展，已成為新一代的分子識別元件。單鏈寡核苷酸因序列不同，可形成構象不同且熱力學上穩定的二級和三級結構，如發卡、口袋、假結、G 四聚體等。由于隨機序列的存在，文庫中的單鏈寡核苷酸因序列各異而形成多樣且獨特的空間構象，適配體能夠通過堿基配對、范德華力、氫鍵和靜電等作用力和靶標結合，主要是通過特異性莖環識別靶標，實現與靶分子高特異性、高親和力的結合。另外，低分子量的適配體容易合成與修飾，可以識別天然狀態下細胞表面的靶向蛋白質，正是這些特點使核酸適配體在腫瘤的早期診斷、靶向治療中具有重要的作用[6]。
2 Cell-SELEX 技術
2.1 Cell-SELEX 技術概述
雖然 SELEX 技術已經篩選到許多高特異性的適配體，但實際應用到生物體內之后，在生理條件下可能發生翻譯后修飾或三維構象的改變，使得利用體外 SELEX 技術篩選得到的適配體無法識別該靶標在細胞膜表面的天然構象。與傳統 SELEX 技術不同的是，Cell-SELEX 的靶標是完整的活細胞，可以篩選出細胞表面分子的適配體，該技術最大的優點是在篩選過程中能夠同時以多種呈天然構象的膜蛋白為靶標分子，并且不需要預先了解細胞表面蛋白的種類及其表達水平。Cell-SELEX 技術篩選的靶標主要是癌細胞，還有正常細胞和炎癥細胞等，涉及到的器官和組織有腦、肺、肝、胰腺、乳腺和卵巢等[7]。2006 年，Shangguan 等[8]首次建立了 Cell-SELEX 篩選模型。該課題組以急性淋巴細胞白血病細胞系（CCRF-CEM）為靶細胞，以來自人 Burkitt 淋巴瘤的 AB 細胞系 Ramos 為對照細胞，篩選出了 10 條與靶細胞 CCRF-CEM 特異性結合的核酸適配體。利用 Cell-SELEX 技術能夠篩選出特異識別一類癌細胞而不與正常細胞或其他癌細胞結合的核酸適配體，而且篩選過程是在具有多種蛋白質受體的活細胞上進行的，所以可以得到一系列適配體探針。這些探針在腫瘤的基礎研究與分子成像[9]、靶向藥物傳送[10]和臨床早期診斷[11]中具有重要的作用。
2.2 篩選方法
細胞是由多種生物大分子和小分子組成的生命體，代謝過程復雜，其細胞膜組成成分也很復雜，包括蛋白質、糖鏈和脂類等多種物質，因此以細胞為靶標進行篩選時，有一定的難度。本文簡述其篩選過程主要包括以下 5 個步驟，即：① 初始文庫與靶細胞的結合（正向篩選）、② 洗去未與靶細胞結合的序列、③ 結合序列與反篩細胞的結合（反向篩選）、④ 洗去與反篩細胞結合的序列，并保留未結合的序列、⑤ 構建次級文庫用于下一輪篩選[12]。重復上述步驟進行 10～20 輪的篩選[13-14]，就可以獲得與靶細胞特異性結合的核酸適配體。為了提高適配體的特異性，在第三輪時，加入反向篩選，即與靶細胞結合后的文庫與反篩細胞結合，其目的是減少背景，提高核酸適配體的特異性。所選擇的反篩細胞與靶細胞相關，培養條件與靶細胞相同。具體篩選過程如圖 1 所示。
圖1
Cell-SELEX 技術篩選流程
Figure1.
The screening process of Cell-SELEX
3 肺癌細胞核酸適配體的篩選
肺癌死亡率高，對人們的健康造成嚴重的危害[15]。對各種癌細胞的核酸適配體的篩選有很多，目前已經篩選出了幾種肺癌細胞核酸適配體，如表 1 所示。Chen 等[16]利用 Cell-SELEX 技術篩選出了能夠特異性結合人小細胞肺癌細胞（NCI-H69）的核酸適配體，但很少結合其他肺癌亞型或其他類型的癌癥（例如：白血病或肝癌）。Kunii 等[17]為了檢測小細胞肺癌細胞表面潛在的生物標志物胃泌素釋放肽前體（pro-gastrin-releasing peptide，pro-GRP），篩選出了能夠與小細胞肺癌細胞（SBC3）高特異性結合的核酸適配體，這種適配體與對照細胞以及其他肺癌細胞的結合力不高，說明該適配體的特異性很強。而另一項研究中，Zhao 等[18]篩選出了能夠特異性結合肺腺癌細胞（A549）的核酸適配體。
表1
篩選出的肺癌細胞核酸適配體
Table1.
Aptamers of Lung cancer cell screened
另外，在復雜的生物環境中（如：人類血液）適配體也具有很強的結合力。以循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTCs）為例，其包含了完整的遺傳信息，與此相關的研究發展迅猛。如：Zamay 等[19]經過 11 輪篩選之后，獲得了與肺腺癌細胞特異性結合的核酸適配體。采用流式細胞術鑒定后發現，該適配體具有較高的特異性，不與正常細胞和淋巴細胞結合，此類特異性的適配體探針能夠檢測到血液中的 CTCs，這不僅可以用于肺癌的無創化診斷，也對評估肺癌治療效率有一定的幫助[20]，為實現肺癌的精準化治療奠定了基礎。
量子點（quantum dot，QDs）由于其獨特的強熒光性和光穩定性，廣泛應用于生物檢測領域[21]。Wu 等[22]研發了一種 QDs—適配體復合系統用于檢測 A549 細胞，該方法既便捷、靈敏度又高，同時還避免了 QDs 的空間位阻對適體構象的影響，提高了適配體的特異性。具體操作為：首先利用鏈霉親和素和生物素分別標記 A549 細胞的核酸適配體 S11e 與 QDs，然后將 QDs—S11e 復合系統同時與 A549 細胞和人舌癌細胞（Tca）孵育。結果顯示，A549 細胞中檢測到很強的熒光，而 Tca 細胞中沒有檢測到熒光，這為癌細胞的體外診斷提供了一種新方法。目前，關于肺癌細胞核酸適配體篩選的研究還有很多，相信未來可以在肺癌的早期診斷治療中發揮重要作用。
4 適配體的表征
基于 Cell-SELEX 技術的核酸適配體在生物醫藥、臨床疾病的診斷和治療方面具有潛在的應用價值，因此研究靶細胞與適配體之間的相互作用關系對生物醫學的發展具有至關重要的作用。盡管核酸適配體可以折疊成三維結構，并通過氫鍵、疏水作用、范德華力與靶細胞結合，但是其具體的結合行為還不是很明確，尤其適配體與細胞分子水平之間的結合關系尚不明朗[24]。目前主流技術是通過流式細胞術、熒光共聚焦顯微鏡、單分子力普技術（single-molecule force spectroscopy，SMFS）等檢測細胞與適配體之間的結合情況。
4.1 流式細胞術
流式細胞術可以監測篩選過程中文庫的富集程度以及檢測適配體與靶細胞的結合程度，其優勢是能夠計算出適配體與靶細胞結合的平衡解離常數。將不同濃度梯度的帶異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的核酸適配體分別與靶細胞孵育，測定適配體與靶細胞結合的熒光強度，以判斷結合效果。熒光強度越強，適配體與靶細胞的親和力越高，反之越小[25]。使用科學圖表繪制軟件 SigmaPlot 12.0（Sigma，中國），通過方程 Y = Bmax·X/（Kd + X）計算出平衡解離常數 Kd[26]（Y：熒光強度；X：不同濃度的核酸適配體的具體濃度；Bmax：所測得的最大熒光強度；Kd：平衡解離常數）
4.2 熒光共聚焦顯微鏡
將 FITC 標記的核酸適配體分別與靶細胞和對照細胞孵育，檢測被 FITC 標記的細胞數量。如果熒光標記的靶細胞數量明顯多于對照細胞的數量，就可證明篩選出了能夠與靶細胞特異性結合的的核酸適配體[27]。
4.3 SMFS 技術
SMFS 技術能夠檢測靶細胞與適配體的結合位點，更重要的是可以清楚地顯示分子之間的相互作用[28]。基于 SMFS 技術的原子力顯微鏡是一種探究分子內或分子間相互作用的強有力的工具，利用好這項技術對適配體探針的設計具有很大的意義。
5 核酸適配體在腫瘤早期診斷治療中的應用
核酸適配體是高度結構化的單鏈寡核苷酸，其特異性和親和力在復雜的生物環境中仍然具有很強的作用，因此將其作為一種新型的分子探針，在疾病的臨床診斷和治療方面具有較高的潛在應用價值[29]。
5.1 核酸適配體在腫瘤診斷中的應用
5.1.1 用于生物傳感器
大多數的生物傳感器是基于抗體—抗原結合的原理來設計的[30]，利用兩種不同類型的抗體來檢測靶分子，但是由于這些抗體的親和力不同，對于將生物傳感器用于疾病診斷帶來了困擾。與抗體相比，核酸適配體具有很多優良特性，更重要的是與靶分子結合后，其構象會發生變化，這為設計獨特、可變傳感器提供了可能，如表 2 所示。因此，核酸適配體作為一種具有前景的生物傳感器，已被用于與腫瘤相關的生物標志物傳感器的設計中，包括：光適體傳感器、電化學傳感器等。
表2
核酸適配體與抗體的性質比較
Table2.
Property comparison of aptamer and antibody
5.1.2 用于腫瘤的體內外成像
由于核酸適配體具有分子量小、容易合成與修飾等優點，可以與熒光染料或納米材料結合，用于體內外組織或細胞的成像，這對提高腫瘤預后具有非常重要的作用。Kunii 等[17]利用 FITC 修飾的 DNA 適配體對小細胞肺癌細胞進行識別和成像。結果表明，靶細胞表面具有很強的熒光性，而其他類型的細胞表面沒有檢測到熒光。Zhao 等[18]研發了一種新型適配體探針，利用四甲基羅丹明（tetramethylrhodamine，TAMRA）標記的熒光適配體將腺癌細胞從正常的肺組織或其他類型的肺癌中區分出來，這對非小細胞肺癌的診斷和治療具有非常重要的意義。Yin 等[31]將新型納米材料與 DNA 適配體 AS1411 結合，用于腫瘤細胞成像。此研究表明，納米材料—適配體復合物同時具有熒光成像能力與磁共振成像能力，可以顯示出針對靶癌細胞的特異性診斷圖像，可用于監測疾病的發展進程。
5.1.3 用于腫瘤標志物的檢測
腫瘤標志物是腫瘤發生、增殖、擴散或轉移過程中，由癌細胞生物合成、分泌的一類分子，大多數是核酸與蛋白質[32]。了解腫瘤發展的生物機制以及準確識別標志物的類型，對腫瘤的準確診斷、治療具有至關重要的作用。核酸適配體作為新型的分子識別元件，已檢測到了與肺癌相關的幾種標志物，如波形蛋白（vimentin，VIM）[19, 21]、組蛋白 H2B（histone-H2B）、微管蛋白（tubulin，TUB）和肌動蛋白（actin，ACT）等[21]。Glod 等[33]研發了一種基于慢速適配體（slow off-rate modified，SOMAmer）的蛋白質陣列技術，可以大規模地檢測少量樣品中的蛋白質組譜。與普通適配體相比，該適配體具有較強的疏水性，更容易與蛋白質結合，對新型生物標志物的檢測有一定的幫助。
5.2 用于腫瘤的治療
很多放化療藥物會給患者帶來很大的副作用，從而限制了其在臨床上的應用。因此，如何將藥物傳送到癌細胞或組織中成為治療過程中的關鍵問題。核酸適配體不僅可以用于腫瘤的診斷，還在腫瘤的治療過程中發揮作用。
5.2.1 作為載體
核酸適配體可以與靶分子特異性結合，為靶向藥物的傳送提供了良好的平臺。核酸適配體還可以與化療劑、納米材料、脂質體、QDs 等載體結合，將藥物直接傳送到腫瘤細胞中，一方面提高了治療的效率，另一方面減少了對正常細胞的傷害。
阿霉素（doxorubicine，DOX）是一種廣泛使用的化學抗癌藥物，其抗癌原理是插入 DNA 片段之后，導致 DNA 的復制和轉錄中斷。因此，可以通過特異性適配體將 DOX 遞送到腫瘤細胞中來阻斷 DNA 鏈的復制，從而阻止腫瘤細胞的擴散和轉移[34]。Almasi 等[35]利用核酸適配體與前列腺癌細胞（LNCaP）上的特異性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）的高特異性，將 DOX 輸送到 LNCaP 細胞中，與沒有 PSMA 表達的前列腺癌細胞 PC3 相比，針對 LNCaP 細胞的處理達到了明顯的治療效果。結果證明，DOX 和核酸適配體的復合物可以對腫瘤細胞進行靶向治療，同時減少了對非靶細胞的副作用。
小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）是短 RNA 分子，可以通過參與 RNA 干擾導致基因沉默。因此，siRNA 已被廣泛應用于很多疾病的治療，在腫瘤的治療中具有很大的應用前景，但是如何把 siRNA 傳遞到細胞中以及高效地發揮作用，一直是個難題。由于核酸適配體具有較好的穩定性、特異性高、親和力強，并易于修飾等優點，可以將修飾的適配體與 siRNA 偶聯，有利于解決 siRNA 的靶向傳遞問題。Lai 等[36]通過核仁蛋白（nucleolin，NCL）介導的內吞作用，將核仁蛋白適配體—siRNA 嵌合體（aptNCL-SLUGsiR 和 aptNCL-NRP1siR）傳送到肺腺癌細胞（CL1-5）中。結果表明，aptNCL-siRNA 嵌合體使 CL1-5 細胞中的 Snail 家族鋅指轉錄因子（snail family zinc finger 2，SLUG）和神經纖毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP1）的表達量明顯降低，從而阻斷了參與肺癌轉移的關鍵信號通路，抑制了腫瘤侵襲、血管生成和循環腫瘤細胞的數量，達到了靶向治療的目的。Perepelyuk 等[37]將適配體—新型納米材料綴合成遞送系統，選擇性地將微小 RNA-29b（miRNA-29b，miR-29b）傳送到表達粘蛋白-1（mucin 1，MUC1）的 A549 細胞中，使 DNA 甲基化轉移酶 3b（DNA methyltransferase3b，DNMT3b）和髓細胞白血病基因-1（myeloid cell leukemia-1，MCL1）的表達量顯著下調，減緩了 A549 細胞的增殖，同時誘導了細胞的凋亡，從而提高了肺癌的治療效率。
5.2.2 作為藥物
核酸適配體由于其無免疫原性，并具有較好的組織滲透性和化學穩定性，容易進入細胞，因此可用于細胞生命活動的調節。所以核酸適配體除了在臨床診斷和靶向載體方面具有重要作用外，還可以作為治療劑來治療疾病。其原理是作為藥物結合腫瘤細胞中的相關分子來影響細胞代謝途徑，從而使細胞凋亡或殺傷細胞，進一步阻止了腫瘤細胞的擴散和轉移，達到治療疾病的目的[38]。2004 年，第一個適配體基礎藥物（Macugen）被美國食品藥品監督管理局批準上市，用于治療黃斑病變（age-related macular degeneration，AMD）性疾病，Macugen 上市之后，其他適配體藥物相繼進入研發或臨床試驗階段。相信隨著技術的發展，核酸適配體藥物在未來將會有更廣闊的應用前景。
6 展望
雖然以細胞為靶標的核酸適配體篩選技術已經達到成熟的階段，但尚存在許多不足，仍有很多方面需要進一步完善。細胞與文庫的比例、孵育時間、孵育溫度、洗滌力度、洗滌液濃度、PCR 條件以及次級文庫的制備方法等都需要逐步探索。核酸適配體作為一種新型的分子探針，在很多疾病的治療中起著重要的作用，然而基于適配體診斷和治療的方法仍處于早期階段，要把核酸適配體應用于臨床還需要進一步確定其有效性和安全性[39]。因此，研究者需要不斷優化和解決這些問題，才有利于今后將核酸適配體廣泛應用于疾病的診斷和治療中。
