豬在解剖學、生理病理學、營養代謝和疾病特征等方面都與人類相似度較高，基因修飾豬現已是疾病發生機制、病理毒理研究、治療藥物評估等眾多領域所需的重要動物模型。但是大型基因修飾動物模型生產難度大、步驟繁瑣、耗時長、成本高昂。隨著基因編輯技術的突破，規律性短重復回文序列簇（CRISPR）和 CRISPR 相關蛋白 9（Cas9）構成的 CRISPR/Cas9 技術大大提高了基因突變效率，降低了基因修飾動物模型的造模成本，同時簡化了步驟，推進了基因修飾豬的廣泛應用。本文主要綜述了基因修飾豬的生產方法以及利用 CRISPR/Cas9 技術生產人類疾病動物模型豬的研究進展。
引用本文： 高孟雨, 楊光, 包驥. 利用CRISPR/Cas9技術繁育基因修飾豬在醫學領域的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(4): 637-642. doi: 10.7507/1001-5515.201802046 復制
引言
目前用于人類生殖發育和疾病研究的動物模型主要為嚙齒類動物，但嚙齒類動物與人親緣關系遠、壽命短、體型小；而非人靈長類動物作為人類的近親，卻又存在成本昂貴、繁育周期長、胎數少等問題，難以大規模推廣應用。相較于以上兩者，豬一方面在解剖學、體型大小、生理病理、營養代謝等方面與人類相似，另一方面豬資源豐富、繁殖周期短、繁育力強、價格便宜。因此，豬作為動物模型，目前已被廣泛應用于移植免疫、藥理毒理、腫瘤、口腔疾病、心血管疾病、遺傳性和營養代謝性疾病等醫學研究。其中，基因修飾豬在生物醫學領域取得的一系列成果尤為突出[1]。但是早期基因編輯技術，如：鋅指核酸內切酶（zinc finger nucleases，ZFNs）和轉錄激活子樣效應核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技術，均存在操作步驟繁瑣、載體構建時間長、打靶效率低、成本高昂等缺陷，限制了基因編輯豬的廣泛應用[2]。而規律性短重復回文序列簇（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR）和 CRISPR 相關蛋白 9（CRISPR-associated 9，Cas9）構成的 CRISPR/Cas9 技術在大大提高基因編輯效率的同時還簡化了相應的操作步驟，因此目前已被廣泛應用于基因編輯動物模型的制造領域[3]。本文主要對基因修飾豬的生產方法以及利用 CRISPR/Cas9 技術構建人類疾病動物模型豬的研究進展進行綜述，旨在為生產基因修飾豬以及利用基因修飾豬研究人類疾病提供方法和思路。
1 CRISPR/Cas9 技術生產基因修飾豬的方法以及優化策略
1.1 CRISPR/Cas9 技術原理簡述
CRISPR/Cas9 技術作為以 RNA 為向導的基因編輯技術，由靶向特異性的 CRISPR RNA（crRNA）、反式激活 CRISPR RNA（transactivating crRNA，tracrRNA）和核酸內切酶 Cas9 蛋白 3 部分組成[4]。tracrRNA 和 crRNA 經人工組合為一條單鏈向導 RNA（single guide RNA，sgRNA），與 Cas9 蛋白結合后即可對靶基因進行特異性切割[5]。在構建打靶載體時，只要將合成的帶有約 20 bp 靶序列的 sgRNA 連接到含有 Cas9 序列的表達載體上即可。
該系統作為最新的人工核酸酶技術與 ZFNs 和 TALENs 技術相比，其優勢在于 Cas9 載體構建簡單，只需根據特異性打靶位點一次性設計 20 bp 左右的 sgRNA 即可，而 ZFNs 和 TALENs 技術針對每個打靶位點都需要重新設計和組裝與 DNA 結合的蛋白序列[6]。其次是 Cas9 可以高效地同時進行多基因打靶，且同一基因的打靶位點多[7]。雖然 CRISPR/Cas9 技術的脫靶率要高于 ZFNs 和 TALENs 技術，但是比較而言， CRISPR/Cas9 技術卻使得基因編輯愈加高效、靈活和廉價[8]。
1.2 利用 CRISPR/Cas9 技術生產基因修飾豬的方法
目前 CRISPR/Cas9 技術已被廣泛應用于生產基因修飾豬等大動物模型，然而豬的妊娠周期較長，為平均 114 天，如果實驗完成后才通過豬胎或新生豬仔的 DNA 樣本來確定豬基因組的插入或缺失突變，需要花費昂貴的時間、動物以及勞動成本。因此，如何提高 CRISPR/Cas9 技術的基因編輯率，以更簡便高效的方式獲得基因修飾豬，是科學家們關注的焦點問題。
體細胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）以及胚胎顯微注射法是目前利用 CRISPR/Cas9 技術生產基因修飾豬最常用的兩種方式，其技術路線如圖 1 所示。通過體外篩選出純合突變或雜合突變的穩定突變體細胞，結合 SCNT 技術，就可以得到預期突變的后代[9-12]。然而利用 SCNT 技術獲得的重構胚胎，通常伴有成活率低、后代畸形等問題，體現出 SCNT 技術具有操作技術要求高、難度大、效率低的缺點[13]。
近年來，一些研究表明，通過胚胎注射 sgRNA 與 Cas9 mRNA 的復合物，或者 sgRNA 與 Cas9 蛋白復合物，可高效建立基因突變豬[14-17]。利用該方法獲得基因修飾豬的操作周期相對較短、成本較低，但是存在原核期受精卵采集困難、基因修飾結果只能等到新生胎兒產出后方可鑒定等缺點。
圖1
利用 CRISPR/Cas9 技術生產基因修飾豬的技術路線
Figure1.
The flowchart to produce genetically modified pig by CRISPR/Cas9
1.3 高效利用 CRISPR/Cas9 技術生產基因修飾豬方法的探索
為了提高 CRISPR/Cas9 技術生產大型基因編輯動物的效率，不同課題組為此付出了很多努力，進行了多種嘗試。Wang 等[18]向胚胎注射 Cas9 mRNA/sgRNA 復合物，然后對發育到囊胚期的胚胎進行靶位點測序，篩選出打靶效率最高的 sgRNA，用于后續基因修飾豬的生產。通過該篩選過程，使得雙等位基因敲除豬獲得率達到 100%。Wu 等[19]利用單鏈退火（single-strand annealing，SSA）報告載體篩選出高活性的 sgRNA，使得利用 CRISPR/Cas9 技術敲除豬胰島素樣生長因子 2（Insulin-like growth factor 2，IGF2）基因的打靶效率提高了 5 倍左右。以上兩個研究是通過篩選高效的 sgRNA 來提高基因編輯豬的生產效率。還有研究人員，利用孤雌激活的胚胎來探究 CRISPR/Cas9 系統注射濃度以及注射時間點對獲得雙等位基因突變豬的影響。結果顯示，卵母細胞經過孤雌激活 8 h 后注射 Cas9 mRNA/sgRNA（濃度為 125 ng·μL–1/12.5 ng·μL–1）至胞質可獲得 93% 的雙等位基因突變率，為利用孤雌生殖法高效地獲得雙等位基因編輯豬提供了可行方案[20]。為了進一步簡化 CRISPR/Cas9 技術生產基因編輯豬的方法，2017 年 Wang 等[21]成功將 Cas9 蛋白基因插入到豬基因組的反向剪切受體 26（reverse orientation splice acceptor 26，ROSA26）位點，首次構建了依賴于環化重組酶（cyclization recombination enzyme，Cre）的條件性表達 Cas9 基因工具豬模型。他們通過直接在動物體水平對該工具豬轉染連有靶基因 sgRNA 的 Cre 重組酶載體，就可快速獲得基因編輯豬，大大節省基因修飾豬生產時間。此后，研究人員進一步通過滴鼻慢病毒的方式感染工具豬，在三個月后出現了典型的肺癌癥狀，成功建立了肺癌模型豬。
2 CRISPR/Cas9 技術在基因修飾豬中的應用實例
2.1 利用 CRISPR/Cas9 技術生產人類疾病動物模型豬
血管性血友病是由血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）基因缺陷所造成的常見遺傳性出血性疾病。Hai 等[22]通過顯微注射 Cas9 mRNA 和靶向豬 vWF 基因 5 號外顯子的 sgRNA 至豬胚胎，獲得的 16 頭仔豬，6 只為雙等位基因突變，5 只為單等位基因突變，基因突變率達 68.8%；雙等位基因突變體的凝血時間顯著高于野生型。
小眼畸形相關轉錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）是黑色素細胞發育的主調節蛋白，MITF 是黑素瘤的重要致癌基因。人類 MITF 基因的突變已經出現在低色素沉著和耳聾綜合征中。Wang 等[18]通過胚胎注射 125 ng/μL 的 Cas9 mRNA 和 12.5 ng/μL 的 sgRNA，生產出 MITF 雙等位基因敲除豬，效率可達 100%，用以模擬人的 Werner 綜合癥（Werner syndrome，WS）。通過基因組測序，預測脫靶位點未發生有害脫靶。
Runt 相關轉錄因子 3（Runt-related transcription factor 3，Runx3 ）基因被認為是一種新型腫瘤抑制基因，該基因的缺失對胃腸道腫瘤的發展有促進作用[23]。由于 Runx3 純合基因突變鼠出現致死情況，Kang 等[24]通過 SCNT 技術獲得 5 只存活的單等位基因修飾豬用于胃癌發生的研究，為研究腫瘤治療的新方案提供動物模型資源。
肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）作為骨骼肌生長負調節因子，對肌肉生長發育起重要調控作用。2015 年 Wang 等[25]運用 CRISPR/Cas9 結合 SCNT技術，獲得了 8 只“雙肌”表型的 MSTN 純合基因敲除豬。該基因缺陷豬在研究肌肉生長發育和提高肉質性能上都具有重要意義。
亨廷頓舞蹈癥（Huntington’s disease，HD）是神經退行性疾病之一，其特點是紋狀體中的中型刺狀神經元選擇性缺失。2018 年 Yan 等[26]利用 CRISPR/Cas9 技術和 SCNT 技術，建立了 HD 豬模型，該豬模型內源性表達全長突變的亨廷頓蛋白（huntingtin，HTT），并且通過繁育，成功地獲得了子一代和子二代 HD 豬。子一代 HD 豬表現出與親本一致的運動、行為異常以及早死癥狀。更重要的是，HD 豬的大腦顯示出明顯的、有選擇性的紋狀體神經元退化。因此，這種 HD 豬可以用于研究大型哺乳動物神經性疾病的發病機制及其治療方案。
為構建帕金森病大動物模型，Zhou 等[10]通過電轉染 CRISPR/Cas9 載體到胚胎成纖維細胞中然后結合 SCNT技術，獲得了 20 只與帕金森疾病相關的帕金森疾病Ⅱ型（Parkinson disease 2，PARK2）基因、PTEN 誘導激酶（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）基因純合敲除豬。PARK2-/-和 PINK1-/-雙基因純合敲除豬不表達 PINK1 蛋白。Wang 等[27]將 2 條靶向 PARK2，2 條靶向帕金森疾病 7（Parkinson disease 7，DJ-1 ），2 條靶向 PINK1 基因的總共 6 條 sgRNA 以及 Cas9 mRNA 復合物同時注射到豬原核期胚胎中，快速獲得了 3 基因純合突變的豬。但是以上兩個研究獲得的豬都沒有出現帕金森癥狀，可能是由于豬年齡尚小。以上兩研究均表明，利用靶向多基因的多條 sgRNA 獲得的基因修飾豬未出現明顯脫靶，證明了利用 CRISPR/Cas9 技術生產多基因修飾豬的高效性。
2.2 利用 CRISPR/Cas9 技術繁育基因修飾豬用于異種移植研究
解決人供體器官短缺的重要途徑是開展異種器官移植和異種細胞移植，而豬則被認為是人體異種器官來源以及異種細胞再生反應器的首選動物。但是免疫排斥反應和豬內源性逆轉錄病毒（porcine endogenous retroviruses，PERVs）對人體具有潛在風險是實現異種移植首要攻克的兩大難題。
2015 年，Yang 等[28]利用 CRISPR/Cas9 技術，在全基因組范圍內滅活了豬腎上皮細胞（porcine kidney epithelial，PK15）中所有 62 個拷貝的 PERVs 基因，使人感染豬內源性逆轉錄病毒的風險降低了 1 000 倍以上。2017 年該課題組最新研究成果表示，PERVs 不僅會感染人類細胞，并且會在感染了 PERVS 的人類細胞間橫向傳播。于是該團隊通過 CRISPR/Cas9 技術獲得了 PERVs 滅活的原代豬胚胎成纖維細胞，結合 SCNT技術，生產出了首例 PERVs 滅活的五指山豬[29]。該研究為避免 PERVs 種間傳播，解決異種移植轉向臨床應用的生物安全問題做出了極大貢獻。
α-1,3-半乳糖基轉移酶（α-1,3-Galactosyltransferase，GGTA1）基因是引起異種器官移植后超急性免疫排斥反應的重要基因。近期多個團隊先后利用 CRISPR/Cas9 技術獲得 GGTA1 以及與免疫相關基因的敲除豬。Estrada 等[30]利用 CRISPR/Cas9 技術結合 SCNT技術，分別獲得 GGTA1、GGTA1/ 胞苷單磷酸 N-乙酰神經氨酸羥化酶（cytidine monophos-phate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）和 GGTA1/CMAH/β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基轉移酶（β-1,4-N-Acetylgalactosaminyl transferase 2，β4GalNT2）基因敲除豬，通過對比 3 種基因敲除豬，發現豬 β4GalNT2 基因被敲除后其細胞與人 IgM 和 IgG 抗體的結合能力明顯下降，表明該模型可降低豬在異種移植中的抗原性。同時該團隊 2016 年一項研究表明，GGTA1/CMAH 雙基因敲除豬可以有效減少豬肝細胞對人體血小板的吞噬作用，為豬—人肝細胞異種移植造成的血小板減少癥提供了一個有效解決策略[31]。2017 年 Gao 等[32]通過手工克隆的方式得到了 11 只雙等位基因突變的 GGTA1/CMAH 五指山豬，均不表達 N-羥基乙酰神經氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）和半乳糖（galactose，Gal）抗原，但該方法操作繁瑣，獲得活胎率低，僅 2.5%。2016 年 Petersen 等[33]，通過受精卵胞質顯微注射靶向 GGTA1 基因 8 號外顯子的 CRISPR/Cas9—px330 質粒，獲得 6 只存活的豬仔。其中，3 只純合突變（雙等位基因突變率達 50%），細胞表面不表達 Gal 表位抗原，兩只嵌合體，僅一只未發生任何基因修飾。
白介素 2 受體（interleukin 2 receptor，IL2RG）基因突變將致 X-連鎖重癥免疫缺陷病（X-linked severe combined immunodeficiency，X-SCID）。Kang 等[34]先通過直接向胚胎注射靶向 IL2RG 基因的 sgRNA 和 Cas9 mRNA 復合物，獲得了純合突變的雌性豬胎，然后分離該純合突變豬的胚胎成纖維細胞進行 SCNT，獲得 3 只 IL2RG-/- 豬仔，表現為胸腺缺失，且 B 細胞、T 細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞顯著減少，該模型可用于異種細胞再生的進一步研究。
綜上所述，以上研究均為高效生產免疫排斥較低的異種器官供體豬以及在免疫缺陷基因編輯豬體內進行異種細胞再生奠定了應用基礎。
3 生產基因修飾豬面臨的操作問題
以上內容介紹了目前利用 CRISPR/Cas9 技術生產用于人類疾病研究的動物模型豬的研究進展，表明利用 CRISPR/Cas9 技術培育疾病模型豬已沒有技術障礙，并且具有重要的應用前景。然而，當前基因修飾豬的構建依然存在很多問題，一方面來源于基因編輯技術本身的限制，如容易脫靶或存在潛在基因突變等問題；另一方面，相較于嚙齒類動物模型，豬本身的繁殖周期較長，且無論利用 SCNT 技術還是胚胎注射的方法獲得基因修飾豬，取卵/受精卵的難度和成本都遠高于嚙齒類動物，因此限制了豬像嚙齒類動物一樣在基礎醫學研究中的大規模應用。
除此以外，還有研究者對利用精子載體法獲得基因修飾豬的方法進行嘗試探索。精子載體法指將外源 DNA 與精子共孵育或通過電轉染、病毒轉染、脂質體轉染等方式將外源基因引入精子，精子作為外源基因載體進入卵細胞受精，得到基因修飾的胚胎[35-36]。這種方法避免了 SCNT 技術以及胚胎顯微注射法的繁瑣操作，只需將改造后的精子通過體外受精或人工受精就可產生基因修飾動物，具有成本低廉、操作簡便和發展空間大等優點，因而受到廣泛關注。Zhang 等[37]通過精子載體法結合慢病毒轉染，獲得了經免疫組化和原位雜交驗證的增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）陽性豬。為了提高精子吸收外源 DNA 的效率，Oddi 等[38]利用 β-環糊精寡聚糖修飾豬精子后，與環狀 DNA 共孵育，使得外源 DNA 攝入量提高 8 倍。
但是精子載體法受動物個體的差異影響較大，可重復性不高，且精子脆弱，在體外修飾過程中易出現畸形等問題，使得該方法難以廣泛應用。本文課題組目前也在優化精子轉染條件，試圖利用精子作為載體攜帶 CRISPR/Cas9 系統到受精卵中，進一步獲得基因修飾豬。
4 結語
豬是研究人類疾病的重要動物模型，CRISPR/Cas9 系統作為一種新的基因編輯工具，打靶效率高，操作簡便，價格低廉，高效促進了基因編輯豬的廣泛應用。
利用 CRISPR/Cas9 技術快速獲得疾病模型豬，可為靶向藥物篩選以及基因治療提供重要幫助。同時，由于 PERVs 在豬體內被全部敲除，為異種移植邁出了關鍵一步，所以如果在此基礎上再敲除免疫相關基因，可以預見基因修飾豬在移植免疫研究中的廣闊應用前景。但是，利用 CRISPR/Cas9 技術生產基因修飾動物模型，伴隨的嵌合體問題和脫靶效應依然是兩大難題。另外，雖然該技術用于基因敲除有很大優勢，但是基因敲入率相對較低，還需要對該系統進行優化。相信隨著 CRISPR/Cas9 技術的快速發展和不斷優化，效率更高、脫靶率更低、特異性更強的基因編輯技術將在生產大型動物模型中發揮更重要的作用。
引言
目前用于人類生殖發育和疾病研究的動物模型主要為嚙齒類動物，但嚙齒類動物與人親緣關系遠、壽命短、體型小；而非人靈長類動物作為人類的近親，卻又存在成本昂貴、繁育周期長、胎數少等問題，難以大規模推廣應用。相較于以上兩者，豬一方面在解剖學、體型大小、生理病理、營養代謝等方面與人類相似，另一方面豬資源豐富、繁殖周期短、繁育力強、價格便宜。因此，豬作為動物模型，目前已被廣泛應用于移植免疫、藥理毒理、腫瘤、口腔疾病、心血管疾病、遺傳性和營養代謝性疾病等醫學研究。其中，基因修飾豬在生物醫學領域取得的一系列成果尤為突出[1]。但是早期基因編輯技術，如：鋅指核酸內切酶（zinc finger nucleases，ZFNs）和轉錄激活子樣效應核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技術，均存在操作步驟繁瑣、載體構建時間長、打靶效率低、成本高昂等缺陷，限制了基因編輯豬的廣泛應用[2]。而規律性短重復回文序列簇（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR）和 CRISPR 相關蛋白 9（CRISPR-associated 9，Cas9）構成的 CRISPR/Cas9 技術在大大提高基因編輯效率的同時還簡化了相應的操作步驟，因此目前已被廣泛應用于基因編輯動物模型的制造領域[3]。本文主要對基因修飾豬的生產方法以及利用 CRISPR/Cas9 技術構建人類疾病動物模型豬的研究進展進行綜述，旨在為生產基因修飾豬以及利用基因修飾豬研究人類疾病提供方法和思路。
1 CRISPR/Cas9 技術生產基因修飾豬的方法以及優化策略
1.1 CRISPR/Cas9 技術原理簡述
CRISPR/Cas9 技術作為以 RNA 為向導的基因編輯技術，由靶向特異性的 CRISPR RNA（crRNA）、反式激活 CRISPR RNA（transactivating crRNA，tracrRNA）和核酸內切酶 Cas9 蛋白 3 部分組成[4]。tracrRNA 和 crRNA 經人工組合為一條單鏈向導 RNA（single guide RNA，sgRNA），與 Cas9 蛋白結合后即可對靶基因進行特異性切割[5]。在構建打靶載體時，只要將合成的帶有約 20 bp 靶序列的 sgRNA 連接到含有 Cas9 序列的表達載體上即可。
該系統作為最新的人工核酸酶技術與 ZFNs 和 TALENs 技術相比，其優勢在于 Cas9 載體構建簡單，只需根據特異性打靶位點一次性設計 20 bp 左右的 sgRNA 即可，而 ZFNs 和 TALENs 技術針對每個打靶位點都需要重新設計和組裝與 DNA 結合的蛋白序列[6]。其次是 Cas9 可以高效地同時進行多基因打靶，且同一基因的打靶位點多[7]。雖然 CRISPR/Cas9 技術的脫靶率要高于 ZFNs 和 TALENs 技術，但是比較而言， CRISPR/Cas9 技術卻使得基因編輯愈加高效、靈活和廉價[8]。
1.2 利用 CRISPR/Cas9 技術生產基因修飾豬的方法
目前 CRISPR/Cas9 技術已被廣泛應用于生產基因修飾豬等大動物模型，然而豬的妊娠周期較長，為平均 114 天，如果實驗完成后才通過豬胎或新生豬仔的 DNA 樣本來確定豬基因組的插入或缺失突變，需要花費昂貴的時間、動物以及勞動成本。因此，如何提高 CRISPR/Cas9 技術的基因編輯率，以更簡便高效的方式獲得基因修飾豬，是科學家們關注的焦點問題。
體細胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）以及胚胎顯微注射法是目前利用 CRISPR/Cas9 技術生產基因修飾豬最常用的兩種方式，其技術路線如圖 1 所示。通過體外篩選出純合突變或雜合突變的穩定突變體細胞，結合 SCNT 技術，就可以得到預期突變的后代[9-12]。然而利用 SCNT 技術獲得的重構胚胎，通常伴有成活率低、后代畸形等問題，體現出 SCNT 技術具有操作技術要求高、難度大、效率低的缺點[13]。
近年來，一些研究表明，通過胚胎注射 sgRNA 與 Cas9 mRNA 的復合物，或者 sgRNA 與 Cas9 蛋白復合物，可高效建立基因突變豬[14-17]。利用該方法獲得基因修飾豬的操作周期相對較短、成本較低，但是存在原核期受精卵采集困難、基因修飾結果只能等到新生胎兒產出后方可鑒定等缺點。
圖1
利用 CRISPR/Cas9 技術生產基因修飾豬的技術路線
Figure1.
The flowchart to produce genetically modified pig by CRISPR/Cas9
1.3 高效利用 CRISPR/Cas9 技術生產基因修飾豬方法的探索
為了提高 CRISPR/Cas9 技術生產大型基因編輯動物的效率，不同課題組為此付出了很多努力，進行了多種嘗試。Wang 等[18]向胚胎注射 Cas9 mRNA/sgRNA 復合物，然后對發育到囊胚期的胚胎進行靶位點測序，篩選出打靶效率最高的 sgRNA，用于后續基因修飾豬的生產。通過該篩選過程，使得雙等位基因敲除豬獲得率達到 100%。Wu 等[19]利用單鏈退火（single-strand annealing，SSA）報告載體篩選出高活性的 sgRNA，使得利用 CRISPR/Cas9 技術敲除豬胰島素樣生長因子 2（Insulin-like growth factor 2，IGF2）基因的打靶效率提高了 5 倍左右。以上兩個研究是通過篩選高效的 sgRNA 來提高基因編輯豬的生產效率。還有研究人員，利用孤雌激活的胚胎來探究 CRISPR/Cas9 系統注射濃度以及注射時間點對獲得雙等位基因突變豬的影響。結果顯示，卵母細胞經過孤雌激活 8 h 后注射 Cas9 mRNA/sgRNA（濃度為 125 ng·μL–1/12.5 ng·μL–1）至胞質可獲得 93% 的雙等位基因突變率，為利用孤雌生殖法高效地獲得雙等位基因編輯豬提供了可行方案[20]。為了進一步簡化 CRISPR/Cas9 技術生產基因編輯豬的方法，2017 年 Wang 等[21]成功將 Cas9 蛋白基因插入到豬基因組的反向剪切受體 26（reverse orientation splice acceptor 26，ROSA26）位點，首次構建了依賴于環化重組酶（cyclization recombination enzyme，Cre）的條件性表達 Cas9 基因工具豬模型。他們通過直接在動物體水平對該工具豬轉染連有靶基因 sgRNA 的 Cre 重組酶載體，就可快速獲得基因編輯豬，大大節省基因修飾豬生產時間。此后，研究人員進一步通過滴鼻慢病毒的方式感染工具豬，在三個月后出現了典型的肺癌癥狀，成功建立了肺癌模型豬。
2 CRISPR/Cas9 技術在基因修飾豬中的應用實例
2.1 利用 CRISPR/Cas9 技術生產人類疾病動物模型豬
血管性血友病是由血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）基因缺陷所造成的常見遺傳性出血性疾病。Hai 等[22]通過顯微注射 Cas9 mRNA 和靶向豬 vWF 基因 5 號外顯子的 sgRNA 至豬胚胎，獲得的 16 頭仔豬，6 只為雙等位基因突變，5 只為單等位基因突變，基因突變率達 68.8%；雙等位基因突變體的凝血時間顯著高于野生型。
小眼畸形相關轉錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）是黑色素細胞發育的主調節蛋白，MITF 是黑素瘤的重要致癌基因。人類 MITF 基因的突變已經出現在低色素沉著和耳聾綜合征中。Wang 等[18]通過胚胎注射 125 ng/μL 的 Cas9 mRNA 和 12.5 ng/μL 的 sgRNA，生產出 MITF 雙等位基因敲除豬，效率可達 100%，用以模擬人的 Werner 綜合癥（Werner syndrome，WS）。通過基因組測序，預測脫靶位點未發生有害脫靶。
Runt 相關轉錄因子 3（Runt-related transcription factor 3，Runx3 ）基因被認為是一種新型腫瘤抑制基因，該基因的缺失對胃腸道腫瘤的發展有促進作用[23]。由于 Runx3 純合基因突變鼠出現致死情況，Kang 等[24]通過 SCNT 技術獲得 5 只存活的單等位基因修飾豬用于胃癌發生的研究，為研究腫瘤治療的新方案提供動物模型資源。
肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）作為骨骼肌生長負調節因子，對肌肉生長發育起重要調控作用。2015 年 Wang 等[25]運用 CRISPR/Cas9 結合 SCNT技術，獲得了 8 只“雙肌”表型的 MSTN 純合基因敲除豬。該基因缺陷豬在研究肌肉生長發育和提高肉質性能上都具有重要意義。
亨廷頓舞蹈癥（Huntington’s disease，HD）是神經退行性疾病之一，其特點是紋狀體中的中型刺狀神經元選擇性缺失。2018 年 Yan 等[26]利用 CRISPR/Cas9 技術和 SCNT 技術，建立了 HD 豬模型，該豬模型內源性表達全長突變的亨廷頓蛋白（huntingtin，HTT），并且通過繁育，成功地獲得了子一代和子二代 HD 豬。子一代 HD 豬表現出與親本一致的運動、行為異常以及早死癥狀。更重要的是，HD 豬的大腦顯示出明顯的、有選擇性的紋狀體神經元退化。因此，這種 HD 豬可以用于研究大型哺乳動物神經性疾病的發病機制及其治療方案。
為構建帕金森病大動物模型，Zhou 等[10]通過電轉染 CRISPR/Cas9 載體到胚胎成纖維細胞中然后結合 SCNT技術，獲得了 20 只與帕金森疾病相關的帕金森疾病Ⅱ型（Parkinson disease 2，PARK2）基因、PTEN 誘導激酶（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）基因純合敲除豬。PARK2-/-和 PINK1-/-雙基因純合敲除豬不表達 PINK1 蛋白。Wang 等[27]將 2 條靶向 PARK2，2 條靶向帕金森疾病 7（Parkinson disease 7，DJ-1 ），2 條靶向 PINK1 基因的總共 6 條 sgRNA 以及 Cas9 mRNA 復合物同時注射到豬原核期胚胎中，快速獲得了 3 基因純合突變的豬。但是以上兩個研究獲得的豬都沒有出現帕金森癥狀，可能是由于豬年齡尚小。以上兩研究均表明，利用靶向多基因的多條 sgRNA 獲得的基因修飾豬未出現明顯脫靶，證明了利用 CRISPR/Cas9 技術生產多基因修飾豬的高效性。
2.2 利用 CRISPR/Cas9 技術繁育基因修飾豬用于異種移植研究
解決人供體器官短缺的重要途徑是開展異種器官移植和異種細胞移植，而豬則被認為是人體異種器官來源以及異種細胞再生反應器的首選動物。但是免疫排斥反應和豬內源性逆轉錄病毒（porcine endogenous retroviruses，PERVs）對人體具有潛在風險是實現異種移植首要攻克的兩大難題。
2015 年，Yang 等[28]利用 CRISPR/Cas9 技術，在全基因組范圍內滅活了豬腎上皮細胞（porcine kidney epithelial，PK15）中所有 62 個拷貝的 PERVs 基因，使人感染豬內源性逆轉錄病毒的風險降低了 1 000 倍以上。2017 年該課題組最新研究成果表示，PERVs 不僅會感染人類細胞，并且會在感染了 PERVS 的人類細胞間橫向傳播。于是該團隊通過 CRISPR/Cas9 技術獲得了 PERVs 滅活的原代豬胚胎成纖維細胞，結合 SCNT技術，生產出了首例 PERVs 滅活的五指山豬[29]。該研究為避免 PERVs 種間傳播，解決異種移植轉向臨床應用的生物安全問題做出了極大貢獻。
α-1,3-半乳糖基轉移酶（α-1,3-Galactosyltransferase，GGTA1）基因是引起異種器官移植后超急性免疫排斥反應的重要基因。近期多個團隊先后利用 CRISPR/Cas9 技術獲得 GGTA1 以及與免疫相關基因的敲除豬。Estrada 等[30]利用 CRISPR/Cas9 技術結合 SCNT技術，分別獲得 GGTA1、GGTA1/ 胞苷單磷酸 N-乙酰神經氨酸羥化酶（cytidine monophos-phate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）和 GGTA1/CMAH/β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基轉移酶（β-1,4-N-Acetylgalactosaminyl transferase 2，β4GalNT2）基因敲除豬，通過對比 3 種基因敲除豬，發現豬 β4GalNT2 基因被敲除后其細胞與人 IgM 和 IgG 抗體的結合能力明顯下降，表明該模型可降低豬在異種移植中的抗原性。同時該團隊 2016 年一項研究表明，GGTA1/CMAH 雙基因敲除豬可以有效減少豬肝細胞對人體血小板的吞噬作用，為豬—人肝細胞異種移植造成的血小板減少癥提供了一個有效解決策略[31]。2017 年 Gao 等[32]通過手工克隆的方式得到了 11 只雙等位基因突變的 GGTA1/CMAH 五指山豬，均不表達 N-羥基乙酰神經氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）和半乳糖（galactose，Gal）抗原，但該方法操作繁瑣，獲得活胎率低，僅 2.5%。2016 年 Petersen 等[33]，通過受精卵胞質顯微注射靶向 GGTA1 基因 8 號外顯子的 CRISPR/Cas9—px330 質粒，獲得 6 只存活的豬仔。其中，3 只純合突變（雙等位基因突變率達 50%），細胞表面不表達 Gal 表位抗原，兩只嵌合體，僅一只未發生任何基因修飾。
白介素 2 受體（interleukin 2 receptor，IL2RG）基因突變將致 X-連鎖重癥免疫缺陷病（X-linked severe combined immunodeficiency，X-SCID）。Kang 等[34]先通過直接向胚胎注射靶向 IL2RG 基因的 sgRNA 和 Cas9 mRNA 復合物，獲得了純合突變的雌性豬胎，然后分離該純合突變豬的胚胎成纖維細胞進行 SCNT，獲得 3 只 IL2RG-/- 豬仔，表現為胸腺缺失，且 B 細胞、T 細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞顯著減少，該模型可用于異種細胞再生的進一步研究。
綜上所述，以上研究均為高效生產免疫排斥較低的異種器官供體豬以及在免疫缺陷基因編輯豬體內進行異種細胞再生奠定了應用基礎。
3 生產基因修飾豬面臨的操作問題
以上內容介紹了目前利用 CRISPR/Cas9 技術生產用于人類疾病研究的動物模型豬的研究進展，表明利用 CRISPR/Cas9 技術培育疾病模型豬已沒有技術障礙，并且具有重要的應用前景。然而，當前基因修飾豬的構建依然存在很多問題，一方面來源于基因編輯技術本身的限制，如容易脫靶或存在潛在基因突變等問題；另一方面，相較于嚙齒類動物模型，豬本身的繁殖周期較長，且無論利用 SCNT 技術還是胚胎注射的方法獲得基因修飾豬，取卵/受精卵的難度和成本都遠高于嚙齒類動物，因此限制了豬像嚙齒類動物一樣在基礎醫學研究中的大規模應用。
除此以外，還有研究者對利用精子載體法獲得基因修飾豬的方法進行嘗試探索。精子載體法指將外源 DNA 與精子共孵育或通過電轉染、病毒轉染、脂質體轉染等方式將外源基因引入精子，精子作為外源基因載體進入卵細胞受精，得到基因修飾的胚胎[35-36]。這種方法避免了 SCNT 技術以及胚胎顯微注射法的繁瑣操作，只需將改造后的精子通過體外受精或人工受精就可產生基因修飾動物，具有成本低廉、操作簡便和發展空間大等優點，因而受到廣泛關注。Zhang 等[37]通過精子載體法結合慢病毒轉染，獲得了經免疫組化和原位雜交驗證的增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）陽性豬。為了提高精子吸收外源 DNA 的效率，Oddi 等[38]利用 β-環糊精寡聚糖修飾豬精子后，與環狀 DNA 共孵育，使得外源 DNA 攝入量提高 8 倍。
但是精子載體法受動物個體的差異影響較大，可重復性不高，且精子脆弱，在體外修飾過程中易出現畸形等問題，使得該方法難以廣泛應用。本文課題組目前也在優化精子轉染條件，試圖利用精子作為載體攜帶 CRISPR/Cas9 系統到受精卵中，進一步獲得基因修飾豬。
4 結語
豬是研究人類疾病的重要動物模型，CRISPR/Cas9 系統作為一種新的基因編輯工具，打靶效率高，操作簡便，價格低廉，高效促進了基因編輯豬的廣泛應用。
利用 CRISPR/Cas9 技術快速獲得疾病模型豬，可為靶向藥物篩選以及基因治療提供重要幫助。同時，由于 PERVs 在豬體內被全部敲除，為異種移植邁出了關鍵一步，所以如果在此基礎上再敲除免疫相關基因，可以預見基因修飾豬在移植免疫研究中的廣闊應用前景。但是，利用 CRISPR/Cas9 技術生產基因修飾動物模型，伴隨的嵌合體問題和脫靶效應依然是兩大難題。另外，雖然該技術用于基因敲除有很大優勢，但是基因敲入率相對較低，還需要對該系統進行優化。相信隨著 CRISPR/Cas9 技術的快速發展和不斷優化，效率更高、脫靶率更低、特異性更強的基因編輯技術將在生產大型動物模型中發揮更重要的作用。
